diastat anti-ro - Technogenetics

BEIA CMV IgG Quant
21465
Edizione
20/04/2013
Solo per uso professionale
0459
TECHNOGENETICS SRL
N° 00509
Pag. 1 - 24 BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013
INTRODUZIONE
Il kit BEIA CMV IgG Quant è un test immunoenzimatico
quantitativo (ELISA) per la determinazione nel siero o nel plasma
degli anticorpi di classe IgG specifici verso il citomegalovirus
umano.
SIGNIFICATO CLINICO
Il Cytomegalovirus umano (HCMV) appartiene alla famiglia delle
Herpersviridae sottofamiglia delle Betaherpesvirinae. Il virione è
costituito da un nucleo cilindrico (core) circondato da un filamento
di DNA a doppia elica. Questa struttura è rivestita da un Capside e
all’esterno si rilevano una o più membrane contenenti lipidi. E’ un
virus ubiquitario e specie-specifico. L’infezione da Cytomegalovirus
può essere primaria (infezione congenita o infezione post-natale)
oppure secondaria (riattivazione della replicazione virale) in
individui
quali
le
donne
in
gravidanza,
in
terapia
immunosoppressiva ed in presenza di malattie molto gravi.
L’infezione congenita, che può essere causata sia da infezione
primaria che da reinfezione della donna gravida, è trasmessa per via
transplacentale o al momento della nascita ed è responsabile, nei
neonati infetti, di gravi manifestazioni cliniche quali sordità,
corioretinite,
microcefalia,
idrocefalo, cardiopatia, epatite,
epatosplenomegalia, trombocitopenia, aborto spontaneo.Le infezioni
post-natali sono spesso asintomatiche eccetto negli individui
immunocompromessi ( AIDS, tumori, trapianti) nei quali l’infezione
evolve in forma disseminata comportando, in questi individui,
severe complicanze (anemia emolitica, encefalite, splenomegalia,
morte). La diagnosi dell'infezione da CMV può essere condotta sia
con la ricerca diretta della presenza del virus, (viremia, DNAemia,
antigenemia) che con la ricerca indiretta della presenza di anticorpi
di classe IgG ad IgM. Le immunoglobuline di classe IgM sono
rilevabili dopo 1-2 settimane dall'infezione mentre le IgG appaiono
circa una settimana più tardi rispetto alle IgM. Il dosaggio delle IgM
specifiche è importante per diagnosticare la fase acuta dell'infezione,
tenendo presente che tali anticorpi possono essere prodotti anche
Pag. 2 - 24 BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013
nel 50% dei casi di infezione secondaria nei pazienti
immunocompromessi. L'infezione primaria è caratterizzata dalla
presenza di alti titoli anticorpali verso un antigene precoce del CMV
di peso molecolare di 52 kDa (p52), risulta quindi particolarmente
utile l'impiego di un kit in grado di rilevare gli anticorpi diretti
verso questa proteina per la diagnosi sierologica dell'infezione acuta
da CMV. Il dosaggio delle IgG, essendo la presenza di queste
immunoglobuline sinonimo di infezione pregressa, permette di
distinguere la popolazione protetta da quella non protetta, oltre a
confermare la sieroconversione da infezione primaria. Numerosi
studi hanno ormai dimostrato che la distinzione tra infezione
primaria e riattivazione, può essere efficacemente conseguita
mediante la ricerca delle IgG a differente avidità in quanto
l'infezione primaria è caratterizzata dalla presenza di IgG a minore
avidità per l'antigene rispetto a quella che caratterizza le IgG
prodotte a seguito di successivi stimoli antigenici.
PRINCIPIO DEL METODO
