Aflatossine Determinazioni rapide

Aflatossine
Determinazioni rapide
Dr.ssa Lucia Monti
CRA-FLC, Settore lattiero-caseario - Lodi
([email protected])
Determinazioni rapide
VANTAGGI
SVANTAGGI
• monitoraggio di un gran
numero di campioni
contemporaneamente
• tempi brevi di risposta
• costi più contenuti
• personale non specializzato
(ma comunque qualificato)
• possibilità di analisi in-situ
• minore sensibilità e
specificità
• possibilità di falsi positivi o
falsi negativi
Matrici
• Mangimi
• Cereali
• Latte e derivati
AFB1, AFB2,
AFG1, AFG2
AFM1, AFM2
(AFB1, AFB2)
Tipologie
FLUORESCENZA
METODI IMMUNOENZIMATICI:
• FLUORIMETRIA
• ELISA
• STRIP/CARD REATTIVE
• IMMUNOSENSORI
SPETTROSCOPIA NIR
FLUORESCENZA
Esame della granella con luce UV (365 nm) in camera oscura.
Fluorescenza giallo-verde è data da acido kojico, un metabolita
prodotto da A. flavus, che reagisce con la perossidasi dei tessuti
della granella
ELEVATA PROBABILITA’ DI FALSI POSITIVI (il fungo può
produrre l’acido kojico, ma non le aflatossine); i campioni che
presentano fluorescenza si devono analizzare per confermare
l’eventuale presenza della micotossina
NO CORRELAZIONE tra fluorescenza e livello di contaminazione
(fluorescenza più evidente in granella danneggiata o rotta, dove la
muffa invade l’endosperma)
STRUMENTO AFLAFLESH: costituito da
un nastro trasportatore, lampade a raggi UV,
telecamera digitale ad alta risoluzione per la
rivelazione degli immagini.
Risultato finale espresso sia in numero totale di
chicchi contaminati, sia in superficie totale
espressa in pixel: possibilità di indicare classi
di appartenenza
Esame su 5 kg di granella; tempo 10 min.
METODI IMMUNOENZIMATICI
Anticorpi
• Policlonali: miscela di anticorpi ottenuti
dall’immunizzazione di un animale con un
antigene; sono prodotti da cellule diverse e
riconoscono epitopi diversi dello stesso antigene
• Monoclonali: sono prodotti da un’unica linea
cellulare e sono diretti contro un solo epitopo
dell'antigene (maggiore specificità)
• Ricombinanti: prodotti da organismi geneticamente
modificati (non molto utilizzato per le aflatossine)
Preparazione dei campioni
Mangimi e cereali:
• Riduzione delle dimensioni: triturare e
miscelare il campione; pesare la quantità
adeguata
• Estrazione: diluire con un soluzione di
estrazione (sz. acqua/metanolo), agitare e
filtrare (filtrazione grossolana)
• Diluizione: diluire un’aliquota dell’estratto e
filtrare (filtrazione più fine)
Latte: sgrassato per centrifugazione (t<10°C)
Latte in polvere: ricostituito in acqua al 10%
Preparazione dei campioni
Formaggio molle: estrazione con solventi
• Triturare e miscelare il campione (eliminare eventuali
muffe superficiali); pesare la quantità adeguata
• Estrazione: aggiungere solvente organico
(diclorometano), agitare, filtrare ed evaporare solvente
sotto N2
• Risospendere in solvente (metanolo e/o eptano e/o
esano) e PBS
• Centrifugare ed eliminare lo strato superiore di solvente
• Diluire con tampone la fase inferiore acquosa
•
Preparazione dei campioni
Formaggio a pasta dura:
digestione enzimatica con pepsina
riturare e miscelare il campione; pesare la quantità adeguata
strazione: aggiungere una soluzione di pepsina allo 0.2% in
0.1N HCl e incubare a 42°C per 16 ore sotto agitazione
entrifugare; recuperare il surnatante e filtrarlo per eliminare il
grasso
relevare una quota di filtrato e neutralizzarla con 0.5N
NaOH (pH 7÷7.5)
Preparazione dei campioni
Panna o burro
•
•
•
•
•
•
•
Pesare il burro o la panna e diluirli (1:5) in metanolo
Scaldare fino a fusione del grasso e agitare vigorosamente
Centrifugare per 10’ a bassa temperatura
Prelevare lo strato superiore ed eventualmente filtrarlo
Purificazione AFM1 mediante colonna di immunoaffinità
Eluizione dell’aflatossina con metanolo
Diluizione dell’eluato con tampone PBS e dosaggio
FLUORIMETRIA
Colonnine di immunoaffinità: clean-up step prima di HPLC opp.
