NOVA Lite™ ANCA Anti-neutrophil Cytoplasmic

NOVA Lite® ANCA (Ethanol) Kit with DAPI
Per uso diagnostico In Vitro
Codice prodotto: 708301
Complessità CLIA: elevata
Uso previsto
Il test NOVA Lite® ANCA è un test per la determinazione semiquantitativa di anticorpi anti-citoplasma dei
neutrofili (ANCA) nel siero umano. La presenza di anticorpi anti-citoplasma dei neutrofili può essere usata
insieme ad altri test sierologici e risultati clinici nella valutazione di varie vasculiti sistemiche.
Introduzione e descrizione del test
Il test degli anticorpi anti-citoplasma dei neutrofili (ANCA) ha rivoluzionato la diagnosi e il trattamento delle
varie vasculiti mediate autoimmuni.1-4 Gli autoanticorpi perinucleari o pANCA e citoplasmatici o cANCA hanno
dimostrato di essere utili nell'individuazione di malattie come la granulomatosi con poliangite
(precedentemente nota come granulomatosi di Wegener17) Ci sono almeno sei antigeni ANCA identificati e
molti sono ancora da identificare.1,5 La maggior parte di questi antigeni sembrano essere enzimi che
risiedono nei granuli primari dei neutrofili. Tra questi enzimi figurano la mieloperossidasi (MPO), la serina
proteasi 3 (PR3), l'elastasi, la lactoferrina, la catepsina G e la proteina cationica 57 (CAP-57). Sono stati
sviluppati dei test ELISA per il rilevamento di molti dei più importanti anticorpi ai neutrofili tuttavia la maggior
parte degli esperti nel campo delle vasculiti autoimmuni raccomandano di utilizzare il test di
immunofluorescenza (IFA) per lo screening iniziale.
Due pattern ANCA sono individuabili utilizzando la procedura IFA ANCA standard. Il pattern ANCA classico
appare come fluorescenza granulare, citoplasmatica. Questo pattern, suggestivo di granulomatosi con
poliangite e in misura minore di poliarterite microscopica, è stato definito cANCA.6 È stato descritto un
secondo pattern ANCA7,8 che colora la regione perinucleare dei neutrofili fissati in alcol. Questo pattern è
stato definito pANCA. Il pattern pANCA è stato associato a una vasculite più limitata da organi, in particolare,
glomerulonefrite con semilune o rapidamente progressiva.9
La correlazione tra cANCA e Granulomatosi con poliangite è stata ben stabilita.3,10 La granulomatosi di
Wegener è caratterizzata da un processo infiammatorio necrotizzante con formazione di granuloma e
vasculite che interessa principalmente i tratti respiratori superiore e inferiore e i reni. Questa triade di
interessamento clinico è considerata il segno distintivo della Granulomatosi con poliangite, cANCA è
presente fino nel 96% dei pazienti affetti da Granulomatosi con poliangite con malattia generalizzata attiva,
ma si riduce al 65% nella malattia limitata attiva ed è presente nel 30-40% dei pazienti in remissione. Il titolo
di cANCA segue il corso della malattia con titoli decrescenti nella remissione di malattia e titoli in aumento
nella ricaduta di malattia.4,12
Contrariamente a cANCA e alla sua associazione con il carattere prevalentemente sistemico della
Granulomatosi con poliangite, l'anticorpo pANCA è stato frequentemente associato a glomerulonefrite
necrotizzante. L'anticorpo pANCA tipicamente non viene osservato nelle sindromi sistemiche. L'antigene
bersaglio più comune associato a pANCA è la mieloperossidasi, ma è stata osservata anche reattività
all'elastasi e alla lactoferrina. Quasi il 90% dei sieri pANCA positivi ottenuti da pazienti con glomerulonefrite
sono reattivi alla mieloperossidasi; tuttavia, nei pazienti con malattie diverse dalla glomerulonefrite che
presentano anche pANCA, solo una percentuale molto inferiore è reattiva alla mieloperossidasi.11,13 Questo
indica che più antigeni sono individuabili come colorazione perinucleare dei neutrofili fissati in etanolo tra cui
sieri che contengono anticorpi antinucleari. Inoltre è possibile confermare i pattern perinucleari rilevati con i
neutrofili fissati in etanolo come pANCA eseguendo l'IFA su neutrofili fissati in formalina. L'antigene bersaglio
primario degli anticorpi pANCA, la mieloperossidasi, resta nel citoplasma delle cellule fissate in formalina
mentre nelle cellule fissate in etanolo l'antigene migra al nucleo causano il pattern perinucleare.