Il test BEIA CMV IgG Quant è un dosaggio immunoenzimatico in
micropozzetti. I micropozzetti di polistirene sono rivestiti con
l'antigene CMV. I campioni da esaminare vengono incubati nei
micropozzetti; le IgG del campione si legano formando un
complesso antigene-anticorpo. Dopo eliminazione mediante
lavaggio dei componenti del siero non legati alla fase solida, la
presenza di IgG anti-CMV viene rilevata attraverso il legame con
un anticorpo monoclonale anti-IgG coniugato con perossidasi.
Dopo allontanamento del coniugato enzimatico non legato viene
aggiunto il substrato-TMB che, per azione dell’enzima presente sulla
fase solida, sviluppa una colorazione azzurra. L’aggiunta di una
soluzione di acido solforico 1N blocca la reazione e provoca il
viraggio del colore dall’azzurro al giallo. La densità ottica letta a
450/620 è direttamente proporzionale alla quantità di IgG specifiche
presenti nel campione in esame. Nei kit BEIA CMV IgG Quant la
concentrazione degli anticorpi di classe IgG viene calcolata
mediante l'utilizzo di una curva di calibrazione ed espressa in Unità
Arbitrarie/mL.
Pag. 3 - 24 BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013
CONTENUTO DELLA CONFEZIONE
La confezione è sufficiente per 96 determinazioni.
Componente
SORB
A
Strip da 8 micropozzetti frazionabili
12x8x1
CAL
0
B
Calibratore 0 (0 UA/mL)
1 x 2 mL
CAL
1
C1
Calibratore 1 (10 UA/mL)
1 x 2 mL
CAL
2
C2
Calibratore 2 ( 20 UA/mL)
1 x 2 mL
CAL
3
C3
Calibratore 3 ( 50 UA/mL)
1 x 2 mL
CAL
4
C4
Calibratore 4 ( 120 UA/mL)
1 x 2 mL
DIL
SPE
D
Diluente Campioni BEIA System
1 x 120 mL
E
Coniugato
1 x 13,5 mL
CONJ
BUF
WASH 20X
F
Tampone di Lavaggio
1 x 100 mL
SUBS
TMB
G
Substrato-TMB
1 x 13,5 mL
H
Soluzione Stoppante
1 x 25 mL
Istruzioni per l’uso
1
H2SO4
A.
B.
C.
D.
Strip sensibilizzate
Strip sensibilizzate con CMV virus inattivato, in busta ermetica
richiudibile. Riporre le strip non utilizzate nella busta e
richiudere. Le strip sono frazionabili in micropozzetti singoli.
Calibratore 0 UA/ml
Siero umano negativo per anticorpi IgG anti-CMV. Contiene
0,09%
p/p
di
sodio
azide
come
conservante.
Reagente pronto all'uso.
Calibratori 10, 20,50 e 120 UA/mL
Siero umano a concentrazioni note di anticorpi IgG anti-CMV.
Contengono 0,09% p/p di sodio azide come conservante.
Reagenti pronti all’uso.
Diluente Campioni BEIA System
Soluzione salina tamponata (PBS) e proteine. Contiene 0,09%
p/p di sodio azide come conservante e Tween 20. Reagente
pronto all'uso.
Pag. 4 - 24 BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013
E.
Coniugato
Soluzione contenente anticorpo monoclonale anti-IgG umane,
marcato con perossidasi. Reagente pronto all'uso.
F. Tampone di Lavaggio
Soluzione salina tamponata (PBS) concentrata 20 volte. Contiene
0,1 % di Kathon CG e Tween 20. Vedi preparazione dei reagenti.
G. Substrato-TMB
Soluzione contenente H2O2/TMB, stabilizzanti e colorante
(rosa). Reagente pronto all'uso.
H. Soluzione Stoppante
Soluzione 1N di acido solforico. Reagente pronto all'uso.
MODALITÀ DI CONSERVAZIONE
Tutti i reattivi devono essere conservati a 2-8°C al riparo dalla luce.
Non utilizzare i reattivi oltre la data di scadenza riportata
sull’etichetta.
REAGENTI INTERCAMBIABILI
Il Diluente Campioni BEIA System, il Tampone di Lavaggio, il SubstratoTMB e la Soluzione Stoppante sono intercambiabili tra i diversi kit
della linea BEIA.
MATERIALE E STRUMENTI RICHIESTI, MA NON FORNITI





