discorso ammina

Prodotti carnei / Tecnologia
Meat products / Technology
Attività decarbossilasica in prodotti carnei stagionati.
Influenza dei parametri tecnologici sulla formazione di
ammine biogene
Decarboxylase activity in ripened meat products. Influence of
technological parameters on the formation of biogenic amines
Giovanna Saccani, Enrica Tanzi
SSICA Stazione Sperimentale per l’Industria delle Conserve Alimentari, V.le Tanara, 31/A - 43100 PARMA
Riassunto
Abstract
L’andamento delle attività amino-decarbossilasiche
The pathway of amino-decarboxylase activities and
e l’accumulo di ammine biogene sono state studiate
the accumulation of biogenic amines were studied
nel corso della maturazione di salami tradizionali ad
during ripening of traditional slow-acidifying salami
acidificazione lenta (senza starter) in relazione alle
(with no starters) in relation with drying and maturation
temperature delle fasi di asciugamento e stagionatura.
temperatures.
Per
seguire
nel
tempo
le
principali
attività
In order to monitor over time the main decaboxylase
decarbossilasiche (tirosino-, ornitino-, istidino- e lisino-
activities
decarbossilasi) e la formazione delle ammine bioattive
decarboxylase activities) as well as the formation of
(tiramina, putrescina, cadaverina, istamina, spermidina
bioactive amines (tyramine, putrescine, cadaverine,
e spermina), sono stati preparati tre batch sperimentali
histamine, spermidine and spermine) three experimental
partendo dalla stessa materia prima e portando a
batches were prepared from the same raw material while
maturazione i salami secondo tre cicli di stagionatura.
achieving salami ripening with three maturation cycles.
È stato osservato un diverso andamento delle singole
attività
amino-decarbossilasiche
in
funzione
(tyrosine,
Different
ornithine,
pathways
of
histidine
the
and
individual
lysine
amino-
delle
decarboxylase activities were observed as a function
condizioni tecnologiche. L’ornitino-decarbossilasi e la
of technological conditions. Ornithine-decarboxylase
lisino-decarbossilasi aumentano durante l’intero processo
and lysine-decarboxilase increased during the whole
produttivo in relazione alle temperature delle fasi di
production process in relation with drying and maturation
asciugamento e stagionatura (P <0,05), con un incremento
temperatures
particolarmente accentuato dopo il rialzo del pH.
marked
L’attività tirosino-decarbossilasica aumenta rapidamente
activity rapidly increased from early ripening stages and
fin dalle prime fasi di stagionatura e si assesta nella fase
stabilised during full ripening, independently of process
di stagionatura vera e propria, indipendentemente dalle
temperatures. Starting from meat mixtures with equal
temperature di processo. Partendo da un impasto con la
amino-forming activities, variations in process parameters
stessa attività amino-formante, le variazione dei parametri
caused significant (P <0.05) differences in the profiles of
di processo hanno determinato differenze significative
bioactive amines in the ripened product. Monitoring of
(P <0,05) nel profilo delle ammine bioattive nel prodotto
technological conditions is therefore one of the factors
stagionato. Il controllo delle condizioni tecnologiche è
able to control amine formation even in the presence of
quindi uno dei fattori in grado di contenere la formazione
a considerable potential activity and to ensure safety of
delle ammine anche in presenza di una considerevole
the ripened products.
after
(P
<0.05),
pH
growth
increase.
being
particularly
Tyrosine-decarboxylase
attività potenziale e di salvaguardare la salubrità dei
prodotti stagionati.
KEY WORDS: biogenic amines, tyramine, dry-cured sausages,
decarboxylase activity
INDUSTRIA CONSERVE, N.4, anno 82, 2007
– 293
INTRODUCTION
INTRODUZIONE
I processi biochimici e i fattori tecnologici che influisco-
no sull’accumulo di ammine biogene in alimenti freschi o
stagionati sono stati oggetto di recenti studi, volti ad individuare le interconnessioni tra processo produttivo e salubrità
del prodotto finito.
L’accumulo di ammine in prodotti carnei sottoposti a
processi di fermentazione e stagionatura è un processo
estremamente complesso, nel quale numerose variabili possono interagire tra loro. Tra queste, in particolare, la
qualità igienica delle materie prime, la cinetica di crescita
dei microrganismi (selezionati naturalmente nel corso del
processo produttivo o aggiunti mediante colture starter), i
fenomeni proteolitici che si instaurano nel corso della stagionatura e, soprattutto, le attività enzimatiche amino-decarbossilasiche sostenute dalla microflora selezionata nel
corso del processo (1-8).
I metaboliti amminici, che si accumulano nel corso del
processo produttivo in funzione di tali fattori, possono essere rilevati nel prodotto stagionato anche quando i ceppi
microbici produttori non sono più riscontrabili (9). Di conseguenza il contenuto di ammine biogene nei salumi stagionati non rappresenta solo un indice di qualità igienica delle
materie prime utilizzate, ma anche un indicatore tecnologico legato sia all’andamento della lavorazione sia alla
sicurezza d’uso del prodotto stagionato (10, 11). In questo
senso è evidente la necessità di monitorare e tenere sotto
controllo tutti i fattori tecnologici che possono influire sulla
selezione della microflora e sull’espressione dell’attività decarbossilasica durante il processo produttivo.
Con quest’obiettivo alcuni gruppi di ricerca hanno
studiato la possibilità di controllare la formazione delle
ammine selezionando opportunamente ceppi starter decarbossilasi-negativi o valutando le condizioni ambientali
durante la fase di fermentazione in presenza di colture
starter idonee (12-16). Molte produzioni italiane tradizionali, tuttavia, non usano abitualmente colture starter
commerciali e sono più esposte, quindi, al rischio che
batteri lattici non starter, presenti nella materia prima e
selezionati nel corso del processo, possano determinare
un accumulo elevato di ammine (17-19).
L’elevata variabilità riscontrata durante un’indagine sul
contenuto di ammine e poliammine in salumi stagionati
(indagine 2002-2005, dati non pubblicati), ci ha indotto
ad approfondire la conoscenza del meccanismo di formazione delle ammine in salami a lenta acidificazione,
prodotti senza l’uso di colture starter. Nel corso della ricerca è stata seguita l’evoluzione delle singole attività
amino-decarbossilasiche (tirosino-, ornitino-, istidino- e lisino-decarbossilasiche) in funzione delle diverse lavorazioni adottate, con particolare riferimento alle temperature
delle fasi di asciugamento e di stagionatura. Parallelamente al saggio enzimatico è stato determinato anche
il contenuto di ammine biogene, prestando particolare
attenzione al livello di poliammine naturalmente presenti
nei tessuti animali.
294 –
INDUSTRIA CONSERVE, N.4, anno 82, 2007
The biochemical processes and technological factors
which affect the accumulation of biogenic amines in
fresh or processed products have been the object of
recent studies, aiming at detecting interconnections,
if any, between production process and safety of the
ripened product.
The accumulation of amines in meat products
subjected to fermentation and ripening is an extremely
complex process, in which numerous variables can
interact. Among these, in particular, the hygienic quality
of raw materials, the growth kinetics of micro-organisms
(naturally selected during the production process or
added as starter cultures), the proteolytic phenomena
occurring during ripening and, above all, the aminodecarboxylase enzymatic activities supported by the
microflora selected in the course of the process (1-8).
Amine metabolites, which accumulate during the
production process as a function of those factors, can
be detected in the ripened product also when aminoforming microbial strains are no longer detectable (9).
As a consequence, the biogenic amine content in dry
cured meat products represents not only an index of the
hygienic quality of the raw materials used, but also a
technological indicator linked to both processing course
and safety of use of the ripened product (10, 11). In this
regard it is clearly necessary to monitor and control all
the technological factors which may affect the selection
of microflora and the expression of the decarboxylase
activity during the production process.
