Mycobacterium Paratuberculosis Antibody Test Kit

Transcript

Mycobacterium Paratuberculosis
Antibody Test Kit Directional Insert
Pg. 1
Notice d'instructions du kit de détection d'anticorps
Pg. 6
Antibody Test Kit - Istruzioni per l'uso
Pg. 11
Folleto de instrucciones del kit de diagnóstico
de anticuerpos
Pág. 16
Bula com orientações do Kit para
Teste de Anticorpos
Pág. 21
Antibody Test Kit - Gebrauchsinformation
Die deutsche Gebrauchsinformation ist zugelassen entsprechend
§17c TierSG - Zulassungsnummer: FLI-B 621
S. 26
SERELISA® ParaTB Ab Mono Indirect (96-0451)
A wholly owned subsidiary of
Manufactured by:
Synbiotics Corporation, 16420 Via Esprillo, San Diego, CA 92127
A wholly owned subsidiary of Zoetis, Inc., U.S. VET. LIC. NO. 312
Distributed by:
Zoetis Inc., Building 300, 333 Portage Street, Kalamazoo, MI 49007, USA, zoetis.com
Synbiotics Europe, Gerland Plaza, BAT. E, 23 Rue Pierre Gilles de Gennes, 69007
Lyon FRANCE
Zoetis Spain, S.L., Avda. de Europa 20B, Parque Empresarial La Moraleja, 28108
Alcobendas (Madrid)
30035200
Effective: September 2013
Time/Date:
30035200.indd 1
5/8/14 11:30 AM
Project No.
Artwork Number
Description
11858
30035200
Serelisa Para TB
Dimensions
Colors:
S. Lewis
Rev
6
GA
Item
Booklet
EDITOR’S COPY
Black
GA
US
SKU No.
11” x 8.5” (folds to 5.5" x 8.5”)
Additional Info:
Mgr J. Rustad
GS K. Minard
Drawing No. Country
GS:DATE:
Dieline
PR
GS / ART REV (LCA)
GS / ART REV (FA)
CHANGES
CHANGES
CHANGES
OK
OK
OK
Mycobacterium Paratuberculosis Antibody Test Kit
Directional Insert
In-vitro diagnostic kit for the detection of M. a. paratuberculosis specific
antibodies in bovine serum and plasma
GENERAL INFORMATION AND INTENDED USES
Johne’s disease is caused by Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis
and is a chronic, contagious enteritis characterized by persistent and progressive
diarrhea, weight loss, debilitation, and ultimately death. It can affect all ruminants with
worldwide distribution. The organism is shed in large numbers in the feces of infected
animals. Infection is acquired by ingestion of contaminated feed and water. Nursing
calves are infected soon after birth from udders contaminated by feces, presence of
organisms in colostrum or milk, or contaminated pens. The highest incidence of infection
is in animals less than 2 years of age where after resistance is stronger. The organisms
infect macrophages in the mucosa of the small intestine and associated lymph nodes.
If not cleared by a cell-mediated immune response, the organisms continue to multiply
causing chronic enteritis leading to shedding of organisms in feces, evidence of wasting,
and clinical disease. Early infection can take months to years to become measurable by
culture of organisms in feces or a detectable rise in antibodies to Mycobacterium.
This SERELISA® Kit is a rapid and specific presumptive screening test for the
detection of antibody to Mycobacterium avium paratuberculosis (ParaTB) in bovine serum
or plasma samples.
The principle of the test is as follows: Serum obtained from bovine herds exposed to
ParaTB antigens contain specific ParaTB antibodies. Serum, diluted in Sample Diluent
(containing Mycobacterium phlei extracts), is added to antigen coated wells. Specific
antibody in the serum forms an antibody-antigen complex with the antigen bound to the
plate. After washing the plate, a monoclonal anti-bovine IgG HRP peroxidase conjugate is
added to each well. The antibody-antigen complex remaining from the previous step binds
with the conjugate. After a brief incubation period, the unbound conjugate is removed by
a second wash step. Substrate, which contains a chromagen (ABTS), is added to each
well. Chromagen color change (from clear to green-blue) occurs in the presence of the
peroxidase enzyme. The relative intensity of color developed in 15 minutes (compared to
controls) is directly proportional to the level of antibody in the serum. After the substrate
has incubated, Stop Solution is added to each well to terminate the reaction and the plate
is read using an ELISA plate reader at 405-410 nm.
REAGENTS REQUIRED TO PERFORM 92 TESTS
a) 1 ParaTB antigen coated plate
b) 20 mL Sample Diluent (SD)
c) 10 µL 40X Negative Control Serum (N)
d) 10 µL 40X Positive Control Serum (P)
e) 110 µL 100X Anti-Bovine IgG HRP Conjugate Solution (C)
f) 11 mL Conjugate Diluent (CD)
g) 20 mL 20X Wash Solution (W)
h) 11 mL ABTS Substrate Solution (ABTS)
i) 2.5 mL 5X Stop Solution (S)
ALLOW ALL REAGENTS TO COME TO ROOM TEMPERATURE BEFORE
STARTING!
EQUIPMENT AND MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED
a) High precision pipette (i.e. 1-20 microliter pipette)
b) 0.2 mL, 1.0 mL, and 5.0 mL pipettes and tips
c) 8 or 12 channel pipette (or automated device)
1
30035200.indd 1
SERELISA® ParaTB Ab Mono Indirect
5/8/14 11:30 AM
d)
e)
f)
g)
h)
i)
j)
2 graduated cylinders (100 mL and 1000 mL)
1 mL or 5 mL borosilicate glass test tubes
Uncoated low binding 96 well test plates
Laboratory grade (distilled or reverse osmosis (R.O.)) water
96 well plate reading spectrophotometer with 405-410 nm filter
Plate washing apparatus (manual or automated)
Waste container with bleach or other oxidizing agent
WARNINGS TO THE USERS OF REAGENTS AND ANTIGEN COATED PLATES
a) Handle all reagents and samples as biohazardous material.
b) Keep all reagents away from skin and eyes. If exposure should occur, immediately
flush affected areas with cold water.
c) Wash solution, control sera, test plates, field samples and all other test kit reagents
should be properly decontaminated according to regulatory requirements before
disposal.
d) Take special care not to contaminate any of the test reagents with serum or bacterial
agents.
e) Humidity indicators are supplied with each plate. If any of the indicators exhibit a pink
color, the plate may be compromised in some way; decontaminate (e.g. wash the
plate with bleach solution) and dispose of the plate.
f) The best results are achieved by following the protocols as they are described below,
using good, safe laboratory techniques.
g) Do not use this kit after the expiration date.
h) NEVER PIPETTE BY MOUTH.
Risk and safety phrases:
R22: Harmful if swallowed.
R36/38: Irritating to eyes and skin.
S26: In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical
advice.
S30: Never add water to the product.
S36: Wear suitable protective clothing.
NOTE: Store all reagents provided in the kit at 2-7°C. Reagents should not be
frozen.
SAMPLE COLLECTION
Proper sample collection procedures, serum harvest, and serum sample storage (4°C for
up to four days or -20°C for longer periods) are needed to provide reliable test results.
Test only good quality serum (i.e. avoid bacterial contamination, heavy hemolysis or
clotted fat). When in doubt, obtain a better quality sample.
SAMPLE DILUTION PROCEDURE
Dilute serum samples using Sample Diluent (SD) in a clean, uncoated 96 well microtiter
transfer plate. Frozen serum samples should be completely thawed and thoroughly mixed
before diluting.
PREPARATION OF THE SAMPLE DILUTION PLATE
a)Add 95 µL of Sample Diluent (SD) to each well of an uncoated 96 well microtiter
plate. This plate is referred to as the sample dilution plate.
b)Add 5 µL of test sample to each well (producing a 1:20 dilution). Start with well A5
and end with well H12 (moving left to right, row by row of wells). For example, wells
1 through 30 contain the diluted sera of herd 1, wells 31-60 contain the diluted sera of
herd 2, etc.
c)Add 5 µL of Negative Control Serum (N) (producing a 1:20 dilution) to wells A3
and A4.
30035200.indd 2
2
5/8/14 11:30 AM
d)Add 5 µL of Positive Control Serum (P) (producing a 1:20 dilution) to wells A1
and A2.
e) Allow all diluted serums to equilibrate in Sample Diluent for 5 minutes before
transferring to the antigen coated ELISA plate.
ALTERNATE SAMPLE AND CONTROL PREPARATION
A transfer plate is not required for small volume testing. All samples and kit
controls can be diluted 1:40 with Sample Diluent in appropriate vials or conical
tubes (mix well, vortexing is preferred) and added directly to the test wells to begin
the first 30 minute incubation. Be sure to return any unused wells to the zip-pouch
with desiccant for storage.
PREPARATION OF CONJUGATE SOLUTION
The HRP conjugated monoclonal anti-bovine IgG is supplied at 100X concentrate in HRP
stabilizer. Dilute 110 µL stock Conjugate Solution (C) in 10.89 mL Conjugate Diluent (CD)
for a final 1:100 dilution. Mix well, vortexing is preferred. This 11 mL preparation will
supply sufficient conjugate for one 96 well ELISA plate.
PREPARATION OF 1X WASH SOLUTION
Dilute 20 mL concentrated Wash Solution (W) in 380 mL laboratory grade (distilled or
R.O.) water (1:20). Mix well. Approximately 400 mL Wash Solution is needed for each
96 well ELISA plate.
PREPARATION OF SUBSTRATE SOLUTION
The Substrate Solution (ABTS) is ready to use. Each plate will require approximately
11 mL substrate solution. For best results, the substrate solution must be equilibrated to
room temperature before use.
PREPARATION OF 1X STOP SOLUTION
Dilute 2.5 mL concentrated Stop Solution (S) in 10 mL laboratory grade (distilled or R.O.)
water (1:5). Mix well. Approximately 12.5 mL Stop Solution is needed for each 96 well
ELISA plate.
NOTE: Storage of 5X Stop Solution (S) at refrigerated temperatures may cause the
formation of a white solid. This does not affect product performance. Allow
5X Stop Solution (S) to warm to room temperature or 37°C before use to
dissolve any solids.
ELISA TEST PROCEDURE
PREPARING THE TEST PLATE
a) Remove an antigen coated test plate (or the required number of strips if whole
plate is not needed) from the plate pouch and label according to the dilution plate
identification described above.
b)Add 50 µL of Sample Diluent (SD) to all wells on the test plate.
c) Using an 8 or 12 channel pipette, transfer 50 µL/well of each of the diluted serum
samples and controls from the sample dilution plate to the corresponding wells of the
coated test plate (yields a final 1:40 dilution). Discard pipette tips after each row of
sample is transferred.
d) Incubate plate for 30 minutes (± 5 min) at room temperature (23°C ± 5°C).
WASH PROCEDURE
e) Discard the contents from each well, either manually or with automated plate washing
apparatus, into an appropriate waste container.
f)Dispense approximately 300 µL/well of 1X Wash Solution using an 8 or
12 channel pipette (or automated device).
3
30035200.indd 3
5/8/14 11:30 AM
g) Allow 1X Wash to soak in wells for 10-15 seconds, and then discard contents into
an appropriate waste container.
h) Repeat wash procedure 2 more times. Invert and blot plate dry after final wash.
NOTE: The wash procedure is a very critical step in any ELISA test. Please follow
the above steps as directed.
ADDITION OF 1X CONJUGATE, SUBSTRATE AND STOP SOLUTION
i)Dispense 100 µL/well of diluted Conjugate (prepared as described above) using an
8 or 12 channel pipette (or automated device). Discard pipette tips.
j) Incubate for 30 minutes (± 5 min) at room temperature (23°C ± 5°C).
k) Repeat WASH PROCEDURE above (steps e thru h).
l)Dispense 100 µL/well of Substrate Solution (ABTS) using an 8 or 12 channel pipette
(or automated device). Discard pipette tips.
m) Incubate for 15 minutes (± 1 min) at room temperature (23°C ± 5°C).
n)Dispense 100 µL/well of 1X Stop Solution (prepared as described above) using an
8 or 12 channel pipette (or automated device).