Principi della procedura
Nella tecnica di immunofluorescenza indiretta, i campioni vengono incubati con il substrato antigenico e gli
anticorpi privi di reazione vengono rimossi mediante lavaggio. Il substrato viene incubato con coniugato
marcato alla fluoresceina specifico e quindi un reagente non legato viene lavato. All'osservazione con un
microscopio a fluorescenza, i campioni positivi agli autoanticorpi mostreranno una fluorescenza verde mela
corrispondente alle aree della cellula o dei nuclei a cui si è legato l’autoanticorpo.
Reagenti
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
ANCA (Etanolo), vetrini QR - 12 pozzetti/vetrino, con essiccante
Coniugato FITC IgG con DAPI, contenente 0,09% di azoturo di sodio
Controllo cANCA Positivo, 1 fiala di tampone contenente 0,09% di azoturo di sodio e anticorpi da
siero umano agli antigeni cANCA, prediluito
Controllo pANCA Positivo, 1 fiala di tampone contenente 0,09% di azoturo di sodio e anticorpi da
siero umano agli antigeni pANCA, prediluito
Controllo Negativo Sistemi IFA, 1 fiala di tampone contenente 0,09% di azoturo di sodio e nessun
anticorpo da siero umano verso ANCA, prediluito
PBS II Concentrato (40x)
Mezzo di montaggio, contenente 0,09% di azoturo di sodio
Coprivetrini
1
Avvertenze
1.
2.
3.
4.
Tutto il materiale di origine umana utilizzato nella preparazione dei controlli per questo prodotto è
stato testato ed è risultato negativo alla presenza di anticorpi al virus dell'immunodeficienza umana
(HIV), dell’antigene superficiale dell’epatite B (HBsAg) e dell’epatite C (HCV) in base a metodi
approvati dall’FDA. Nessun metodo di prova tuttavia può offrire l'assicurazione completa dell’assenza
del virus dell’HIV, HCV o altri agenti infettivi. Pertanto, i controlli pANCA Positivo, cANCA Positivo e
Negativo Sistemi IFA devono essere trattati come materiali potenzialmente infettivi.14
L’azoturo di sodio viene usato come conservante. L’azoturo di sodio è un veleno e può essere tossico
se ingerito o assorbito attraverso la pelle o gli occhi. L’azoturo di sodio può reagire con le tubature in
piombo o rame e formare azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lavare i lavandini, se usati per lo
smaltimento dei reagenti, con grandi volumi di acqua per evitare l’accumulo di azide.
Utilizzare attrezzatura di protezione idonea quando si manipolano i reagenti forniti.
I reagenti rovesciati devono essere puliti immediatamente. Durante lo smaltimento delle scorie,
rispettare tutti i regolamenti ambientali federali, statali e locali.
Precauzioni
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Questo prodotto è destinato a un uso diagnostico In Vitro.
La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel sistema può causare risultati incoerenti.
Un lavaggio incompleto o inefficiente dei pozzetti IFA può causare un elevato rumore.
L’adattamento di questo dosaggio all’uso con unità di sviluppo automatiche dei campioni e altri
dispositivi per la manipolazione dei liquidi, anche parziale, può produrre differenze nei risultati del test
rispetto a quelli ottenuti utilizzando la procedura manuale. È responsabilità di ogni laboratorio
verificare che la procedura automatica dia risultati dei test entro limiti accettabili.