With this aim, some research groups have studied
the possibility to control amine formation by properly
selecting decarboxylase-negative starter strains or by
evaluating the environmental conditions during the
fermentation stage in the presence of suitable starter
cultures (12-16). Many Italian traditional productions,
however, do not commonly make use of commercial
starter cultures and are therefore more exposed to the
risk that non-starter lactic acid bacteria, present in the
raw material and selected during the process, may
cause a substantial accumulation of amines (17-19).
The large variability found during an investigation
into the amine and polyamine content in ripened meat
products (2002-2005, data not published) induced us
to carry out more in-depth studies on the formation
mechanism of amines in slow acidifying salami produced
without starter cultures. During the research work, the
development in the different amino acid decarboxylase
activities (tyrosine, ornithine, histidine and lysine
decarboxylase activities) was monitored in relation to
the technological processes with special reference to
the temperatures in the drying and ripening phases.
Besides carrying out the enzymatic test, the biogenic
ammine content was also determined with special
attention being paid to the level of polyamines naturally
present in animal tissues.
MATERIALS AND METHODS
MATERIALI E METODI
Disegno sperimentale per lo studio dell’attività decarbossilasica e delle
ammine biogene in salame stagionato
La formazione di ammine biogene e l’evoluzione delle principali attività decarbossilasiche (tirosino-, ornitino- istidino- e lisino-decarbossilasi)
sono state determinate durante l’intero ciclo di stagionatura di salami
tradizionali. Per studiare l’influenza delle condizioni tecnologiche (temperature della fase di asciugamento e di stagionatura) sulla formazione
delle ammine e sull’attività enzimatica è stato predisposto il seguente
piano sperimentale.
Per la preparazione dei salami è stata utilizzata una ricetta tradizionale: 80% di tagli magri suini e 20% di grasso di gola suina sono stati macinati
al tritacarne (ø fori: 7 mm) e conditi con una miscela di sale (2,4%) NaCl
(24 g kg-1), NaNO2 (150 mg kg-1), KNO3 (150 mg kg-1), aromi naturali (aglio,
vino bianco, pepe macinato e in grani). L’impasto è stato successivamente insaccato in budelli naturali (calibro 80 mm). I salami, del peso
medio di circa 1 kg, sono stati poi avviati alla stagionatura in tre stabilimenti secondo i cicli di asciugatura e stagionatura riportati nella Tabella
1. Nel corso della lavorazione e a fine stagionatura i salami prelevati sono
stati esaminati per verificare le caratteristiche organolettiche e quindi avviati alle analisi.
Per seguire nel tempo l’attività decarbossilasica e la formazione delle
ammine, i prelievi dei campioni sono stati programmati nell’arco di 50
giorni (sei prelievi). Ad ogni scadenza sono stati prelevati tre campioni
per ogni batch sperimentale. La presenza di ammine biogene, l’attività
decarbossilasica, il contenuto salino, il valore di aw e pH sono stati verificati in tre porzioni centrali e tre esterne di ciascun campione.
Experimental design for the study of decarboxylase activity of
biogenic amines in ripened salami
The formation of biogenic amines and the evolution of the
main decarboxylase activities (tyrosine, ornithine, histidine and
lysine decarboxylase activities) were determined during the
whole ripening cycle of traditional salami. In order to study
the influence of technological conditions (temperatures of the
drying and ripening stages) on amine formation and enzymatic
activity the following experimental design was arranged.
A traditional recipe was used to prepare salami: 80% pork
lean cuts and 20% pig throat fat were ground in a mincer (ø
holes: 7 mm) and seasoned with a mixture of salt (2.4%) NaCl (24
g kg -1), NaNO 2 (150 mg kg -1), KNO 3 (150 mg kg -1), natural flavours
(garlic, white whine, pepper both ground and in grains). The
mix was then stuffed into natural casings (80 mm). The salami,
having an average weight of about 1 kg, were then conveyed
to maturation in three factories according to the drying and
ripening cycles reported in Table 1.
In order to follow decarboxylase activity and amine formation
over time, taking of samples was planned within 50 days (six
samplings). At each time limit, three samples were taken for
each experimental batch. The presence of biogenic amines,
decarboxylase activity, salt content, a w and pH values were
checked in three central and three external portions of each
sample.
Tab. 1 – Piano sperimentale per lo studio della formazione di ammine in salami stagionati: andamento dei cicli di
maturazione sperimentati.
Table 1 – Experimental design for the study of amine formation in ripened salami: evolution of the ripening
cycles tested.
Prova
Trial
Fase di asciugamento
T[°C] della cella
Drying phase
Cell T[°C]
Fase di stagionatura
T[°C] della cella
Ripening phase
Cell T[°C]
1
25-20
16-18
2
22-18
14-15
3
18-15
14-15
Saggio per la determinazione dell’attività decarbossilasica in campioni
di carne fresca e derivati carnei
Per valutare le specifiche attività amino-decarbossilasiche del prodotto in esame (lisino-, ornitino-, istamino e tirosino-decarbossilasi), è stato utilizzato il metodo proposto da M. M. Hernandez-Herrero (20) adattandolo
all’analisi di campioni di carne freschi e stagionati. Il metodo prevede
l’estrazione degli enzimi decarbossilasici mediante soluzione tampone in
presenza di antiossidanti e il successivo inoculo in terreno colturale arricchito con amminoacidi e co-fattori enzimatici, dove le reazioni decarbossilasiche possono procedere a temperatura ottimale. Le ammine formatesi nel terreno – analizzate mediante cromatografia ionica (tiramina,
putrescina, istamina e cadaverina) – indicano la capacità enzimatica
amino-formante complessiva sostenuta dalla microflora selezionata nel
corso del processo produttivo.
Estrazione degli enzimi e saggio per la determinazione dell’attività
decarbossilasica
Gli enzimi decarbossilasici vengono estratti da 20 g di campione con
due volumi di tampone di estrazione (Trizma-Base 25 mM, EDTA 0,1 mM,
DL-Ditiotreitolo 2 mM, piridossal-5-fosfato 0,01mM e Triton 100 0,1%, pH a
7,5 con acido cloridrico) mediante omogeneizzazione a freddo (15000
rpm per 1 minuto a 2-5°C) (Sterilmixer, PBI International). Dopo centrifugazione per 25 minuti a 4°C il surnatante è separato e filtrato su filtri da
0,2 µm. Gli estratti vengono inoculati su terreno decarbossilasico sterile in
Test to determine decarboxylase activity in samples of fresh meat and
meat products
In order to evaluate the specific amino-decarboxylase activities
(tyrosine, ornithine, histidine and lysine decarboxylase activities) of the
product investigated, the method proposed by M. M. HernandezHerrero (20) was used after modifying it to make it suitable for the analysis
of fresh and ripened meat products. The method involves extracting the
decarboxylase enzymes by using buffered solutions in the presence of
antioxidants followed by inoculation in culture medium enriched with
aminoacids and enzymatic co-factors, where decarboxylase reactions
can take place at optimum temperature. The amines formed in the
medium and analysed by ion chromatography (tyramine, putrescine,
histamine and cadaverine) indicate the overall amino-forming enzymatic
ability supported by the microflora selected during the production
process.
Enzyme extraction and test for the determination of decarboxylase
activity
Decarboxylase enzymes are extracted from 20 g of sample with
two volumes of extraction buffer (Trizma-Base 25 mM, EDTA 0,1 mM, DLDithiothreitol 2 mM, pyridoxal-5’-phosphate 0,01mM and Triton 100 0,1%,
pH 7.5 with hydrochloric acid) by cold homogenization (15000 rpm for 1
INDUSTRIA CONSERVE, N.4, anno 82, 2007
– 295
provetta e incubati a 37°C per 3 giorni.