quantificazione mediante fluorimetro
•
•
•
•
•
Preparazione del campione
Caricamento in colonna
Lavaggio con acqua
Eluizione con metanolo
Addizione di una soluzione di sviluppo in grado di aumentare la
fluorescenza delle aflatossine (sz. bromo o iodio)
• Lettura in un fluorimetro calibrato (λexc = 363 nm, λem =440 nm)
Tempo di analisi <30 min + preparazione del campione
MATRICI: - mais, riso, mandorle, arachidi
Range di det.: 1-300 ppb (aflatossine totali: B1, B2,G1,G2)
- latte: Range di det.: 12-200 ppt
RECUPERI: 80-90%
ELISA (Enzyme Lynked Immunosorbent Assay)
1° tipo
saggio competitivo diretto
Supporto di polistirene
Ab specifici per la
sostanza da ricercare
Antigene contenuto nella
soluzione standard o nel
campione
Antigene legato ad un Ab
coniugato ad un enzima
Substrato
incolore
Prodotto
colorato
Misurazione fotometrica
a λ=450 nm
ELISA (Enzyme Lynked Immunosorbent Assay)
2° tipo
Test immunoenzimatico competitivo
AF campione
o standard
AF coniugata
all’enzima
Ab-anti
aflatossina
Ab di cattura
contro Ab-anti
aflatossina
Substrato
incolore
Lavaggio di ciò che
non ha reagito
Prodotto
colorato
Dosaggio di tipo qualitativo o semi-quantitativo
(presenza/assenza rispetto ad un valore di riferimento)
+
lo
l
e
o
n
tr
o
i
n
p
co
m
Ca
lo
l
e
o
n
r
io
nt
p
o
c
m
Ca
Controllo: standard di aflatossina a 20 ppb
Campione: .-più blu, contenuto aflatossina inferiore rispetto al controllo
-meno blu (maggiore componente rossa), contenuto aflatossine
maggiore rispetto al controllo
Tempo saggio: 5 min
Possibilità di standard a diverse conc., lettura allo spettrofotometro e
quantificazione (limite di rilevabilità: 5 ppb)
Dosaggio quantitativo (lettura a λ=450 nm con un apposito lettore)
Colore sviluppato inversamente proporzionale alla quantità di
aflatossina presente nel campione
90
80
70
Abs%
60
CALCOLO DEI RISULTATI
assorbanza dello standard (o dei campioni) B
50
40
30
20
*100= x (%)
10
10
100
Log concentrazione (ppt)
assorbanza del valore massimo B 0
- il valore massimo di assorbanza (standard a conc=0) viene posto uguale al 100% e gli
altri valori sono espressi in percentuale:
- curva standard in un sistema di coordinate semi-logaritmiche
- in base ai valori di B/B 0 di ciascun campione interpolare le corrispondenti
concentrazioni sulla curva di calibrazione.
- moltiplicare i valori di concentrazione per il fattore di diluizione applicato.
