diastat anti-ro - Technogenetics

BEIA CMV IgG Avidity
21871
Edizione 20/04/2013
Solo per uso professionale
0459
TECHNOGENETICS SRL
N° 00524
Pag. 1 - 28 BEIA CMV IgG Avidity Ed. 20/04/2013
INTRODUZIONE
Il kit BEIA CMV IgG Avidity è un test immunoenzimatico
quantitativo (ELISA) per la determinazione nel siero o nel plasma
dell’avidità degli anticorpi di classe IgG specifici verso il
Citomegalovirus umano.
SIGNIFICATO CLINICO
Il Cytomegalovirus umano (HCMV) appartiene alla famiglia delle
Herpersviridae sottofamiglia delle Betaherpesvirinae. Il virione è
costituito da un nucleo cilindrico (core) circondato da un filamento
di DNA a doppia elica. Questa struttura è rivestita da un Capside e
all’esterno si rilevano una o più membrane contenenti lipidi. E’ un
virus ubiquitario e specie-specifico.
L’infezione da Cytomegalovirus può essere primaria (infezione
congenita o infezione post-natale) oppure secondaria (riattivazione
della replicazione virale) in individui quali le donne in gravidanza,
in terapia immunosoppressiva ed in presenza di malattie molto
gravi. L’infezione congenita, che può essere causata sia da infezione
primaria che da reinfezione della donna gravida, è trasmessa per via
transplacentale o al momento della nascita ed è responsabile, nei
neonati infetti, di gravi manifestazioni cliniche quali sordità,
corioretinite,
microcefalia,
idrocefalo, cardiopatia, epatite,
epatosplenomegalia, trombocitopenia, aborto spontaneo.
Le infezioni post-natali sono spesso asintomatiche eccetto negli
individui immunocompromessi ( AIDS, tumori, trapianti) nei quali
l’infezione evolve in forma disseminata comportando, in questi
individui, severe complicanze (anemia emolitica, encefalite,
splenomegalia, morte). La diagnosi dell'infezione da CMV può
essere condotta sia con la ricerca diretta della presenza del virus,
(viremia, DNAemia, antigenemia) che con la ricerca indiretta della
presenza di anticorpi di classe IgG ad IgM.
Le immunoglobuline di classe IgM sono rilevabili dopo 1-2
settimane dall'infezione mentre le IgG appaiono circa una settimana
più tardi rispetto alle IgM
Il dosaggio delle IgM specifiche è importante per diagnosticare la
fase acuta dell'infezione, tenendo presente che tali anticorpi possono
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essere prodotti anche nel 50% dei casi di infezione secondaria nei
pazienti immunocompromessi.
Il dosaggio delle IgG, essendo la presenza di queste
immunoglobuline sinonimo di infezione pregressa, permette di
distinguere la popolazione protetta da quella non protetta.
Numerosi studi hanno ormai dimostrato che la distinzione tra
infezione primaria e non primaria, può essere efficacemente
conseguita mediante la ricerca delle IgG a differente avidità in
quanto l'infezione primaria è caratterizzata dalla presenza di IgG a
minore avidità per l'antigene rispetto a quella che caratterizza le IgG
prodotte a seguito di successivi stimoli antigenici.
La determinazione dell’avidità degli anticorpi anti-CMV di classe
IgG, permettendo di datare l’infezione, risulta particolarmente utile
nel confermare od escludere un’infezione primaria nei primi mesi di
gravidanza.
PRINCIPIO DEL METODO
Il test BEIA CMV IgG Avidity è un dosaggio immunoenzimatico in
micropozzetti. I micropozzetti di polistirene sono rivestiti con
l'antigene CMV.
Ogni campione da esaminare viene dispensato in due micropozzetti
contigui (“ a ” - “ b ” ); le IgG del campione si legano alla fase
solida formando un complesso antigene-anticorpo.
Dopo aver allontanato con un lavaggio tutto quanto non si è legato
alla fase solida, si aggiunge al micropozzetto “ a ” un tampone di
composizione tale da non modificare le forze di legame antigeneanticorpo e nel micropozzetto “ b ” un tampone dissociante che è in
grado di staccare dalla fase solida prevalentemente gli anticorpi a
bassa avidità.
Dopo aver eseguito un ulteriore lavaggio, la quantità di IgG rimasta
legata alla fase solida viene rilevata mediante l’aggiunta di anti-IgG
umane coniugate con perossidasi (HRP).
Dopo allontanamento del coniugato non legato, viene aggiunto il
substrato-TMB che, per azione dell’enzima presente sulla fase
solida, sviluppa una colorazione azzurra.
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L’aggiunta di una soluzione di acido solforico 1N blocca la reazione
e provoca il viraggio del colore da azzurro a giallo. La densità ottica
letta a 450/620 nm è direttamente proporzionale alla quantità di IgG
specifiche rimaste legate alla fase solida.
Nel kit BEIA CMV IgG Avidity la concentrazione degli anticorpi
di classe IgG presenti nel micropozzetto “ a “ e nel micropozzetto “
b “ viene calcolata mediante l'utilizzo di una curva di calibrazione e
viene espressa in mU/mL arbitrarie.
Il rapporto tra le due concentrazioni fornisce un indice che riflette
l’avidità degli anticorpi presenti nel campione in esame.
CONTENUTO DELLA CONFEZIONE
La confezione è sufficiente per 96 determinazioni.
Componente
SORB
A
Strip da 8 micropozzetti frazionabili
12x8x1
CAL
0
B
Calibratore 0 (0 mU/mL)
1 x 2 mL
CAL
1
C1
Calibratore 1 (25 mU/mL)
1 x 2 mL
CAL
2
C2
Calibratore 2 (50 mU/mL)
1 x 2 mL
CAL
3
C3
Calibratore 3 (100 mU/mL)
1 x 2 mL
CAL
4
C4
Calibratore 4 (300 mU/mL)
1 x 2 mL
CAL
5
C5
Calibratore 5 (600 mU/mL)
1 x 2 mL
CONTROL
L
D
Controllo L
1 x 2 mL
CONTROL
H
E
Controllo H
1 x 2 mL
DIL
SPE
F
Diluente Campioni
1 x 120 mL
SOLN
AVID
G
Soluzione Avidita’
1 x 15 mL
H
Coniugato
1 x 13,5 mL
CONJ
BUF
WASH 20X
I
Tampone di Lavaggio
1 x 100 mL
SUBS
TMB
J
Substrato-TMB
1 x 13,5 mL
k
Soluzione Stoppante
1 x 25 mL
Istruzioni per l’uso
1
Certificato d’analisi
1
H2SO4
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A.
Strip sensibilizzate
Strip sensibilizzate con antigene CMV inattivato, in busta
ermetica richiudibile. Riporre le strip non utilizzate nella busta
e richiudere. Le strip sono frazionabili in micropozzetti singoli.
B. Calibratore 0 mU/mL
Siero umano negativo per anticorpi IgG anti-CMV. Contiene
0,09%
p/p
di
sodio
azide
come
conservante.
Reagente pronto all'uso.
C. Calibratori 25, 50,100, 300 e 600 mU/mL
Siero umano a concentrazioni note di anticorpi IgG anti- CMV.
Contengono 0,09% p/p di sodio azide come conservante.
Reagenti pronti all’uso.
D. Controllo L
Siero umano con anticorpi IgG anti-CMV a bassa avidità.
Contiene 0,09% p/p di sodio azide come conservante.
Reagente pronto all'uso.
E. Controllo H
Siero umano con anticorpi IgG anti-CMV ad alta avidità.
Contiene 0,09% p/p di sodio azide come conservante.
Reagente pronto all'uso.
F. Diluente Campioni
Soluzione salina tamponata (PBS), proteine e siero umano
negativo per anticorpi IgG anti-CMV. Contiene 0,09% p/p di
sodio azide come conservante e Tween 20.
Reagente pronto all'uso.
G. Soluzione Avidità
Tampone CAPS contenente Tiocianato di potassio, Triton X-100
e colorante (giallo). Reagente pronto all'uso.
H. Coniugato
Soluzione contenente anticorpo monoclonale anti-IgG umane,
coniugato con perossidasi. Reagente pronto all'uso.
I. Tampone di Lavaggio
Soluzione salina tamponata (PBS) concentrata 20 volte. Contiene
0,1 % di Kathon CG e Tween 20. Vedi preparazione dei reagenti
J. Substrato-TMB
Soluzione contenente H2O2/TMB, stabilizzanti e colorante
(rosa). Reagente pronto all'uso.
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K.
Soluzione Stoppante
Soluzione 1N di acido solforico. Reagente pronto all'uso.
MODALITÀ DI CONSERVAZIONE
Tutti i reattivi devono essere conservati a 2-8°C al riparo dalla luce.
Non utilizzare i reattivi oltre la data di scadenza riportata
sull’etichetta.
REAGENTI INTERCAMBIABILI
Il Tampone di Lavaggio, il Substrato-TMB e la Soluzione Stoppante sono
intercambiabili tra i diversi kit della linea BEIA.
MATERIALE E STRUMENTI RICHIESTI, MA NON FORNITI