Lettore di colorimetria per micropiastre con filtro a 450/620 nm.
Apparecchiatura manuale o automatica per il lavaggio di
micropiastre.
Micropipette con puntali monouso da 10, 100, 200, 500, 1000 µL.
Provette monouso e normale vetreria da laboratorio.
Acqua distillata o deionizzata.
AVVERTENZE E PRECAUZIONI

Prima dell'uso portare tutti i reattivi a temperatura ambiente
(18-25°C). Prelevare solo la quantità necessaria per l'analisi.
Pag. 5 - 24 BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013








Evitare l'essiccamento dei micropozzetti.
Usare esclusivamente vetreria accuratamente pulita.
Non utilizzare uno stesso puntale per pipettare reagenti
diversi.
Cambiare il puntale tra un campione e l’altro.
Qualora il Substrato-TMB evidenziasse un viraggio da rosa ad
azzurro, il reagente non deve essere utilizzato.
Se il dosaggio viene ripetuto, preparare una nuova diluizione
del campione.
Si raccomanda di inserire in ogni corsa analitica dei campioni
di controllo al fine di validare i risultati ottenuti, secondo
criteri e procedure che ciascun utilizzatore deve definire.
Procedere periodicamente alla manutenzione e taratura delle
pipette e del lettore.
AUTOMAZIONE
Il test può essere eseguito con sistemi automatici per kit ELISA, nel
qual caso Vi invitiamo a consultare il manuale specifico dello
strumento per una corretta esecuzione della corsa analitica.
PRELIEVO E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
Il dosaggio può essere eseguito su siero o plasma (Eparina-EDTA).
Se il dosaggio è eseguito entro 5 giorni dal prelievo, i campioni
possono essere conservati a 2-8 °C. In caso contrario, aliquotare i
campioni e congelarli a -20°C. Evitare ripetuti scongelamenti e
congelamenti. Si sconsiglia l’uso di campioni lipemici, torbidi ed
emolizzati. I campioni devono essere opportunamente diluiti con il
Diluente Campioni BEIA System prima del dosaggio. Vedi
esecuzione del test.
PREPARAZIONE DEI REAGENTI