Limiti di rilevabilità
• mangimi e cereali: 1/5 ppb
• latte: 5 ppt
• latte in polvere:
• (relativamente al latte ricostituito) 5 ppt,
• (relativamente al peso in g) 50 ppt
• formaggio molle (estrazione con solvente) 10-37-50 ppt
• formaggio a pasta dura (metodo enzimatico) 120 ppt
• burro: 12.5 ppt
Tempi di analisi: da 15 a 120 min
ELISA
(Enzyme Lynked Immunosorbent Assay)
Normativa UNI EN ISO 14675/2003
Latte e prodotti del latte: Linee guida per una descrizione
normalizzata di prove immuno-enzimatiche competitive Determinazione del contenuto di aflatossina M1
Parametri di saggio raccomandati
•
•
•
•
•
•
•
Anticorpi monoclonali o policlonali
Saggio immunoenzimatico competitivo
Formato: piastra a 96 pozzetti
Tempo di saggio: 3-4 ore
Concentrazione delle tossina espressa come assorbanza relativa
Cross-reattività con AFM1: 100%, con altre aflatossine: < 20%
Standard in doppio, a 6 o più diluizioni incluso lo zero, con una
concentrazione tra 5 e 50 ng/l o più
• Curva di taratura: modello logistica a quattro parametri opp. cubica;
regressione lineare solo nella parte lineare della curva standard
Precisione
Standard:
• CV dell’assorbanza relativa in condiz. di ripetibilità :<10%
• CV dell’assorbanza relativa in condiz. di riproducibilità :<20%
Campioni:
•
•
limite di ripetibilità: <100ng/kg ad un livello 200 ng/kg (latte in polvere)
limite di riproducibilità: <150ng/kg ad un livello 200ng/kg (latte in
polvere)
• limite di rilevabilità: <5 ng/kg (latte)
• limite di quantificazione: <10ng/kg (latte)
Recupero: >80% tra 10 e 50 ng/kg (latte) (correz. per il recupero non necessaria)
SENSIBILITA’ del saggio in funzione di TEMPO E TEMPERATURA
(affinità antigene-anticorpo regolata da reazioni termodinamiche)
SPECIFICITA’ (capacità dell’anticorpo, in presenza di molecole diverse, di
complessare un solo tipo di molecola): condizione soddisfatta da anticorpi
monoclonali e da antisieri contro molecole a basso PM
PRECISIONE data la non-linearità della curva, letture di assorbanza relativa
intorno al 50% danno risultati più precisi
Kit ELISA (Progetto Aflarid)
• Utilizzo del kit ELISA anche per l’analisi dei reflui di
caseificazione (siero, scotta, latticello), analizzati previa
neutralizzazione con NaOH 1N.
• Le analisi ELISA effettuate da laboratori diversi
forniscono dati comparabili su matrici liquide (R2=
0,9724), dando buone garanzie di affidabilità della tecnica
di screening.
• Le analisi ELISA hanno fornito risultati comparabili ai
dati HPLC.
• Pratiche di estrazione con solvente si sono rivelate adatte
al dosaggio della tossina in campioni di formaggi a pasta
molle.
•
l metodo di estrazione con pepsina, ad oggi
consigliata solo per formaggi a pasta dura e lunga
maturazione, andrebbe approfondita per la verifica
della sua efficacia anche per il dosaggio della tossina
in altre matrici: ad es., la procedura di estrazione con
solvente non sembra sufficiente per determinare un
recupero completo della tossina da campioni di
mozzarella ed è necessaria la digestione con pepsina
per ottenere recuperi prossimi al 100%.