Le prestazioni del dosaggio sono influenzate da molti fattori. Tra questi figurano la temperatura
iniziale dei reagenti, l’intensità della lampadina del microscopio usato, la precisione e la riproducibilità
della tecnica di pipettamento, l’accuratezza del lavaggio e la lunghezza dei periodi di incubazione
durante il test. Per ottenere risultati accurati e riproducibili è necessario prestare grande attenzione
alla coerenza.
Nel tempo, il coniugato può cambiare di colore a causa dell'esposizione alla luce. Tuttavia, il cambio
di colore non altera le prestazioni del dosaggio.
Si raccomanda un rigido rispetto del protocollo.
Condizioni di conservazione
1.
2.
3.
4.
Conservare tutti i reagenti del kit a 2-8°C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di
scadenza indicata sull'etichetta apposta sulla confezione se conservati e maneggiati in accordo alle
istruzioni.
Una volta volta che i vetrini sono stati rimossi dall'involucro in alluminio, devono essere utilizzati
immediatamente.
Il tampone PBS diluito è stabile per 4 settimane a 2-8°C..
Il coniugato del kit deve essere tenuto lontano dalla luce del sole, dalla luce fluorescente e dai raggi
UV, quando possibile.
Prelievo del campione
Questa procedura deve essere eseguita con un campione di siero. L’aggiunta di azide o altri conservanti ai
campioni del test può influenzare negativamente i risultati. I campioni microbicamente contaminati, sottoposti
a trattamento termico o contenenti particolato visibile non devono essere usati. Evitare campioni o sieri
lipemici o fortemente emolizzati. Dopo il prelievo, separare il siero dal coagulo. Il CLSI (in passato NCCLS)
Document H18-A4 raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1) conservare i
campioni a temperatura ambiente per un massimo di 8 ore; 2) se il test non verrà completato entro 8 ore,
refrigerare il campione a 2-8°C; 3) se il test non verrà completato entro 48 ore, oppure per la spedizione del
campione, congelare a -20°C o a una temperatura inferiore. I campioni congelati devono essere miscelati
dopo il decongelamento e prima di eseguire il test. Evitare il congelamento e lo congelamento ripetuti.
Procedura
Materiale fornito
708301
20
1
1
1
1
2
1
1
1
ANCA (Etanolo), vetrini QR - 12 pozzetti
15 ml di coniugato FITC IgG con DAPI
0,5 ml di controllo cANCA Positivo
0,5 ml di controllo pANCA Positivo
0,5ml di Controllo Negativo Sistemi IFA
25 ml di PBS II Concentrato (40x)
7 ml di Mezzo di montaggio
20 Coprivetrini
Inserto per istruzioni
2
Materiale aggiuntivo richiesto ma non fornito
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Acqua distillata
Contenitore da 1l (per la diluizione del PBS)
Micropipette e puntali monouso
Camera umida
Spruzzette o Pipette pipette Pasteur
Vaschetta di Coplin
Microscopio a fluorescenza
Metodo
Prima di iniziare
1.
2.
3.
Portare tutti i reagenti e i campioni a temperatura ambiente (20-26°C) e miscelare bene.
Diluire il PBS Concentrato:IMPORTANTE: diluire il concentrato PBS concentrato nella misura di
1:40 aggiungendo il contenuto del flacone di concentrato PBS concentrato a 975 ml di acqua distillata
o deionizzata e miscelare accuratamente. Il tampone PBS viene usato per diluire i campioni dei
pazienti e come tampone di lavaggio. Il tampone diluito può essere conservato fino a 4 settimane a
2-8°C.
Diluire i campioni dei pazienti:
a.
Screening iniziale: Diluire i campioni dei pazienti nella misura di 01:20:00 con tampone PBS
diluito (p.es., aggiungere 50μl di siero fino a 950μl di tampone PBS).
b.