Il terreno decarbossilasico è preparato sciogliendo in un tampone
fosfato 20 mM a pH 5,5 (corretto con acido fosforico) gli aminoacidi precursori delle ammine quali ornitina, lisina e istidina (0,25%) e tirosina (0,20%
- sale sodico dell’amminoacido) in presenza di NaCl al 2,5%; sono inoltre presenti tiamina (0,01%) e piridossal-5-fosfato (0,015%) che agiscono
come co-fattori nella reazione di decarbossilazione. Gli estratti enzimatici inoculati nel terreno colturale sterile sono incubati in un termostato a
37°C per 3 giorni (diluizione 1:10), quindi diluiti con acido perclorico 0,375
M prima dell’analisi in cromatografia per interrompere la reazione (diluizione 1:2) e per far precipitare le sostanze proteiche.
Dopo opportuna diluizione viene effettuata un’analisi quali-quantitativa delle ammine biogene formatesi durante l’incubazione mediante
cromatografia ionica.
L’attività decarbossilasica a carico di ogni singolo aminoacido
(tirosino-, ornitino-, istidino- e lisino-decarbossilasi) viene espressa come
millimoli o mg di ammina corrispondente formatasi durante il periodo di
incubazione dagli enzimi estratti da 1000 g di prodotto.
Analisi delle ammine biogene
Le principali ammine biogene (putrescina, cadaverina, istamina,
feniletilammina, spermidina, spermina, tiramina e triptamina) vengono
determinate nei prodotti carnei dopo un’estrazione in ambiente acido
(acido perclorico 0,375 M) ed analizzate in HPLC con separazione a
scambio ionico e rivelazione conduttimetrica. Per la determinazione
della tiramina e della triptamina si utilizza uno spettrofotometro a serie
di diodi λ = 275 nm e posto in serie al conduttimetro (21). Il metodo
cromatografico è stato utilizzato per la determinazione delle ammine
presenti nei campioni di salame e per l’analisi delle ammine formatesi
nel terreno decarbossilasico dopo aggiunta dell’estratto enzimatico.
Preparazione del campione
Dieci grammi di campione precedentemente omogeneizzato
sono estratti con acido perclorico 0,375 M (diluizione 1:10 p/v). La miscela viene omogeneizzata a 15000 giri/min per 25 minuti, filtrata su
carta e su filtro in acetato di cellulosa (diametro = 0,45 μm). Volume
di iniezione 10 μL.
Analisi statistica
L’analisi statistica dei dati è stata effettuata mediante il pacchetto
statistico SPSS ver. 11.5. Il confronto tra i campioni è stato effettuato
mediante analisi della varianza ad una via, rispetto alla prova di lavorazione (temperature dei cicli di lavorazione); le medie delle ammine
stimate alle diverse scadenze sono state confrontate a coppie con il
test LSD (P <0,05).
RISULTATI E DISCUSSIONE
Formazione e accumulo di ammine biogene in funzione
dei parametri tecnologici
È stata seguita la formazione delle principali ammine
biogene e l’attività decarbossilasica nei campioni di salame in relazione alle condizioni degli ambienti di asciugamento e stagionatura (vedi disegno sperimentale)
con particolare riferimento alla temperatura dei cicli di
lavorazione.
Nella Tabella 2 sono riportati i parametri chimico-fisici dell’impasto (prima dell’insacco) e dei campioni di
salame al termine della fase di stagionatura (50 giorni)
per verificare eventuali differenze tra i campioni da attribuire al processo produttivo. Le caratteristiche compositive dei salami alla fine della fase di stagionatura non
mettono in evidenza differenze significative (P >0,05) da
attribuire alla lavorazione utilizzata; è così possibile un
confronto diretto tra i campioni provenienti dai diversi
trattamenti.
296 –
INDUSTRIA CONSERVE, N.4, anno 82, 2007
min at 2-5°C) (Sterilmixer, PBI International). After centrifuging for 25 min
at 4°C the supernatant was separated and filtered on 0.2 µm filters. The
extracts are inoculated on sterile decarboxylase medium in test tubes
and incubated at 37°C for 3 days.
The decarboxylase medium is prepared by dissolving in 20 mM
phosphate buffer at pH 5.5 (corrected with phosphoric acid) the
aminoacids precursors of amines such as ornithine, lysine and histidine
(0.25%) and tyrosine (0.20% - amino acid sodium salt) in the presence
of 2.5%; NaCl; thiamine (0.01%) and pyridoxal-5’-phosphate (0.015%)
are also present acting as co-factors in the decarboxylation reaction.
The enzymatic extracts inoculated in the sterile culture medium are
incubated in thermostate at 37°C for 3 days (1:10 dilution), then diluted
with 0.375 M perchloric acid before chromatographic analysis in order to
interrupt the reaction (1:2 dilution) and induce protein precipitation.
After suitable dilution a quali-qualitative analysis is performed of the
biogenic amines forming during incubation by ion chromatography.
The decarboxylase activity for each individual aminoacid (tirosine-,
ornithine-, hystidine- and lysine-decarboxylase) is expressed as millimoles
or as mg of the corresponding amine formed during the incubation
period from the enzymes extracted from 1000 g product.
Anaysis of biogenic amines
The main biogenic amines (putrescine, cadaverine, histamine,
phenylethylamine, spermine, tyramine and tryptamine) are determined in
meat products after extraction with 0.375 M perchloric acid and analysed
by HPLC with ion-exchange separation column and conductimetric
detection. For the determination of tyramine and tryptamine a λ = 275
nm diod-array spectrophotometer connected in series is used (21). The
chromatographic method was used for the determination of the amines
in salami and for the analysis of the amines formed in the decarboxylase
medium after enzymatic extract addition.
Sample preparation
Ten grams of sample previously homogenised was extracted with
0.375 M perchloric acid (dilution 1:10 w/v). The mixture is homogenised at
15000 rev/min for 25 min, filtered on paper and on cellulose acetate filter
(diameter = 0.45 μm). Injection volume 10 μL.
Statistical Analysis
Statistical analysis of data was performed using the statistical package
SPSS ver. 11.5. Sample comparison was carried out by one-way ANOVA
to check the effect of the processing factory (temperatures of processing
cycles); the estimated means of the amines at different times were
compared by the Least Significant Differences (LSD) test (P <0.05).
RESULTS AND DISCUSSION
Formation and accumulation of biogenic amines as a
function of technological parameters
The formation of the main biogenic amines and the
decarboxylase activity was monitored in salami as
related to the conditions of the drying and ripening areas
(see experimental design) with special reference to the
temperature during the processing cycles.
Table 2 reports the physico-chemical parameters
of the meat mixture (before stuffing into casings) and
of the salami samples at the end of the ripening stage
(50 days) to find differences, if any, among the samples
which could be ascribed to the processing process. The
compositional characteristics of salami at the end of the
ripening stage do not display significant differences (P
>0.05) to be ascribed to the type of processing applied,
thus making possible a direct comparison between the
samples coming from the different treatments.
The average content of the main amines (bioactive
Tab. 2 – Contenuto salino, attività dell’acqua e valore di pH degli impasti e dei salami stagionati in relazione ai
tre cicli di lavorazione.
Table 2 – Salt content, water activity and pH value of meat mixtures and ripened salami in relation with
three processing cycles.