o) Read the plate using an ELISA plate reader set at 405-410 nm. Allow any bubbles to
dissipate before reading plate.
RESULTS
Assay Control Values
Valid ELISA results are obtained when the average optical density (OD) value of the
Negative Control Serum is less than 0.25 and the Positive Control value is between
0.40 and 1.20. If either of these values are out of range, the test results should be
considered invalid and the samples should be retested.
Manual Processing of Data
a) Calculate the average Negative Control Serum absorbance optical density (OD) using
the values of wells A3 and A4. Calculate the Positive Control Serum OD using values
obtained from wells A1 and A2. Record both averages.
b) Subtract the average Negative Control OD from the average Positive OD. The
difference is the Corrected Positive Control.
c) Calculate a sample to Positive (S/P) ratio by subtracting the average Negative control
OD from each sample OD. The difference is divided by the corrected Positive control.
Use the following equation format:
S/P= (SAMPLE OD) – (AVERAGE NEGATIVE CONTROL OD)
CORRECTED POSITIVE CONTROL
Example:
1. Example Positive Control OD’s:
0.585 and 0.605
Average = (0.585 + 0.605) / 2 = 0.595
2. Example Negative Control OD’s:
0.072 and 0.062
Average = (0.072 + 0.062) / 2 = 0.067
3. Corrected Positive Control:
(0.595) – (0.067) = 0.528
4. Example S/P value calculation:
OD of sample = 0.560
(0.560) – (0.067) / 0.528 = 0.934
30035200.indd 4
4
5/8/14 11:30 AM
Interpretation of Results
The ParaTB ELISA S/P ratio values and/or ELISA titer values obtained for sera should be
interpreted using the following value ranges:
Sample to Positive
(S/P) Ratio
< 0.70
≥ 0.70 ParaTB Presumed
Antibody Status
Negative (a)
Positive (b)
a. Negative: Serum samples with a ParaTB S/P ratio value < 0.70 are presumed
negative for antibody. However, a variety of factors, such as possible variations that
may exhibit atypical biological and/or antigenic properties, prevalence of ParaTB
within a herd and timing and randomness of serum sample collection procedures
could result in an infected herd yielding negative ELISA results. It is therefore
recommended that each herd only be considered to be negative after
(1) each herd has been adequately sampled and repeatedly tested several times
and has yielded negative ELISA results each time and
(2) each herd has been adequately sampled and repeatedly tested by standard
conventional methods (culture, PCR, etc.) and has yielded negative results each
time.
b. Positive: Serum samples with a ParaTB S/P ratio value ≥ 0.70 are presumed positive
for antibody. Additional confirmation testing of samples collected from presumed
ParaTB ELISA antibody positive herds, using standard techniques, are needed to
confirm a positive diagnosis of a ParaTB infection within a herd.
5
30035200.indd 5
5/8/14 11:30 AM
Mycobacterium Paratuberculosis Notice d'instructions
du kit de détection d'anticorps
Kit de diagnostic in vitro pour la détection des anticorps spécifiques dirigés
contre M. a. paratuberculosis dans le sérum et le plasma des bovins
INFORMATIONS GÉNÉRALES ET PRINCIPE DU TEST
La maladie de Johne est provoquée par Mycobacterium avium, sous-espèce
paratuberculosis ; c’est une entérite chronique contagieuse caractérisée par des
symptômes progressifs et persistants de diarrhée avec perte pondérale, affaiblissement,
entraînant finalement la mort. Elle peut affecter tous les ruminants et est présente partout
dans le monde. La bactérie est excrétée en grande quantité dans les fèces des animaux
infectés. L’infection se transmet par ingestion d’eau et d’aliments contaminés. Les veaux
allaités sont infectés rapidement après leur naissance par les pis souillés par des fèces,
par la présence de bactéries dans le colostrum ou le lait, ou par des étables contaminées.
Les animaux de moins de 2 ans présentent la plus forte incidence d’infection, les animaux
plus âgés étant plus résistants. Les bactéries infectent les macrophages au niveau de
la muqueuse de l’intestin grêle et les ganglions lymphatiques associés. Si les bactéries
ne sont pas éliminées par la réponse immunitaire à médiation cellulaire, elles continuent
à se multiplier en provoquant une entérite chronique associée à une dissémination des
bactéries, à un amaigrissement et à une maladie clinique. L’infection initiale peut prendre
des mois avant que les bactéries ne deviennent détectables par coproculture ou que les
anticorps anti-Mycobacterium ne soient détectables.
Cette trousse SERELISA® est un test de dépistage présomptif rapide et spécifique
pour la détection des anticorps dirigés contre Mycobacterium avium paratuberculosis
(ParaTB) dans des échantillons de sérum ou de plasma de bovins.
Le principe du test est le suivant : Le sérum prélevé dans des troupeaux exposés
aux antigènes ParaTB contient des anticorps spécifiques anti-ParaTB. Le sérum, dilué
dans le diluant des échantillons (contenant des extraits de Mycobacterium phlei), est
ajouté dans les puits sensibilisés par l’antigène. Les anticorps spécifiques présents
dans le sérum forment des complexes anticorps-antigène avec l’antigène lié à la plaque.
Après le lavage de la plaque, un anticorps monoclonal anti-IgG bovine conjugué à la
peroxydase de raifort (HRP) est ajouté dans chaque puits. Les complexes anticorpsantigène qui subsistent à l’étape de lavage précédente, se lient au conjugué. Après une
courte période d’incubation, le conjugué non lié est éliminé par une seconde étape de
lavage. Un substrat contenant un chromogène (ABTS) est ajouté dans chaque puits. Un
changement de couleur du chromogène (d’incolore à vert-bleu) se produit en présence de
la peroxydase. L’intensité relative (par rapport aux contrôles) de la coloration développée
en 15 minutes est directement proportionnelle au taux d’anticorps présents dans le sérum.
Après incubation du substrat, une solution d’arrêt est ajoutée dans chaque puits pour
arrêter la réaction. La lecture de la plaque s’effectue dans un lecteur de plaque ELISA à
405–410 nm.
RÉACTIFS REQUIS POUR RÉALISER 92 TESTS
a) 1 plaque sensibilisée avec l'antigène M.ParaTB
b) 20 ml de diluant des échantillons (SD)
c) 10 µl de sérum de contrôle négatif concentré 40 fois (N)
d) 10 µl de sérum de contrôle positif concentré 40 fois (P)
e) 110 µl de solution de conjugué anti-IgG bovine HRP concentrée 100 fois (C)
f) 11 ml de diluant du conjugué (CD)
g) 20 ml de solution de lavage concentrée 20 fois (W)
h) 11 ml de solution de substrat ABTS (ABTS)
i) 2,5 ml de solution d’arrêt concentrée 5 fois (S)
AVANT UTILISATION, PLACER TOUS LES RÉACTIFS À TEMPÉRATURE
AMBIANTE !
30035200.indd 6
6
5/8/14 11:30 AM
MATERIEL ET REACTIFS NECESSAIRES NON FOURNIS
a) Pipette de haute précision (pipette de 1–20 microlitres) (En France: L'erreur de
la mesure doit être ≤10% pour des volumes ≤10 µl et ≤ 5% pour tous les autres
volumes indiqués.)
b) Pipettes et cônes de 0,2 ml, 1,0 ml et 5,0 ml
c) Pipette à 8 ou 12 canaux (ou dispositif automatique)
d) 2 éprouvettes graduées (100 ml et 1000 ml)
e) Tubes à essai en verre borosilicate de 1 ou 5 ml
f) Plaques de pré-dilution à faible liaison, de 96 puits
g) Eau de qualité laboratoire (distillée ou par osmose inverse (OI))
h) Appareil de lecture pour microplaque de 96 puits, avec filtre de 405–410 nm
i) Dispositif de lavage manuel ou automatique pour plaques
j) Conteneur pour déchets contaminés avec de l’eau de Javel ou un autre agent
oxydant
PRECAUTIONS D'EMPLOI
a) Traiter tous les réactifs et les échantillons comme des matériaux contaminés.
b) Éviter tout contact entre les réactifs et la peau ou les yeux. En cas d’exposition, rincer
immédiatement les zones atteintes à l’eau froide.
c) Avant l’élimination, la solution de lavage, les sérums de contrôle, les plaques de test,
les échantillons de terrain et tous les autres réactifs du kit doivent être correctement
décontaminés selon les exigences règlementaires.
d) Eviter toute contamination des réactifs du test avec du sérum ou des bactéries.
e) Chaque plaque possède un témoin d’humidité. Si un témoin a pris une coloration
rose, il est possible que la plaque soit endommagée ; le cas échéant, décontaminer
la plaque (par ex., par lavage avec une solution d’eau de Javel), puis l’éliminer.
f) Les meilleurs résultats s’obtiennent en respectant les protocoles décrits ci-dessous et
en utilisant des techniques de laboratoire adéquates et sûres.
g) Ne pas utiliser le kit après la date de péremption.
h) NE JAMAIS PIPETTER À LA BOUCHE.
Phrases de risque et conseils de prudence :
R22 : Nocif en cas d’ingestion.
R36/38 : Irritant pour les yeux et la peau.
S26 : En cas de contact avec les yeux, laver immédiatement et abondamment avec de
l’eau et consulter un spécialiste.
S30 : Ne jamais verser de l’eau dans ce produit.
S36 : Porter un vêtement de protection approprié.
REMARQUE : Stocker tous les réactifs du kit entre 2 et 7°C. Ne pas congeler les
réactifs.
PRÉLÈVEMENT DES ÉCHANTILLONS
Afin d’obtenir des résultats fiables, il faut impérativement utiliser des procédures correctes
de prélèvement d’échantillon, de séparation du sérum et de conservation des échantillons
de sérum (à 4°C pendant maximum quatre jours ou à -20°C pour une plus longue
conservation). Tester uniquement du sérum de bonne qualité (en évitant la contamination
bactérienne, les sérums très hémolysés ou très lipémiques). En cas de doute, prélever un
échantillon de meilleure qualité.
PROCÉDURE DE DILUTION DES ÉCHANTILLONS
Diluer les échantillons de sérum avec le diluant des échantillons (SD) dans une plaque
vierge de pré-dilution (non-sensibilisée) de 96 puits. Les échantillons de sérum congelés
doivent être complètement décongelés et correctement mélangés avant la dilution.
7
30035200.indd 7
5/8/14 11:30 AM
PRÉPARATION DE LA PLAQUE DE DILUTION DES ÉCHANTILLONS
a)Ajouter 95 µl de diluant des échantillons (SD) dans chaque puits d’une plaque de
pré-dilution de 96 puits. Cette plaque est appelée plaque de dilution des échantillons.
b)Ajouter 5 µl d’échantillon à tester dans chaque puits (dilution 1/20). Commencer
par le puits A5 et terminer par le puits H12 (de gauche à droite, rangée par rangée de
puits). Par exemple, les puits 1 à 30 contiennent les sérums dilués du troupeau 1, et
les puits 31 à 60 contiennent les sérums dilués du troupeau 2, etc.
c)Ajouter 5 µl de sérum de contrôle négatif (N) (dilution 1/20) dans les puits A3 et A4.
d)Ajouter 5 µl de sérum de contrôle positif (P) (dilution 1/20) dans les puits A1 et A2.
e) Laisser tous les sérums dilués s’équilibrer dans le diluant des échantillons pendant
5 minutes avant de les transférer dans la plaque ELISA sensibilisée.
AUTRE MÉTHODE DE PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS ET DES
CONTRÔLES
Une plaque de dilution n’est pas nécessaire pour tester un petit nombre
d’échantillons. Tous les échantillons et les sérums de contrôle peuvent être
dilués au 1/40 avec le diluant des échantillons dans des flacons appropriés
(bien mélanger, de préférence au vortex) et déposés directement dans la plaque
sensibilisée pour commencer la première incubation de 30 minutes. Replacer tous les
puits non utilisés dans le sachet refermable avec dessicant pour la conservation.
PRÉPARATION DE LA SOLUTION DE CONJUGUÉ
Le conjugué anticorps monoclonal anti-IgG bovine HRP est fourni à une concentration
100x dans du stabilisateur pour HRP. Diluer 110 µl de solution de conjugué concentré (C)
dans 10.89 ml de diluant du conjugué (CD) pour une dilution finale de 1/100. Bien