Lettore di colorimetria per micropiastre con filtro a 450/620 nm.
Apparecchiatura manuale o automatica per il lavaggio di
micropiastre.
Micropipette con puntali monouso da 10, 100, 200, 500, 1000 µL.
Provette monouso e normale vetreria da laboratorio.
Acqua distillata o deionizzata.
AVVERTENZE E PRECAUZIONI






Prima dell'uso portare tutti i reattivi a temperatura ambiente
(18-25°C). Prelevare solo la quantità necessaria per l'analisi.
Evitare l'essiccamento dei micropozzetti.
Usare esclusivamente vetreria accuratamente pulita.
Non utilizzare uno stesso puntale per pipettare reagenti
diversi.
Cambiare il puntale tra un campione e l’altro.
Qualora il Substrato-TMB evidenziasse un viraggio da rosa ad
azzurro, il reagente non deve essere utilizzato.
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


Se il dosaggio viene ripetuto, preparare una nuova diluizione
del campione.
Si raccomanda di inserire in ogni corsa analitica dei campioni
di controllo al fine di validare i risultati ottenuti, secondo
criteri e procedure che ciascun utilizzatore deve definire.
Procedere periodicamente alla manutenzione e taratura delle
pipette e del lettore.
AUTOMAZIONE
Il test può essere eseguito con sistemi automatici per kit ELISA, nel
qual caso Vi invitiamo a consultare il manuale specifico dello
strumento per una corretta esecuzione della corsa analitica del kit.
PRELIEVO E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
Il dosaggio può essere eseguito su siero o plasma (Eparina-EDTA).
Se il dosaggio è eseguito entro 5 giorni dal prelievo, i campioni
possono essere conservati a 2-8 °C. In caso contrario aliquotare i
campioni e congelarli a -20°C. Evitare ripetuti scongelamenti e
congelamenti. Si sconsiglia l’uso di campioni lipemici, torbidi ed
emolizzati. I campioni devono essere opportunamente diluiti con il
Diluente Campioni prima del dosaggio. Vedi esecuzione del test.
PREPARAZIONE DEI REAGENTI