Tampone di Lavaggio
Diluire il Tampone di Lavaggio (20x) 1:20 con acqua distillata o
deionizzata prima dell'uso. Dopo ricostituzione il tampone è stabile
Pag. 6 - 24 BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013
15 giorni se conservato a 2-8°C e comunque non oltre la data di
scadenza riportata sull'etichetta originaria.
Nel Tampone di Lavaggio concentrato si possono formare dei
precipitati cristallini che si solubilizzano portando il reagente a 37°C
prima della diluizione. Si raccomanda di diluire la quantità di
tampone necessaria per eseguire i lavaggi dell'analisi in corso.
CICLO DI LAVAGGIO
Si consiglia di procedere come segue sia nel caso in cui si utilizzi un
lavatore automatico di micropiastre sia nel caso in cui si operi
manualmente.
1. Svuotare completamente i pozzetti.
2. Riempirli con 300 µL di tampone di lavaggio.
3. Svuotare i pozzetti.
4. Ripetere i punti 2 e 3 per ulteriori 3 cicli.
5. Asciugare con carta assorbente la superficie esterna dei pozzetti
al termine del lavaggio.
ESECUZIONE DEL TEST
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Portare i reagenti a temperatura ambiente (almeno 30-60 minuti
a 18-25°C).
Diluire (1:81) i campioni in esame con il Diluente Campioni
BEIA System (esempio 10 µL di siero e 800 µL di Diluente
Campioni BEIA System). Agitare su Vortex.
Prelevare il numero di strip necessario per l'analisi in funzione
del numero di campioni in esame e dei Calibratori (vedi il
paragrafo “Schema del dosaggio”). Richiudere accuratamente la
busta.
Dispensare nei rispettivi pozzetti 100 L di ciascun siero in
esame prediluito e dei Calibratori.
Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25°C) per 30
minuti.
Eseguire la procedura di lavaggio dei pozzetti seguendo il
procedimento raccomandato (vedi Ciclo di lavaggio).
Dispensare in ciascun pozzetto 100 µL di Coniugato.
Pag. 7 - 24 BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013
7.
Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25°C) per 30
minuti.
8. Eseguire la procedura di lavaggio dei pozzetti seguendo il
procedimento raccomandato (vedi Ciclo di lavaggio).
9. Dispensare in ciascun pozzetto 100 µL di Substrato-TMB.
10. Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25°C) per 15
minuti.
11. Bloccare la reazione cromogenica dispensando in ciascun
pozzetto 100 µL di Soluzione Stoppante.
12. Leggere la densità ottica (DO) in bicromatismo a 450/620 nm
CALCOLO ED INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
VALIDAZIONE DELLA SEDUTA ANALITICA
Le condizioni che consentono l’accettazione dei risultati sono :

il rapporto tra la DO del Calibratore 4 (120 UA/mL) e la DO
del Calibratore 1 (10 UA/mL) deve essere > 3.0.