(T. M.P Cattaneo, E.V. Panarelli, S. Iametti, A. Pietri, L. Monti. Studio di
parametri che possono influire sulle performance di metodi
immunochimici per il dosaggio di AFM1 in matrici casearie. Atti del II
Congresso nazionale “Le Micotossine nella filiera agro-alimentare”
Rapporti ISTISAN 07/37 Rev., 218-223)
1° TIPO: Anticorpo marcato con oro colloidale
Membrana
assorbente
Linea di
Controllo
ZA
N
SE
AS AF
DI
Linea di
Test
Test negativo (valore
di AF < limite di
rilevabilità del metodo)
Anticorpo di
controllo
Finestra
di lettura
Antigene
immobilizzato
Direzione
di flusso
Anticorpo
marcato con P
oro colloidale D RESE
IA
F
NZ
Linea di
Controllo
A
Applicazione
del campione
2° TIPO: Rilevazione aflatossina coniugata con enzima
Test
positivo
Se non compare la linea di controllo il test non è valido
Strip/card reattive
Strip/card reattive
Analisi semi-quantitativa: rivelazione visiva di bande colorate
Esempio: Interpretazione dei risultati e relativi tempi di incubazione
risultato negativo
20 ppb
10 ppb
4 ppb
Banda di controllo*
+++
+++
+++
+++
Banda del test dopo 4 ‘
(+-)
+
(+-)
(+-)
Banda del test dopo 8 ‘
(+-)
++
+
(+-)
Banda del test dopo 16 ‘
(+-)
+++
++
+
* visibile chiaramente dopo 2 minuti
+++ = banda intensamente colorata
++ = banda chiaramente visibile
+ = banda visibile
(+-) = banda debole
Possibilità di far reagire le strip in condizioni controllate in appositi
incubatori
Possibilità di leggere le strip con appositi lettori per quantificare il
risultato
Immunosensori elettrochimici
Università di Tor Vergata - Prof. Giuseppe Palleschi
• Sistema immunoenzimatico competitivo diretto
• Supporto (elettrodo stampato) rivestito con Ab
monoclonali anti-AF
• Competizione tra l’AF libera e quella coniugata all’enzima
(perossidasi)
• Aggiunta del substrato (3-3’-5-5’ tetrametilbenzidina,
TMB)+ H2O2
• Rilevazione: l’attività della perossidasi, che converte il
substrato in un prodotto elettroattivo, è misurata
elettrochimicamente
• I valori di corrente registrati vengono confrontati con
quelli dello standard zero senza aflatossina
•
eterminazione su elettrodi usa e getta accoppiati con
strumentazione portatile per misure sul campo
Rilevazione cronoamperometrica applicando un potenziale di 100 mV
Tempo = 75 min
Limite di determinazione 25 ppt; range di lavoro tra 30 e 160 ppt
Contro-elettrodo di grafite
Elettrodo di lavoro di grafite
Elettrodo di riferimento d’argento
L. Micheli, R. Grecco, M. Badea, D. Moscone, G. Palleschi, An electrochemical
immunosensor for aflatoxin M1 determination in milk using screen-printed
electrodes. Biosensors and Bioelectronics 21 (2005) 588–596
• Sistema elettrochimico multicanale, costituito da una piastra
ELISA di tipo competitivo diretto monouso da 96 pozzetti sul cui
fondo sono localizzati elettrodi stampati: supporti plastici di 0.5
mm su cui si trovano un elettrodo a carbonio (Ø3 mm) e un
elettrodo di riferimento ad Ag/AgCl
• Sistema di rilevazione: amperometria pulsata intermittente (IPA):
a ciascun pozzetto vengono inviati impulsi con potenziale di 100
mV della durata di 10 ms e una frequenza di 5 Hz, alternati a
periodi più lunghi in cui la piastra è scollegata dal circuito
Range di lavoro 5–250 pg mL-1 e limite di determinazione 1 pg mL-1.
D. Neagu, S. Perrino, L. Micheli, G. Palleschi, D. Moscone Aflatoxin M1 determination and
stability study in milk samples using a screen-printed 96-well electrochemical microplate.
International Dairy Journal 19 (2009) 753–758
• Determinazione in flusso dell’AFM1
(flow-injection immuno-assay FI-IA) con rilevazione amperometrica
• Incubazione off-line dell’AFM1, dell’Ab anti-AFM1 e dell’AFM1* coniugata all’enzima
• Iniezione nel sistema
• I complessi AFM1-Ab e AFM1*-Ab
si legano alla proteina G, con elevata
affinità per la regione costante delle Ig
• Eluizione dell’antigene marcato con l’Ab
e misurazione amperometrica dell’attività
dell’enzima (perossidasi) in seguito all’ossidazione di un substrato
• Rilevazione amperometrica
Range di concentrazione tra 20 e 500 ppt di AFM1, limite di determinazione 11 ppt, buona
riproducibilità (RSD < 8%), alta produttività (6 campioni in triplo in 1 ora).