Titolazione: preparare diluizioni seriali doppie dalla diluizione di screening iniziale per tutti i
campioni positivi con tampone PBS diluito (ossia 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, ecc). Per esempio,
Prendere 100μl della diluizione 1:20, miscelare con 100μl di PBS per ottenere una diluizione
1:40. Ripetere per ottenere ulteriori diluzioni.
Procedura del dosaggio
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Preparare i vetrini di substrato: lasciare che il vetrino di substrato raggiunga la temperatura
ambiente prima di rimuoverlo dalla busta. Marcare il vetrino con una matita e collocarlo in una camera
umida idonea. Aggiungere 1 goccia (20-25μl) di controllo positivo e negativo non diluito
rispettivamente ai pozzetti 1 e 2. Aggiungere 1 goccia (20-25μl) di campione del paziente diluito ai
pozzetti restanti.
Incubazione del vetrino: incubare il vetrino per 30 ± 5 minuti in una camera umida (la carta
assorbente inumidita posta sul fondo di un contenitore chiuso in vetro o in plastica conserverà le
condizioni di umidità idonee). Non consentire al substrato di seccare durante la procedura di
dosaggio
Lavare i vetrini: dopo l’incubazione, utilizzare una spruzzetta in plastica per eliminare delicatamente
il siero con il tampone PBS diluito. Orientare il vetrino e il flusso di tampone PBS in modo da ridurre al
minimo il wash-over dei campioni tra i pozzetti. Evitare di dirigere il flusso direttamente sui
pozzetti per evitare di danneggiare il substrato. Se lo si desidera, collocare i vetrini in una
vaschetta di Coplin di tampone PBS diluito per massimo 5 minuti.
Aggiunta di coniugato fluorescente: Picchiettare per rimuovere l’eccesso di tampone PBS.
Collocare nuovamente il vetrino nella camera umida e coprirlo immediatamente con una goccia di
coniugato fluorescente. Incubare i vetrini per altri 30 + 5 minuti al buio.
Lavare i vetrini: ripetere il punto 3.
Coprivetrino: le procedure da utilizzare con i coprivetrini variano da un laboratorio all’altro; tuttavia, si
raccomanda la seguente procedura:
a.
Collocare un coprivetrino su carta assorbente.
b.
Applicare il mezzo di montaggio in linea continua sul bordo inferiore del coprivetrino.
c.
Picchiettare per rimuovere l'eccesso di tampone PBS e toccare il bordo inferiore del vetrino
con il bordo del coprivetrino. Abbassare delicatamente il vetrino sul coprivetrino in modo che il
mezzo di montaggio fluisca sul bordo superiore del vetrino senza formazione o
intrappolamento di bolle d’aria.
Osservare i vetrini al microscopio a fluorescenza: I vetrini finiti devono essere conservati a 2-8°C e
osservati il più presto possibile.
Controllo della qualità
Un controllo positivo (cANCA Positivo o pANCA Positivo) e il Controllo Negativo Sistemi IFA devono essere
eseguiti su ogni vetrino per garantire che tutti i reagenti e tutte le procedure vengano eseguite correttamente.
Sieri di controllo aggiuntivi idonei possono essere preparati suddividendo in aliquote campioni di siero umano
e conservandoli a < -70°C. Affinché i risultati di test possano essere considerati validi, devono essere
soddisfatti tutti i criteri seguenti. Se uno qualsiasi di questi non viene soddisfatto, il dosaggio deve essere
considerato non valido e deve essere ripetuto.
1.
Il controllo cANCA Positivo non diluito deve essere > 3+.
2.
Il controllo pANCA Positivo non diluito deve essere > 3+.
3.
Il Controllo controllo Negativo negativo Sistemi del sistema IFA deve essere negativo.
Se i controlli non appaiono come descritto, il test non è valido e deve essere ripetuto.
3
Interpretazione dei risultati
Reattività negativa. Un campione viene considerato negativo se una colorazione nucleare e citoplasmatica
specifica è uguale o inferiore al Controllo Negativo Sistemi IFA. I campioni possono mostrare vari gradi di
colorazione di sfondo dovuta agli anticorpi eterofili o ad autoanticorpi di basso livello ai costituenti
citoplasmatici come le proteine contrattili.