il rapporto tra la DO del Calibratore 0 (0 UA/mL) e la DO del
Calibratore 1 (10 UA/mL) deve essere < 0.6.
Qualora la seduta dia risultati non conformi alle condizioni sopra
elencate, essa non è validabile ed i risultati relativi ai campioni non
possono essere refertati senza analisi critica documentata. La non
conformità va qualificata e trattata secondo le procedure di
Assicurazione Qualità proprie del laboratorio.
Si consiglia di instaurare ed attuare procedure di Controllo Qualità
interne al laboratorio, i cui risultati concorrano alla validazione delle
sedute ed alla gestione di eventuali non conformità.
CALCOLO DEI RISULTATI
Calcolare la media dei valori di densità ottica per ogni calibratore e
campione (i duplicati dovrebbero presentare un CV minore del
20%). Elaborare la curva di calibrazione riportando la media delle
densità ottiche di ogni calibratore sull’asse delle ordinate e le
corrispondenti concentrazioni sull’asse delle ascisse. Disegnare la
migliore curva che passi attraverso i punti della calibrazione. Per
calcolare la concentrazione di IgG anti-CMV di ogni campione
riportare il valore della densità ottica sull’asse delle ordinate e
collegare con una linea retta alla curva di calibrazione.
Pag. 8 - 24 BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013
Al punto di intersezione, collegare con una linea verticale all’asse
delle ascisse e leggere il corrispondente valore di IgG anti-CMV.
Qualora si disponesse di un sistema di calcolo automatico si
consiglia di utilizzare una delle seguenti funzioni matematiche:
spline cubica, iperbolica e lineare punto a punto. I seguenti valori
devono essere considerati solo come un esempio e non devono
essere usati in luogo dei dati ottenuti dall’utilizzatore. Esempio di
calcolo con interpolazione spline cubica:
Calibratori
Cal 0
Cal 1
Cal 2
Cal 3
Cal 4
Campione A
Campione B
Campione C
UA/mL
0
10
20
50
120
Densità Ottica
0.071
0.395
0.806
1.597
2.525
0.196
0.481
1.881
UA/mL
4.1
12.2
67.3
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Studi effettuati su campioni di popolazione equivalente a quella
europea hanno condotto a stabilire i seguenti criteri interpretativi:
UA/mL
INTERPRETAZIONE
> 10
Il campione è da considerare POSITIVO per la
presenza di anticorpi di classe IgG anti-CMV
8
Il campione è da considerare NEGATIVO per la
presenza di anticorpi di classe IgG anti-CMV
810
Il campione è da considerare DUBBIO per la
presenza di anticorpi di classe IgG anti-CMV
Va tenuto presente che:
- il test indica solo la presenza o assenza di anticorpi specifici di
classe IgG. Non è di per sé e univocamente indice di uno stato
infettivo;
Pag. 9 - 24 BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013
- una decisione medica non può essere basata sul risultato di un solo
test, ma va fondata sull’insieme dei dati clinici disponibili.
Dati clinici discrepanti vanno risolti prima di prendere la decisione,
eventualmente col conforto di test di conferma o di II livello;
- risultati compresi entro la zona grigia vanno chiariti: con la
ripetizione del test sullo stesso campione; con la ripetizione del test
su un prelievo successivo; col confronto con un test di riferimento.
PRESTAZIONI DEL KIT
Avvertenza: i dati presentati sotto questa voce non rappresentano le
specifiche di funzionamento del kit, ma costituiscono evidenza
sperimentale di come il kit funzioni entro tali specifiche nel modo
previsto dal fabbricante.
SENSIBILITÀ E SPECIFICITÀ
Sensibilità e specificità sono state valutate confrontando le
prestazioni del kit BEIA CMV IgG Quant nei confronti di un kit già
immesso sul mercato con prestazioni accettabili (EIA CMV IgG).
BEIA
CMV IgG Quant
+
-
EIA CMV IgG
+
238
0
6
84
Da questi dati si ottiene:
Sensibilità relativa
Specificità relativa
Concordanza
97,5%
100%
98,2%
LIMITE DI RILEVAZIONE
Prove condotte in replicato sul Calibratore 0 indicano il limite di
rilevazione in 0.44 UA/mL.
Pag. 10 - 24 BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013
SPECIFICITÀ ANALITICA
Non è stata rilevata alcuna interferenza in sieri contenenti fino a 10
mg/mL di emoglobina, fino a 1 mg/mL di bilirubina e fino a 30
mg/mL di trioleina. L’uso di campioni lipemici, torbidi o emolizzati
viene comunque sconsigliato.
RIPETIBILITÀ
La variabilità intra-saggio ed inter-saggio è stata determinata
valutando un campione negativo con concentrazione 4 UA/mL e
due campioni positivi a due concentrazioni 11 UA/mL e 70
UA/mL. I campioni sono stati replicati 6 volte per seduta in
ciascuna di 12 sedute diverse. Sono stati ottenuti coefficienti di
variazione inferiori al 20% per il campione negativo ed inferiori al
7% per i due campioni positivi.
LIMITAZIONI
Contaminazione batterica o ripetuti scongelamenti e congelamenti
dei campioni possono alterare i livelli rilevabili di IgG specifiche.
PRINCIPI GENERALI DI SICUREZZA








Tenere in ordine il laboratorio ed effettuare con cura le
operazioni previste per l'esecuzione del test.
Non mangiare, bere, fumare o usare cosmetici nell’area di
laboratorio designata.
Non pipettare soluzioni o campioni con la bocca.
Evitare il contatto diretto con i reattivi ed i campioni
indossando guanti monouso e camici.
Lavare accuratamente le mani al termine del dosaggio.
Pulire immediatamente con opportuni detergenti le superfici
di lavoro eventualmente contaminate.
Raccogliere il materiale solido o liquido utilizzato per il
dosaggio in appositi contenitori ed effettuare lo smaltimento
secondo le norme vigenti.
Controllare periodicamente il grado di contaminazione
dell'ambiente di lavoro e degli operatori.
Pag. 11 - 24 BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013
Reagenti contenenti siero