Sale [g%]
Salt [g%]
aw
pH
2.4 ± 0.3
0.968 ± 0.003
5.61 ± 0.02
Prova 1
Trial 1
3.7 ± 0.5
0.881 ± 0.011
5.65 ± 0.05
Prova 2
Trial 2
3.6 ± 0.4
0.894 ± 0.011
5.68 ± 0.05
Prova 3
Trial 3
3.6 ± 0.4
0.901 ± 0.009
5.65 ± 0.05
Impasto
Meat mixture
Salame stagionato
Ripened salami
Il contenuto medio delle principali ammine (ammine
bioattive e poliammine) e la somma delle ammine biogene propriamente dette (tiramina, putrescina, cadaverina,
istamina, feniletilammina e triptamina) sono riportati nella
amines and polyamines) and the sum of bioactive amines
(putrescine, cadaverine, histamine, phenylethylamine,
tyramine and tryptamine) are reported in Table 3 as a
function of the ripening period, whereas the values of
Tabella 3 in funzione dell’epoca di stagionatura, mentre i
valori dell’attività enzimatica tirosino-, ornitino-, lisino- e istidino-decarbossilasica sono riportati nella Tabella 4.
Dai dati riportati nella Tabella 3 è possibile osservare che
il livello complessivo delle ammine aumenta in maniera
progressiva nell’arco della stagionatura in tutti i batch sperimentali; l’aumento risulta particolarmente evidente per
tiramina e per le ammine alifatiche (putrescina e cadaverina), che risultano, a fine stagionatura, le principali ammine
presenti. Non sono stati rilevati, invece, valori di triptamina
superiori al limite di determinazione del metodo analitico
utilizzato (2 mg kg-1), mentre bassi valori di feniletilammina,
compresi in un intervallo tra 2 e 11 mg kg-1, sono stati osservati in una piccola percentuale di salami a partire dal 35°
giorno di stagionatura.
In accordo con quanto riportato da altri Autori (22-24) anche nei salami prodotti in questa sperimentazione non sono
stati riscontrati livelli di istamina superiori a 2 mg kg-1 di prodotto (limite di determinazione) e, ancor di più, non è stata
rilevata alcuna attività istidino-decarbossilasica.
In diversi studi pubblicati, la presenza di tale ammina nei
prodotti carnei è solitamente attribuita all’utilizzo di materia
prima di scarsa qualità igienica o conservata in modo improprio (22, 9); l’assenza di istamina può essere spiegata dal
fatto che nei prodotti carnei siano stati raramente riscontrati ceppi microbici in grado di sostenere un’attività istidino
decarbossilasica (9) e dall’utilizzo in questo lavoro di tagli
muscolari di elevata qualità igienica.
Un discorso a parte meritano le poliammine alifatiche
(spermidina e spermina), componenti endogeni delle cellule dei tessuti animali e vegetali, presenti sia nei campioni di
impasto sia nei campioni di salame prelevati durante il ciclo
produttivo, per le quali non sono stati osservati cambiamenti significativi (P >0,05) nel corso della stagionatura. L’andamento delle poliammine, riportato nella Tabella 3, sembra
non risentire delle variazioni di temperatura in lavorazione
e i valori medi rilevati sono in accordo con quelli riportati in
letteratura per tessuti muscolari freschi e impasti stagionati
the tirosine, ornithine, lysine and histidine decarboxylase
activities are reported in Table 4.
The data reported in Table 3 show that the overall level
of amines progressively increases during ripening in all
experimental batches; the increase is particularly evident for
tyramine and aliphatic amines (putrescine and cadaverine)
which, at the end of ripening, are shown to be the main
amines present. However, tryptamine values higher than
the detection limit of the analytical method used (2 mg
kg1) were observed, whereas low phenylethylamine values,
ranging from 2 to 11 mg kg-1 were observed in a small
percentage of salami from day 35 of ripening.
In accordance with what reported by other Authors (2224) also the salami produced in this experimentation did
not have histamine levels higher than 2 mg kg-1 product
(detection limit) and, moreover, no histidine-decarboxylase
activity was found.
In a number of studies published, the presence of that
amine in meat products is usually ascribed to the use of raw
material of poor hygienic quality or stored improperly (22, 9);
the absence of histamine can be accounted for by the fact
that in meat products histidine-decarboxylating bacteria
were only rarely found (9); moreover, in this study muscle
cuts of high hygienic quality were used.
Aliphatic polyamines (spermidine and spermine) must
be considered from a different point of view: these
endogenous components of animal and vegetable tissue
cells, present both in the meat mixture and in salami during
the production cycle, did not undergo any significant
changes (P >0.05) during ripening. Polyamine development
and accumulation, reported in Table 3, does not seem to
be affected by temperature changes during processing
and the average values found are in agreement with those
reported in the literature for fresh muscle tissues and ripened
sausages (25, 26). These results seem to confirm the absence
of microbial involvement in their formation, as is assumed by
numerous Authors (13, 15, 27, 28).
INDUSTRIA CONSERVE, N.4, anno 82, 2007
– 297
Tab. 3 – Evoluzione del contenuto di ammine biogene nel corso della stagionatura di salami in funzione della tecnologia
adottata. I dati sono espressi come valore medio ± deviazione standard.
Table 3 – Changes in biogenic amine contents during ripening of salami as a function of the technology adopted. The
data are expressed as average value ± standard deviation.
Prova 1
Tiramina
Tyramine
[mg kg-1]
Trial 1
Prova 2
Trial 2
Prova 3
Trial 3
Prova 1
Putrescina
Putrescine
[mg kg ]
-1
Trial 1
Prova 2
Trial 2
Prova 3
Trial 3
Prova 1
Cadaverina
Cadaverine
[mg kg-1]
Trial 1
Prova 2
Trial 2
Prova 3
Trial 3
Prova 1
Istamina
Histamine
[mg kg-1]
Trial 1
Prova 2
Trial 2
Prova 3
Trial 3
Prova 1
Fenil-etilamina
Phenylethylamine
[mg kg-1]
Trial 1
Prova 2
Trial 2
Prova 3
Trial 3
Prova 1
Spermidina
Spermidine
[mg kg-1]
Trial 1
Prova 2
Trial 2
Prova 3
Trial 3
Prova 1
Spermina
Spermine
[mg kg-1]
Trial 1
Prova 2
Trial 2
Prova 3
Trial 3
Prova 1
Triptamina
Triptamine
[mg kg ]
-1
Trial 1
Prova 2
Trial 2
Prova 3
Trial 3
Ammine biogene totali
(tiramina, putrescina, cadaverina,
istamina, feniletilammina, triptamina)
Prova 2
Trial 2
phenylethylamine, triptamine)
[mg·kg-1]
a,b
Trial 1
Total biogenic amines (tyramine,
putrescine, cadaverine, histamine,
a,b
Prova 1
Prova 3
Trial 3
Impasto
Fine asc.
15 giorni
25 giorni
35 giorni
50 giorni
Meat mixture
End of drying
15 days
25 days
35 days
50 days
5±7
57 ± 11
89 ± 13
129 ± 13
135 ± 18
228 ± 58
5±7
54 ± 10
92 ± 18
109 ± 19
155 ± 18
175 ± 24
5±7
57 ± 11
88 ± 9
129 ± 11
135 ± 12
162 ± 14
9 ± 11
81 ± 15a
118 ± 12a
136 ± 11a
157 ± 13a
198 ± 17 a
9 ± 11
68 ± 17 a
107 ± 15a
115 ± 13b
129 ± 11b
145 ± 15b
9 ± 11
46 ± 11 b
84 ± 18 b
102 ± 11 c
117 ± 12b
129 ± 18 c
<L.O.D.
13 ± 9 a
38 ± 8 a
64 ± 17a
87 ± 14 a
117 ± 24a
<L.O.D.
15 ± 7 a
49 ± 11 a
55 ± 12a
76 ± 12 a
89 ± 14 a
<L.O.D.