mélanger, de préférence au vortex. Cette préparation de 11 ml fournit un volume de
conjugué suffisant pour une plaque ELISA de 96 puits.
DILUTION DE LA SOLUTION DE LAVAGE
Diluer 20 ml de solution de lavage concentrée (W) dans 380 ml d’eau de qualité
laboratoire (distillée ou OI) (dilution 1/20). Bien mélanger. Environ 400 ml de solution de
lavage sont nécessaires pour chaque plaque ELISA de 96 puits.
PRÉPARATION DE LA SOLUTION DE SUBSTRAT
La solution de substrat (ABTS) est prête à l’emploi. Chaque plaque nécessite environ
11 ml de solution de substrat. Pour de meilleurs résultats, la solution de substrat doit être
portée à température ambiante avant utilisation.
DILUTION DE LA SOLUTION D’ARRÊT
Diluer 2,5 ml de solution d’arrêt concentrée (S) dans 10 ml d’eau de qualité laboratoire
(distillée ou OI) (dilution 1/5). Bien mélanger. Environ 12,5 ml de solution d’arrêt sont
nécessaires pour chaque plaque ELISA de 96 puits.
REMARQUE : Le stockage de la solution d’arrêt concentrée 5x (S) dans un
réfrigérateur peut entraîner la formation d’un solide blanc.
Ce phénomène n’affecte en rien les performances du produit.
Ramener à température ambiante ou chauffer à 37°C la solution
d'arrêt 5x (S) afin de dissoudre d'éventuels solides.
MODE OPERATOIRE
PRÉPARATION DE LA PLAQUE DE TEST
a) Sortir de la pochette une plaque sensibilisée par l’antigène (ou le nombre nécessaire
de rangées si la plaque entière n’est pas nécessaire) et l’étiqueter conformément à
l’identification de la plaque de dilution décrite plus haut.
30035200.indd 8
8
5/8/14 11:30 AM
b)Déposer 50 µl de diluant des échantillons (SD) dans chaque puits de la plaque de
test.
c) À l’aide d’une pipette de 8 ou 12 canaux, prélever et transférer 50 µl de chaque
échantillon de sérum et des contrôles dilués de la plaque de dilution des échantillons
vers la plaque sensibilisée (dilution finale 1/40). Éliminer les cônes de pipette après
chaque transfert des échantillons d’une rangée.
d) Incuber la plaque pendant 30 minutes (± 5 min) à température ambiante
(23°C ± 5°C).
PROCÉDURE DE LAVAGE
e) Éliminer le contenu de tous les puits dans un contenant approprié pour
l’élimination des déchets, manuellement ou avec un appareil de lavage automatique
pour plaques.
f)Déposer environ 300 µl de solution de lavage diluée dans chaque puits au
moyen d’une pipette à 8 ou 12 canaux (ou d’un dispositif automatique).
g) Laisser la solution de lavage tremper dans les puits pendant 10–15 secondes,
puis vider le contenu des puits dans un contenant approprié pour l’élimination des
déchets.
h) Répéter encore 2 fois la procédure de lavage. Après le dernier lavage, retourner la
plaque et l’égoutter sur du papier absorbant.
REMARQUE : La procédure de lavage est une étape très critique pour tout test
ELISA. Respecter scrupuleusement les instructions données
ci-dessus.
AJOUT DU CONJUGUÉ, DU SUBSTRAT ET DE LA SOLUTION D’ARRÊT
i)Déposer 100 µl de conjugué dilué dans chaque puits (préparé comme décrit
précédemment) au moyen d’une pipette à 8 ou 12 canaux (ou d’un dispositif
automatique). Éliminer les cônes de pipette.
j) Incuber pendant 30 minutes (± 5 min) à température ambiante (23°C ± 5°C).
k) Répéter la PROCÉDURE DE LAVAGE décrite plus haut (étapes e à h).
l)Déposer 100 µl de solution de substrat (ABTS) dans chaque puits au moyen d’une
pipette à 8 ou 12 canaux (ou d’un dispositif automatique). Éliminer les cônes de
pipette.
m) Incuber pendant 15 minutes (± 1 min) à température ambiante (23°C ± 5°C).
n)Déposer 100 µl de solution d’arrêt diluée dans chaque puits (préparé comme
décrit précédemment) au moyen d’une pipette à 8 ou 12 canaux (ou d’un dispositif
automatique).
o) Lire la plaque au moyen d’un lecteur de plaque ELISA réglé à 405–410 nm. Eliminer
la présence éventuelle de bulles avant de lire la plaque.
RÉSULTATS
Validation du test
Les résultats du test ELISA sont valides quand la densité optique (DO) moyenne du
sérum de contrôle négatif est inférieure à 0,25, avec une DO du contrôle positif comprise
entre 0,40 et 1,20. Si une de ces valeurs est en dehors de l’intervalle, les résultats du test
doivent être considérés comme non valides, et les échantillons doivent être retestés.
Traitement manuel des données
a) Calculer la densité optique (DO) moyenne du sérum de contrôle négatif en utilisant
les valeurs des puits A3 et A4. Calculer la DO moyenne du sérum de contrôle positif
en utilisant les valeurs des puits A1 et A2. Noter les deux moyennes.
b) Soustraire la DO moyenne du contrôle négatif à la DO moyenne du contrôle positif.
La différence est la DO corrigée du contrôle positif.
9
30035200.indd 9
5/8/14 11:30 AM
c) Calculer le rapport de la DO de l’échantillon sur la DO du contrôle positif (E/P) en
soustrayant la DO moyenne du contrôle négatif de la DO de chaque échantillon.
Diviser la différence par la DO corrigée du contrôle positif. Utiliser l’équation
suivante :
E/P = (DO DE L’ÉCHANTILLON) – (DO MOYENNE DU CONTRÔLE NÉGATIF)
DO CORRIGÉE DU CONTRÔLE POSITIF
Exemple :
1. DO du contrôle positif de l’exemple :
0,585 et 0,605
Moyenne = (0,585 + 0,605) / 2 = 0,595
2. DO du contrôle négatif de l’exemple :
0,072 et 0,062
Moyenne = (0,072 + 0,062) / 2 = 0,067
3. DO corrigée du contrôle positif :
(0,595) – (0,067) = 0,528
4. Calcul de la valeur E/P de l’exemple :
DO de l’échantillon = 0,560
(0,560) – (0,067) / 0,528 = 0,934
Interprétation des résultats
Les valeurs du rapport E/P et/ou les titres du test ELISA obtenus avec les sérums doivent
être interprétés selon les intervalles suivants :
Échantillon positif
Rapport (E/P)
< 0,70
≥ 0,70
Présomption de ParaTB
Statut en anticorps
Négatif (a)
Positif (b)
a. Négatif : Les échantillons de sérum présentant un rapport ParaTB E/P < 0,70
sont présumés négatifs quant à la présence d’anticorps. Divers facteurs peuvent
cependant entraîner des résultats ELISA négatifs pour un troupeau infecté :
variations éventuelles pouvant induire des propriétés biologiques et/ou antigéniques
atypiques ; prévalence de ParaTB dans le troupeau ; moment et caractère aléatoire
des procédures de prélèvement des échantillons de sérum. Il est donc recommandé
de ne considérer un troupeau négatif que si les conditions suivantes sont
rassemblées :
(1) le troupeau a été correctement échantillonné et testé de manière répétée,
chaque fois avec des résultats ELISA négatifs et
(2) le troupeau a été correctement échantillonné et testé de manière répétée par
les méthodes classiques standard (culture, PCR, etc.), avec à chaque fois des
résultats négatifs.
b. Positif : Les échantillons de sérum présentant un rapport ParaTB E/P ≥ 0,70 sont
présumés positifs quant à la présence d’anticorps. Les échantillons prélevés dans
un troupeau présumé positif pour les anticorps ParaTB au test ELISA doivent être
soumis à des tests supplémentaires afin de confirmer le diagnostic d’infection ParaTB
dans le troupeau.
30035200.indd 10
10
5/8/14 11:30 AM
Mycobacterium Paratuberculosis Antibody Test Kit Istruzioni per l'uso
Kit diagnostico in vitro per il rilevamento di anticorpi specifici contro
M. a. paratuberculosis in campioni di siero e di plasma bovino
INFORMAZIONI GENERALI E USO PREVISTO
La malattia di Johne, causata da Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis,
è un’enterite contagiosa cronica caratterizzata da diarrea persistente e progressiva,
perdita di peso, debilitazione e, infine, morte. Tale patologia può colpire tutti i ruminanti
ed è diffusa in tutto il mondo. L’agente patogeno è disseminato in gran numero nelle
feci degli animali infetti. L’infezione è acquisita mediante ingestione di alimenti e acqua
contaminati. I vitelli da latte si infettano subito dopo la nascita attraverso mammelle
contaminate da feci, presenza di microrganismi nel colostro o nel latte o box contaminati.
La più elevata incidenza di infezione si rileva negli animali di meno di 2 anni di età,
mentre successivamente la resistenza aumenta. Gli agenti patogeni infettano i macrofagi
della mucosa dell’intestino tenue e i linfonodi associati. Se non viene contrastato
dalla risposta immunitaria cellulo-mediata, l’agente patogeno continua a moltiplicarsi,
causando un’enterite cronica con conseguente disseminazione dei microrganismi nelle
feci, deperimento dell’animale e malattia clinica. L’infezione precoce può richiedere mesi
o anni prima di poter essere rilevata mediante coltura degli agenti patogeni nelle feci o
aumento rilevabile degli anticorpi contro il Mycobacterium.
Questo kit SERELISA® costituisce un test presuntivo di screening, rapido e specifico,
per il rilevamento di anticorpi contro il Mycobacterium avium paratuberculosis (ParaTB) in
campioni di siero o plasma bovino.
Il principio del test è il seguente: il siero ottenuto da mandrie bovine esposte agli
antigeni ParaTB contiene anticorpi specifici ParaTB. Il siero, diluito nel campione diluente
(contenente estratti di Mycobacterium phlei), viene aggiunto ai pozzetti rivestiti di
antigene. L’anticorpo specifico presente nel siero forma un complesso antigene-anticorpo
con l’antigene legato alla piastra. Dopo aver lavato la piastra, si aggiunge a ogni pozzetto
una IgG monoclonale anti-bovino coniugata con perossidasi di rafano (HRP, horseradish
peroxidase). Il complesso antigene-anticorpo rimanente dal passaggio precedente si lega
al coniugato. Dopo un breve periodo d’incubazione, il coniugato non legato viene rimosso
mediante un secondo passaggio di lavaggio. Si aggiunge poi a ogni pozzetto il substrato
che contiene un cromogeno (ABTS). In presenza dell’enzima perossidasi si verifica una
variazione di colore del cromogeno (da trasparente a verde-azzurro). L’intensità relativa
(rispetto ai controlli) del colore sviluppato in 15 minuti è direttamente proporzionale al
livello di anticorpi nel siero. Dopo aver incubato il substrato, si aggiunge la soluzione di
arresto a ciascun pozzetto per terminare la reazione e si legge la piastra mediante un
lettore di piastre ELISA a 405-410 nm.
REAGENTI NECESSARI PER PRATICARE 92 TEST
a) 1 piastra rivestita con antigene ParaTB
b) 20 ml di diluente del campione (SD)
c) 10 µl 40X di siero di controllo negativo (N)
d) 10 µl 40X di siero di controllo positivo (P)
e) 110 µl 100X di soluzione di IgG anti-bovino coniugata con HRP (C)
f) 11 ml di diluente del coniugato (CD)
g) 20 ml 20X di soluzione di lavaggio (W)
h) 11 ml di soluzione di substrato (ABTS)
i) 2,5 ml 5X di soluzione di arresto (S)
ATTENDERE CHE TUTTI I REAGENTI RAGGIUNGANO LA TEMPERATURA
AMBIENTE PRIMA DI INIZIARE!
11
30035200.indd 11
5/8/14 11:30 AM
APPARECCHIATURE E MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI
a) Pipetta di alta precisione (vale a dire con capacità da 1 a 20 microlitri)
b) Pipette e puntali da 0,2 ml, 1,0 ml e 5,0 ml
c) Pipetta a 8 o 12 canali (o dispositivo automatico)
d) 2 cilindri graduati (100 ml e 1000 ml)
e) Provette in vetro borosilicato da 1 ml o 5 ml
f) Piastre per microtitolazione a 96 pozzetti a basso legame non rivestite
g) Acqua di grado laboratorio (distillata o purificata mediante osmosi inversa [R.O.])
h) Spettrofotometro per la lettura di piastre a 96 pozzetti con filtro a 405-410 nm
i) Apparecchio per il lavaggio delle piastre (manuale o automatizzato)
j) Contenitore di scarico con soluzione di ipoclorito di sodio o altri agenti ossidanti
AVVERTENZE PER L’UTILIZZATORE DEI REAGENTI E DELLE PIASTRE RIVESTITE
CON ANTIGENE
a) Trattare tutti i reagenti e i campioni come materiale a rischio biologico.
b) Tenere tutti i reagenti lontani dalla cute e dagli occhi. In caso di esposizione, lavare
