La saliva quale mezzo diagnostico di assunzione recente di

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La saliva quale mezzo diagnostico di assunzione recente di cannabinoidi
Nunziata Barbera1, Vincenzo Piazza1, Ferruccio Santangelo1, Guido Romano1
Riassunto
Gli Autori propongono l’utilizzo della saliva quale substrato diagnostico alternativo al sangue per identificare lo stato di
intossicazione acuta da cannabinoidi.
Lo studio è stato condotto su otto soggetti di sesso maschile, consumatori occasionali di Cannabis. I campioni di saliva,
prelevati ad intervalli di tempo costanti dopo il fumo di uno spinello, sono stati esaminati mediante GC/MS. La presenza di
cannabinoidi è stata rilevata sino a quattro ore dopo l’assunzione.
La metodica analitica utilizzata risulta di facile esecuzione e non invasiva, e potrebbe pertanto essere efficacemente
adottata per l’identificazione dei soggetti in stato di alterazione psicofisica conseguente all’uso di derivati della Cannabis.
Parole chiave: Cannabinoidi, Intossicazione acuta, Diagnosi, Saliva
Abstract
Saliva analysis as a tool for diagnosing the recent use of cannabinoids
The Authors evaluate the reliability of saliva analysis as a practical alternative to blood analysis for identifying acute
cannabinoid intoxication. The study was carried out on eight male volunteers who occasionally use Cannabis. Saliva samples were collected at regular intervals, after the volunteers had smoked a joint. Saliva analysis was performed using
GC/MS. The results suggest that saliva samples could be used as a new effective diagnostic tool to detect THC, CBD and
CBN up to four hours after smoking.
Keywords: Cannabinoids, Acute intoxication, Diagnosis, Saliva
Introduzione
L’accertamento dello stato di intossicazione acuta da
sostanze stupefacenti e psicotrope costituisce ancor oggi,
per quanti operanti nel settore tossicologico-forense, uno
dei punti di maggiore difficoltà applicativa e procedurale.
La valutazione dello “stato di intossicazione acuta da stupefacenti” si pone al centro di un complesso vuoto normativo che - di fatto - limita fortemente la sua concreta esecuzione. Allo stato attuale, infatti, l’unico riferimento normativo in ordine all’accertamento degli stati d’abuso è rappresentato dal D.M. 12 luglio 1990, n.186, “Regolamento
concernente la determinazione delle procedure diagnostiche e medico-legali per accertare l’uso abituale di sostanze stupefacenti o psicotrope”. Tale regolamento, tuttavia,
definisce le procedure diagnostiche e medico-legali finalizzate non tanto all’accertamento degli stati di intossicazione
acuta, quanto piuttosto all’individuazione dei comportamenti abituali d’abuso; da ciò discende, quindi, l’oggettiva
difficoltà diagnostico-procedurale sottesa alla valutazione
delle intossicazioni attuali da stupefacenti.
I cannabinoidi, in particolare, sono spesso implicati
nella dinamica di sinistri stradali.
Crouch e coll. (1), in uno studio condotto su 168
guidatori deceduti in seguito ad incidente stradale, segnalano che il 67% dei guidatori deceduti presentava a
livello ematico una o più sostanze d’abuso prevalentemente rappresentate da cannabinoidi e alcool. In un altro
studio, effettuato su 600 guidatori deceduti in incidenti
stradali, il 66% risultava positivo per stupefacenti e alcool, e di questi circa il 10% presentava livelli ematici
di cannabinoidi superiori a 3 ng/ml (2). Lund e coll. (3),
in uno studio riguardante 317 autotrasportatori, rilevarono la presenza di THC nel sangue e nelle urine del 16%
1
Dipartimento di Anatomia, Patologia Diagnostica, Medicina Legale, Igiene e Sanità Pubblica - Università degli Studi di Catania via Santa Sofia 87 - comparto 10 - 95123 Catania - tel. 095.256164 - fax 095.256165 - e-mail: [email protected]
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dei campioni analizzati; il 3% di tali soggetti si presentava in stato di intossicazione acuta.