Tampone di Lavaggio
Diluire il Tampone di Lavaggio (20x) 1:20 con acqua distillata
o deionizzata prima dell'uso. Dopo ricostituzione il tampone è
stabile 15 giorni se conservato a 2-8°C e comunque non oltre la
data di scadenza riportata sull'etichetta originaria. Nel
Tampone di Lavaggio concentrato si possono formare dei
precipitati cristallini che si solubilizzano portando il reagente a
37°C prima della diluizione. Si raccomanda di diluire la
quantità di tampone necessaria per eseguire i lavaggi
dell'analisi in corso.
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CICLO DI LAVAGGIO
Si consiglia di procedere come segue sia nel caso in cui si utilizzi un
lavatore automatico di micropiastre sia nel caso in cui si operi
manualmente.
1. Svuotare completamente i micropozzetti.
2. Riempirli con 300 µL di tampone di lavaggio.
3. Svuotare i micropozzetti.
4. Ripetere i punti 2 e 3 per ulteriori 3 cicli.
5. Asciugare con carta assorbente la superficie esterna dei
micropozzetti al termine del lavaggio.
ESECUZIONE DEL TEST
1.
Portare i reagenti a temperatura ambiente (almeno 30-60 minuti
a 18-25°C).
Diluire secondo lo schema riportato i campioni in esame con il
Diluente campioni. Agitare su Vortex.
Concentrazione IgG anti-CMV
Diluizione campione
Bassa
1:50
Media
1: 200
Alta
1:500 - 1: 2000
Poiché non esiste uno standard internazionale di riferimento, la concentrazione
di anticorpi specifici anti-CMV di un campione è intesa come la risposta
relativa rispetto al Cut-off ottenuta con il kit presente in ogni singolo
laboratorio.
2.
3.
4.
5.
Prelevare il numero di strip necessarie per l'analisi in funzione
del numero di campioni in esame, dei Controlli e dei
Calibratori (vedi il paragrafo “Schema del dosaggio”).
Richiudere accuratamente la busta.
N.B. Per ogni Controllo e Campione considerare due
micropozzetti. Per i calibratori soltanto uno.
Dispensare nei rispettivi micropozzetti 100 L di ciascun siero
in esame prediluito, dei Controlli e dei Calibratori.
Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25°C) per 30
minuti.
Eseguire la procedura di lavaggio dei micropozzetti seguendo il
procedimento raccomandato (vedi Ciclo di lavaggio).
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6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
Dispensare 200 µL di Tampone di Lavaggio nei micropozzetti
contenenti i calibratori e nel primo micropozzetto dei due
relativi ai Controlli ed ai Campioni.
Dispensare 200 µL di Soluzione Avidità
nel
secondo
micropozzetto relativo ai Controlli ed ai Campioni.
Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25°C) per 30
minuti.
Eseguire la procedura di lavaggio dei micropozzetti seguendo il
procedimento raccomandato (vedi Ciclo di lavaggio).
Dispensare in ciascun micropozzetto 100 µL di Coniugato.
Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25°C) per 30
minuti.
Eseguire la procedura di lavaggio dei micropozzetti seguendo il
procedimento raccomandato (vedi Ciclo di lavaggio).
Dispensare in ciascun micropozzetto 100 µL di Substrato-TMB.
Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25°C) per 15
minuti.
Bloccare la reazione cromogenica dispensando in ciascun
micropozzetto 100 µL di Soluzione Stoppante.
Leggere la densità ottica (DO) in bicromatismo a 450/620 nm.
CALCOLO ED INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
VALIDAZIONE DELLA SEDUTA ANALITICA
Le condizioni che consentono l’accettazione dei risultati sono :