immediatamente le aree interessate con acqua fredda.
c) La soluzione di lavaggio, i sieri di controllo, le piastre del test, i campioni prelevati sul
campo e tutti gli altri reagenti del kit devono essere decontaminati appropriatamente
prima dello smaltimento secondo i requisiti di legge.
d) Usare cautela per non contaminare nessuno dei reagenti del test con siero o batteri.
e) Con ciascuna piastra vengono forniti indicatori di umidità. Se uno degli indicatori
mostra un colore rosa, la piastra potrebbe essere in qualche modo difettosa e
pertanto dovrà essere decontaminata (vale a dire lavata con la soluzione di ipoclorito
di sodio) e poi smaltita.
f) I migliori risultati vengono ottenuti osservando i protocolli riportati di seguito e
applicando buone e sicure tecniche di laboratorio.
g) Non usare questo kit dopo la data di scadenza.
h) NON PIPETTARE MAI CON LA BOCCA.
Frasi di rischio e frasi di sicurezza
R22: nocivo per ingestione.
R36/38: irritante per gli occhi e per la pelle.
S26: in caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente e abbondantemente con
acqua e consultare il medico.
S30: non versare acqua sul prodotto.
S36: usare indumenti protettivi adatti.
NOTA: Conservare tutti i reagenti forniti con il kit a 2°C-7°C. Non congelare i
reagenti.
PRELIEVO DEL CAMPIONE
Per avere risultati dei test affidabili sono necessarie corrette procedure per il
campionamento, per la raccolta del siero e per la conservazione dei campioni di siero
(4°C per periodi fino a quattro giorni o -20°C per periodi più lunghi). Sottoporre a test solo
siero di buona qualità (evitare quindi sieri contaminati da batteri, fortemente emolizzati o
con coaguli lipidici). In caso di dubbi, prelevare un campione di migliore qualità.
PROCEDURA DI DILUIZIONE DEL CAMPIONE
Diluire i campioni di siero utilizzando il diluente del campione (SD) in una piastra per
microtitolazione a 96 pozzetti per il trasferimento, pulita e non rivestita. I campioni di siero
congelati devono essere completamente scongelati e miscelati accuratamente prima della
diluizione.
30035200.indd 12
12
5/8/14 11:30 AM
PREPARAZIONE DELLA PIASTRA DI DILUIZIONE DEI CAMPIONI
a)Aggiungere 95 µl di diluente del campione (SD) a ciascun pozzetto di una piastra per
microtitolazione a 96 pozzetti non rivestita. Questa piastra viene denominata piastra
di diluizione del campione.
b) Aggiungere a ciascun pozzetto 5 µl del campione da esaminare (in tal modo si
ottiene una diluizione di 1:20). Iniziare dal pozzetto A5 e terminare con il pozzetto
H12 (spostandosi da sinistra a destra, riga dopo riga). Per esempio, i pozzetti da 1 a
30 contengono i sieri diluiti della mandria 1, i pozzetti 31-60 contengono i sieri diluiti
della mandria 2 ecc.
c)Aggiungere 5 µl di siero di controllo negativo (N) ai pozzetti A3 e A4 (in tal modo si
ottiene una diluizione 1:20).
d)Aggiungere 5 µl di siero di controllo positivo (P) ai pozzetti A1 e A2 (in tal modo si
ottiene una diluizione 1:20).
e) Dopo la diluizione è necessario attendere 5 minuti (tempo di equilibramento) prima di
trasferire i sieri diluiti sulla piastra ELISA rivestita con antigene.
PROCEDURA ALTERNATIVA PER LA PREPARAZIONE DI CAMPIONI E
CONTROLLI
Per esigui numeri di campioni da esaminare non è necessario usare una piastra di
trasferimento. Tutti i campioni e i controlli del kit possono essere diluiti 1:40 con
il diluente del campione in provette appropriate - anche coniche - (miscelare bene,
preferendo l’uso di un miscelatore vortex) e aggiunti direttamente ai pozzetti di esame
prima di iniziare il primo periodo di incubazione di 30 minuti. Assicurarsi di rimettere
tutti i pozzetti non utilizzati nella busta richiudibile contenente la sostanza essiccante
per la conservazione.
PREPARAZIONE DELLA SOLUZIONE DI CONIUGATO
La soluzione di IgG monoclonali anti-bovino coniugate con HRP è fornita a una
concentrazione 100x in uno stabilizzatore della HRP. Diluire 110 µl di soluzione madre del
coniugato (C) in 10.89 ml di diluente del coniugato (CD) per una diluizione finale di 1:100.
Miscelare bene, preferendo l’utilizzo di un miscelatore vortex. Questa preparazione di
11 ml fornisce una quantità di coniugato sufficiente per una piastra ELISA da 96 pozzetti.
PREPARAZIONE DELLA SOLUZIONE DI LAVAGGIO 1X
Diluire 20 ml di soluzione di lavaggio concentrata (W) in 380 ml di acqua di grado
laboratorio (distillata o R.O.) (1:20). Miscelare bene. Per una piastra ELISA da 96 pozzetti
sono necessari circa 400 ml di soluzione di lavaggio.
PREPARAZIONE DELLA SOLUZIONE DEL SUBSTRATO
La soluzione del substrato (ABTS) è pronta per l’uso. Ciascuna piastra richiede circa
11 ml di soluzione del substrato. Per ottenere i risultati migliori, la soluzione del substrato
deve essere equilibrata a temperatura ambiente prima dell’uso.
PREPARAZIONE DELLA SOLUZIONE DI ARRESTO 1X
Diluire 2,5 ml di soluzione di arresto concentrata (S) in 10 ml di acqua di grado laboratorio
(distillata o R.O.) (1:5). Miscelare bene. Per una piastra ELISA da 96 pozzetti sono
necessari circa 12,5 ml di soluzione di arresto.
NOTA: La conservazione della soluzione di arresto (S) 5X a temperature di
refrigerazione può causare la formazione di un precipitato bianco.
Questo fenomeno non influenza l’integrità del prodotto. Per dissolvere
eventuali precipitati, lasciare che la soluzione di arresto 5X (S) raggiunga la
temperatura ambiente o scaldarla a 37°C prima dell’uso.
13
30035200.indd 13
5/8/14 11:30 AM
PROCEDURA DEL TEST ELISA
PREPARAZIONE DELLA PIASTRA PER IL TEST
a) Estrarre la piastra del test rivestita con antigene (o il necessario numero di strisce,
se non è richiesta una piastra intera) dalla busta che la contiene e contrassegnare la
sequenza di campioni sulla piastra secondo quella della piastra di diluizione descritta
in precedenza.
b)Aggiungere 50 µl di diluente del campione (SD) in tutti i pozzetti della piastra del test.
c) Mediante una pipetta a 8 o 12 canali trasferire 50 µl/pozzetto di ciascun campione
di siero diluito e controllo dalla piastra di diluizione del campione ai corrispondenti
pozzetti della piastra del test rivestita, che conterranno così una diluizione finale 1:40.
Eliminare i puntali della pipetta dopo il trasferimento di ciascuna riga di campioni.
d) Incubare la piastra per 30 minuti (± 5 min) a temperatura ambiente (23°C ± 5°C).
PROCEDURA DI LAVAGGIO
e) Eliminare, manualmente o con un apparecchio per il lavaggio delle piastre, il
contenuto di ciascun pozzetto in un appropriato contenitore di scarico.
f) Aggiungere a ciascun pozzetto circa 300 µl della soluzione di lavaggio 1X,
utilizzando una pipetta a 8 o 12 canali (o un dispositivo automatico).
g) Lasciare agire la soluzione di lavaggio 1X nei pozzetti per 10-15 secondi e poi
svuotarli in un appropriato contenitore di scarico.
h) Ripetere la procedura di lavaggio altre 2 volte. Dopo il lavaggio finale, capovolgere
la piastra e scuoterla leggermente su tovaglioli di carta assorbente.
NOTA: La procedura di lavaggio è un passaggio molto critico in qualsiasi test
ELISA. Osservare quindi scrupolosamente i passaggi sopra indicati.
AGGIUNTA DEL CONIUGATO 1X, DEL SUBSTRATO E DELLA SOLUZIONE DI
ARRESTO
i)Aggiungere a ciascun pozzetto 100 µl di coniugato diluito (preparato come sopra
descritto), utilizzando una pipetta a 8 o 12 canali (o un dispositivo automatico).
Eliminare i puntali della pipetta.
j) Incubare per 30 minuti (± 5 min) a temperatura ambiente (23°C ± 5°C).
k) Ripetere la PROCEDURA DI LAVAGGIO sopra indicata (passaggi da “e” ad “h”).
l)Aggiungere a ogni pozzetto 100 µl di soluzione del substrato (ABTS), utilizzando
una pipetta a 8 o 12 canali (o un dispositivo automatico). Eliminare i puntali della
pipetta.
m) Incubare per 15 minuti (± 1 min) a temperatura ambiente (23°C ± 5°C).
n) Aggiungere a ogni pozzetto 100 µl di soluzione di arresto 1X (preparata come
sopra descritto), utilizzando una pipetta a 8 o 12 canali (o un dispositivo automatico).
o) Leggere la piastra mediante un lettore per piastre ELISA impostato a 405-410 nm.
Prima di leggere i risultati, lasciar scomparire le eventuali bollicine presenti.
RISULTATI
Controllo di qualità
I risultati del test ELISA sono validi quando il valore medio della densità ottica (OD) del
siero di controllo negativo è inferiore a 0,25 e quando il valore del controllo positivo è
compreso tra 0,40 e 1,20. Se uno di questi due valori è fuori dall’intervallo consentito,
i risultati del test vanno considerati non validi e i campioni devono essere nuovamente
analizzati.
Elaborazione manuale dei dati
a) Calcolare il valore medio della densità ottica (OD) del siero di controllo negativo,
utilizzando i valori dei pozzetti A3 e A4. Calcolare il valore medio della densità ottica
(OD) del siero di controllo positivo, utilizzando i valori ottenuti dai pozzetti A1 e A2.
Registrare entrambe le medie.
30035200.indd 14
14
5/8/14 11:30 AM
b) Sottrarre il valore medio della OD del controllo negativo al valore medio della OD del
controllo positivo. La differenza rappresenta la OD corretta del controllo positivo.
c) Calcolare il rapporto fra ciascun campione e il controllo positivo (S/P), sottraendo
prima il valore medio della OD del controllo negativo al valore della OD di ciascun
campione e dividendo poi tale differenza per il valore corretto della OD del controllo
positivo secondo la seguente equazione:
S/P=(OD DEL CAMPIONE) – (OD MEDIA DEL CONTROLLO NEGATIVO)
OD CORRETTA DEL CONTROLLO POSITIVO
Esempio:
1. Esempio per i valori OD del controllo positivo:
0,585 e 0,605
Media = (0,585 + 0,605) / 2 = 0,595
2. Esempio per i valori OD del controllo negativo:
0,072 e 0,062
Media = (0,072 + 0,062) / 2 = 0,067
3. OD corretta del controllo positivo:
(0,595) – (0,067) = 0,528
4. Esempio di calcolo del rapporto S/P:
OD del campione = 0,560
(0,560) – (0,067) / 0,528 = 0,934
Interpretazione dei risultati
I valori del rapporto S/P del test ELISA per ParaTB e/o valori del titolo ELISA ottenuti per i
campioni di siero devono essere interpretati utilizzando i seguenti intervalli di valori:
Rapporto campione/
controllo positivo (S/P)
< 0,70
≥ 0,70
Stato anticorpale
ParaTB presunto
Negativo (a)
Positivo (b)
a. Negativo: campioni di siero con un valore del rapporto S/P ParaTB < 0,70 vengono
classificati come negativi agli anticorpi. Tuttavia, una serie di fattori (per es. eventuali
variazioni dovute a caratteristiche biologiche e/o antigeniche atipiche, prevalenza di
ParaTB entro la mandria e momento e distribuzione delle procedure di prelievo dei
campioni di siero) possono portare a risultati negativi del test ELISA in una mandria
infettata. Si raccomanda perciò di considerare negativa una mandria solo nei casi
seguenti:
(1) se la mandria è stata sottoposta a prelievi adeguati e i test ELISA ripetuti diverse
volte hanno dato ogni volta risultati negativi e;
(2) se la mandria è stata sottoposta a prelievi adeguati e i test con metodi
convenzionali (coltura, PCR ecc.) hanno dato ogni volta risultati negativi;
b. Positivo: campioni di siero con un valore del rapporto S/P ParaTB ≥ 0,70 vengono
classificati come positivi agli anticorpi. Per confermare in una mandria la diagnosi di
infezione da ParaTB basata sul test ELISA per la ParaTB sono necessari ulteriori test
di conferma condotti con tecniche convenzionali sugli stessi campioni.
15
30035200.indd 15
5/8/14 11:30 AM
Folleto de instrucciones del kit de diagnóstico de anticuerpos
Kit de diagnóstico in vitro para la detección de anticuerpos frente a
M. a. paratuberculosis en suero y plasma de bovinos