Anche in Italia gli incidenti stradali costituiscono un
grave problema sociale, rappresentando la prima causa di
morte nella fascia d’età compresa tra i 15 ed i 24 anni, e la
quarta causa di morte nella popolazione in generale. Una
ricerca epidemiologica condotta dalla Regione Veneto,
dall’Assessorato alla Sanità, dall’Azienda Ospedaliera e
dall’Università di Padova, nell’ambito di una “Campagna
di prevenzione degli incidenti stradali” condotta a partire
dal 1994, ha esaminato l’incidenza del consumo di alcool,
di droghe e di farmaci in diverse popolazioni di utenti della
strada rilevando le frequenze medie di tali sostanze nei
conducenti durante i fine settimana. Da tali accertamenti,
effettuati su sangue e urine, è emerso che il 29,5% risultava intossicato da alcool e il 14% da stupefacenti, di questi
ultimi il 70% era positivo per i cannabinoidi (4).
Le difficoltà legate all’accertamento dello stato di intossicazione acuta da stupefacenti sono principalmente
connesse alla impossibilità di sottoporre i soggetti a prelievo ematico coatto perché ritenuto modalità di accertamento
eccessivamente invadente la sfera dell’integrità fisica e di
autodeterminazione, e ciò in linea con l’interpretazione
giurisprudenziale corrente secondo cui i necessari accertamenti e rilievi sulla persona debbano essere eseguiti senza
violare gli artt. 13 e 32 della Costituzione (5, 6). Per cui, se
da una parte i disposti legislativi relativi all’esecuzione di
tale accertamento escludono la possibilità del ricorso a metodiche invasive, dall’altra, l’esame tossicologico su campione ematico costituisce - allo stato attuale - l’unico metodo in grado di documentare l’assunzione acuta, essendo invece la presenza di sostanze stupefacenti e/o dei loro metaboliti nelle urine o nei capelli indice di assunzione pregressa.
Inoltre, sebbene la normativa vigente (art. 187 C.d.S.)
preveda che l’accertamento dello stato psicofisico possa
essere effettuato in base alla sintomatologia presentata dal
conducente, tale metodo sembra difficilmente applicabile
ai derivati dei cannabinoidi in quanto quest’ultimi non danno alcun rilievo semeiologicamente apprezzabile.
Del tutto recentemente numerosi studi sperimentali
hanno indagato la possibilità di effettuare indagini chimico-tossicologiche su campioni biologici alternativi a quello
ematico.
Di particolare interesse sono gli studi relativi all’individuazione di sostanze stupefacenti su campioni di saliva (7).
È stato visto infatti che la somministrazione di eroina (8, 9)
e cocaina (9-13), per via intranasale, endovenosa o inalatoria, dà luogo a concentrazioni salivari rilevabili gascromatograficamente. Nel caso di eroina e cocaina, pare inoltre
che la loro presenza a livello salivare sia dovuta a fenomeni di ridistribuzione; tale ipotesi è peraltro confermata dalla
concomitante presenza dei loro metaboliti. Indipendentemente dalla via di somministrazione, infatti, in seguito ad
assunzione di eroina è possibile evidenziare a livello salivare la monoacetilmorfina e la morfina, e nel caso della cocaina, anche la benzoilecgonina. Poiché la saliva rappresenta l’ultrafiltrato dei fluidi interstiziali, nel caso di eroina
28
e cocaina la ridistribuzione dal compartimento ematico
verso le ghiandole salivari è possibile per le caratteristiche
fisico-chimiche di tali molecole, e in particolare idrosolubilità e pKa (8-13). Di contro, nel caso di altre sostanze
stupefacenti, quali, ad esempio, i derivati della Cannabis,
la loro elevata liposolubilità limita fortemente la loro cinetica nei mezzi acquosi.
In tal senso sono stati effettuati numerosi studi sperimentali volti a verificare la possibilità di individuare i cannabinoidi a livello salivare. In uno studio condotto su 325
volontari dopo assunzione di cannabinoidi è stato rilevato
che la concentrazione salivare di THC riflette quella presente a livello ematico, sebbene non consenta di operare
una precisa correlazione (14). Sembra, inoltre, che in alcuni casi il THC è determinabile nella saliva per un periodo
di tempo più lungo rispetto al sangue (15). I dati presenti in
letteratura riportano che il THC salivare è determinabile fino a 8 ore dopo l’assunzione, e che il suo metabolita permane sino a 14 ore dopo (16). Le concentrazioni di THC
rilevabili nella saliva rientrano in un range piuttosto ampio,
compreso tra 5 e 330 ng/ml (14, 15, 17).