6±4b
14 ± 8 b
29 ± 11 b
33 ± 12 b
48 ± 13 b
<L.O.D.
<L.O.D.
<L.O.D.
< L.O.D.
<L.O.D.
<L.O.D.
<L.O.D.
<L.O.D.
<L.O.D.
< L.O.D.
<L.O.D.
<L.O.D.
<L.O.D.
<L.O.D.
<L.O.D.
< L.O.D.
<L.O.D.
<L.O.D.
<L.O.D.
<L.O.D.
<L.O.D.
5±6
7±9
9±5
<L.O.D.
<L.O.D.
<L.O.D.
5±8
7±6
9±7
<L.O.D.
<L.O.D.
<L.O.D.
<L.O.D.
5±4
7±7
6±6
8±6
8±7
11 ± 8
9±7
6±6
6±6
10 ± 9
9±4
6±6
11 ± 7
9±9
6±6
7±6
9±6
10 ± 5
6±9
9±8
31 ± 9
36 ± 8
28 ± 11
26 ± 9
32 ± 9
34 ± 11
31 ± 9
29 ± 9
29 ± 14
31 ± 11
35 ± 11
37 ± 13
31 ± 9
34 ± 9
34 ± 13
32 ± 14
31 ± 14
35 ± 12
<L.O.D.
<L.O.D.
<L.O.D.
<L.O.D.
<L.O.D.
<L.O.D.
<L.O.D.
<L.O.D.
<L.O.D.
<L.O.D.
<L.O.D.
<L.O.D.
<L.O.D.
< L.O.D.
<L.O.D.
<L.O.D.
<L.O.D.
<L.O.D.
14 ± 18
151 ± 35a
245 ± 33a
344 ± 47a
416 ± 44a
565 ± 58a
14 ± 18
137 ± 34a
245 ± 44a
317 ± 52a
387 ± 47a
428 ± 61b
14 ± 18
109 ± 26b
186 ± 35b
260 ± 33b
296 ± 42b
372 ± 59c
= lettere soprascritte indicano una differenza significativa (p <0,05) tra le prove. I confronti sono stati effettuati alla stessa epoca di prelievo.
= the letters written above indicate a significant difference (p <0.05) between the trials. The comparison were made at the same sampling times.
298 –
INDUSTRIA CONSERVE, N.4, anno 82, 2007
Tab. 4 – Evoluzione delle attività enzimatiche amino-decarbossilasiche rilevate nel corso della stagionatura di salami in
funzione della tecnologia adottata. L’attività enzimatica è espressa come mg di singola ammina formata su
terreno decarbossilasico dagli enzimi estratti da 1000 g di salame.
Table 4 – Amino-decarboxylase activities in the course of salami ripening as a function of the technology adopted.
Enzymatic activity is expressed as mg of individual amines formed on decarboxylase substrate by the enzymes
extracted from 1000 g salami.
Impasto
Fine asc.
Meat mixture End of drying
Attività tirosino-decarbossilasica
[mg tiramina da enzimi estratti
da 1000 g di prodotto]
Tyrosine-decarboxylase activity
[mg tiyramine from enzymes extracted
from 1000 g product]
Attività ornitino-decarbossilasica
[mg putrescina da enzimi estratti
da 1000 g di prodotto]
Ornithyne-decarboxylase activity
[mg putrescine from enzymes extracted
from 1000 g product]
Attività lisino-decarbossilasica
[mg cadaverina da enzimi estratti
da 1000 g di prodotto]
Lysine-decarboxylase activity
[mg cadaverine from enzymes extracted
from 1000 g product]
Attività istidino-decarbossilasica
[mg istidina da enzimi estratti
da 1000 g di prodotto]
Hystidine-decarboxylase activity
[mg hystidine from enzymes extracted
from 1000 g product]
Prova 1
Trial 1
Prova 2
Trial 2
Prova 3
Trial 3
Prova 1
Trial 1
Prova 2
Trial 2
Prova 3
Trial 3
Prova 1
Trial 1
Prova 2
Trial 2
Prova 3
Trial 3
Prova 1
Trial 1
Prova 2
Trial 2
Prova 3
Trial 3
15 giorni
15 days
25 giorni
25 days
35 giorni
35 days
50 giorni
50 days
154 ± 28
752 ± 66
722 ± 89
341± 45
337 ± 39
309 ± 16
154 ± 28
605 ± 61
623 ± 78
319 ± 49
218 ± 38
232 ± 17
154 ± 28
848 ± 74
771 ± 89
234 ± 36
301± 37
224 ± 16
299 ±19
2938 ± 132
3278 ± 154 3437 ± 149 3053 ± 165 3853 ± 177
299 ±19
2595 ± 145
2702 ± 147 3298 ± 154 3407 ± 176 3289 ± 187
299 ±19
1645 ± 127
2773 ± 135 3441 ± 173 3127 ± 169 3398 ± 198
23 ± 9
45 ± 6
202 ± 18
345 ± 32
723 ± 65
1080 ± 97
23 ± 9
31 ± 5
70 ± 11
257 ± 27
472 ± 37
626 ± 49
23 ± 9
29 ± 5
57 ± 8
270 ± 28
343 ± 33
519 ± 48
assente
absent
assente
absent
assente
absent
assente
absent
assente
absent
assente
absent
assente
absent
assente
absent
assente
absent
assente
absent
assente
absent
assente
absent
assente
absent
assente
absent
assente
absent
assente
absent
assente
absent
assente
absent
(25, 26). Questi risultati sembrano confermare l’assenza di
un coinvolgimento microbico nella loro formazione, come
sostenuto da numerosi Autori (13, 15, 27, 28).
Al contrario la presenza delle altre ammine bioattive nei
prodotti fermentati e stagionati è, per la maggior parte,
riconducibile all’attività decarbossilasica della flora microbica presente ed è quindi, fondamentalmente, una conseguenza dei processi di selezione microbica che avvengono
nel corso della stagionatura.
Come già indicato nella parte introduttiva, numerosi studi condotti sull’attività amino-formante di ceppi microbici
isolati da prodotti carnei freschi e stagionati hanno mostrato che la maggior parte dei generi microbici è in grado di
produrre metaboliti amminici. Alcune osservazioni fatte nel
corso di questi ultimi anni hanno permesso di definire il ruolo
delle singole specie microbiche nella formazione delle ammine. L’attitudine a formare ammine è una caratteristica
specie-specifica legata alla presenza delle singole attività
amino-decarbossilasiche. Specie microbiche solitamente
considerate come contaminanti indesiderati (quali Enterobacteriaceae e Gram-negativi) ma anche numerosi ceppi
di Lattobacilli, Micrococchi, Pediococchi e Lattococchi,
normalmente coinvolti nei processi di fermentazione e maturazione degli insaccati possiedono una o più attività amino-formante.
Le osservazioni effettuate hanno messo in evidenza che
la formazione e l’accumulo di tiramina sono generalmente
On the contrary, the presence of the other bioactive
amines in fermented and ripened products can be mainly
ascribed to the decarboxylase activity of the microflora
present and is, therefore, mainly a consequence of the
microbial selection processes which occur during ripening.
As has already been indicated in the introduction part,
numerous studies on the amino-forming activity of microbial
strains isolated from fresh and ripened meat products
showed that most microbial genera are able to produce
amine metabolites. Some observations made during the last
few years allowed us to define the role of individual microbial
species in amine formation. The ability to form amines is a
species-specific characteristic linked to the presence of
the individual amino-decarboxylase activities. Microbial
species usually considered as undesirable contaminants
(such as Enterobacteriaceae and Gram-negatives) but also
numerous Lactobacillus, Micrococcus, Pediococcus and
Lactococcus strains, usually involved in the fermentation
and ripening processes of meat products have one or more
amino-forming activity.