INFORMACIÓN GENERAL Y USOS PREVISTOS
La enfermedad de Johne es causada por Mycobacterium avium subespecie
paratuberculosis. Es una enteritis crónica contagiosa caracterizada por una diarrea
persistente y progresiva, pérdida de peso, debilitamiento y finalmente, la muerte. Afecta
a todo tipo de rumiantes de todo el mundo. Los animales infectados eliminan grandes
cantidades del microorganismo en las heces. La infección se adquiere por ingestión de
alimentos y agua contaminados. Los terneros lactantes se infectan poco después de
nacer al entrar en contacto con las ubres contaminadas con heces, por la presencia de
microorganismos en el calostro o en la leche, o en corrales contaminados. La infección
presenta una incidencia máxima en los animales de menos de 2 años de edad; después,
su resistencia aumenta. El microorganismo infecta los macrófagos de la mucosa del
intestino delgado y los ganglios linfáticos asociados. Si la respuesta inmunitaria celular no
consigue destruirlo, el microorganismo sigue multiplicándose hasta causar una enteritis
crónica que provoca la eliminación del microorganismo por las heces, evidencia de
debilitamiento y el correspondiente cuadro clínico. La infección precoz puede hacer que
tarde meses o años en ser detectable mediante un cultivo del microorganismo en las
heces o mediante una elevación apreciable de anticuerpos contra Mycobacterium.
Este Kit SERELISA® es una prueba de diagnóstico rápido y específico, para detectar
anticuerpos contra Mycobacterium avium paratuberculosis (ParaTB) en muestras de
suero o plasma bovino.
El principio de la prueba es el siguiente: el suero procedente de rebaños de ganado
vacuno expuestos al antígeno ParaTB contiene anticuerpos específicos contra ParaTB. El
suero, diluido con el diluyente del kit (que contiene extractos de Mycobacterium phlei), se
introduce en pocillos revestidos de antígeno. Los anticuerpos específicos que contiene el
suero forman un complejo antígeno-anticuerpo con el antígeno unido a la placa. Tras
lavar la placa, se añade un conjugado de IgG monoclonal anti-bovino y peroxidasa HRP a
cada pocillo. El complejo antígeno-anticuerpo que queda del paso anterior se une con el
conjugado. Tras un breve periodo de incubación, se elimina el conjugado que no se ha
fijado mediante un segundo lavado. Se añade un sustrato que contiene un indicador
(ABTS) a cada pocillo. En presencia de la enzima peroxidasa el indicador cambia de color
(de incoloro a verde azulado). La intensidad relativa del color que se genera en 15
minutos (comparada con los controles) es directamente proporcional a la concentración
de anticuerpos en el suero. Después de incubar el sustrato, se añade solución de parada
a cada pocillo para detener la reacción y se lee la placa mediante un lector de ELISA a
405-410 nm.
REACTIVOS NECESARIOS PARA HACER 92 PRUEBAS
a) 1 placa revestida con antígeno ParaTB
b) 20 ml de diluyente de muestras (SD)
c) 10 µl de suero de control negativo 40X (N)
d) 10 µl de suero de control positivo 40X (P)
e) 110 µl de solución de conjugado IgG anti-bovino y HRP 100X (C)
f) 11 ml de diluyente de conjugado (CD)
g) 20 ml de solución de lavado 20X (W)
h) 11 ml de solución de sustrato ABTS (ABTS)
i) 2,5 ml de solución de parada 5X (S)
¡ANTES DE USAR, PERMITIR QUE LOS REACTIVOS ALCANCEN LA
TEMPERATURA AMBIENTE!
30035200.indd 16
16
5/8/14 11:30 AM
EQUIPO Y MATERIALES NECESARIOS PERO NO INCLUIDOS EN EL KIT
a) Pipeta de precisión (p. ej. pipeta de 1-20 µl)
b) Pipetas y puntas de 0,2 ml, 1,0 ml y 5,0 ml
c) Pipeta de 8 o 12 canales (o dispositivo automático)
d) 2 probetas graduadas (100 ml y 1000 ml)
e) Tubos de ensayo de vidrio borosilicatado de 1 ml o 5 ml
f) Placas de 96 pocillos de baja adherencia y sin revestimiento
g) Agua de grado laboratorio (destilada u ósmosis inversa [RO])
h) Espectrofotómetro para leer placas de 96 pocillos con filtro de 405-410 nm
i) Aparato para lavar placas (manual o automático)
j) Recipiente para desechos con lejía u otro agente oxidante
ADVERTENCIAS A LOS USUARIOS DE LOS REACTIVOS Y LAS PLACAS
REVESTIDAS DE ANTÍGENO
a) Manipular todos los reactivos y muestras como material de riesgo biológico.
b) Evitar que los reactivos entren en contacto con la piel o los ojos. Si se produce algún
contacto, lavar inmediatamente las zonas afectadas con agua fría.
c) La solución de lavado, los sueros de control, las placas de ensayo, las muestras
de campo y los demás reactivos del kit se deben descontaminar de acuerdo a los
requisitos indicados por la normativa vigente.
d) Tener especial cuidado de no contaminar ningún reactivo de prueba con suero o
bacterias.
e) Con cada placa se suministran indicadores de humedad. Si alguno de ellos presenta
un color rosado, puede que la placa esté afectada de alguna forma. Debe ser
descontaminada (p. ej. lavándola con una solución de lejía) y desechada.
f) Los mejores resultados se consiguen siguiendo los protocolos que se describen a
continuación, aplicando una técnica laboratorial buena y segura.
g) No utilizar este kit después de la fecha de caducidad.
h) NO PIPETEAR NUNCA CON LA BOCA.
Frases de riesgo y de seguridad:
R22: Nocivo por ingestión.
R36/38: Irrita los ojos y la piel.
S26: En caso de contacto con los ojos, lavarlos de inmediato con agua abundante y
solicitar atención médica.
S30: No echar jamás agua a este producto.
S36: Usar ropa protectora adecuada.
NOTA: Conservar los reactivos del kit en refrigeración entre 2° y 7°C. Los
reactivos no se deben congelar.
RECOLECCIÓN DE MUESTRAS
Para obtener resultados fiables es necesario aplicar métodos adecuados de recolección
de muestras, así como de extracción y conservación del suero (4°C para conservar
hasta cuatro días ó -20°C para periodos más largos). Analizar solamente suero de buena
calidad (sin contaminación bacteriana, sin hemólisis intensa ni grumos de grasa, etc.). En
caso de duda, obtener otra muestra de mejor calidad.
PROCEDIMIENTO DE DILUCIÓN DE LAS MUESTRAS
Diluir las muestras de suero usando el diluyente de muestras (SD) en una placa de
microtitulación de 96 pocillos, limpia y sin revestimiento. Antes de diluirlas, las muestras
deben estar completamente descongeladas y mezcladas.
17
30035200.indd 17
5/8/14 11:30 AM
PREPARACIÓN DE LA PLACA DE DILUCIÓN DE LAS MUESTRAS
a)Añadir 95 µl de diluyente de muestras (SD) a cada pocillo de una placa de
microtitulación de 96 pocillos sin revestimiento. Esta placa se denominará placa de
dilución de muestras.
b)Añadir 5 µl de muestra para analizar en cada pocillo (para obtener una dilución de
1:20). Empezar en el pocillo A5 y terminar en el H12 (desplazándose de izquierda a
derecha y de arriba abajo por las filas). Por ejemplo, los pocillos 1 a 30 contendrán
los sueros diluidos del rebaño 1, los pocillos 31 a 60 los del rebaño 2, etc.
c)Añadir 5 µl de suero de control negativo (N) (para obtener una dilución de 1:20) a los
pocillos A3 y A4.
d)Añadir 5 µl de suero de control positivo (P) (para obtener una dilución de 1:20) a los
pocillos A1 y A2.
e) Dejar reposar los sueros diluidos con el diluyente de muestras durante 5 minutos
antes de transferirlos a la placa revestida de antígeno para ELISA.
MODO ALTERNATIVO DE PREPARACIÓN DE MUESTRAS Y CONTROLES
No se necesita una placa de transferencia para analizar volúmenes pequeños.
Todas las muestras y controles del kit se pueden diluir a 1:40 con diluyente de
muestras en viales apropiados o en tubos cónicos (mezclar bien, preferentemente
con un movimiento circular) y añadir directamente a los pocillos de análisis para
empezar con los primeros 30 minutos de incubación. Asegurarse de volver a
guardar los pocillos sin usar en la bolsa con cierre y con material secante para su
conservación.
PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN CON CONJUGADO
El conjugado de HRP con IgG monoclonal anti-bovino se suministra a una concentración
100X con estabilizador HRP. Diluir 110 µl de solución de conjugado (C) en 10.89 ml
de diluyente de conjugado (CD) para obtener una dilución final de 1:100. Mezclar bien,
preferentemente con un movimiento circular. Esta preparación de 11 ml proporcionará
conjugado suficiente para una placa de ELISA de 96 pocillos.
PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE LAVADO 1X
Diluir 20 ml de solución concentrada de lavado (W) en 380 ml de agua de grado
laboratorio (destilada o RO) (1:20). Mezclar bien. Se necesitan aproximadamente 400 ml
de solución de lavado para cada placa de ELISA de 96 pocillos.
PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE SUSTRATO
La solución de sustrato (ABTS) está lista para su uso. Cada placa necesitará
aproximadamente 11 ml de solución de sustrato. Para obtener resultados óptimos, la
solución de sustrato debe alcanzar la temperatura ambiente antes de su uso.
PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE PARADA 1X
Diluir 2,5 ml de solución de parada concentrada (S) en 10 ml de agua de grado
laboratorio (destilada o RO) (1:5). Mezclar bien. Se necesitan aproximadamente 12,5 ml
de solución de parada para cada placa de ELISA de 96 pocillos.
NOTA: Durante la conservación en refrigeración, la solución de parada 5X (S)
puede solidificar teniendo la apariencia de un sólido blanco. Eso no afecta
el rendimiento del producto. Dejar que la solución de parada 5X (S) alcance
la temperatura ambiente ó 37°C antes de usarla para que se disuelva
cualquier sólido que contenga.
30035200.indd 18
18
5/8/14 11:30 AM
PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA ELISA
PREPARACIÓN DE LA PLACA DE ENSAYO
a) Extraer una placa de ensayo revestida de antígeno (o el número de tiras necesarias
si no se necesita una placa completa) de la bolsa y etiquetarla igual que la placa de
dilución de muestras antes citada.
b)Añadir 50 µl de diluyente de muestras (SD) a los pocillos de la placa de ensayo.
c) Con una pipeta de 8 o 12 canales, transferir 50 µl/pocillo de cada muestra de suero
y de control diluidos, desde la placa de dilución de muestras a los correspondientes
pocillos de la placa de ensayo revestida (proporciona una dilución final de 1:40).
Eliminar las puntas de las pipetas tras transferir cada línea de muestras.
d) Incubar la placa durante 30 minutos (± 5 min) a temperatura ambiente
(23°C ± 5°C).
PROCEDIMIENTO DE LAVADO
e) Eliminar el contenido de cada pocillo en un recipiente de desecho adecuado, ya sea
a mano o con un aparato de lavado automático.
f)Dispensar aproximadamente 300 µl/pocillo de solución de lavado 1X usando una
pipeta de 8 o 12 canales (o un dispositivo automático).
g) Dejar que la solución de lavado 1X empape los pocillos de 10 a 15 segundos y
después eliminarla en un recipiente de desecho adecuado.
h) Repetir el procedimiento de lavado otras dos veces. Invertir y secar la placa tras
el lavado final.
NOTA: El procedimiento de lavado es un paso fundamental en cualquier prueba
ELISA. Seguir los pasos citados tal como se indica.
ADICIÓN DE SOLUCIONES DE CONJUGADO 1X, DE SUSTRATO Y DE PARADA
i)Dispensar 100 µl/pocillo de solución de conjugado diluida (preparada como se ha
descrito antes) usando una pipeta de 8 o 12 canales (o un dispositivo automático).
Eliminar las puntas de las pipetas.
j) Incubar durante 30 minutos (± 5 min) a temperatura ambiente (23°C ± 5°C).
k) Repetir el PROCEDIMIENTO DE LAVADO anterior (pasos e hasta h).
l)Dispensar 100 µl/pocillo de solución de sustrato (ABTS) usando una pipeta de 8 o
12 canales (o un dispositivo automático). Eliminar las puntas de las pipetas.
m) Incubar la placa durante 15 minutos (± 1 min) a temperatura ambiente