I derivati da sangue umano inclusi nel kit sono stati analizzati
e trovati negativi per HbsAg, anti-HCV ed anticorpi anti-HIV.
Poiché nessun metodo può garantire che tali derivati non
possano trasmettere epatite, AIDS o altre infezioni, si
raccomanda di manipolare i reagenti con le opportune cautele.
Reagenti pericolosi

Soluzione Stoppante (Council Directive 88/379/EEC)
R36/38
Irritante per gli occhi e per la pelle
S26
In caso di contatto con gli occhi, lavare
immediatamente ed abbondantemente con acqua e consultare
un medico.
SCHEMA DEL DOSAGGIO












Preparare i reattivi
Diluire i campioni 1:81 con il Diluente Campioni BEIA System
Dispensare
100 L di ogni Calibratore (0-120 UA/mL) in doppio
100 L di campione prediluito in singolo o doppio,
Incubare 30 minuti a T.A. (18-25°C)
Eseguire 4 cicli di lavaggio
Dispensare 100 L di Coniugato
Incubare 30 minuti a T.A. (18-25°C)
Eseguire 4 cicli di lavaggio
Dispensare 100 L di Substrato-TMB
Incubare 15 minuti a T.A. (18-25°C)
Dispensare 100 L di Soluzione Stoppante
Leggere le densità ottiche al fotometro a 450/620 nm
A
B
C
D
E
F
G
H
1
Cal 0
Cal 0
Cal 8
Cal 8
Cal 20
Cal 20
Cal 50
Cal 50
2
Cal 120
Cal 120
P1
P2
P3
….
….
….
3
4
….
Pag. 12 - 24 BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013
BEIA CMV IgG Quant
21465
Version
20/04/2013
For professional use only
0459
TECHNOGENETICS SRL
Pag. 13 - 24 BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013
INTENDED USE
The BEIA CMV IgG Quant kit is a quantitative enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) for the detection of IgG antibodies to
Cytomegalovirus, in human serum or plasma samples.
CLINICAL RELEVANCE
Human Cytomegalovirus (HCMV) is a virus belonging to the group of
Herpesviridae, a subfamily of the Betaherpesvirinae. Virion has a
cylindric nucleus (core) surrounded by double-stranded DNA. This
structure is covered by a Capside and one or more membranes
containing lipides can be found externally. Is a host-specific and
ubiquitarian virus.
CMV infection can be primary (congenital or postnatal) as well as
secondary (viral replication reactivation) in individuals like
pregnant women, people being treated with immunosuppressant
drugs, people suffering from serious diseases.
Congenital infection, which can be caused both by a primary
infection or by a re-infection in pregnant women, is transmitted
transplacentally or during delivery and is responsible in infected
newborns of complications which may include hearing loss, vision
impairment, microcephaly, hydrocephalus, hearth disease, hepatitis,
hepatosplenomegaly, thrombocytopenia, miscarriage.
For healthy persons who acquire CMV after birth there are no
symptoms but in immunocompromised patients (AIDS patients,
organ transplant recipients, patients with cancer) CMV infection can
cause serious disease with manifestations such as hemolytic anemia,
encephalitis, splenomegaly and death.
Diagnosis of infection can be made directly determining the
presence of the virus (viremia, DNAemia, antigenemia) and
indirectly measuring IgG and IgM class antibodies to CMV.
IgM antibodies can be detected within 2 weeks after infection while
IgG appear about a week later than IgM.
Specific IgM antibodies titers are important for the diagnosis of
acute infections, considering that such antibodies can be also
produced in 50% of secondary infections in individuals with
impaired immune system.
Pag. 14 - 24 BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013
As in primary infections high titers of antibodies against the early
antigen of 52 kDa (p52) can be found, kits able to detect antibodies
against this protein are particularly indicated for a serologial
diagnosis of CMV primary infection.
The detection of the IgG antibodies in a patient’s serum helps to
determine his immune status as these antibodies persist in the body
for the lifetime of the patient.
Many studies have demonstrated that the detection of low avidity
IgG antibodies is indicative of primary infection while in reactivated
CMV infections high avidity IgG antibodies are produced.
PRINCIPLE OF THE ASSAY
The BEIA CMV IgG Quant kit is a quantitative enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) for the detection of specific IgG
antibodies to CMV, in human serum or plasma.
During the first incubation, only anti-CMV specific antibodies
present in serum or plasma bind to the inner surface of the wells
coated with the CMV antigen. After the first incubation the wells are
washed to remove non-reactive serum components. During the
second incubation a monoclonal antibody anti-human IgG
conjugated with horseradish peroxidase (HRP) is added. After a
second washing cycle, a substrate-TMB solution is dispensed into
the wells in order to detect specific antibodies during a subsequent
incubation. The enzymatic reaction is then stopped by adding a Stop
Solution which changes to yellow the blue colour developed into the
wells. The amount of colour is directly proportional to the specific
IgG anti-CMV concentration in the patient samples.
Pag. 15 - 24 BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013
KIT COMPONENTS
Package size: 96 tests.
Component
SORB
A
Coated Strip
12x8x1
CAL
0
B
Calibrator 0 (0 AU/mL)
1 x 2 mL
CAL
1
C1
Calibrator 1 ( 10 AU/mL)
1 x 2 mL
CAL
2
C2
Calibrator 2 ( 20 AU/mL)
1 x 2 mL
CAL
3
C3
Calibrator 3 ( 50 AU/mL)
1 x 2 mL
CAL
4
C4
Calibrator 4 ( 120 AU/mL)
1 x 2 mL
DIL
SPE
D
Sample Diluent BEIA System
1 x 120 mL
E
Conjugate
1 x 13,5 mL
CONJ
BUF
WASH 20X
F
Wash Buffer
1 x 100 mL
SUBS
TMB
G
Substrate-TMB
1 x 13,5 mL
H
Stop Solution
1 x 25 mL
Package Insert
1
H2SO4
A.
B.
C.
D.
E.
F.
Coated strips
Breakable strips coated with inactivated CMV virus packed in
sealed pouch. Place the unused strips in the pouch and reseal.
Calibrator 0 AU/mL
Negative human serum for IgG antibodies anti-CMV. Contains
0.09% w/w of Sodium azide as preservative. Ready to use
reagent.
Calibrators 10-20-50-120 AU/mL
Human serum, containing IgG antibodies anti-CMV with
different known concentrations. Contain 0.09% w/w of
Sodium azide as preservative. Ready to use reagent.
Sample Diluent BEIA System
Buffered salt solution (PBS). Contains protein, 0,09 % w/w
Sodium azide and Tween 20. Ready to use reagent
Conjugate
Monoclonal anti-human IgG antibody conjugated with
horseradish peroxidase. Ready to use reagent.
Wash Buffer
Buffered salt solution (PBS) 20x concentrated. Contains 0,1 % di
Kathon CG and Tween 20. See “Preparation of reagents”.
Pag. 16 - 24 BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013
G.
H.
Substrate-TMB
Tetramethylbenzidine H2O2/TMB in stabilizing buffered
solution. Contains pink dye. Ready to use reagent.
Stop Solution
1N Sulphuric acid solution.
Ready to use reagent.
STORAGE OF REAGENTS
Store all reagents at 2-8°C avoiding exposure to light. Do not use
reagents after the expiry date indicated on the label.
INTERCHANGEABLE REAGENTS
The Sample Diluent BEIA System, Wash Buffer, Substrate-TMB and Stop
Solution are common to all BEIA kits.
MATERIALS/EQUIPMENT REQUIRED BUT NOT PROVIDED