The observations made have evidenced that the
formation and accumulation of tyramine is generally
supported by Lactobacillus, the formation of cadaverin by
Enterococcus and spoilage microflora material, whereas
putrescin formation can be attributed to the action of both
of them (6, 9, 15, 24).
INDUSTRIA CONSERVE, N.4, anno 82, 2007
– 299
sostenuti da Lactobacillus, la formazione di cadaverina da Enterococcus e altra microflora d’alterazione, mentre la formazione
di putrescina è attribuibile all’azione di entrambi (6, 9, 15, 24).
Numerosi fattori come la qualità igienica della materia prima,
il tenore salino, l’aggiunta di additivi e i parametri tecnologici di
stagionatura - agendo sulla selezione della microflora nel corso
della stagionatura – possono influire sulla formazione di questi
metaboliti che si accumulano durante il processo di maturazione e che sono quindi rilevabili nel prodotto stagionato, anche
quando non è più possibile riscontrare la presenza della microflora responsabile (15).
Pertanto è utile rilevare la presenza delle ammine per evitare
eventuali conseguenze a livello tossicologico per i consumatori
e per avere precise indicazioni sulla qualità del processo produttivo e del prodotto finito.
Tra i numerosi fattori che possono influire sulla formazione di
questi metaboliti, questo studio ha concentrato l’attenzione
sul processo, per verificare se è possibile limitare l’accumulo di
ammine con il solo controllo tecnologico, partendo dalla stessa
materia prima.
Nelle Tabelle 3 e 4 è possibile seguire l’evoluzione delle principali ammine e delle attività decarbossilasiche alle diverse
epoche di prelievo in funzione dei cicli di temperatura di asciugamento e stagionatura. Le specifiche attività decarbossilasiche rappresentano il contributo dei singoli ceppi microbici
selezionati dal processo tecnologico e sviluppati nel prodotto
rilevati nel corso della stagionatura. A differenza della maggior
parte dei dati riportati in letteratura che si riferiscono alle attività decarbossilasica di ceppi isolati dal prodotto e misurate in
vitro, i livelli enzimatici riportati in questo lavoro sono il risultato
dell’espressione enzimatica di tutta la microflora decarbossilasipositiva, selezionata nel corso del processo e presente alle varie
scadenze produttive.
A parità di attività decarbossilasica iniziale, la formazione e
l’accumulo di cadaverina e di putrescina risultano dipendere
(P <0,05) dall’aumento della temperatura, rispettivamente, della fase di asciugamento e di stagionatura.
Nel caso della putrescina, i dati presentati nella Tabella 3
indicano che le temperature della fase di asciugamento e
stagionatura esercitano un’influenza determinante (P <0,05)
sulla formazione e sul progressivo accumulo di putrescina nel
prodotto finito. Solo nella prova 3 dove il ciclo di asciugamento e di stagionatura avviene a temperature ridotte è possibile
contenere l’accumulo di putrescina negli insaccati stagionati
a valori di poco inferiori ai 130 mg kg-1. In generale è evidente l’effetto esercitato dalla temperatura che, in modo diretto
e proporzionale, sostiene l’attività ornitino-decarbossilasica fino
alle fasi finali della stagionatura.
Nel caso dell’attività lisino-decarbossilasica e della sintesi di
cadaverina, il fattore in grado di spiegare la diversa evoluzione
nelle tre prove sembra essere la temperatura media della fase
di asciugamento: nei salami delle prove 1 e 2 , entrambi caratterizzati da temperature superiori a 22°C in asciugamento, già
dopo 15 giorni sono stati osservati valori medi superiori (P <0,01)
rispetto alla prova 3. L’accumulo progressivo di cadaverina
prosegue nella fase di stagionatura di entrambe le prove, sostenuto da un’attività lisino-decarbossilasica più elevata anche
quando – come nella prova 2 – le temperature di stagionatura
tornano in linea con quelle della prova 3, dove invece il dato
medio di cadaverina non supera i 60 mg kg-1.
Le temperature più elevate ( >22°C) delle prime fasi di lavorazione potrebbero sostenere la crescita di ceppi microbici di
300 –
INDUSTRIA CONSERVE, N.4, anno 82, 2007
Numerous factors such as the hygienic quality of raw
material, salt content, the use of additives and ripening
technological parameters, by acting on microflora
selection during ripening, may affect the formation of these
metabolites which accumulate during the ripening process
and can therefore be detected in the ripened product,
also when the presence of the microflora involved cannot
be detected any more (15).
Therefore, it can be useful to detect the presence
of amines in order to avoid possible consequences for
consumers at a toxicological level and to have precise
indications on the quality of the production process and of
the finished product.
Among the numerous factors which may affect the
formation of these metabolites, in this study focus was
on the process to evaluate whether it is possible to limit
accumulation of amines through technological control
only, starting from raw material.
Tables 3 and 4 show the evolution of the main amines
and decarboxylase activities at the different sampling
times as a function of drying temperature cycles and
ripening. Specific decarboxylase activities represent the
contribution of individual microbial strains selected from
the technological process and developing in the product
during ripening. Unlike most literature data which refer to the
decarboxylase activities of strains isolated from the product
and measured in vitro, the enzymatic levels reported in this
work are the result of the enzymatic expression of the whole
decarboxylase-positive microflora, selected during the
process and present at the different processing times.
For equal initial decarboxylase activities, the formation
and the accumulation of cadaverin and putrescin prove
to depend (P <0.05) on temperature increase of the drying
and ripening stages, respectively.
In the case of putrescine, the data presented in Table 3
indicate that the temperatures of the drying and ripening
stages exert a determining influence (P <0.05) on the
formation and progressive accumulation of putrescin in
the finished product. Only in trial 3 where the drying and
ripening cycle occurs at lower temperatures a reduction
of the accumulation of putrescin in ripened meat products
to values lower than 130 mg kg-1 is possible. In general, the
effect exerted by temperature is evident; this, in a direct
and proportional way, supports ornithine-decarboxylase
activity up to final ripening steps.
In the case of lysine-decarboxylase activity and
cadaverine synthesis, the factor able to account for
the different evolution in the three trials seems to be the
average temperature of the drying step: in salami from trials
1 and 2, both characterised by temperatures higher than
22°C during drying, already after 15 days were observed
average values higher (P <0.01) than those of trial 3.
Progressive accumulation of cadaverin continues during
the ripening stage in both trials, this being supported by a
higher lysino-decarboxylase activity even when, as in trial 2,
ripening temperatures fall again within the range of those
of trial 3, where, instead, the average datum of cadaverin
does not exceed 60 mg kg-1.
The higher temperatures (>22°C)of the first processing
steps might support the growth of microbial strains of
Enterobacteriaceae and Gram-negative strains, common
Enterobacteriaceae e ceppi Gram-negativi, abituali contaminanti degli impasti e tra i principali responsabili della sintesi di
cadaverina. L’attività enzimatica risulterebbe, quindi, essere
influenzata dalle temperature della fase di asciugamento che
pur permettendo una buona discesa di pH (valore minimo riscontrato 5,4) non consente tuttavia di contenere la crescita
della microflora contaminante.
L’attività tirosino-decarbossilasica e l’accumulo di tiramina
procedono con la maturazione indipendentemente dai valori
di temperatura in lavorazione (P >0,05), anche se si può osservare una tendenza all’aumento dell’attività enzimatica in funzione delle temperature di processo.
