Processo di isolamento

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IMPUREZZE DI NATURA CHIMICA
Ogni principio attivo puro o formulato è sempre
accompagnato da impurezze: la loro individuazione
è legata solo alla selettività e alla sensibilità
del metodo analitico
-
Origine
Da processo di sintesi (purezza reagenti, procedura di
purificazione, ecc)
Da fermentazione/estrazione (composti analoghi, procedura di
purificazione)
Da studi di stabilità (degradazione)
Da interazioni eccipienti/principio attivo
Cessioni da materiali di imballaggio
Da cross-contamination
Primo problema da risolvere: il metodo analitico
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SCEGLIERE IL CORRETTO METODO DI INDAGINE
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Selettività e sensibilità
La selettività di un metodo analitico consente di separare
tutte le specie chimiche presenti in un campione.
Sono sempre necessari diversi metodo analitici per ottenere il
profilo reale dei componenti del prodotto in analisi.
La sensibilità di un metodo analitico è legata alle
caratteristiche delle impurezze da evidenziare e alla richieste
regolatorie
- Per impurezze note usualmente (fino ad oggi) ci si
accontenta di frazioni di percento
Per impurezze incognite si seguono le raccomandazioni ICH,
mantenendole al di sotto dello 0.1%, calcolato secondo il
metodo della diluizione 1/1000, riferendolo alla risposta del
principio attivo.
Per impurezze genotossiche la sensibilità richiesta è molto
alta; il metodo dovrà essere idoneo alla rivelazione di ppm o
ppb di impurezza
La concentrazione delle impurezze è inoltre legata alla
quantità giornaliera somministrata di farmaco
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Selettività e sensibilità: impurezze genotossiche
Na2S
R1
R1
OH
O
+
R1
SH
OH
SH
EpSH1
Ep
EpSH2
R3
O
O
O
OH
+
R2
NH2
OH-/R3SH
S
O
OH
N
R2
RIVELAZIONE FLUORIMETRICA
(derivatizzazione)
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Selettività e sensibilità: impurezze genotossiche
OH
R1
S
O
OH
O
O
O
OH
N
OH-
R2
+
R2
NH2
EpSH1 + EpSH2
R1
+
OH
S
O
OH
N
R2
Rivelazione fluorimetrica: derivatizzazione con OPA
- Sensibilità OK
- Due reazioni consecutive (riproducibilità ?)
- Possibilità di formazione isomeri
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SELETTIVITÀ E SENSIBILITÀ: IMPUREZZE GENOTOSSICHE
Nuovo metodo: GC/MS (I.S.), SIM
Sensibilità <30 ppb
R1
O
Analisi diretta GC/MS/SIM
- Sensibilità OK
- Derivatizzazione: NO
- Riproducibilità: OK (Internal Standard)
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SELETTIVITÀ E SENSIBILITÀ: IMPUREZZE DA PRODOTTI DI
FERMENTAZIONE
-
Analisi diretta HPLC/UV
SELETTIVITA’: parametro più importante
Colonne/fasi mobili, rivelazione (peak purity)
Sensibilità OK (0.01-0.05 %)
Riproducibilità (metodo di integrazione)
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IMPUREZZE A STRUTTURA INCOGNITA
Qualora una impurezza incognita superi lo 0.1 %, si
rende necessaria la sua identificazione e
caratterizzazione
Isolamento per identificazione: pochi milligrammi per MS,
NMR, UV, IR
Isolamento per produzione reference standard: decine o
centinaia di mg
Isolamento per studi tossicologici: decine di grammi
La preparazione quantità importanti di impurezza, di
cui è stata provata la struttura, viene possibilmente
compiuta mediante sintesi chimica.
Nel caso di impurezze provenienti da prodotti di
fermentazione, spesso la sintesi non è fattibile e si
deve
necessariamente
procedere
per
estrazione/purificazione.
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IL PROCESSO DI INDIVIDUAZIONE E ISOLAMENTO
Cercare il classico ago nel pagliaio, spesso senza avere la
certezza che si tratti di un ago!