La DO del Calibratore 5 (600 mU/mL) dev’essere  1.000
L’indice di avidità (%) del Controllo L e del Controllo H deve
rientrare nei limiti di accettabilità riportati nel “Certificato di
analisi ” inserito nel kit.
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Qualora la seduta dia risultati non conformi alle condizioni sopra
elencate, essa non è validabile e i risultati relativi ai campioni non
possono essere refertati senza analisi critica documentata. La non
conformità va qualificata e trattata secondo le procedure di
Assicurazione Qualità proprie del laboratorio.
Si consiglia di instaurare ed attuare procedure di Controllo Qualità
interne al laboratorio, i cui risultati concorrano alla validazione delle
sedute e alla gestione di eventuali non conformità.
La concentrazione di IgG “totali” relativa ai campioni incogniti è da
considerarsi affidabile solo nel caso in cui il valore della DO
corrispondente risulti inferiore o uguale al valore della DO del
Calibratore 5 e superiore al valore della DO del Calibratore 1
(comunque il valore di IgG Totali deve essere > 50 mU/mL). Se la
DO del campione è superiore al Calibratore 5 è necessario ripetere il
test utilizzando una diluizione del campione più elevata. Se la
concentrazione delle IgG totali del campione è inferiore al
Calibratore 1, ripetere il test utilizzando una diluizione del
campione inferiore (è sconsigliato l’uso di diluizioni inferiori a 1:50).
CALCOLO DELL’INDICE DI AVIDITÀ
Il calcolo è automatico per chi esegue il test con i sistemi automatici
utilizzando il programma AVICAL. Nel caso non si disponga di un
lettore o di un calcolatore in grado di eseguire automaticamente il
calcolo dei risultati, riportare su carta millimetrata lin-lin in ascisse i
valori di concentrazione dei calibratori ed in ordinate i rispettivi
valori di densità ottica. Collegare i punti a mezzo di segmenti
rettilinei e interpolare i valori di densità ottica dei campioni sulla
spezzata così ottenuta ricavandone le concentrazioni.
Calcolare il valore di Avidità % relativo ad ogni campione e
Controllo utilizzando la seguente formula:
IgG Residue ( micropozzetto “ b ”)
AVIDITA’ (%) = ___________________________________________________
IgG Totali ( micropozzetto “ a ”)
X 100
I seguenti valori devono essere considerati solo come un esempio e
non devono essere usati in luogo dei dati ottenuti dall’utilizzatore.
Pag. 10 - 28 BEIA CMV IgG Avidity Ed. 20/04/2013
Esempio di calcolo :
Calibratori
mU/mL
Cal 0
Cal 1
Cal 2
Cal 3
Cal 4
Cal 5
Campione A IgG Totali
Campione A IgG Residue
Campione B IgG Totali
Campione B IgG Residue
Campione C IgG Totali
Campione C IgG Residue
0
25
50
100
300
600
361
22
429
145
415
205
Densità
Ottica
0.049
0.347
0.572
1.026
1.881
2.547
2.075
0.325
2.236
1.264
2.205
1.555
Avidità %
6.1
33.8
49.4
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Studi effettuati su campioni di popolazione equivalente a quella
europea hanno condotto a stabilire i seguenti criteri interpretativi:
Avidità %
< 25
25-45
> 45
INTERPRETAZIONE
BASSA AVIDITA’
Infezione primaria da CMV contratta negli ultimi tre mesi
MEDIA AVIDITA’
Possibile infezione da CMV contratta negli ultimi sei mesi
ALTA AVIDITA’
Esclusione di infezione primaria da CMV contratta negli ultimi
tre mesi
Va tenuto presente che:
- il test, successivo a quello di prima istanza che ha rilevato la
presenza di anticorpi specifici di classe IgG, determina l’avidità di
questi ultimi. E’ un indice utile, ma non univoco ai fini della
datazione dell’infezione;
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- una decisione medica non può essere basata sul risultato di un solo
test, ma va fondata sull’insieme dei dati clinici disponibili. Dati
clinici discrepanti vanno risolti prima di prendere la decisione.
PRESTAZIONI DEL KIT
Avvertenza: i dati presentati sotto questa voce non rappresentano le
specifiche di funzionamento del kit, ma costituiscono evidenza
sperimentale di come il kit funzioni entro tali specifiche nel modo
previsto dal fabbricante.
PRESTAZIONI CLINICHE
Sono stati testati 73 campioni sequenziali da 24 soggetti con
infezione primaria HCMV. Tutti i campioni prelevati entro 3 mesi
dall’inizio dell’infezione (54/54) hanno evidenziato un indice di
avidità < 25 %.
Sono stati testati 102 campioni da soggetti con immunità da
pregressa infezione. 93 campioni hanno evidenziato un indice di
avidità > 45 %; 5 presentavano un’avidità tra il 42-45%, mentre 4
presentavano un’avidità compresa tra il 35 - 39%.
LIMITE DI RILEVAZIONE
Prove condotte in replicato sul Calibratore 0 indicano il limite di
rilevazione in 1.1 mU/mL.
SPECIFICITÀ ANALITICA
Non è stata rilevata alcuna interferenza in sieri contenenti fino a 10
mg/mL di emoglobina, fino a 1 mg/mL di bilirubina e fino a 30
mg/mL di trioleina. L’uso di campioni lipemici, torbidi o emolizzati
viene comunque sconsigliato.
RIPETIBILITÀ
La variabilità intra-saggio ed inter-saggio è stata determinata
valutando un campione a bassa avidità (< 25%), un campione a
media avidità (25 - 45%) ed un campione ad alta avidità (>45%).
Pag. 12 - 28 BEIA CMV IgG Avidity Ed. 20/04/2013
I campioni sono stati replicati 3 volte per seduta in ciascuna di 12
sedute diverse. Sono stati ottenuti coefficienti di variazione inferiori
al 10% per tutti i campioni.
LIMITAZIONI
Contaminazione batterica o ripetuti scongelamenti e congelamenti
dei campioni possono alterare i livelli rilevabili di IgG specifiche.
PRINCIPI GENERALI DI SICUREZZA
Tenere in ordine il laboratorio ed effettuare con cura le
operazioni previste per l'esecuzione del test.

Non mangiare, bere, fumare o usare cosmetici nell’area di
laboratorio designata.

Non pipettare soluzioni o campioni con la bocca.

Evitare il contatto diretto con i reattivi ed i campioni
indossando guanti monouso e camici.

Lavare accuratamente le mani al termine del dosaggio.

Pulire immediatamente con opportuni detergenti le superfici
di lavoro eventualmente contaminate.

Raccogliere il materiale solido o liquido utilizzato per il
dosaggio in appositi contenitori ed effettuare lo smaltimento
secondo le norme vigenti.

Controllare periodicamente il grado di contaminazione
dell'ambiente di lavoro e degli operatori.
Reagenti contenenti siero

I derivati da sangue umano inclusi nel kit sono stati analizzati
e trovati negativi per HbsAg, anti-HCV ed anticorpi anti-HIV.
Poiché nessun metodo può garantire che tali derivati non
possano trasmettere epatite, AIDS o altre infezioni, si
raccomanda di manipolare i reagenti con le opportune cautele.
Reagenti pericolosi

Soluzione Stoppante (Council Directive 88/379/EEC)
R36/38
Irritante per gli occhi e per la pelle
S26
In caso di contatto con gli occhi, lavare
immediatamente ed abbondantemente con acqua e consultare
un medico.