I dati medi nel prodotto stagionato sono in accordo con
quelli riportati in letteratura e riferiti a salami fermentati prodotti
senza colture starter (13, 15, 29, 30). In tutti questi insaccati la
tiramina varia, infatti, in un intervallo molto ampio compreso
tra 64 e 295 mg kg-1 e risulta sempre l’ammina principale a fine
stagionatura, con un rapido aumento fin dalle prime fasi del
processo produttivo.
Anche se in questo lavoro non sono stati osservati effetti significativi della temperatura sulla formazione di tiramina,
l’intervallo di variazione osservato negli insaccati provenienti
dalle tre prove (a fine stagionatura tra 162 e 228 mg kg-1) fa
ipotizzare il coinvolgimento di più fattori tecnologici e microbiologici insieme.
Dalla Figura 1 è evidente che la riduzione delle temperature
di asciugamento e stagionatura ai livelli riportati nel presente
lavoro, permette, in seconda battuta, di contenere efficacemente la formazione delle ammine, compatibilmente con il
mantenimento delle caratteristiche organolettiche dei salumi
stagionati.
contaminants of the mixes and among the main agents
responsible for cadaverin synthesis. Enzymatic activity,
therefore, would appear to be influenced by the drying
stage temperatures which, although allowing a good pH
decrease (minimum value observed 5.4), does not allow
growing contaminating microflora.
The tyrosine-decarboxylase activity and tyramine
accumulation advance with maturing independently of
temperature values during processing (P >0.05), even though
a tendency toward an increase in enzymatic activity as a
function of processing temperatures can be observed.
The average data in the ripened product are in
agreement with those reported in the literature referring
to fermented salami produced without standard cultures
(13, 15, 29, 30). In all these products, tyramine, in fact,
widely ranges between 64 and 295 mg kg-1 and is always
the main amine at the end of ripening, with a rapid
increase from the very first stages of the production
process.
Although in this work no significant effects of
temperature on tyramine formation were observed, the
variation range found in the products from the three trials
(between 162 and 228 mg kg -1 at the end of ripening)
let us assume involvement of several technological and
microbiological factors.
Figure 1 shows that a reduction in drying and ripening
temperatures to the levels reported in the present
work allows, in a second phase, amine formation to be
effectively controlled, compatibly with the maintainance
of the sensory chracteristics of ripened meat products.
FIG. 1 – Effetto della temperatura sull’accumulo delle ammine (putrescina, cadaverina, tiramina): confronto tra il contenuto medio
dell’impasto e il livello medio riscontrato nei salami a fine stagionatura provenienti dalle tre prove. Le condizioni di stagionatura
delle tre prove sono riportate nella Tabella 1.
FIG.1 – Effect of temperature on amine accumulation (putrescine, cadaverine, tyramine): comparison between average meat
mixture content and average level found in salami at the end of ripening coming from the three trials. Ripening conditions in
the three trials are reported in Table 1.
INDUSTRIA CONSERVE, N.4, anno 82, 2007
– 301
Mettendo in relazione l’andamento dell’attività tirosinoe lisino-decarbossilasica con l’evoluzione del pH (Figura 2)
registrato durante la stagionatura dei salami, si può osservare che l’attività tirosino-decarbossilasica raggiunge un
massimo durante la fase di asciugamento in corrispondenza proprio del minimo di pH (pH = 5,4 alla fine della fase
di asciugamento) per poi abbassarsi nella seconda fase
di stagionatura. L’andamento della curva coincide con il
massimo sviluppo della microflora lattica, di cui è stata descritta la capacità di favorire, oltre all’acidificazione, anche
l’attività tirosino-decarbossilasica (13, 28). Anche l’accumulo di tiramina procede rapidamente in corrispondenza
dell’attività decarbossilasica, con un rapido aumento nella
fase di fermentazione, per poi rimanere attorno a valori costanti nella seconda parte della stagionatura.
By relating the pattern of tyrosine and lysine decarboxylase
activities to pH course (Figure 2) recorded during salami
ripening it can be observed that tyrosine-decarboxylase
activity reaches a maximum during the drying stage in
correspondence with pH minimum value (pH = 5.4 at the
end of the drying stage). The pattern of the curve coincides
with maximum growth of lactic acid microflora whose ability
to favour, beyond acidification, also tyrosine-decarboxylase
activity was described (13, 28). Also tyramine accumulation
rapidly progresses in correspondence with decarboxylase
activity, with a rapid increase in the fermentation stage, to
settle around constant values in the second part of ripening.
An opposite behaviour is observed for lysine-decarboxylase
activity which remains at minimum values until pH does not
FIG. 2 – Andamento delle attività tirosino- e lisino-decarbossilasiche in relazione all’evoluzione del pH nel corso
della maturazione dei salami.
FIG.2 – Tyrosine- and lysine-decarboxylase activities in relation with pH changes during salami ripening
6,4
600
500
6
400
300
5,6
200
100
0
impasto
5,2
fine asc
15 gg
25 gg
35 gg
50 gg
te mpo di stagiona tura (giorni)
tirosina decarbossilasi
Un andamento opposto viene osservato per l’attività
lisino-decarbossilasica che resta ai minimi valori fino a
quando il pH non comincia a risalire dal 20° giorno in
avanti. Anche in questo caso è evidente l’analogia tra
le condizioni ambientali, la selezione microbica e l’attività enzimatica: la fase di acidificazione costituisce un
ostacolo alla sopravvivenza e allo sviluppo dei ceppi di
Enterobacteriaceae e Gram-negativi, ceppi produttori
di cadaverina ed è in grado di rallentarne le attività enzimatiche.
L’accumulo di putrescina e cadaverina aumenta,
quindi, dopo i primi 15-20 giorni di stagionatura e da
quel momento in poi i valori medi delle due ammine
si discostano da quelli osservati alla fine della fase di
asciugamento per aumentare in maniera significativa (P
<0,05) soprattutto nei salami della prova 1.
302 –
INDUSTRIA CONSERVE, N.4, anno 82, 2007
lisina decarbossilasi
pH
start to increase again from day 20. Also in this case analogy
among environmental conditions, microbial selection and
enzymatic activity is evident: the acidification stage is an
obstacle to survival a growth of Enterobacteriaceae e Gramnegative strains, cadaverine producers, and is able to slow
down their enzymatic activities.
Accumulation of putrescine and cadaverine, therefore,
increases after the initial 15-20 days’ ripening and from that
time on average values of the two amines are different from
those observed at the end of the drying stage to increase
significantly (P <0.05) especially in salami from batch 1.
Decarboxylase activity and formation of biogenic amines:
comparison between potential and actual production during
ripening of salami.
Attività decarbossilasica e formazione di ammine biogene:
confronto tra produzione potenziale ed effettiva nel corso
della stagionatura di salami.
Sono stati messi a confronto i livelli di ammine potenzialmente prodotti dall’attività enzimatica estratta dai campioni con la concentrazione reale delle ammine riscontrata:
nei tre grafici della Figura 3, l’area sullo sfondo indica l’evoluzione delle singole attività decarbossilasiche a cui viene
sovrapposto il dato medio della relativa ammina in forma
di grafico a barre.
The amine levels potentially produced by the enzymatic
activity extracted from samples were compared with the
actual concentration of the amines observed: in the three
plots in Figure 3, the area in the background indicates
the evolution of the individual decarboxylase activities to
which the average datum of the corresponding amine is
overlapped in the form of a bar graph.
The data reported refer to the average of all samples
processed according to the experimental design (average
FIG. 3 – Confronto tra le singole attività amino-decarbossilasiche (tirosino-, ornitino- e lisino-decarbossilasi) e la corrispondente
ammina (tiramina, putrescina e cadaverina) realmente formatasi nel corso della maturazione di salami. Le condizioni
di stagionatura (asciugatura e stagionatura) sono riportate nella Tabella 1.