Tuttavia non sono ben chiari i metodi mediante i quali
vengono effettuati i prelievi dei campioni di saliva. È noto
infatti che l’assunzione di cannabinoidi è associata a secchezza delle fauci con produzione di scarsa quantità di saliva densa, rendendo poco agevole il prelievo dei campioni.
Altrettanto poco indagata risulta essere l’influenza esercitata dall’assunzione di cibo e di bevande sulla determinazione dei cannabinoidi a livello salivare.
Il presente studio è stato volto alla sperimentazione di
un metodo rapido ed efficace per il prelievo della saliva, ed
alla valutazione dell’eventuale influenza dell’assunzione di
cibo e alcool sulle concentrazioni salivari di cannabinoidi,
e segnatamente del cannabidiolo (CBD), del D9-tetraidrocannabinolo (D9-THC) e del cannabinolo (CBN).
Materiali e metodi
Gruppo sperimentale
Lo studio è stato condotto su 8 volontari di sesso maschile, consumatori occasionali di cannabinoidi. I soggetti
sono stati invitati a confezionare nove spinelli con uguale
contenuto di miscela di tabacco e hashish, secondo le modalità usuali.
Otto spinelli sono stati utilizzati dai componenti del
gruppo (uno spinello per partecipante), mentre uno spinello
è stato sottoposto ad analisi chimico-tossicologica al fine
di rilevarne il contenuto di principio attivo. Il quantitativo
medio di cannabinoidi presente nello spinello analizzato è
risultato il seguente: THC 15,8 mg, CBD 9 mg, CBN 3,6
mg.
Quattro soggetti (A-D) sono stati invitati a non consumare cibo, né bevande né a fumare sigarette per tutta la durata dell’esperimento; mentre, al fine di verificare l’effetto
dell’assunzione di alcool e cibo sulla concentrazione salivare di cannabinoidi, i soggetti E ed F sono stati invitati a
consumare una bottiglia di birra subito dopo aver fumato lo
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spinello, ed i soggetti G ed H a consumare un pacchetto di
cracker e bere due bicchieri di acqua dopo aver fumato lo
spinello.
Prelievo dei campioni di saliva
Ogni soggetto è stato sottoposto a ripetuti prelievi di
saliva dopo aver fumato lo spinello. I campioni di saliva
sono stati raccolti mediante lavaggio della cavità buccale
con 2 ml di una soluzione di acqua e alcool etilico al 5%.
A tale scopo, ad ogni partecipante sono stati forniti dei flaconcini di vetro, muniti di tappo a vite, contenenti l’esatta
quantità di soluzione di lavaggio già preparata. I prelievi di
saliva sono stati effettuati secondo i tempi riportati nel seguente protocollo:
Soggetto A: 15 minuti, 1 ora, 2 ore, 3 ore, 4 ore;
Soggetto B: 1 ora, 2 ore, 3 ore, 4 ore;
Soggetto C: 2 ore, 3 ore, 4 ore;
Soggetto D: 3 ore e 4 ore;
Soggetto E: (dopo aver bevuto) 1 ora, 2 ore, 3 ore e 4
ore;
Soggetto F: (dopo aver bevuto) 1 ora, 2 ore, 3 ore e 4
ore.
Soggetto G: (dopo aver mangiato) 1ora, 2 ore, 3 ore, 4
ore.
Soggetto H: (dopo aver mangiato) 1ora, 2 ore, 3 ore, 4
ore.
Ai tempi stabiliti come da protocollo, ogni partecipante
ha effettuato il risciacquo della cavità buccale per 30 secondi; il campione è stato quindi emesso direttamente nello
stesso flacone mediante apposito imbuto di vetro.
Estrazione del campione
Dopo aggiunta di metaqualone come standard interno
(10 ng/ml), ogni campione è stato estratto con 2 ml di nesano:etile acetato nel rapporto di 9:1. Dopo centrifugazione per 2 minuti a 3000 rpm, la fase organica è stata prelevata e lavata con 2 ml di acqua distillata. Dopo ulteriore
centrifugazione per 1 minuto a 3000 rpm, la fase organica
è stata prelevata ed evaporata in corrente di azoto. Il residuo secco è stato quindi ripreso con 20 ml di acetone.