M. Badea , L. Micheli, M.C. Messia, T. Candigliota, E. Marconi, T. Mottram, M. Velasco-Garcia, D. Moscone,
G. Palleschi, Aflatoxin M1 determination in raw milk using a flow-injection immunoassay system, Analytica
Chimica Acta 520 (2004) 141–148
Spettroscopia NIR
Near Infra Red Spectroscopy (λ
λ: 1000 - 2500 nm)
•
•
•
•
Consente l’analisi di campioni tal quali, senza uso di reagenti chimici
Tempo d’analisi < 2 min
Possibilità di misurare diversi parametri contemporaneamente;
Metodo sufficientemente accurato e preciso per l’analisi della composizione in
macrocostituenti dei prodotti alimentari; possibile dosaggio di costituenti minori
• Disponibilità di strumentazione portatile per rilevazioni in campo
Spettro NIR
Pre-processamento dei dati
Calibrazione
Partial Least Squares
Cross-validazione o validazione
su set indipendente
Predizione: verifica della
robustezza della calibrazione
NIR-AFB1
V. Fernández-Ibañez, A. Soldado, A. Martínez-Fernández, B. de la Roza-Delgado.
Application of near infrared spectroscopy for rapid detection of aflatoxin B1 in maize
and barley as analytical quality assessment. Food Chemistry 113 (2009) 629–634
• Messe in luce le potenzialità della tecnica NIR come tecnica di
screening per la determinazione dell’AFB1 in granella di mais e
orzo a valori di 20 ppb (152 campioni)
• No falsi negativi
• Possibilità di applicare la tecnica on-line
• Necessità di ampliare il data-set per migliorare l’equazione di
calibrazione
• Sono state evidenziate differenze tra gli spettri delle diverse
popolazioni di campioni contaminati. Evidenziate bande di
assorbimento nell’IR riconducibili all’infezione fungina e
determinate da composti cellulari del fungo.
NIR-AFM1
• 140 campioni di prodotti lattiero-caseari (grana, mozzarella, crescenza, caprino,
ricotta, panna e burro) a diverso contenuto naturale di AFM1: lettura in capsula
Petri, in trasmittanza ad una λ da 850 a 1050 nm, ogni 2 nm per un totale di 100
punti per spettro.
• Confronto dati spettrali - dati ELISA
• Costruzione di curve di calibrazione suddividendo i campioni in 3 set: Formaggi
freschi (80), Formaggi a lunga stagionatura (37), Prodotti a elevato contenuto lipidico (23)
Valori di coefficiente di regressione lineare ( R ) sempre superiori a 0.90, valori di slope sempre
superiori a 0.75, errori standard in calibrazione (RMSEC%) compresi tra 7 e 11%, errori
standard in validazione (RMSECV%) contenuti tra 12 e 16% per i formaggi freschi e
comunque inferiori al 20% per le altre categorie di prodotto
•Analisi qualitativa PLSDR sul campione formaggi freschi, suddividendo i campioni
in due categorie in funzione della concentrazione di AFM1 (> o < 200 ppt): buone
potenzialità di classificazione con potere discriminante pari al 90%.
Cattaneo T.M.P., Panarelli E.V., Barzaghi S., Giangiacomo R., “Dosaggio di Aflatossina M1 in prodotti
caseari mediante spettroscopia nel vicino infrarosso (NIR)”. Atti del VI Congresso Nazionale di Chimica
degli alimenti. A cura di J.D. Coïsson, M. Arlorio, A. Martelli. Ed. Taro (Alessandria), 657-662 (2007).
Correlazione dati NIR- CE (elettroforesi capillare) usando
i valori dell’area del picco dell’as1-I-caseina come
variabile: determinazione indiretta della presenza di
AFM1 in funzione dell’attività proteolitica nei formaggi
contaminati.
Cattaneo T.M.P., Cabassi G., Panarelli E.V., Giangiacomo R., “Why does NIT discriminate Quark
type cheese manufactured in the presence or absence of aflatoxin M1 (AFM1)? J. Near Infrared
Spectrosc. 16 (3) 159-164, 2008
Per la sicurezza degli operatori
del laboratorio……..
• Evitare il contatto del reagente con la cute:
indossare indumenti protettivi, inclusi guanti
in lattice, e camici.
• Indossare mascherina e occhiali protettivi.
• Decontaminare la vetreria e le soluzioni
contenenti le tossine con una soluzione di
ipoclorito di sodio per una notte e sciacquare
con abbondante acqua distillata.