(23°C ± 5°C).
n)Dispensar 100 µl/pocillo de solución de parada 1X (preparada como se ha descrito
antes) usando una pipeta de 8 o 12 canales (o un dispositivo automático).
o) Leer la placa con un lector de placas ELISA ajustado a 405-410 nm. Antes de leer la
placa, dejar que desaparezcan todas las burbujas.
RESULTADOS
Valores de los controles del análisis
Se obtienen resultados ELISA válidos cuando la densidad óptica media (OD) del suero
de control negativo es inferior a 0,25 y la del control positivo está entre 0,40 y 1,20.
Si cualquiera de estos dos valores estuviera fuera de su rango, los resultados de la
prueba se deben considerar inválidos y se debe volver a analizar las muestras.
Procesado manual de los datos
a) Calcular la media de la absorbancia o densidad óptica (OD) del suero del control
negativo usando los valores de los pocillos A3 y A4. Calcular la OD del suero del
control positivo usando los valores obtenidos de los pocillos A1 y A2. Anotar ambas
medias.
b) Restar la media de OD del control negativo de la media de OD del control positivo.
La diferencia es el control positivo corregido.
19
30035200.indd 19
5/8/14 11:30 AM
c) Calcular el cociente Muestra:Control positivo (S/P) restando la OD media del control
negativo de la OD de cada muestra. La diferencia se divide entre el control positivo
corregido. Aplicar la siguiente ecuación:
S/P= (OD DE LA MUESTRA) - (OD MEDIA DEL CONTROL NEGATIVO)
CONTROL POSITIVO CORREGIDO
Ejemplo:
1. Ejemplo de OD de control positivo:
0,585 y 0,605
Media = (0,585 + 0,605) / 2 = 0,595
2. Ejemplo de OD de control negativo:
0,072 y 0,062
Media = (0,072 +0,062) / 2 = 0,067
3. Control positivo corregido:
(0,595) – (0,067) = 0,528
4. Ejemplo de cálculo de S/P:
OD de la muestra = 0,560
(0,560) – (0,067) / 0,528 = 0,934
Interpretación de los resultados
Los valores del cociente S/P ParaTB ELISA y los valores de título de ELISA obtenidos
para los sueros se interpretan según los rangos siguientes:
Muestra:Control positivo
Cociente (S/P)
< 0,70
≥ 0,70
Presunción de ParaTB
Presencia de anticuerpos
Negativa (a)
Positiva (b)
a. Negativa: Se estima que las muestras de suero con un cociente S/P ParaTB < 0,70
no contienen anticuerpos. Sin embargo, existen diversos factores que pueden hacer
que un rebaño infectado obtenga resultados negativos en una prueba de ELISA,
como posibles situaciones en las que los animales muestren propiedades biológicas
o antigénicas atípicas, la prevalencia de ParaTB en un rebaño, o el ritmo y la
aleatoriedad en el proceso de recolección de muestras. Por eso se recomienda que
solamente se considere negativo un rebaño después que:
(1) se hayan hecho los muestreos correctamente y se hayan analizado varias
veces, obteniendo cada vez un resultado ELISA negativo y
(2) se hayan hecho los muestreos correctamente y se hayan analizado varias veces
con métodos convencionales estándar (cultivo, PCR, etc.), obteniendo cada vez
un resultado negativo.
b. Positiva: Se estima que las muestras de suero con un cociente S/P ParaTB ≥ 0,70
contienen anticuerpos. Cuando un rebaño da un resultado presuntamente positivo
a anticuerpos de ParaTB con el método ELISA, es necesario hacer más análisis de
confirmación con métodos estándar con nuevas muestras antes de confirmar un
diagnóstico positivo de ParaTB.
30035200.indd 20
20
5/8/14 11:30 AM
Mycobacterium Paratuberculosis Bula com orientações
do Kit para Teste de Anticorpos
Kit diagnóstico in vitro para a detecção de anticorpos contra
M. a. paratuberculosis em amostras de soro e plasma de bovinos
INFORMAÇÕES GERAIS E USOS PRETENDIDOS
A doença de Johne, causada por Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis,
é uma enterite crônica e contagiosa caracterizada por diarreia persistente e progressiva,
perda de peso, debilitação e, em última instância, morte. Pode afetar todos os ruminantes
no mundo todo. O organismo é eliminado em grande número nas fezes de animais
infectados. A infecção é adquirida pela ingestão de alimentos e água contaminada.
Bezerros lactentes são infectados logo após o nascimento através de úberes
contaminados por fezes, presença de organismos no colostro, leite, ou baias infectadas.
A maior incidência de infecção ocorre em animais com menos de 2 anos de idade onde a
resistência tardia ainda não é tão forte. Os organismos infectam macrófagos na mucosa
do intestino delgado e linfonodos associados. Se não forem eliminados por uma resposta
imune mediada por células, os organismos continuam a se multiplicar causando enterite
crônica, levando à expulsão de organismos pelas fezes, evidência de perdas e doença
clínica. A infecção precoce pode levar meses a anos para se tornar mensurável pela
cultura de organismos nas fezes ou por um aumento detectável de anticorpos contra o
Mycobacterium.
O Kit SERELISA® é um teste de triagem rápida e presuntiva específica para a
detecção de anticorpos contra o Mycobacterium avium paratuberculosis (ParaTB) em
amostras de soro ou plasma bovino.
O principio deste teste é o seguinte: O soro obtido de rebanhos bovinos expostos
a antígenos do ParaTB contém anticorpos específicos de ParaTB. O soro, diluído em
Diluente da Amostra (contendo extratos de Mycobacterium phlei), é adicionado aos poços
revestidos de antígeno. O anticorpo específico no soro forma um complexo antígenoanticorpo com o antígeno ligado à placa. Após lavar a placa, um conjugado de peroxidase
(HRP) e anti-IgG bovino monoclonal é adicionado a cada poço. O complexo antígenoanticorpo remanescente da etapa anterior se liga ao conjugado. Após um breve período
de incubação, o conjugado não ligado é removido por uma segunda etapa de lavagem.
O substrato, que contém um cromógeno (ABTS), é adicionado a cada poço. Na presença
da enzima peroxidase o cromógeno muda de cor, de transparente para azul esverdeado.
A intensidade relativa da cor desenvolvida em 15 minutos (comparada aos controles) é
diretamente proporcional ao nível de anticorpos no soro. Após o substrato ser incubado,
uma Solução de Interrupção é adicionada a cada poço para interromper a reação e a
placa é lida usando um leitor de placa de ELISA a 405-410 nm.
REAGENTES NECESSÁRIOS PARA REALIZAR 92 TESTES
a) 1 placa revestida de antígeno ParaTB
b) Diluente das Amostras (SD) 20 ml
c) Soro de Controle Negativo 40X (N) 10 μl
d) Soro de Controle Positivo 40X (P) 10 μl
e) Solução de Conjugado HRP e antigo bovino 100X (C) 110 μl
f) Diluente do Conjugado (CD) 11 ml
g) Solução de Lavagem 20X (W) 20 ml
h) Solução Substrato ABTS (ABTS) 11 ml
i) Solução de Interrupção 5X (S) 2,5 ml
DEIXE TODOS OS REAGENTES ATINGIREM A TEMPERATURA AMBIENTE ANTES
DE COMEÇAR!
21
30035200.indd 21
5/8/14 11:30 AM
EQUIPAMENTOS E MATERIAIS NECESSÁRIOS, MAS NÃO FORNECIDOS
a) Pipeta de alta precisão (isto é, pipeta de 1-20 microlitros)
b) Pipetas e ponteiras de 0,2 ml, 1,0 ml e 5,0 ml
c) Pipeta de 8 ou 12 canais (ou dispositivo automático)
d) 2 cilindros graduados (100 ml e 1000 ml)
e) Tubos de ensaio de vidro borosilicado de 1 ml ou 5 ml
f) Placas de teste de 96 poços não revestidos de baixa ligação
g) Água de grau laboratorial (destilada ou obtida por osmose reversa (OR))
h) Espectrofotômetro de leitura de placas de 96 poços com filtro de 405-410 nm
i) Equipamento para de lavagem de placas (manual ou automatizado)
j) Recipiente para descarte com alvejante ou outro agente oxidante
AVISOS AOS USUÁRIOS DE REAGENTES E PLACAS REVESTIDAS DE
ANTÍGENOS
a) Manuseie todos os reagentes e amostras como se fossem materiais que apresentam
riscos biológicos.
b) Evite o contato dos reagentes com a pele e os olhos. Caso ocorra exposição, lave
imediatamente as áreas afetadas com água fria.
c) Solução de lavagem, soros de controle, placas de teste, amostras de campo, e todos
os outros reagentes do kit do teste devem ser adequadamente descontaminados de
acordo com os requisitos regulamentare, antes do descarte.
d) Tome cuidado especial para não contaminar nenhum dos reagentes do teste com
soro ou agentes bacterianos.
e) Indicadores de umidade são fornecidos com cada placa. Se algum dos indicadores
exibir uma coloração rosa, a placa pode estar comprometida de alguma forma;
descontamine-a (isto é, lave a placa com solução alvejante) e descarte a placa.
f) Os melhores resultados são obtidos seguindo-se os protocolos como descritos
abaixo, usando técnicas laboratoriais boas e seguras.
g) Não use esse kit após a data de validade.
h) NUNCA PIPETE OS REAGENTES COM A BOCA.
Frases de risco e de segurança:
R22: Nocivo se ingerido.
R36/38: Irritante aos olhos e à pele.
S26: Em caso de contato com os olhos, lavar imediatamente com bastante água e
procurar assistência médica.
S30: Não adicionar água ao produto em nenhuma circunstância.
S36: Use roupas de proteção adequada.
NOTA: Armazene todos os reagentes fornecidos no kit a 2-7°C. Os reagentes não
devem ser congelados.
COLETA DE AMOSTRAS
Para se obter resultados confiáveis, são necessários procedimentos adequados de
coleta de amostras, obtenção de soro e armazenamento de amostras de soro (a 4°C
por até quatro dias ou -20°C para períodos mais longos). O teste deve ser realizado
exclusivamente em amostras de soro de boa qualidade (isto é, evite amostras que
apresentam contaminação bacteriana, hemólise intensa ou grumos de gordura). Quando
em dúvida, obtenha uma amostra de melhor qualidade.
PROCEDIMENTO PARA DILUIÇÃO DE AMOSTRAS
Dilua as amostras de soro usando o Diluente de Amostras (SD) em uma placa de
microtitulação de 96 poços, não revestida e limpa, para transferência. Amostras de soro
congeladas devem ser completamente descongeladas e rigorosamente misturadas antes
de diluir.
30035200.indd 22
22
5/8/14 11:30 AM
PREPARO DA PLACA DE DILUIÇÃO DA AMOSTRA
a)Adicione 95 µL de Diluente de Amostra (SD) em cada poço de uma placa de
microtitulação não revestida de 96 poços. Esta placa é referida como a placa de
diluição de amostras.
b)Adicione 5 µL de amostra de teste a cada poço (produzindo uma diluição 1:20).
Inicie com o poço A5 e termine com o poço H12 (movendo da esquerda para a
direita, fila por fila de poços). Por exemplo, os poços 1 a 30 contêm o soro diluído do
rebanho 1, os poços 31-60 contêm o soro diluído do rebanho 2, etc.
c)Adicione 5 µL de Soro de Controle Negativo (N) (produzindo uma diluição 1:20) aos
poços A3 e A4.
d)Adicione 5 µL de Soro de Controle Positivo (P) (produzindo uma diluição 1:20) aos
poços A1 e A2.
e) Deixe que todos os soros diluídos equilibrem no Diluente da Amostra por 5 minutos
antes de transferir para a placa de ELISA revestida com antígeno.
PREPARO ALTERNATIVO DE AMOSTRAS E DE CONTROLES
Não é necessária uma placa de transferência para testes de volumes pequenos.
Todas as amostras e controles do kit podem ser diluídos a 1:40, com o Diluente
de Amostras em frascos apropriados ou tubos cônicos (misture bem, preferivelmente
usando um agitador vórtex) e adicionadas diretamente aos poços do teste para
iniciar a primeira incubação de 30 minutos. Certifique-se de retornar qualquer poço
não utilizado à bolsa plástica com dessecante para armazenamento.
PREPARO DA SOLUÇÃO DO CONJUGADO
O conjugado de HRP e anti-IgG bovino monoclonal é fornecido como um concentrado
100 vezes em estabilizador HRP. Dilua 110 µL do estoque da Solução de Conjugado (C)
em 10.89 ml de Diluente do Conjugado (CD) para obter uma diluição final de 1:100.
Misture bem, de preferência usando um agitador vórtex. Esta preparação de 11 ml
fornecerá conjugado suficiente para uma placa de ELISA de 96 poços.
PREPARO DE SOLUÇÃO DE LAVAGEM PARA 1X