Reattività positiva. Un campione è considerato positivo se la colorazione nucleare e/o citoplasmatica
specifica descritta di seguito è maggiore del controllo negativo e l'intensità della colorazione è pari a 1+ o
superiore.
Determinare il grado o l'intensità di fluorescenza utilizzando questi criteri:
4+
Fluorescenza verde mela brillante
3+
Fluorescenza verde mela intensa
2+
Fluorescenza positiva chiaramente distinguibile
1+
Fluorescenza specifica minima che consente di differenziare chiaramente la colorazione
nucleare e/o citoplasmatica dalla fluorescenza di fondo.
Interpretazione del pattern. Possono essere presenti una varietà di pattern di colorazione nucleare e
citoplasmatica in base ai tipi e alle quantità corrispondenti di autoanticorpi presenti nel campione. È possibile
osservare i seguenti tipi di pattern di colorazione:
cANCA o colorazione citoplasmatica: Questo pattern in generale presenta una fluorescenza
citoplasmatica con punteggiatura grossolana, spesso con fluorescenza accentuata nei lobi nucleari o attorno
a questi. Questo pattern di solito è prodotto dagli anticorpi che reagiscono con l'enzima granulare primario
Serina Proteasi 3 (PR3).
Colorazione pANCA o perinucleare: In generale questo pattern compare come colorazione omogenea dei
lobi nucleari, spesso con un'accentuazione perinucleare, prodotta dagli anticorpi che reagiscono con l'enzima
granulare primario migrato mieloperossidasi (MPO). Dato che alcuni anticorpi antinucleari (ANA) possono
reagire anche con i nuclei dei neutrofili umani fissati in etanolo, si raccomanda di sottoporre questi campioni
anche all'analisi degli ANA. Inoltre, questi campioni possono essere sottoposti ad analisi sui neutrofili umani
fissati in formalina anziché in etanolo. La formalina, un fissativo di cross-linking, distrugge la maggior parte
degli antigeni nucleari e sposta il pattern di colorazione da perinucleare a citoplasmatico se il campione
contiene mieloperossidasi. I vetrini fissati in formalina a questo scopo sono disponibili separatamente.
Limiti della procedura
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
I campioni inattivati con il calore, emolizzati, microbicamente contaminati o defibrinati in modo
completo possono causare una forte colorazione di sfondo e rendere difficile l'interpretazione.
Ottenere un campione fresco e ripetere il test. L'aggiunta del 2% di albumina e siero bovino al
tampone PBS usato per diluire i campioni può ridurre la colorazione di sfondo dei campioni
problematici.
I campioni ANA positivi possono reagire con i neutrofili fissati in etanolo. I campioni nucleari positivi
devono essere sottoposti ad analisi per gli ANA e/o testati su vetrini con substrato di neutrofili fissato
in formalina.
Dato che è noto che i neutrofili fissati in etanolo contengono più antigeni di granuli primari come
elastasi, lactoferrina, catepsina G, proteina cationica 57 e forse altri antigeni dei neutrofili non ancora
identificati, è possibile che i campioni che appaiono pANCA o cANCA positivi non risultino sempre
positivi agli anticorpi specifici di mieloperossidasi (MPO) o serina proteasi 3 (PR3).
Oltre agli ANA, vi sono determinati altri autoanticorpi che possono reagire con i neutrofili umani fissati
in etanolo. Questi anticorpi includono quelli anti muscolo liscio (actina) e determinati alloanticorpi
come Mart o NB1.15 L'actina o gli anticorpi anti muscolo liscio reagiscono con il citoplasma dei
neutrofili ma producono un pattern di colorazione omogeneo invece del tipico pattern c-ANCA con
colorazione grossolana. Anche gli alloanticorpi appaiono come un pattern citoplasmatico, ma con una
punteggiatura molto più fine rispetto agli anticorpi cANCA e solo una percentuale ridotta di cellule
(tipicamente il 40%) o meno produce fluorescenza.