FIG.3 – Comparison between individual amino-decarboxylase activities (tyrosine, ornithine and lysine-decarboxylase) and the
corresponding amines (tyramine, putrescine and cadaverine) really forming during salami ripening. Ripening conditions are
reported in Table 1.
attività tirosino
decarbossilasica
(mgkg-1 prodotto)
tiramina
(mgkg-1)
attività ornitino
decarbossilasica
(mgkg-1 prodotto)
putrescina
(mgkg-1)
attività lisino
decarbossilasica
(mgkg-1 prodotto)
cadaverina
(mgkg-1)
INDUSTRIA CONSERVE, N.4, anno 82, 2007
– 303
I dati riportati si riferiscono alla media di tutti i campioni
lavorati secondo il disegno sperimentale (dato medio delle
tre prove). Il confronto viene effettuato lungo tutto il corso
della stagionatura per verificare se e quanto le condizioni
tecnologiche adottate nel corso della maturazione possano influire sull’espressione dell’attività enzimatica, limitando
o meno la formazione e l’accumulo delle ammine.
Dalla Figura 3 è evidente come il contenuto reale di metaboliti amminici sia notevolmente inferiore a quello potenziale, cioè a quello prodotto nelle condizioni impiegate nel
saggio enzimatico, anche quando i parametri tecnologici
delle singole fasi di produzione (temperatura, pH, aw) possono sostenere una maggiore attività amino-decarbossilasica, come nel caso della prova 1.
È da sottolineare che la somma delle ammine biologicamente attive rilevate nel corso della maturazione e riportata nella Tabella 3 resta al di sotto dei limiti di interesse tossicologico segnalati (1000 mg kg-1) (31).
CONCLUSIONI
La determinazione dell’attività decarbossilasica nella produzione di salami a lunga stagionatura ha permesso di osservare il
diverso andamento delle singole attività enzimatiche.
L’ornitino decarbossilasi e la lisino decarbossilasi aumentano
durante l’intero processo produttivo, con un aumento particolarmente accentuato dopo il rialzo del pH. È risultata evidente
l’influenza delle temperature di stagionatura sulla formazione
di cadaverina: nel processo condotto a temperatura più alta
si instaurano probabilmente condizioni ambientali ottimali per
selezionare una flora microbica decarbossilasi positiva, anche
quando il processo di disidratazione e le variazioni di pH sono
sotto controllo.
Nel caso dell’attività tirosino-decarbossilasica, è stato osservato un rapido aumento proprio nel primo periodo di stagionatura in concomitanza della diminuzione del pH, così come
osservato anche da altri Autori, in associazione con l’accrescimento della flora lattica. Nella seconda fase della stagionatura
vera e propria l’attività tirosino-decarbossilasica subisce un calo
evidente e il livello di tiramina non si discosta da quello raggiunto dopo i primi 20 giorni di stagionatura.
È importante comunque sottolineare che un primo effetto di
contenimento della formazione dei metaboliti amminici è costituito dalla tradizionale tecnologia di stagionatura: le condizioni
tecnologiche adottate nel corso della stagionatura risultano,
infatti, importanti nel controllo dell’accumulo di ammine anche
in presenza di un’elevata attività amino-formante.
La riduzione delle temperature di asciugamento e stagionatura ai livelli riportati nel presente lavoro, permette, in seconda battuta, di contenere efficacemente la formazione delle
diammine (putrescina e cadaverina), compatibilmente con il
mantenimento delle caratteristiche organolettiche dei salumi
stagionati.
Se da una parte è vero che i prodotti sottoposti a un processo
fermentativo risentono inevitabilmente del fenomeno di formazione e accumulo di ammine biogene anche quando il processo produttivo è condotto con il massimo controllo delle condizioni igieniche e di processo, è altresì evidente che dallo stesso
impasto di partenza si arriva ad un profilo finale di ammine molto
differente anche solo variando i parametri di processo.
304 –
INDUSTRIA CONSERVE, N.4, anno 82, 2007
datum of the three batches). The comparison is
performed throughout ripening to assess whether and
to what extent the technological conditions adopted
during ripening may affect the expression of enzymatic
activity while possibly limiting the formation and
accumulation of amines.
Figure 3 shows that the real content of amine
metabolites is much lower than the potential one, i.e. that
produced under the conditions used in the enzymatic
test, even when the technological parameters of the
individual production stages (temperature, pH, a w) can
support a higher decarboxylase activity, as was the
case of trial 1.
It must be underlined that the sum of biologically
active amines detected during ripening and reported in
Table 3 remains below the limits of toxicological interest
indicated (1000 mg kg -1) (31).
CONCLUSIONS
The determination of decarboxylase activity in the production
of long-ripening salami allowed the different evolution of the
individual enzymatic activities.
Ornithine-decarboxylase and lysine-decarboxylase increase
during the whole production process, with a particularly
marked increase after pH increase. The influence of ripening
temperatures on cadaverine accumulation proved evident:
in the process performed at higher temperature optimum
environmental conditions to select a decarboxylase-positive
microbial flora are probably present even when the dehydration
process and changes in pH are under control.
In the case of tyrosine-decarboxylase activity a rapid increase
was observed just in the first ripening period concurrently
with pH decrease, as was observed also by other Authors, in
association with the growth of lactic acid flora. In the second
stage of ripening the tyrosine-decarboxylase activity undergoes
an evident decrease and tyramine level is the same as that
reached after the first 20 days’ ripening.
However, it is important to underline that a first control
on the formation of amine metabolites is performed by the
traditional ripening technology: the technological conditions
applied during ripening are, in fact, important in the control
of amine accumulation also in the presence of a high aminofermentative activity.
Decrease of drying and ripening temperatures to the levels
reported in the present work allows, in a second phase, effective
control of diamine (putrescine and cadaverine), compatibly
with the maintainance of the sensory characteristics of ripened
meat products.
If, on one hand, it is true that the products undergoing
a fermentative process are inevitably affected by the
phenomenon of formation and accumulation of biogenic
amines even when the production process is performed under
strict hygienic and process conditions, it also evident that,
although the original mix used is the same, the final amine
profile achieved is much different even by changing the
process parameters alone.
Thus, assuming that the evolution of technological conditions
during salami ripening process is able to control amine
È giustificato, allora, affermare che l’evoluzione delle condizioni tecnologiche durante il processo di maturazione dei salami è in grado di contenere la formazione di ammine, anche
in presenza di una considerevole attività potenziale, salvaguardando, in tal modo, la salubrità dei prodotti.
I dati ottenuti in questo lavoro incoraggiano a proseguire sulla via di una limitazione delle temperature di stagionatura e a
riservare una particolare attenzione anche alle temperature di
conservazione dei prodotti interi o confezionati.
Si avverte comunque la necessità di approfondire il ruolo
svolto dagli additivi e da specifici ceppi microbici (starter) per
individuare le eventuali sinergie con i cicli termici di lavorazione,
al fine di indicare le condizioni tecnologiche idonee al contenimento delle ammine e della tiramina in particolare.
formation, it is justified to state that evolution of technological
conditions during ripening of salami is able to control amine
formation, even in the presence of considerable potential
activity, which ensures product safety.
The data obtained in this work allow for efforts being
directed towards limiting ripening temperatures, with
attention being paid also to storage temperatures of whole
or packaged products.
There is also a need to perform further studies on the role
played by additives and specific microbial strains (starter) to
look for potential synergies with thermal processing cycles, in
order to detect suitable technological conditions for amine
control, especially tyramine.
Parma, 10 maggio 2007
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INDUSTRIA CONSERVE, N.4, anno 82, 2007
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INDUSTRIA CONSERVE, N.4, anno 82, 2007