Pag. 13 - 28 BEIA CMV IgG Avidity Ed. 20/04/2013
SCHEMA DEL DOSAGGIO
















Preparare i reattivi
Diluire i campioni con il Diluente Campioni
Dispensare
100 L di ogni Calibratore (0-600 mU/mL) in singolo
100 L di ogni Controllo (L-H) in doppio
100 L di campione prediluito in doppio,
Incubare 30 minuti a T.A. (18-25°C)
Eseguire 4 cicli di lavaggio
Dispensare 200 L di Tampone di Lavaggio nei pozzetti dei calibratori e nel
pozzetto “a” dei Controlli e dei campioni
Dispensare 200 L di Soluzione Avidità nel pozzetto “b” dei Controlli e dei
campioni
Incubare 30 minuti a T.A. (18-25°C)
Eseguire 4 cicli di lavaggio
Dispensare 100 L di Coniugato
Incubare 30 minuti a T.A. (18-25°C)
Eseguire 4 cicli di lavaggio
Dispensare 100 L di Substrato-TMB
Incubare 15 minuti a T.A. (18-25°C)
Dispensare 100 L di Soluzione Stoppante
Leggere le densità ottiche al fotometro a 450/620 nm
1
A
S0
B
S1
C
S2
D
S3
E
S4
F
S5
G
H
CL
“a”
CL
“b”
2
CH
“a”
CH
“b”
P1
“a”
P1
“b”
3
P4
“a”
P4
“b”
P5
“a”
P5
“b”
4
P8
“a”
P8
“b”
P9
“a”
P9
“b”
5
P12
“a”
P12
“b”
P13
“a”
P13
“b”
6
P16
“a”
P16
“b”
P17
“a”
P17
“b”
7
P20
“a”
P20
“b”
P21
“a”
P21
“b”
8
P24
“a”
P24
“b”
P25
“a”
P25
“b”
9
P28
“a”
P28
“b”
P29
“a”
P29
“b”
10
P32
“a”
P32
“b”
P33
“a”
P33
“b”
11
P36
“a”
P36
“b”
P37
“a”
P37
“b”
12
P40
“a”
P40
“b”
P41
“a”
P41
“b”
P2
“a”
P6
“a”
P10
“a”
P14
“a”
P18
“a”
P22
“a”
P26
“a”
P30
“a”
P34
“a”
P38
“a”
P42
“a”
P2
“b”
P3
“a”
P3
“b”
P6
“b”
P7
“a”
P7
“b”
P10
“b”
P11
“a”
P11
“b”
P14
“b”
P15
“a”
P15
“b”
P18
“b”
P19
“a”
P19
“b”
P22
“b”
P23
“a”
P23
“b”
P26
“b”
P27
“a”
P27
“b”
P30
“b”
P31
“a”
P31
“b”
P34
“b”
P35
“a”
P35
“b”
P38
“b”
P39
“a”
P39
“b”
P42
“b”
P43
“a”
P43
“b”
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BEIA CMV IgG Avidity
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0459
TECHNOGENETICS SRL
Pag. 15 - 28 BEIA CMV IgG Avidity Ed. 20/04/2013
INTENDED USE
The BEIA CMV IgG Avidity kit is a quantitative enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) for the avidity detection of IgG
antibodies to Cytomegalovirus, in human serum or plasma samples.
CLINICAL RELEVANCE
Human Cytomegalovirus (HCMV) is a virus belonging to the group of
Herpesviridae, a subfamily of the Betaherpesvirinae. Virion has a
cylindric nucleus (core) surrounded by double-stranded DNA. This
structure is covered by a Capside and one or more membranes
containing lipides can be found externally. Is a host-specific and
ubiquitarian virus.
CMV infection can be primary (congenital or postnatal) as well as
secondary (viral replication reactivation) in individuals like
pregnant women, people being treated with immunosuppressant
drugs, people suffering from serious diseases.
Congenital infection, which can be caused both by a primary
infection or by a re-infection in pregnant women, is transmitted
transplacentally or during delivery and is responsible in infected
newborns of complications which may include hearing loss, vision
impairment, microcephaly, hydrocephalus, hearth disease, hepatitis,
hepatosplenomegaly, thrombocytopenia, miscarriage.
For healthy persons who acquire CMV after birth there are no
symptoms but in immunocompromised patients (AIDS patients,
organ transplant recipients, patients with cancer) CMV infection can
cause serious disease with manifestations such as hemolytic anemia,
encephalitis, splenomegaly and death.
Diagnosis of infection can be made directly determining the
presence of the virus (viremia, DNAemia, antigenemia) and
indirectly measuring IgG and IgM class antibodies to CMV.
IgM antibodies can be detected 1-2 weeks after infection while IgG
appear about a week later than IgM.
Specific IgM antibodies titers are important for the diagnosis of
acute infections, considering that such antibodies can be also
produced in 50% of secondary infections in individuals with
impaired immune system.
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The detection of the IgG antibodies in a patient’s serum helps to
determine his immune status as these antibodies persist in the body
for the lifetime of the patient.
Many studies have demonstrated that the detection of low avidity
IgG antibodies is indicative of primary infection while in reactivated
CMV infections high avidity IgG antibodies are produced.
As the avidity test estimates the time of acquisition of CMV
infection it is particularly useful to confirm or exclude CMV primary
infection in early pregnancy.
PRINCIPLE OF THE ASSAY
The BEIA CMV IgG Avidity kit is a quantitative enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) for the avidity detection of the
specific IgG antibodies to CMV virus.
The microwells are coated with CMV antigen. Each specimen is
dispensed into two adjoining microwells (well “a“ and well “b“).
During the first incubation, only IgG anti-CMV specific antibodies
present in serum or plasma bind to the inner surface of the wells
coated with the CMV antigen making an antigen-antibody complex.
After the incubation the wells are washed to remove non-reactive
serum components, and a Wash Buffer is dispensed into wells “a“
and an Avidity Solution into wells “b“ that is able to remove from
the wells prevalently the antibody with low avidity. After a further
washing cycle, an anti-human IgG antibody conjugated with
horseradish peroxidase (HRP) is dispensed into the wells. This
conjugate binds only to the specific IgG anti-CMV, bound in the
antigen-IgG complex present on the wells. After the incubation the
wells are washed to remove the no bound conjugate, and a
chromogenic substrate solution is dispensed into the wells
developping a blue coloration due to the HRP bound on the wells.
The enzymatic reaction is then stopped by adding a Stop Solution
(H2SO4 1 N) which changes to yellow the blue color developed into
the wells. The O.D. at 450/620 nm is directly proportional to the
amount of specific IgG bound to the wells.
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The IgG antibodies concentration present both in the well “a” and
in the well “b” is calculated by a calibration curve expressed as
arbitrary mU/mL. The ratio between the two concentration is an
index of the antibodies avidity present in the samples.
KIT COMPONENTS
Package size: 96 tests.
Component
SORB
A
Coated Strip
12x8x1
CAL
0
B
Calibrator 0 (0 mU/mL)
1 x 2 mL
CAL
1
C1
Calibrator 1 (25 mU/mL)
1 x 2 mL
CAL
2
C2
Calibrator 2 (50 mU/mL)
1 x 2 mL
CAL
3
C3
Calibrator 3 (100 mU/mL)
1 x 2 mL
CAL
4
C4
Calibrator 4 (300 mU/mL)
1 x 2 mL
CAL
5
C5
Calibrator 5 (600 mU/mL)
1 x 2 mL
CONTROL
L
D
Control L
1 x 2 mL
CONTROL
H
E
Control H
1 x 2 mL
DIL
SPE
F
Sample Diluent
1 x 120 mL
SOLN
AVID
G
Avidity Solution
1 x 15 mL
H
Conjugate
1 x 13,5 mL
CONJ
BUF
WASH 20X
I
Wash Buffero
1 x 100 mL
SUBS
TMB
J
Substrate-TMB
1 x 13,5 mL
k
Stop Solution
1 x 25 mL
Package Insert
1
Certificate of analysis
1
H2SO4
A.
Coated Strip
Breakable strips coated with inactivated CMV antigen in
sealed pouch. Place the unused strips in the pouch and reseal.
Pag. 18 - 28 BEIA CMV IgG Avidity Ed. 20/04/2013
B.
C.
D.
E.
F.
G.
H.
I.
J.
K.
Calibrator 0 mU/mL
Negative human serum for IgG antibodies anti-CMV. Contains
0.09% w/w Sodium azide as preservative. Ready to use reagent.
Calibrators 25, 50,100, 300, 600 mU/mL
Human serum, containing IgG antibodies anti-CMV different
known concentrations. Contain 0.09% w/w Sodium azide as
preservative. Ready to use reagent.
Control L
Human serum, containing IgG antibodies anti-CMV with low
avidity. Contains 0.09% w/w Sodium azide as preservative.
Ready to use reagent.
Control H
Human serum, containing IgG antibodies anti-CMV with high
avidity. Contains 0.09% w/w Sodium azide as preservative.
Ready to use reagent.
Sample Diluent
Buffered salt solution (PBS). Contain protein, negative human
serum for IgG anti-CMV, 0.09% w/w Sodium azide and
Tween 20. Ready to use reagent.
Avidity Solution
Buffered solution (CAPS). Contains Potassium Thiocyanate
Triton-100 and yellow dye. Ready to use reagent.
Conjugate
Monoclonal anti-human IgG antibody conjugated with
horseradish peroxidase.
Ready to use reagent.
Wash Buffer
Buffered salt solution (PBS) 20x concentrated. Contains 0,1 %
Kathon CG and Tween 20.
Substrate-TMB
Tetramethylbenzidine H2O2/(TMB) in stabilizing buffered
solution. Contains pink dye. Ready to use reagent.
Stop Solution
1N Sulphuric acid solution.
Ready to use reagent.
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STORAGE OF REAGENTS
Store all reagents at 2-8°C avoiding exposure to light. Do not use
reagents after the expiry date indicated on the label.
INTERCHANGEABLE REAGENTS
Do not mix different lots of any reagent within an individual assay
except the Wash Buffer, the Substrate-TMB and the Stop Solution.
MATERIALS/EQUIPMENT REQUIRED BUT NOT PROVIDED