Dilua 20 ml de Solução de Lavagem concentrada (W) em 380 ml de água de grau
laboratorial (destilada ou obtida por RO) (1:20). Misture bem. Para cada placa de ELISA
de 96 poços são necessários aproximadamente 400 ml da Solução de Lavagem.
PREPARO DA SOLUÇÃO SUBSTRATO
A Solução Substrato (ABTS) está pronta para uso. Cada placa exigirá aproximadamente
11 ml de solução de substrato. Para melhores resultados, a solução de substrato deve
estar equilibrada à temperatura ambiente antes do uso.
PREPARO DE SOLUÇÃO DE INTERRUPÇÃO PARA 1 X
Dilua 2,5 ml de Solução de Interrupção concentrada (S) em 10 ml de água de grau
laboratorial (destilada ou obtida por RO) (1:5). Misture bem. Para cada placa de ELISA de
96 poços é necessário aproximadamente 12,5 ml da Solução de Interrupção.
OBSERVAÇÃO: O armazenamento da Solução de Interrupção 5X (S) em
temperaturas refrigeradas pode causar a formação de um sólido
branco. Isto não afeta o desempenho do produto. Deixe a Solução
de Interrupção 5X (S) aquecer até atingir a temperatura ambiente
ou 37°C antes do uso para dissolver quaisquer sólidos.
PROCEDIMENTO DO TESTE DE ELISA
COMO PREPAR A PLACA DE TESTE
a) Retire uma placa de teste revestida com antígeno (ou o número necessário de fitas
se não for necessário usar a placa inteira) da bolsa da placa e rotule de acordo com
a identificação da placa de diluição descrita acima.
23
30035200.indd 23
5/8/14 11:30 AM
b)Adicione 50 µL de Diluente de Amostra (SD) a todos os poços na placa de teste.
c) Usando uma pipeta de 8 ou 12 canais, transfira 50 µL/poço de cada uma das
amostras de soro e controles diluídos a partir da placa de diluição de amostras aos
poços correspondentes da placa de teste revestida (gera uma diluição final de 1:40).
Descarte as ponteiras de pipetas após transferir cada linha da amostra.
d) Incube a placa por 30 minutos (± 5 min) a temperatura ambiente (23°C ± 5°C).
PROCEDIMENTO DE LAVAGEM
e) Descarte os conteúdos de cada poço, manualmente ou utilizando uma lavadora
automática de placas, em um recipiente de descarte apropriado.
f)Distribua aproximadamente 300 µL/poço de Solução de Lavagem para 1X
usando uma pipeta de 8 ou 12 canais (ou dispositivo automático).
g) Deixe a solução de lavagem 1X embeber os poços por 10-15 segundos, e então
descarte os conteúdos em um recipiente de descarte apropriado.
h) Repita o procedimento de lavagem mais duas vezes. Após a lavagem final inverta
a placa e deixe-a secar sobre papel absorvente.
OBSERVAÇÃO: O procedimento de lavagem é uma etapa muito crítica em qualquer
teste de ELISA. Siga as etapas acima como orientado.
ADIÇÃO DE CONJUGADO, SUBSTRATO E SOLUÇÃO DE INTERRUPÇÃO 1 X
i)Distribua 100 µL/poço de Conjugado diluído (preparado como descrito acima)
usando uma pipeta de 8 ou 12 canais (ou dispositivo automático). Descarte as
ponteiras das pipetas.
j) Incube por 30 minutos (± 5 min) a temperatura ambiente (23°C ± 5°C).
k) Repita o PROCEDIMENTO DE LAVAGEM acima (etapa e até h).
l)Distribua 100 µL/poço de Solução de Substrato (ABTS) usando uma pipeta de 8 ou
12 canais (ou dispositivo automático). Descarte as ponteiras das pipetas.
m) Incube por 15 minutos (± 1 min) a temperatura ambiente (23°C ± 5°C).
n)Distribua 100 µL/poço de Solução de Interrupção 1X (preparada como descrito
acima) usando uma pipeta de 8 ou 12 canais (ou dispositivo automático).
o) Faça a leitura da placa usando um leitor de placas de ELISA ajustado para
405-410 nm. Antes de efetuar a leitura, deixe que as bolhas se dissipem.
RESULTADOS
Valores de Controle do Ensaio
Os resultados do ELISA são válidos quando o valor da densidade óptica média (D.O.) do
Soro Controle Negativo é menor que 0,25 e o valor do Controle Positivo está entre 0,40 e
1,20. Se algum destes valores estiver fora desse intervalo, os resultados do teste devem
ser considerados inválidos e as amostras devem ser testadas novamente.
Processamento manual dos dados
a) Calcule a densidade óptica de absorbância (D.O.) do Soro de Controle Negativo
usando os valores dos poços A3 e A4. Calcule a D.O. do Soro do Controle Positivo
usando os valores obtidos dos poços A1 e A2. Registre ambas as médias.
b) Subtraia a média da D.O. do Controle Negativo da média da D.O. do Controle
Positivo. A diferença é o Controle Positivo Corrigido.
c) Calcule a relação amostra para controle positivo (S/P) subtraindo a média da D.O.
do Controle Negativo de cada D.O. da amostra. A diferença é dividida pelo controle
positivo corrigido. Use o seguinte formato de equação:
S/P=(D.O. AMOSTRA) – (MÉDIA DE OD CONTROLE NEGATIVO)
CONTROLE POSITIVO CORRIGIDO
30035200.indd 24
24
5/8/14 11:30 AM
Exemplo:
1. Exemplo de D.O. de Controle Positivo:
0,585 e 0,605
Média = (0,585 + 0,605) / 2 = 0,595
2. Exemplo de D.O. de Controle Negativo:
0,072 e 0,062
Média = (0,072 + 0,062) / 2 = 0,067
3. Controle Positivo Corrigido:
(0,595) – (0,067) = 0,528
4. Exemplo de cálculo do valor S/P:
D.O. da amostra = 0,560
(0,560) – (0,067) / 0,528 = 0,934
Interpretação dos resultados
Os valores das relações ParaTB ELISA S/P e/ou valores de titulação de ELISA obtidos
para o soro devem ser interpretados usando os seguintes intervalos:
Amostra para Controle Positivo
Relação (S/P)
< 0,70
≥ 0,70
ParaTB presumido
Status de Anticorpos
Negativo (a)
Positivo (b)
a. Negativo: Amostras de soro com uma relação ParaTB S/P < 0,70 são
presumidamente negativos para anticorpos. Porém, diversos fatores, como possíveis
variações nas propriedades biológicas e/ou antigênicas, prevalência de ParaTB
dentro de um rebanho, Horário e aleatoriedade dos procedimentos de coleta de
amostras de soro podem resultar em um rebanho infectado gerando resultados
ELISA negativos. Portanto, recomenda-se que cada rebanho seja considerado
negativo apenas após:
(1) coleta adequada de amostras de cada rebanho e testes repetidos várias vezes,
sempre gerando resultados negativos por ELISA; e
(2) coletas adequadas de amostras de cada rebanho e testes repetidos várias
vezes por métodos convencionais padrão (cultura, PCR, etc.) e sempre gerando
resultados negativos.
b. Positivo: Amostras de soro com uma relação ParaTB S/P ≥ 0,70 são
presumidamente positivos para anticorpos. São necessárias confirmações adicionais
do teste em amostras coletadas de rebanhos presumidamente positivos para
anticorpos por ELISA de ParaTB, usando técnicas padrão, para confirmar um
diagnóstico positivo de uma infecção por ParaTB dentro de um rebanho.
25
30035200.indd 25
5/8/14 11:30 AM
Mycobacterium Paratuberculosis Antibody Test Kit Gebrauchsinformation
Die deutsche Gebrauchsinformation ist zugelassen entsprechend §17c TierSG Zulassungsnummer: FLI-B 621
In-vitro-Diagnostikum zum Nachweis von Antikörpern gegen
M. a. paratuberculosis in Serum- und Plasma-Proben von Rindern
ALLGEMEINE INFORMATIONEN UND VERWENDUNGSZWECK
Die Paratuberkulose (Johne‘sche Krankheit) ist eine chronische, ansteckende
Enteritis, die durch Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis verursacht wird.
Kennzeichnend für die Paratuberkulose sind unstillbare Durchfälle mit progredientem
Gewichtsverlust und schleichender Entkräftung, die schließlich zum Tod führen. Die
Krankheit tritt weltweit bei allen Wiederkäuerarten auf. Der Erreger wird in großen Mengen
in den Fäzes infizierter Tiere ausgeschieden. Die Infektion erfolgt durch die Aufnahme
von kontaminiertem Futter bzw. Wasser. Saugkälber werden bereits kurz nach der
Geburt über mit erregerhaltigem Kot verschmutzte Euter, erregerhaltiges Kolostrum bzw.
erregerhaltige Milch oder über kontaminierte Stallbuchten infiziert. Die Infektionsrate ist
am höchsten bei Tieren unter 2 Jahren; ältere Tiere sind widerstandsfähiger. Der Erreger
befällt die Makrophagen in der Dünndarmschleimhaut und die zugehörigen Lymphknoten.
Gelingt es der zellvermittelten Immunabwehr nicht, die Erreger zu eliminieren,
vermehren diese sich weiter und verursachen eine chronische Enteritis, die wiederum
zur Erregerausscheidung mit den Fäzes und zur klinischen Manifestation mit Anzeichen
zunehmender Schwäche führt. Vom Frühstadium der Infektion bis zur Nachweisbarkeit
des Erregers in den Fäzes bzw. einem erkennbaren Anstieg des Antikörpertiters gegen
Mycobacterium können Monate bis Jahre verstreichen.
Dieser SERELISA® Kit ist ein spezifischer Screening-Schnelltest zum Nachweis von
Antikörpern gegen Mycobacterium avium paratuberculosis (ParaTb) in bovinen Serumoder Plasmaproben.
Der Test beruht auf folgendem Prinzip: Serumproben von Rinderherden, die
Kontakt mit ParaTb-Antigenen hatten, enthalten spezifische ParaTb-Antikörper. Das
mit Probenverdünnungslösung (mit Mycobacterium phlei-Auszüge) verdünnte Serum
wird in antigenbeschichtete Vertiefungen einer Mikrotiterplatte pipettiert. Die im Serum
enthaltenen spezifischen Antikörper bilden mit dem an die Platte gebundenen Antigen
einen Antigen-Antikörper-Komplex. Nach einem Waschschritt wird jede Vertiefung
mit Anti-Rind-IgG-HRP-Peroxidase-Konjugat versetzt. Das Konjugat bindet an den
Antigen-Antikörper-Komplex aus dem ersten Schritt. Nach kurzer Inkubationszeit wird
nicht gebundenes Konjugat in einem zweiten Waschschritt entfernt. Danach wird jede
Vertiefung mit einem chromogenhaltigen (ABTS) Substrat versetzt. In Gegenwart der
Peroxidase erfolgt ein Farbumschlag des Chromogens von farblos nach blaugrün. Die
innerhalb von 15 Minuten entwickelte relative (gegenüber den Kontrollen) Farbintensität
verhält sich direkt proportional zur Antikörperkonzentration der Serumprobe. Nach
der Inkubation mit dem Substrat wird durch Zugabe von Stopplösung in die einzelnen
Vertiefungen die Reaktion abgebrochen; anschließend erfolgt die Messung in einem
ELISA-Photometer bei 405–410 nm.
ERFORDERLICHE REAGENZIEN FÜR 92 TESTS
a) 1 mit ParaTb-Antigen beschichtete Mikrotiterplatte
b) 20 ml Probenverdünnungslösung (SD)
c) 10 µl 40-fach konzentriertes negatives Kontrollserum (N)
d) 10 µl 40-fach konzentriertes positives Kontrollserum (P)
e) 110 µl 100-fach konzentrierte Anti-Rind-IgG-HRP-Konjugatlösung (C)
f) 11 ml Konjugat-Verdünnungslösung (CD)
30035200.indd 26
26
5/8/14 11:30 AM
g) 20 ml 20-fach konzentrierte Waschlösung (W)
h) 11 ml ABTS-Substratlösung (ABTS)
i) 2,5 ml 5-fach konzentrierte Stopplösung (S)
ALLE REAGENZIEN MÜSSEN BEI TESTBEGINN RAUMTEMPERATUR HABEN!
ZUSÄTZLICH BENÖTIGTE GERÄTE UND MATERIALIEN (NICHT IM LIEFERUMFANG
ENTHALTEN)
a) Präzisionspipette (Pipette für Volumina von 1–20 Mikroliter)
b) 0,2-, 1,0- und 5,0-ml-Pipetten mit entsprechenden Spitzen
c) 8- bzw. 12-Kanalpipette (oder Pipettierroboter)
d) 2 Messzylinder (100 ml und 1000 ml)
e) 1-ml- oder 5-ml-Reagenzgläser aus Borosilikatglas
f) Unbeschichtete Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit geringer Biomolekülbindung
g) Laborreines Wasser (destilliertes oder durch Umkehrosmose aufbereitetes [RO-]
Wasser)
h) Spektrophotometer für Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit Filter 405–410 nm
i) Plattenwaschvorrichtung (manuell oder automatisiert)
j) Flüssigabfallbehälter mit Natriumhypochloritlösung oder einem anderen
Oxidationsmittel
WARNHINWEISE FÜR DIE HANDHABUNG DER REAGENZIEN UND DER
ANTIGENBESCHICHTETEN PLATTEN
a) Die Reagenzien aus Kits verschiedener Chargen nicht mischen!
b) Alle Reagenzien und Proben sind gemäß den Vorschriften für biologisch gefährliche
Materialien zu behandeln.
c) Kontakt der Reagenzien mit Haut oder Augen vermeiden. Bei versehentlichem
Kontakt die betroffenen Stellen sofort mit kaltem Wasser abspülen.
d) Waschlösung, Kontrollseren, Testplatten, zu testende Proben und alle anderen