Microplate reader with 450/620 nm filters.
Manual or automated microplate washing device.
Precision pipettes with disposable tips 10,100,1000 L .
Disposable pipettes and normal glassware.
Distilled or deionised water.
WARNINGS AND PRECAUTIONS






Bring all reagents to room temperature (18-25°C) before use.
Only take the quantity necessary for the assay.
Avoid wells drying.
Use clean glassware.
Use a clean disposable pipette tip for each reagent.
Use a clean disposable pipette tip for each sample.
If the substrate-TMB shows a change from pink to blue colour,
discard the reagent.
Pag. 17 - 24 BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013



For repeated assays, each time provide for new diluted
samples.
Every analytical run should include control samples in order
to validate the results, according to criteria and procedures
established by each laboratory.
Periodical maintenance and calibration of pipettes and
microplate reader are required.
AUTOMATION
The test can be performed on automated ELISA processor. Please
refer to specific instrument manual for proper applications.
SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION
The test can be performed on serum or plasma (heparin – EDTA).
Specimens may be stored refrigerated at 2-8 °C up to 5 days. For
longer storage they should be aliquoted and stored frozen at – 20°C.
Avoid repeated thawing and freezing. Do not use haemolyzed,
lipemic or turbid specimens. All serum and plasma samples must be
pre-diluted with Sample Diluent BEIA System prior to assay. See
assay protocol.
PREPARATION OF REAGENTS
Wash Buffer (20 X)
Dilute 1:20 the content of the Wash Buffer bottle with distilled or
deionised water. The diluted Wash Buffer is stable 15 days when
stored at 2-8 °C; in any case, do not use it after expiry date printed
on the original label. If crystallization occurs in the concentrated
Wash Buffer, warm the solution to 37 °C before diluting. Only dilute
the quantity necessary for the assay.
WASHING CYCLES
Both using a microplate washer and washing the plate manually,
perform the following steps.
Pag. 18 - 24 BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013
1.
2.
3.
4.
5.
Empty the wells
Fill them with 300 µL of Wash Buffer.
Empty the wells
Repeat steps 2 and 3 for other 3 cycles
Dry the rim of the wells with blotting paper at the end of the
washing cycles.
ASSAY PROTOCOL
Allow all reagents to reach room temperature leaving them at
least 30-60 minutes at 18-25 °C.
1.
Dilute the samples to be assayed (1 :81) with the Sample
Diluent BEIA System (i.e. 10 µL of serum and 800 µL of
Sample Diluent BEIA System). Shake on Vortex.
2.
Select the number of strips required for the assay according to
the number of samples to be assayed and the Calibrators (see
paragraph “Summary of protocol” below). Reseal the pouch.
3.
Dispense 100 µL of each Calibrator and of the diluted sample.
4.
Incubate the plate at room temperature (18-25 °C) for 30
minutes.
5.
Perform a washing cycle following the suggested procedure
(see Washing Cycles).
6.
Dispense 100 µL of Conjugate in each well.
7.
Incubate the plate at room temperature (18-25 °C) for 30
minutes.
8.
Perform a washing cycle following the suggested procedure
(see Washing Cycles).
9.
Dispense 100 µL of Substrate-TMB in each well .
10. Incubate the plate at room temperature (18-25 °C) for 15
minutes.
11. Stop the chromogenic reaction dispensing 100 µL of Stop
Solution into each well.
12. Read the optical density in bi-chromatism at 450/620 nm.
CALCULATION AND INTERPRETATION OF RESULTS
RUN VALIDATION CRITERIA
Criteria used to validate the obtained results are the following:
Pag. 19 - 24 BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013
The ratio of the OD for Calibrator 4 (120 AU/mL) to the OD
for the Calibrator 1 (10 AU/mL) must be > 3.0

The ratio of the OD for Calibrator 0 (0 AU/mL) to the OD for
the Calibrator 1 (10 AU/mL) must be < 0.6
If the above criteria are not met, the run is invalid and the results
cannot be reported without a documented critical review of the
data. The non conformity must be addressed and treated according
to each laboratory’s Quality Assurance procedures. Each lab should
establish and follow its own internal Quality Control procedures
and use the QC results to validate runs and manage non
conformities.
CALCULATION OF RESULTS
Calculate the average O.D. values for each set of duplicate
calibrators and samples (duplicates should have a CV < 20%).
Create a calibration curve by plotting the mean of O.D. for each
calibrator concentration on the ordinate against the IgG anti-CMV
concentration on the abscissa. Draw a best fit curve through the
points of the graph. To determine the concentration of IgG antiCMV for each sample, first find the O.D. value on the ordinate and
extend a horizontal line to the calibration curve. At the point of
intersection, extend a vertical line to the abscissa and read the
corrisponding IgG anti-CMV concentration. If an automated
processor is available it’s advise to select among the following curve
fit types: cubic spline, hyperbolic and point-to-point straigth line.
The data below show typical results for the test. These data are
intended as an example only and should not be used to calculate
results from another run. Example of calculation with cubic spline
fit:
Calibrators
AU/mL
O.D.
AU/mL
Cal 0
0
0.071
Cal 1
10
0.395
Cal 2
20
0.806
Cal 3
50
1.597
Cal 4
120
2.525
Sample A
0.196
4.1
Sample B
0.481
12.2
Sample C
1.881
67.3

Pag. 20 - 24 BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013
INTERPRETATION OF RESULTS
Results from our clinical trials, performed on samples representative
of the European population, suggest the following interpretative
criteria:
AU/mL
INTERPRETATION
> 10
Sample should be considered POSITIVE for the
presence of IgG anti-CMV antibodies.
Sample should be considered NEGATIVE for
the presence of IgG anti-CMV antibodies.
Sample should be considered BORDERLINE for
the presence of IgG anti-CMV antibodies.
8
810
Please consider that:
- the test only detects specific IgG antibodies. It cannot per se and
univocally be referred to as evidence of infection;
- a medical decision cannot be made on the basis of a single test
result but should be grounded on all the available clinical data;
discrepancies in clinical data should be clarified prior to final
decisions, also, if necessary, by confirmatory or 2 nd level tests;
- results within grey zone should be made clear: re-testing the same
sample; testing a sample from another collection from the same
patient; comparing the results with those of a reference test.
PERFORMANCE DATA
Warning: Data below do not represent the performance
specifications of the kit, but only experimental evidence that the
performance of the kit is within such specifications, as intended by
the manufacturer.
SPECIFICITY AND SENSITIVITY
The diagnostic sensitivity and specificity were evaluated comparing
the BEIA CMV IgG Quant results versus an established EIA
commercial kit (EIA CMV IgG) with acceptable performances.
Pag. 21 - 24 BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013
BEIA
CMV IgG Quant
+
-
EIA CMV IgG
+
238
0
6
84
From which the following table can be calculated:
Relative Sensitivity
Relative Specificity
Agreement
97,5%
100%
98,2%
DETECTION LIMIT:
Trials in replicate on the Calibrator 0 lead to calculate the detection
limit in 0.44 AU/mL.
ANALYTICAL SPECIFICITY
No interference has been observed in samples with hemoglobin up
to 10 mg/mL, bilirubin up to 1 mg/mL, triolein up to 30 mg/mL.
Lipemic, turbid or hemolyzed samples, however, should not be
used.
REPEATABILITY
The within-run and run-to-run variability were determined using
one negative sample with concentration of 4 AU/mL and two
positive samples, containing different concentration : 11 AU/mL
and 70 AU/mL. These samples were tested 6 times per single run in
12 different analytical runs. Coefficients of variation lower than 20%
have been obtained for the negative sample and 7% for the positive
samples.
LIMITATIONS
Bacterial contamination or repeated freeze-thaw cycles of specimens
may affect the detectable levels of specific IgG.
Pag. 22 - 24 BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013
GENERAL DIRECTIONS FOR A SAFE USE