Occasionalmente possono essere osservati campioni con più di un autoanticorpo. Per esempio
cANCA e pANCA o ANCA più ANA.
I risultati IFA positivi devono essere confermati mediante i test immunoenzimatici (EIA)
mieloperossidasi (MPO) e proteinase 3 (PR3)
Alcuni pazienti con malattia intestinale infiammatoria o colite ulcerosa presentano anticorpi reattivi ai
neutrofili.16 Questi campioni appaiono come un pattern di tipo pANCA sul substrato di neutrofili fissato
in etanolo con una colorazione perinucleare molto accentuata. Tipicamente questi campioni
sembrano negativi o presentano una fluorescenza citoplasmatica omogenea debole sui vetrini con
substrato di neutrofili fissato in formalina.
Un uso improprio dei vetrini durante la procedura di colorazione, in particolare il fatto di permettere ai
vetrini di asciugarsi tra le fasi, può causare un pattern "slavato" e un elevato livello di colorazione di
sfondo.
L'uso di reagenti ottenuti da altri tipi di kit di anticorpi fluorescenti (in particolare coniugato) può
influenzare negativamente la sensibilità e la specificità dei vetrini con substrato di neutrofili fissato in
etanolo.
La sensibilità del test è influenzata da una varietà di fattori esterni tra cui il tipo di microscopio a
fluorescenza utilizzato, l’intensità e l'età della lampadina, l'ingrandimento usato, il sistema di filtro e
l'osservatore.
4
11.
12.
13.
14.
15.
La fonte luminosa, i filtri e le ottiche di microscopi di fluorescenza diversi influenzano la sensibilità del
kit. Le prestazioni del microscopio vengono influenzate in modo significativo da una corretta
manutenzione specialmente se si centra la lampada al vapore e si cambia la lampada dopo il periodo
di tempo raccomandato.
Per contrassegnare i vetrini utilizzare solo la matita. L'uso di qualsiasi altro materiale di scrittura può
causare artefatti di colorazione.
Tutte le vaschette di Coplin usate per il lavaggio dei vetrini devono essere ripulite da tutti i residui di
colorante. L’uso di vaschette di Coplin contenenti un residuo di coloranti può causare artefatti di
colorazione.
Questo test da solo non deve essere considerato diagnostico. Occorre tenere in considerazione tutti
gli altri fattori tra cui l'anamnesi clinica del paziente e altri risultati sierologici o di biopsie.
Non sono stabilite prestazioni per matrici diverse dal siero.
Valori previsti
Sono stati testati su vetrini ANCA NOVA Lite® centoquindici campioni normali di donatori causali. Questi
campioni erano stati presentati come esami fisici pre-assunzione o dei collaboratori e come tali difficilmente
includevano soggetti anziani o in età pediatrica. I campioni erano un misto casuale di uomini e donne. Tutti e
115 i campioni erano negativi alla diluizione di screening 1:20.
Inoltre, sono stati testati 45 pazienti affetti da glomerulonefrite di Wegener, 39 da poliarterite microscopica e
20 da glomerulonefrite a semilune nonché pazienti con una vasta gamma di malattie del tessuto connettivo. I
risultati sono riepilogati nella tabella seguente:
Gruppo di pazienti
Donatori normali casuali
Granulomatosi di Wegener
Poliarterite microscopica
Glomerulonefrite a semilune
LES
Sindrome di Sjögrens
Sclerodermia
Polimiosite
N° di pazienti
115
45
39
20
27
21
15
6
% Positivi
0
89
(tutti cANCA)
100
(tutti pANCA)
100
(tutti pANCA)
7
(sia pANCA sia cANCA)
0
0
0
I vetrini NOVA Lite® ANCA sono stati messi confrontati con preparazioni di neutrofili centrifugate utilizzate di
routine in un centro di riferimento ANCA con sede in Università. Sono stati testati cinque sieri positivi (23
cANCA, 28 pANCA, 4 atipici) e 14 campioni ANCA negativi. Dei 55 campioni positivi, 54 hanno prodotto un
modello di colorazione identico sui vetrini ANCA NOVA Lite®. Uno dei campioni cANCA con titolo basso ha
prodotto un risultato negativo sul vetrino INOVA. Tutti e 14 i campioni ANCA negativi sono risultati negativi
anche sui vetrini ANCA NOVA Lite®. Le titolazioni dei 55 campioni positivi su entrambi i substrati hanno
prodotto lo stesso risultato oppure una differenza dimezzando la concentrazione una volta con 53 dei
campioni testati. Gli altri 2 campioni differivano dimezzando la concentrazione due volte.