Microplate reader with 450/620 nm filters.
Manual or automated microplate washing device.
Precision pipettes with disposable tips 10,100,200,1000 L.
Disposable pipettes and normal glassware.
Distilled or deionized water.
WARNINGS AND PRECAUTIONS









Bring all reagents to room temperature (18-25°C) before use.
Only take the quantity necessary for the assay.
Avoid wells drying.
Use clean glassware.
Use a clean disposable pipette tip for each reagent.
Use a clean disposable pipette tip for each sample.
If the Substrate-TMB shows a change from pink to blue colour,
discard the reagent.
For repeated assays, each time provide for new diluted
samples.
Every analytical run should include control samples in order
to validate the results, according to criteria and procedures
established by each laboratory.
Periodical maintenance and calibration of pipettes and
microplate reader are required.
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AUTOMATION
The test can be performed on automated ELISA processor. Please
refer to specific instrument manual for proper applications.
SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION
The test can be performed on serum or plasma (heparin – EDTA).
Specimens may be stored refrigerated at 2-8 °C up to 5 days. For
longer storage they should be aliquoted and stored frozen at – 20°C.
Avoid repeated thawing and freezing. Do not use haemolyzed,
lipemic or turbid specimens. All serum and plasma samples must be
pre-diluted with Sample Diluent prior to assay. See assay protocol.
PREPARATION OF REAGENTS