Reagenzien des Testkits müssen vor der Entsorgung ordnungsgemäß nach
regulatorischen Anforderungen dekontaminiert werden.
e) Insbesondere ist darauf zu achten, dass die Testreagenzien nicht mit Serum oder
bakteriellen Erregern verunreinigt werden.
f) Die Testplatten werden jeweils mit Feuchtigkeitsindikatoren geliefert. Ein nach rosa
umgeschlagener Indikator zeigt an, dass die Platte für den Test möglicherweise
nicht mehr brauchbar ist; in diesem Fall wird die Platte dekontaminiert (d. h. Mit
Natriumhypochloritlösung oder einem anderen Oxidationsmittel gewaschen) und
entsorgt.
g) Die bestmöglichen Ergebnisse erhalten Sie, wenn Sie bei der Testdurchführung
gemäß der nachfolgenden Anleitung vorgehen und die Grundregeln des genauen,
sicheren Arbeitens im Labor beachten.
h) Testkit nach Ablauf des Verfalldatums nicht mehr verwenden.
i) NICHT MIT DEM MUND PIPETTIEREN!
Risiko- und Sicherheitssätze:
R22: Gesundheitsschädlich beim Verschlucken.
R36/38: Reizt die Augen und die Haut.
S26: Bei Berührung mit den Augen gründlich mit Wasser abspülen und den Arzt
konsultieren.
S30: Niemals Wasser hinzugießen.
S36: Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung tragen.
HINWEIS: Alle im Kit enthaltenen Testreagenzien bei 2–7°C lagern. Reagenzien
nicht einfrieren.
27
30035200.indd 27
5/8/14 11:30 AM
PROBENNAHME
Die Zuverlässigkeit der Testergebnisse hängt ab von der sachgemäßen Probenentnahme,
Serumgewinnung und Serumprobenlagerung (Lagertemperatur: 4°C bei Lagerzeiten
bis zu vier Tagen, ‑20°C für längere Lagerzeiten). Führen Sie den Test nur mit qualitativ
einwandfreiem Serum durch (d. h. kein bakteriell verunreinigtes, stark hämolytisches oder
stark lipämisches Serum verwenden). Im Zweifelsfall sollte eine weitere Probe besserer
Qualität entnommen werden.
VERDÜNNUNG DER PROBE
Die Serumproben werden mit Probenverdünnungslösung (SD) in einer sauberen,
unbeschichteten Mikrotiter-Transferplatte mit 96 Vertiefungen verdünnt. Gefrorene
Serumproben vollständig auftauen und vor dem Verdünnen gut mischen.
VORBEREITUNG DER PROBENVERDÜNNUNGSPLATTE
a) In die Vertiefungen einer unbeschichteten Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen
werden jeweils 95 µl Probenverdünnungslösung (SD) vorgelegt. Diese Platte wird
nachfolgend als Probenverdünnungsplatte bezeichnet.
b) Pipettieren Sie nun 5 µl der zu testenden Proben in je eine Vertiefung (entspricht
einer Verdünnung von 1:20), beginnend bei A5 und endend mit H12. Auf diese Weise
liegen beispielsweise in den Vertiefungen 1 bis 30 die verdünnten Seren von Herde 1
vor, in den Vertiefungen 31 bis 60 die verdünnten Seren von Herde 2, usw.
c) Pipettieren Sie den Vertiefungen A3 und A4 jeweils 5 µl negatives Kontrollserum (N)
zu (ergibt eine Verdünnung von 1:20).
d) Pipettieren Sie den Vertiefungen A1 und A2 jeweils 5 µl positives Kontrollserum (P)
zu (ergibt eine Verdünnung von 1:20).
e) Die verdünnten Proben müssen sich vor der Übertragung in die antigenbeschichtete
ELISA-Platte 5 Minuten lang durchmischen können.
ALTERNATIVES VORGEHEN ZUR VORBEREITUNG VON PROBEN UND
KONTROLLEN
Bei einer kleinen Probenanzahl ist keine Transferplatte erforderlich. Alle Proben und
Kontrollen können sofort im Verhältnis 1:40 in geeigneten – auch konischen –
Reaktionsgefäßen mit der Probenverdünnungslösung verdünnt werden (gut mischen,
vorzugsweise mittels Vortexmischer) und zur ersten, 30-minütigen Inkubation
direkt in die Testvertiefungen pipettiert werden. Achten Sie darauf, dass nicht
verwendete Testplatten bzw. -streifen zur Aufbewahrung wieder zusammen mit dem
Trocknungsmittel in den wiederverschließbaren Beutel gepackt werden.
VORBEREITUNG DER KONJUGATLÖSUNG
Das HRP-konjugierte monoklonale Anti-Rind-IgG liegt 100-fach konzentriert in HRPStabilisatorlösung vor. Zur Herstellung der Gebrauchslösung mit einer Verdünnung
von 1:100 werden 110 µl dieser Stamm-Konjugatlösung (C) mit 10.89 ml KonjugatVerdünnungslösung (CD) verdünnt. Gut mischen, vorzugsweise mittels Vortexmischer.
Dieses 11-ml-Präparat enthält ausreichend Konjugat für eine ELISA-Platte mit
96 Vertiefungen.
VORBEREITUNG DER 1X-WASCHLÖSUNG
20 ml konzentrierte Waschlösung (W) in 380 ml laborreinem Wasser (destilliertes bzw.
RO-Wasser) verdünnen (1:20). Gut mischen. Pro ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen
werden ca. 400 ml Waschlösung benötigt.
VORBEREITUNG DER SUBSTRATLÖSUNG
Die Substratlösung (ABTS) liegt bereits gebrauchsfertig vor. Pro Platte werden ungefähr
11 ml Substratlösung benötigt. Optimale Testergebnisse lassen sich erzielen, wenn die
Substratlösung vor Gebrauch zunächst auf Raumtemperatur gebracht wird.
30035200.indd 28
28
5/8/14 11:30 AM
VORBEREITUNG DER 1-FACH-KONZENTRIERTEN STOPPLÖSUNG
2,5 ml konzentrierte Stopplösung (S) in 10 ml laborreinem Wasser (destilliertes bzw.
RO-Wasser) verdünnen (1:5). Gut mischen. Je ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen werden
ca. 12,5 ml Stopplösung benötigt.
HINWEIS: Bei Kühlschranklagerung der 5-fach konzentrierten Stopplösung
(S) kann sich ein weißer Niederschlag bilden. Dieser beeinträchtigt
nicht die Qualität des Produkts. Lassen Sie die 5-fach konzentrierte
Stopplösung (S) vor Gebrauch zunächst Raumtemperatur annehmen
bzw. erwärmen Sie sie auf 37°C auf, damit sich ein eventuell
vorhandener Niederschlag auflöst.
DURCHFÜHRUNG DES ELISA-TESTS
VORBEREITUNG DER TESTPLATTE
a) Entnehmen Sie dem Plattenbeutel eine antigenbeschichtete Testplatte (bzw.
die erforderliche Anzahl Streifen, falls keine ganze Platte erforderlich ist) und
protokollieren Sie die Plattenbelegung entsprechend der oben beschriebenen
Verdünnungsplatte.
b) Legen Sie 50 µl Probenverdünnungslösung (SD) pro Vertiefung vor.
c) Übertragen Sie mithilfe einer 8- bzw. 12-Kanal-Pipette jeweils 50 µl der verdünnten
Serumproben bzw. Kontrollen aus den Vertiefungen der Probenverdünnungsplatte
in die entsprechenden Vertiefungen der beschichteten Testplatte (Endverdünnung
1:40). Verwenden Sie dabei für jede Probenreihe neue Pipettenspitzen.
d) Platte 30 Minuten (± 5 min) bei Raumtemperatur inkubieren (23°C ± 5°C).
WASCHSCHRITT
e) Den Inhalt der einzelnen Vertiefungen entweder manuell oder mittels automatischer
Plattenwaschstation abpipettieren und in einem geeigneten Flüssigabfallbehälter
entsorgen.
f) Mithilfe einer 8- bzw. 12-Kanal-Pipette (oder eines Pipettierroboters) ca. 300 µl der
1x-Waschlösung in jede Vertiefung geben.
g)Waschlösung 10–15 Sekunden einwirken lassen, anschließend aus den
Vertiefungen abpipettieren und in einem geeigneten Flüssigabfallbehälter entsorgen.
h) Diesen Waschvorgang weitere 2 Male wiederholen. Nach dem letzten
Waschdurchgang Platte umdrehen und auf Papiertüchern leicht ausklopfen.
HINWEIS: Der Waschvorgang ist bei der Durchführung eines ELISA-Tests von
wesentlicher Bedeutung. Bitte halten Sie sich genau an die obigen
Anweisungen.
ZUFÜGEN VON 1X-KONJUGATLÖSUNG, SUBSTRATLÖSUNG UND STOPPLÖSUNG
i) Mithilfe einer 8- bzw. 12-Kanal-Pipette (oder eines Pipettierroboters) 100 µl der
verdünnten und gemäß obiger Beschreibung vorbereiteten Konjugatlösung in jede
Vertiefung geben. Pipettenspitzen abwerfen.
j) 30 Minuten (± 5 min) bei Raumtemperatur inkubieren (23°C ± 5°C).
k) Oben beschriebenen WASCHSCHRITT wiederholen (Schritte e bis h).
l) Mithilfe einer 8- bzw. 12-Kanal-Pipette (oder eines Pipettierroboters) 100 µl der
Substratlösung (ABTS) in jede Vertiefung geben. Pipettenspitzen abwerfen.
m) 15 Minuten (± 1 min) bei Raumtemperatur inkubieren (23°C ± 5°C).
n) Mithilfe einer 8- bzw. 12-Kanal-Pipette (oder eines Pipettierroboters) 100 µl der
gemäß obiger Beschreibung vorbereiteten 1x-Stopplösung in jede Vertiefung
geben.
o) Platte mithilfe eines ELISA-Photometers bei 405–410 nm messen. Vor der Messung
vorhandene Luftblasen entweichen lassen.
29
30035200.indd 29
5/8/14 11:30 AM
ERGEBNISSE
Qualitätskontrolle
Die Messergebnisse des ELISA sind gültig, wenn der OD-Durchschnittswert des
negativen Kontrollserums unter 0,25 und der OD-Durchschnittswert des positiven
Kontrollserums zwischen 0,40 und 1,20 liegt. Wenn einer dieser Werte außerhalb des
zulässigen Bereichs liegt, sind die Testergebnisse als ungültig zu betrachten und die
Proben erneut zu testen.
Manuelle Messdatenaufarbeitung
a) Berechnen Sie den Durchschnittswert der optischen Dichte (OD) des negativen
Kontrollserums aus den Messwerten der Vertiefungen A3 und A4. Berechnen Sie die
den OD-Durchschnittswert des positiven Kontrollserums aus den Messwerten der
Vertiefungen A1 und A2. Halten Sie beide Durchschnittswerte fest.
b) Ziehen Sie den OD-Durchschnittswert der Negativkontrolle vom
OD-Durchschnittswert der Positivkontrolle ab. Die Differenz entspricht der korrigierten
OD der positiven Kontrolle.
c) Berechnen Sie nun jeweils das Verhältnis Serumprobe/Positiv-Kontrolle (S/PRatio), indem Sie zunächst vom OD-Messwert jeder Probe den durchschnittlichen
OD-Wert der Negativkontrolle abziehen. Diese Differenz wird anschließend durch den
korrigierten OD-Wert der Positivkontrolle dividiert, gemäß der folgenden Gleichung:
S/P = (OD DER SERUMPROBE) – (DURCHSCHNITTLICHE OD
DER NEGATIVEN KONTROLLE)
KORRIGIERTE OD DER POSITIVEN KONTROLLE
Beispiel:
1. Beispiel für OD-Werte der positiven Kontrolle:
0,585 und 0,605
Durchschnittswert = (0,585 + 0,605) / 2 = 0,595
2. Beispiel für OD-Werte der negativen Kontrolle:
0,072 und 0,062
Durchschnittswert = (0,072 +0,062) / 2 = 0,067
3. Korrigierte positive Kontrolle:
(0,595) – (0,067) = 0,528
4. Beispiel für die Berechnung des S/P-Werts:
OD der Probe = 0,560
(0,560) – (0,067) / 0,528 = 0,934
Interpretation der Ergebnisse
Die in Serumproben ermittelten ParaTb-ELISA-S/P-Quotienten und/oder ELISA-Titer sind
anhand der folgenden Ergebnisbereiche zu interpretieren:
Serumprobe/Positivkontrolle-ParaTb
(S/P)-Verhältnis
Antikörperstatus
< 0,70
Negativ (a)
≥ 0,70
Positiv (b)
a. Negativ: Serumproben mit einem ParaTb-S/P-Verhältnis < 0,70 werden als
antikörpernegativ eingestuft. Allerdings können eine Reihe von Faktoren
(z. B. mögliche Schwankungen aufgrund atypischer biologischer und/oder antigener
Eigenschaften, ParaTb-Prävalenz innerhalb einer Herde sowie Zeitpunkt und
Verteilung der Probenahme innerhalb einer infizierten Herde) zu negativen ELISAErgebnissen führen. Es wird daher empfohlen, eine Herde nur dann als negativ
einzustufen, wenn die folgenden Kriterien zutreffen:
(1) Ausnahmslos negative ELISA-Ergebnisse in mehreren Testwiederholungen nach
adäquater Beprobung der Herde und
30035200.indd 30
30
5/8/14 11:30 AM
(2) Ausnahmslos negative Ergebnisse in wiederholten Tests mit herkömmlichen
Standardverfahren (Kultur, PCR, etc.) nach adäquater Beprobung der Herde.
b. Positiv: Serumproben mit einem ParaTb-S/P-Verhältnis ≥ 0,70 werden als
antikörperpositiv eingestuft. Das Vorliegen einer ParaTb-Infektion innerhalb einer
Herde muss zusätzlich durch ein Standard-Testverfahren an den Proben aus der
gemäß ParaTb-ELISA antikörperpositiven Herde gesichert werden.
31
30035200.indd 31
5/8/14 11:30 AM

Mycobacterium Paratuberculosis Antibody Test Kit

Transcript

Documenti analoghi

5M Paoloni Francese - Liceo Linguistico "A.MANZONI"

The Art of Ecstasy – Juvarra and Legros in the Antamori Chapel at

Plakaten

Bei den Herren ist wieder längeres Deckhaar angesagt!

AIDE LEXICALE PRISE DE PAROLE en italien VOCABULAIRE CANIN

3CLL_FRANCESE_MACCAGNO

Martorana Francese - Liceo Linguistico "A.MANZONI"

FAQ – Häufig gestellte Fragen

Giubileo della Misericordia

Apparecchio in classe I - - IP20 - Art

Enzygnost* Anti-HBc monoclonal - Medcorp Produtos Hospitalares