Quarantotto campioni di siero ottenuti da donatori casuali sono stati inviati a un importante laboratorio di
riferimento degli USA per il test ANA e sono stati testati simultaneamente per gli ANCA con vetrini ANCA
NOVA Lite® e per gli anticorpi specifici MPO e PR-3 con kit ELISA INOVA QUANTA Lite®. I risultati sono
riepilogati nella tabella seguente.
Risultato IFA
N. di campioni
% ELISA Positivi
MPO
PR3
negativo
8
0
0
pANCA
13
84
0
cANCA
21
0
95
c e pANCA
5
80
0
Atipica
1
0
0
Otto campioni erano ANCA negativi al test di immunofluorescenza. Tutti e otto i campioni erano negativi per
MPO e PR-3 con il test ELISA. I risultati per MPO e PR-3 variavano da 1-5 unità, ben al di sotto della soglia di
positività di 20 unità. Tredici campioni sono stati valutati come pANCA positivi con il test IFA. Undici di questi
erano MPO positivi e nessuno era PR-3 positivo. Ventuno campioni erano cANCA positivi al test di
immunofluorescenza. Nessuno di questi campioni era MPO positivo, mentre 20 dei 21 campioni erano PR-3
positivi. Cinque campioni sembrano avere modelli di tipo sia pANCA sia cANCA mediante test IFA. Quattro di
questi erano MPO positivi e nessuno era PR3 positivo. Un campione è stato classificato come un pANCA
atipico. Questo campione pANCA atipico era negativo con entrambi i kit MPO e PR3.
5
Accorto tra i risultati ANCA - ELISA vs. IFA
Mentre MPO e PR3 sono i principali antigeni che comprendono quelli che possono essere identificati come p
e c ANCA, l'utente dovrebbe ricordare che gli anticorpi a numerosi altri enzimi nei granuli primari dei neutrofili
possono produrre modelli c e p ANCA al test di immunofluorescenza su neutrofili fissati in etanolo. Questo è
particolarmente vero nel caso degli anticorpi pANCA in cui almeno altri 3 autoanticorpi agli antigeni diversi da
MPO possono produrre un modello IFA di tipo pANCA. Per illustrare quanto appena affermato, sono stati
raggruppati campioni tratti dai suddetti gruppi con glomerulonefrite di Wegener, poliarterite microscopica e
glomerulonefrite a semilune insieme ai 48 campioni inviati per il test sierologico di routine per la vasculite. Di
seguito vengono riportati i risultati al test di immunofluorescenza dei neutrofili umani fissati in etanolo ed
ELISA.
+
QUANTA Lite® PR-3 IgG
+
60
6
cANCA IFA
-
+
1
85
QUANTA Lite® MPO IgG
+
47
30
pANCA IFA
-
0
75
Sensibilità relativa
Specificità relativa
Accordo
90,9%
98,8%
95,4%
Sensibilità relativa
Specificità relativa
Accordo
61,0%
100%
80,3%
Dei 66 campioni IFA cANCA positivi, 6 erano negativi per PR3 e 1 campione era positivo al dosaggio ELISA
ma positivo al test IFA. Dei 77 campioni IFA pANCA positivi, 30 erano negativi al test ELISA specifico per
MPO. Non sono stati individuati campioni IFA pANCA negativi mediante test ELISA per MOP.
6
Bibliografia
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