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IMPUREZZA SCONOSCIUTA DA FERMENTAZIONE
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IMPUREZZA SCONOSCIUTA DA FERMENTAZIONE
Processo di isolamento
ML0602
starting material
Collection fractions
Pool collected
A, B, C
RP/PHPLC
p-TSA 0.05M
Lichroprep C18
Collection fractions
SAX resin
p-TSA removal
SAX resin
p-TSA removal
SCX resin
concentration
SCX resin
concentration
solvent/ammonia
removal < 50 °C
solvent/ammonia
removal < 50 °C
Tot. 64 Prep runs
Pool collected
A, B, C
RP/PHPLC
p-TSA 0.05M
Delta Pak C18
Tot. 64 Prep runs
to 2nd Step
Pool collected
E, F, G
to 3rd Step
Pool collected
E, F, G
Collection fractions
Pool collected
M,M
RP/PHPLC
p-TSA 0.05M
Lichroprep C18
Collection fractions
SAX resin
p-TSA removal
SAX resin
p-TSA removal
SCX resin
concentration
SCX resin
concentration
solvent/ammonia
removal < 50 °C
solvent/ammonia
removal < 50 °C
Tot. 14 Prep runs
Pool collected
M, N
Pool purification
Q, M
RP/PHPLC
p-TSA 0.05M
Lichroprep C18
Tot. 6 Prep runs
to 4th Step
To
6th Step
Pool purification
Q, R
Pool collected
O, P, Q
To 5th Step
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IMPUREZZA SCONOSCIUTA DA FERMENTAZIONE
I° E II° STEP
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IMPUREZZA SCONOSCIUTA DA FERMENTAZIONE
III° E IV° STEP
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IMPUREZZA SCONOSCIUTA DA FERMENTAZIONE
V° step, impurezza isolata, 96.3%
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IMPUREZZA SCONOSCIUTA DA FERMENTAZIONE
VI° step, Impurezze X e Y
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IMPUREZZA SCONOSCIUTA DA FERMENTAZIONE
Riassunto del processo: HPLC preparativa
Materiale di partenza processato:30g
N° totale di corse preparative: 153
Tempo impiegato (prep HPLC): 180 h
Tempo impiegato (work-up):
150 h
Solvente totale (H2O):
850 l
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IMPUREZZA SCONOSCIUTA DA FERMENTAZIONE
Resa quantitativa del processo
%
g
g
Recovery
%
Recovery
IMP X
31,8
9,54
3
31,44
IMP Y
16,51
4,95
0,98
19,97
IMP1
1
0,3
0,063
21
45
13,5
-
-
UNKNOW
5,69
1,71
-
-
TOT
100
30
4,043
-
PP
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IMPUREZZA INTERAZIONE PRINCIPIO ATTIVO - ECCIPIENTE
Formulazione:
Ibuprofene/Polietilenglicole
O
O
O
O
O
O
OH
O
O
O
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IMPUREZZA INTERAZIONE PRINCIPIO ATTIVO - ECCIPIENTE
Formulazione:
Ibuprofene/Polietilenglicole/polialcoli
O
O
O
O
O
O
OH
OH
O
OH
HO
O
OH
O
O
OH
OH
HO
O
O
O
O
OH
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IMPUREZZE DA CESSIONE (LEACHABLES)
Problema:
picco incognito non correlato con struttura del principio attivo a
5.70 – 5.80 minuti
Prodotto: soluzione in fialoidi di Polietilene
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IMPUREZZE DA CESSIONE (LEACHABLES)
Sequenza operazioni per l’indagine
1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
Analisi bianco (negativa)
Analisi di intermedi e solventi impiegati nella sintesi (negativa)
Analisi eluenti, Sali per tamponi, acqua ecc. (negativa)
Analisi degradazioni accelerate (negative)
Analisi fiale autocampionatore per contaminazioni (negative)
Analisi estratti PE, fialoidi vuoti e pellets (negative)
Analisi campioni non filtrati (positiva: assenza picco incognito)
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IMPUREZZE DA CESSIONE (LEACHABLES)
Analisi cessione filtri per campioni da analizzare in HPLC
Risultato:
Il picco è un artefatto cromatografico dovuto alla cessione dal
microfiltro.
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IMPUREZZE DA CESSIONE (LEACHABLES)
Problema:
picco incognito non correlato con struttura del principio attivo a
13.0 minuti riscontrato anche nel placebo
Prodotto: soluzione in sacche Polietilene sterilizzate
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IMPUREZZE DA CESSIONE (LEACHABLES)
-
Procedura:
trattare 50-100 sacche contenenti placebo (3-5 cicli di
sterilizzazione)
Concentrare le soluzioni
Purificare il picco
Analisi in HRMS
Prodotto: soluzione in sacche Polietilene sterilizzate
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IMPUREZZE DA CESSIONE (LEACHABLES)
Lista dei possibili additivi fornita dal produttore
Antioxidants
Chemical identification
Cas N°
Irganox 1010
Pentaeritryl tetrakis[3-(3,5 di-terbutyl-4-Hydroxyphenyl) propionate]
6683-19-8
Irganox 1076
Octadecyl 3-(3,5 di-terbutyl-4-hydroxyphenyl) propionate
2082-79-3
Irganox 1330
1,3,5 trimethyl 2,4,6-tris-benzene
1709-70-2
Irgafos 168
Tris (2,4 di-terbutylphenyl) phosphite
31570-04-4
Irgafos 168 oxid
Tris (2,4 di-terbutylphenyl) phosphite oxyde
Irgafos P-EPQ
Tetrakis (2,4 di-terbutylphenyl)[1,1 biphenyl]-4,4’-biphosphonite
38613-7-73
Idrocalcite
Mg-Al-hydroxycarbonate
11097-59-9
Calcio stearate
Calcium stearate
1592-23-0
Plasticisers
Chemical identification
Erucamide
(Z)-docos-13-en-amide
112-84-5
Oleamide
(Z)-octadec-9-en-amide
301-02-0
Ogni additivo può generare prodotti di decomposizione
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IMPUREZZE DA CESSIONE (LEACHABLES)
Antiossidanti: Irganox 1040, Irgaphos 138
IRGANOX 1040
IRGAPHOS 138
OH
O
O
O
P
O
O
O
O
HO
OH
O
O
O
O
O
O
O
HO
O
O
O
OH
OH
OH
OH
O
OH
O
O
OH
O
O
O
P
OH
HO
O
O
HO
O
P OH
HO
P
OH
HO
HO
OH
O
O
O
OH
OH
OH
HO
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CONCLUSIONI
Ogni impurezza racconta la storia del prodotto e del processo
che l’ha creato
-
Conoscere le impurezze significa:
conoscere il prodotto
sapere come migliorarlo
sapere come formurarlo
sapere come rispettarlo
Grazie per l’attenzione
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