Analisi GC/MS
L’analisi è stata condotta iniettando 1 ml delle soluzioni acetoniche precedentemente preparate in un gascromatografo Hewlett-Packard (HP), mod. 5890, collegato ad uno
spettrometro di massa HP mod. 5989B e ad un computer
HP Vectra XM2 alle seguenti condizioni operative: Colonna: Ultra2 (Crosslinked 5% PH ME Siloxane) 12 m x 0,2
mm i.d. x 0,33 mm film thickness; Temperatura colonna:
isoterma a 70 ∞C per 1 minuto, incremento di 50 ∞C/min
sino a 210 ∞C, incremento di 3 ∞C/min sino a 240 ∞C, incremento di 30 ∞C/min sino a 290 ∞C; isoterma a 290 ∞C
per 2 minuti; Temperatura iniettore: 250 ∞C; Temperatura
interfaccia: 280 °C; Temperatura sorgente: 250 °C; Temperatura quadrupolo: 100 °C; Gas vettore: elio 1 ml/min.
Acquisizione dei dati
L’acquisizione dei dati è stata effettuata mediante Se-
lected ion monitoring (SIM) utilizzando i seguenti rapporti
massa/carica (m/z): CBD: m/z 231, 232, 246, 314; THC:
m/z 299, 300, 314, 315; CBN: m/z 295, 296, 310; Metaqualone: m/z 235, 250.
Curva di calibrazione
La curva di calibrazione è stata realizzata mediante
analisi di campioni di saliva di controllo, prelevati secondo
le modalità sopra descritte, addizionati con quantità note di
CBD, THC e CBN (5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 50 ng/ml,
100 ng/ml, 200 ng/ml e 500ng/ml) e di standard interno
(metaqualone 10 ng/ml), estratti ed analizzati secondo la
metodica utilizzata per i campioni in esame
Risultati
I dati delle indagini eseguite in GC/MS relative alle
concentrazioni salivari di CBD, THC e CBN (ng/ml) sono
riportati nella tabella 1.
Si ricorda che i soggetti A-D non hanno assunto né cibo, né bevande per tutta la durata dell’esperimento mentre
i soggetti E ed F hanno bevuto una bottiglia di birra, ed i
soggetti G ed H hanno mangiato un pacchetto di cracker ed
hanno bevuto due bicchieri d’acqua dopo aver fumato lo
spinello.
Discussione
Dalla nostra indagine sperimentale è emerso che in seguito ad assunzione di derivati della Cannabis per via inalatoria è possibile rilevare la presenza di cannabinoidi a livello salivare. Il presente lavoro ha inoltre dimostrato che
nei soggetti che si sono astenuti da cibo e bevande, concentrazioni di CBD, THC e CBN sono ancora determinabili 4
ore dopo il fumo di uno spinello contenente circa 15 mg di
THC.
Anche nei soggetti che avevano assunto una bottiglia di
birra subito dopo il fumo dello spinello è stato possibile rilevare la presenza di cannabinoidi, sebbene in concentrazioni lievemente più basse, in tutti e quattro i prelievi effettuati ad intervalli di un ora.
Di particolare interesse è invece il dato relativo ai soggetti che avevano assunto cracker subito dopo aver fumato:
contrariamente ai dati riportati in letteratura (14, 15, 17),
infatti, la presenza di cannabinoidi è stata accertata solo nel
primo prelievo salivare effettuato un’ora dopo il fumo dello spinello. Le concentrazioni erano tuttavia molto basse e
già alla seconda ora il test dava esito negativo. Tale risultato è indicativo del fatto che le concentrazioni di cannabinoidi rilevabili nella saliva non provengono da processi di
ridistribuzione dal compartimento ematico verso quello salivare, quanto piuttosto da fenomeni di sequestro da parte
della stessa cavità buccale durante il fumo dello spinello.
Tale ipotesi è peraltro confermata da un’altro studio sperimentale (17) in cui è stato dimostrato che la somministrazione endovenosa di cannabinoidi non determina la presen-
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za di THC nella saliva. L’ipotesi che i cannabinoidi non
siano in grado di attraversare il compartimento ematico per
giungere alle ghiandole salivari troverebbe spiegazione
nella natura fortemente lipofila del THC, che renderebbe
particolarmente difficile la sua cinetica in mezzi acquosi.