Wash Buffer (20 X)
Dilute 1:20 the content of the Wash Buffer bottle with distilled
or deionized water. The diluted Wash Buffer is stable 15 days
when stored at 2-8 °C; in any case, do not use it after expiry
date printed on the original label. If crystallization occurs in
the concentrated Wash Buffer, warm the solution to 37 °C
before diluting. Only dilute the quantity necessary for the
assay.
WASHING CYCLES
Both using a microplate washer and washing the plate manually,
perform the following steps.
1.
Empty the wells
2.
Fill them with 300 µL of Wash Buffer.
3.
Empty the wells
4.
Repeat steps 2 and 3 for other 3 cycles
5.
Dry the rim of the wells with blotting paper at the end of the
washing cycles.
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ASSAY PROTOCOL
Allow all reagents to reach room temperature leaving them at least
30-60 minutes at 18-25 °C.
1.
Dilute the samples to be assayed following the table below.
Shake on Vortex.
IgG anti-CMV Concentration
Low
Medium
High
Sample Dilution
1:50
1: 200
1: 500 and 1:2000
As an international standard preparation isn’t available, the antiCMV specific concentration of a sample has to be intended as the
relative value to the Cut-off of the test, used by each laboratory.
2.
Select the number of strips required for the assay according to
the number of samples to be assayed, Controls and the
Calibrators (see paragraph “Summary of protocol” below).
Reseal the pouch.
Note: Two wells for each Control and sample; One for each
Calibrator
3.
Dispense 100 µL of each Calibrator, Control and of the diluted
sample.
4.
Incubate the plate at room temperature (18-25 °C) for 30
minutes.
5.
Perform a washing cycle following the suggested procedure
(see Washing Cycles).
6.
Dispense 200 µL of Wash Buffer into the wells of the
Calibrators and into the well “a” of each Control and sample.
7.
Dispense 200 µL of Avidity Solution into the well “b” of each
Control and sample.
8.
Incubate the plate at room temperature (18-25 °C) for 30
minutes.
9.
Perform a washing cycle following the suggested procedure
(see Washing Cycles).
10. Dispense 100 µL of Conjugate in each well.
11. Incubate the plate at room temperature (18-25 °C) for 30
minutes.
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12.
13.
14.
15.
16.
Perform a washing cycle following the suggested procedure
(see Washing Cycles).
Dispense 100 µL of Substrate-TMB in each well .
Incubate the plate at room temperature (18-25 °C) for 15
minutes.
Stop the chromogenic reaction dispensing 100 µL of Stop
Solution into each well.
Read the optical density (O.D.) in bi-chromatism at 450/620
nm.
CALCULATION AND INTERPRETATION OF RESULTS
RUN VALIDATION CRITERIA
Criteria used to validate the obtained results are the following:

The OD for Calibrator 5 (600 mU/ML) must be ≥ 1,000

The Avidity index (%) of the Control H and Control L must be in
the range reported in the enclosed Quality Control Data Sheet.
If the above criteria are not met, the run is invalid and the results cannot
be reported without a documented critical review of the data. The non
conformity must be addressed and treated according to each laboratory’s
Quality Assurance procedures. Each lab should establish and follow its
own internal Quality Control procedures and use the QC results to
validate runs and manage non conformities. IgG Total results of the
unknown samples must be consider reliable only when the OD value of
the sample is lower or equal the OD value of the Calibrator 5 and higher
the OD value of the Calibrator 1 (the IgG Total value must be > 50
mU/mL). If the OD value of the sample is higher of OD value of the
Calibrator 5, please repeat the test using a higher dilution of the sample.
If the OD value of the sample is lower of OD value of the Calibrator 1,
please repeat the test using a lower dilution of the sample; ( it’s not
suggested to utilise a dilution lower than 1:50).
CALCULATION OF RESULTS
Calculation is automatically performed when using an automated
processor utilising the AVICAL program. In case an automated system is
not available, plot the mean OD value of each Calibrator (ordinate)
against Calibrator concentration (abscissa) on suitable
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graph paper, linking points by straight segments. Concentrations of
Controls and samples can then be read from the fragmented curve by
interpolation with the OD.
In order to correlate the analytical results to the Avidity (%) of the
sample, results should be determined using the following formula:
Residual IgG well “b”
______________________________________________ x 100
Avidity (%) =
Total IgG well “a”
The data below show typical results for the test. These data are intended
as an example only and should not be used to calculate results from
another run.
Calibrators
Cal 0
Cal 1
Cal 2
Cal 3
Cal 4
Cal 5
Sample A Total IgG “a “
Sample A Residual IgG “b”
Sample B Total IgG “a “
Sample B Residual IgG “b”
Sample C Total IgG “a “
Sample C Residual IgG “b”
mU/mL
O.D.
0
25
50
100
300
600
361
22
429
145
415
205
0.049
0.347
0.572
1.026
1.881
2.547
2.075
0.325
2.236
1.264
2.205
1.555
Avidity %
6.1
33.8
49.4
INTERPRETATION OF RESULTS
Results from our clinical trials, performed on samples representative
of the European population, suggest the following interpretative
criteria:
Avidity %
< 25
25-45
> 45
INTERPRETATION
LOW AVIDITY
Primary CMV infection occurred during in the last three months
MEDIUM AVIDITY
Primary CMV infection occurred during in the last six months
HIGH AVIDITY
Exclude CMV primary infection within the last three months
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Please consider that:
- After the first level test that points out the presence of specific IgG
to CMV, the Avidity test determines the IgG Avidity. It’s an useful
index but cannot per se and univocally be referred to as dating of
infection;
- a medical decision cannot be made on the basis of a single test
result but should be grounded on all the available clinical data;
discrepancies in clinical data should be clarified prior to final
decisions.
PERFORMANCE DATA
Warning: Data below do not represent the performance
specifications of the kit, but only experimental evidence that the
performance of the kit is within such specifications, as intended by
the manufacturer.
CLINICAL PERFORMANCES
73 samples, coming from a follow up of 24 subjects with primary
CMV infection diagnosed were evaluated. All the samples (54/54)
drawed during in the last three from the starting infection, were
observed with an avidity index < 25 %.
102 specimens coming from immunocompetent subjects with a past
CMV infection were evaluated. 93 specimens were observed with
an avidity index > 45%, 5 samples showed an avidity between 42
and 45% while 4 samples showed an avidity between 35 and 39%.
DETECTION LIMIT:
Trials in replicate on the Calibrator 0 lead to calculate the detection
limit: 1.1 mU/mL.
ANALYTICAL SPECIFICITY
No interference has been observed in samples with hemoglobin up
to 10 mg/mL, bilirubin up to 1 mg/mL, triolein up to 30 mg/mL.
Lipemic, turbid or hemolyzed samples, however, should not be
used.
REPEATABILITY
The within-run and run-to-run variability were determined using a
sample with low avidity (< 25 %), a sample with intermediate
avidity ( 25-45 %) and a sample with high avidity (> 45 %).
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These serum samples were tested 3 times per single run in 12
different analytical runs. Coefficients of variation lower than 10%
have been obtained for all three samples.
LIMITATIONS
Bacterial contamination or repeated freeze-thaw cycles of specimens
may affect the detectable levels of specific IgG.
GENERAL DIRECTIONS FOR A SAFE USE