Keep the laboratory clean and tidy and strictly follow the
procedural directions.

Do not eat, drink, smoke or apply cosmetics in a clinical lab.

Do not pipette solutions or samples by mouth.

Wear disposable gloves and overalls when handling reagents
and samples. Avoid direct contact.

Wash hands thoroughly after assay.

Thoroughly clean working area with proper detergent
solutions.

Collect solid and liquid waste material in proper containers
and provide for disposal according to the local regulations.

Periodically check contamination level of operators and
rooms.
Reagents containing serum

All components of human origin have been tested and found
negative for HbsAg, anti-HCV and anti-HIV antibodies. Since
no known test can guarantee, however, that products derived
from human blood will not transmit Hepatitis, AIDS or other
infectious diseases, these reagents should be handled as
hazardous material.
Hazardous Reagents

Stop Solution (Council Directive 88/379/EEC)
R36/38
Irritating to eyes and skin.
S26
In case of contact with eyes, rinse immediately
with plenty of water, and seek for medical advice.
SUMMARY OF PROTOCOL



Prepare reagents
Pre-dilute samples 1:81 with Sample Diluent
Dispense:


Incubate 30 minutes at R.T. (18-25°C)
Perform 4 washing cycles
100L of Calibrators (0-120 AU/mL) in duplicate
100 L of pre-diluted samples in single or duplicate
Pag. 23 - 24 BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013







Dispense 100 L of Conjugate
Incubate 30 minutes at R.T. (18-25°C)
Perform 4 washing cycles
Dispense 100 L of Substrate-TMB
Incubate 15 minutes at R.T. (18-25°C)
Dispense 100 L of Stop Solution
Read the O.D. at 450/620nm
A
B
C
D
E
F
G
H
1
2
Cal 0
Cal 0
Cal 10
Cal 10
Cal 20
Cal 20
Cal 50
Cal 50
Cal 120
Cal 120
P1
P2
P3
….
….
….
3
4
….
REFERENCE - BIBLIOGRAFIA
- Champsaur H., Fattal-German M., Arranhado R. 1988. Sensitivity and
specificity of viral M determination by indirect enzyme-linked immunosorbent
assay. Journal of Clinical Microbiology 26: 323-332.
- Demmler GJ. 1994. Congenital cytomegalovirus infection. Semin. Pediatr.
Neurol. 1: 36-42.
- Dolan J., Briggs J.D. and Clements GB. 1989. Antibodies to cytomegalovirus in
renal allograft recipients : correlation with isolation of virus. J. Clin.Pathol. 42:
1070-1077.
- Griffiths PD., Stagno S., Pass RF., Alford CH. 1982 : Infection with
cytomegalovirus during pregnancy : specific IgM antibodies as a marker of
recent primary infection. Journal of Infectious Diseases 145 : 647-653
- Lennette EH. 1992. “ Laboratory Diagnosis of Viral Infections “ Second
Edition. New York : Dekker M, Inc.
- Nelson CT., Demmler GJ. 1997. Cytomegalovirus infection in the pregnant
mother, fetus and newborn infant. Clin. Perinatol. 24 : 151-160.
- Pass Rf., Griffiths PD., August AM. 1983 : Antibody response to
cytomegalovirus after renal transplantation : comparison of patients with
primary and recurrent infections. Journal of Infectious Diseases 147 : 40-46.
Patel
R.
and Paya C.V.. 1997. Infections in solid-organ
transplantrecipents.Clin. microbial. Rev. 10 : 86-124.
- Rasmussen L., Kelsall D., Nelson R., Carney W., Hirsch M., Winston D.,
Preisatis J., Merican TC. 1982: Virus-specific IgG and IgM antibodies in normal
and immunocompromised subjects infected with cytomegalovirus. Journal of
Infectious Diseases 145: 191-199.
Pag. 24 - 24 BEIA CMV IgG Quant Ed. 20/04/2013