Altro punto di particolare interesse è rappresentato dalla tecnica utilizzata per il prelievo. Al fine di ovviare alla
scarsa produzione di saliva, peraltro densa, che si verifica
in seguito ad assunzione di Cannabis, è stata utilizzata una
modalità di prelievo che prevede il risciacquo della cavità
buccale con quantità prefissate di soluzione di acqua e alcool etilico al 5%. Tale tecnica, oltre a rendere agevole il
prelievo, consente di asportare in maniera più accurata i
cannabinoidi presenti nella cavità buccale. L’impiego di tale miscela idro-alcoolica, in quantità prestabilita e costante,
e con tempi di risciacquo definiti, rende il prelievo più preciso e accurato; inoltre il campione così prelevato può essere direttamente utilizzato per l’estrazione dei cannabinoidi, eliminando la necessità di tecniche di deproteinizzazione, e fornendo risultati riproducibili.
I risultati ottenuti dal presente studio, contrariamente a
quanto sostenuto da Kintz e coll. (18) che reputano l’utilizzo della saliva suscettibile di falsi positivi e falsi negativi,
inducono a ritenere che i campioni di saliva possano essere
validamente utilizzati quale substrato d’indagine per l’accertamento dell’assunzione recente di cannabinoidi.
Il riscontro di THC nella saliva infatti è strettamente
correlato alla modalità stessa dell’assunzione dato che la
cavità buccale costituisce il percorso obbligato del fumo
durante l’aspirazione degli spinelli e ciò escluderebbe la
possibilità di falsi positivi.
In conclusione, il nostro studio consente di ipotizzare
che i cannabinoidi presenti nella saliva derivino non tanto
da processi di ridistribuzione dal sangue verso le ghiandole
salivari, quanto piuttosto da fenomeni correlati al sequestro
dei cannabinoidi presenti nel fumo da parte della stessa cavità buccale.
Sebbene le concentrazioni di cannabinoidi nella saliva
non siano in realtà correlabili a quelle presenti a livello
ematico, tale test consente tuttavia di stabilire se il soggetto
ha assunto di recente derivati della Cannabis.
Il riscontro di quantità determinabili di cannabinoidi fino a 4 ore dopo l’assunzione consente di indagare, inoltre,
l’arco di tempo durante il quale il THC esercita i suoi effetti, sebbene questi possano non essere più avvertiti soggettivamente.
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Non è ammessa forma alcuna di detenzione, di ispezione o
perquisizione personale, se non per atto motivato dalla autorità giudiziaria e nei soli casi e modi previsti dalla legge….
6) Art. 32 della Costituzione: La Repubblica tutela la salute come fondamentale diritto dell’individuo e interesse della collettività, e garantisce cure gratuite agli indigenti. Nessuno
può essere obbligato a un determinato trattamento sanitario
se non per disposizione di legge. La legge non può in nessun
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La saliva quale mezzo diagnostico di assunzione recente di cannabinoidi
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Tabella 1. Concentrazioni di THC, CBD e CBN (ng/ml) rilevate nella saliva degli otto
soggetti, a diversi intervalli di tempo dopo il fumo di uno spinello contenente circa 15,8
mg di THC, 9 mg di CBD e 3,6 mg di CBN. I soggetti A-D si sono astenuti dal cibo, dalle
bevande e dal fumo; i soggetti E ed F hanno bevuto una bottiglia di birra subito dopo
aver fumato lo spinello; i soggetti G ed H hanno mangiato un pacchetto di cracker e bevuto due bicchieri di acqua dopo aver fumato lo spinello.
A
B
C
D
E
F
G
H
243
114
17
194
405
21
7
4
2
19
11
3
127
28
10
115
29
8
15 min
CBD
THC
CBN
481
197
92
1 ora
CBD
THC
CBN
421
136
42
437
153
41
2 ore
CBD
THC
CBN
123
39
15
131
37
12
134
31
7
3 ore
CBD
THC
CBN
97
20
9
39
21
7
86
18
4
75
21
6
71
17
7
64
11
5
4 ore
CBD
THC
CBN
39
12
5
26
13
4
65
15
2
35
14
2
27
11
1
30
9
2
5
2
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