Keep the laboratory clean and tidy and strictly follow the
procedural directions.

Do not eat, drink, smoke or apply cosmetics in a clinical lab.

Do not pipette solutions or samples by mouth.

Wear disposable gloves and overalls when handling reagents
and samples. Avoid direct contact.

Wash hands thoroughly after assay.

Thoroughly clean working area with proper detergent
solutions.

Collect solid and liquid waste material in proper containers
and provide for disposal according to the local regulations.

Periodically check contamination level of operators and
rooms.
Reagents containing serum

All components of human origin have been tested and found
negative for HbsAg, anti-HCV and anti-HIV antibodies. Since
no known test can guarantee, however, that products derived
from human blood will not transmit Hepatitis, AIDS or other
infectious diseases, these reagents should be handled as
hazardous material.
Hazardous Reagents
Stop Solution (Council Directive 88/379/EEC)
R36/38 Irritating to eyes and skin.
S26 In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty
of water, and seek for medical advice.
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SUMMARY OF PROTOCOL












Prepare reagents
Pre-dilute samples with Sample Diluent
Dispense:
100L of Calibrators (0-600 mU/mL) in single
100L of Controls (L,H) in duplicate
100 L of pre-diluted samples in duplicate
Incubate 30 minutes at R.T. (18-25°C)
Perform 4 washing cycles
Dispense 200 L of Wash Buffer into wells of the Calibrators and
into the wells “a” of each Control and sample
Dispense 200 L of Avidity Solution into the wells “b” of each
Control and sample
Incubate 30 minutes at R.T. (18-25°C)
Perform 4 washing cycles
Dispense 100 L of Conjugate
Incubate 30 minutes at R.T. (18-25°C)
Perform 4 washing cycles
Dispense 100 L of Substrate-TMB
Incubate 15 minutes at R.T. (18-25°C)
Dispense 100 L of Stop Solution
Read the O.D. at 450/620nm
A
S0
B
S1
C
S2
D
S3
E
S4
F
S5




1
G
H
CL
“a”
CL
“b”
2
CH
“a”
CH
“b”
P1
“a”
P1
“b”
3
P4
“a”
P4
“b”
P5
“a”
P5
“b”
4
P8
“a”
P8
“b”
P9
“a”
P9
“b”
5
P12
“a”
P12
“b”
P13
“a”
P13
“b”
6
P16
“a”
P16
“b”
P17
“a”
P17
“b”
7
P20
“a”
P20
“b”
P21
“a”
P21
“b”
8
P24
“a”
P24
“b”
P25
“a”
P25
“b”
9
P28
“a”
P28
“b”
P29
“a”
P29
“b”
10
P32
“a”
P32
“b”
P33
“a”
P33
“b”
11
P36
“a”
P36
“b”
P37
“a”
P37
“b”
12
P40
“a”
P40
“b”
P41
“a”
P41
“b”
P2
“a”
P6
“a”
P10
“a”
P14
“a”
P18
“a”
P22
“a”
P26
“a”
P30
“a”
P34
“a”
P38
“a”
P42
“a”
P2
“b”
P3
“a”
P3
“b”
P6
“b”
P7
“a”
P7
“b”
P10
“b”
P11
“a”
P11
“b”
P14
“b”
P15
“a”
P15
“b”
P18
“b”
P19
“a”
P19
“b”
P22
“b”
P23
“a”
P23
“b”
P26
“b”
P27
“a”
P27
“b”
P30
“b”
P31
“a”
P31
“b”
P34
“b”
P35
“a”
P35
“b”
P38
“b”
P39
“a”
P39
“b”
P42
“b”
P43
“a”
P43
“b”
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