ricerca di mrsa con screening su campioni

METODO NAZIONALE STANDARD
RICERCA DI MRSA
CON SCREENING
SU CAMPIONI
BSOP 29
Emesso da Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory
Centre for Infections
RICERCA DI MRSA CON SCREENING SU CAMPIONI
Revisione no. 5 Data di revisione: 27.07.07 Emesso da: Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory Pagina 1 di 24
BSOP 29i5
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STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD
I Metodi Nazionali Standard, che includono le procedure operative standard (POS) algoritmi e linee guida,
promuovono l’adozione di elevati livelli di qualità, contribuendo ad assicurare la possibilità di confronto
delle informazioni diagnostiche ottenute in laboratori diversi. Ciò consente la standardizzazione della
sorveglianza sostenuta dalla ricerca, sviluppo e verifica, promovendo nello stesso tempo la salute
pubblica e la fiducia del paziente nelle proprie strutture sanitarie. I metodi sono ben referenziati e
rappresentano un buon standard minimo per la microbiologia clinica e per la salute pubblica. Comunque,
utilizzando i Metodi Nazionali Standard, i laboratori dovranno tenere in considerazione le esigenze locali
e potranno intraprendere ricerche addizionali. I metodi forniscono inoltre un punto di riferimento per un
loro ulteriore sviluppo.
I Metodi Nazionali Standard sono stati sviluppati, revisionati ed aggiornati con una procedura aperta di
consenso ove le opinioni di tutti i partecipanti sono state tenute in adeguata considerazione ed i
documenti elaborati riflettono il consenso della maggior parte degli stessi.
I rappresentanti di alcune organizzazioni professionali, incluse quelle il cui logo appare sulla prima
pagina, sono membri dei gruppi di lavoro che sviluppano i Metodi Nazionali Standard. L’inclusione del
logo di una organizzazione nella prima pagina implica sostegno agli obiettivi ed al processo di
preparazione dei metodi standard. I componenti di queste organizzazioni scientifiche hanno partecipato
allo sviluppo dei Metodi Nazionali Standard ma le loro opinioni personali non rispecchiano
necessariamente quelle dell’organizzazione di cui sono membri. L’elenco attuale delle organizzazioni
professionali partecipanti può essere ottenuto tramite e-mail all’indirizzo [email protected].
Le prestazioni dei metodi standard sono condizionate dalla qualità di reagenti, strumentazione, procedure
commerciali o prove messe a punto in loco. I laboratori dovrebbero assicurare che queste siano state
validate e dimostrate idonee allo scopo prefissato. Devono essere adottate procedure di controllo di
qualità interno ed esterno.
Nonostante siano state osservate le più scrupolose attenzioni nella preparazione di questa pubblicazione,
la Health Protection Agency o qualsiasi organizzazione di sostegno non può essere ritenuta responsabile
dell’accuratezza o dell’utilizzo o di qualsiasi conseguenza derivante dall’uso o da modifiche delle
informazioni contenute in questo documento. Queste procedure sono intese solamente come una risorsa
generale per i professionisti che esercitano in questo settore, operanti nel Regno Unito, pertanto si dovrà
ricorrere ad altri consulenti quando ritenuto necessario. Se si apportano modifiche a questa
pubblicazione, si deve porre in evidenza dove sono state apportate modifiche al documento originale. La
Health Protection Agency (HPA) dovrà essere informata in ogni circostanza.
La HPA è una organizzazione indipendente che ha lo scopo di proteggere la salute della popolazione. Ad
essa confluiscono esperienze professionali già appartenenti ad organizzazioni ufficiali. Maggiori
informazioni riferibili alla HPA possono essere ottenute al sito www.hpa.org.uk
La HPA è un’organizzazione che mira ad essere completamente in accordo con le direttive Caldicott. Ciò
significa prendere ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni
sui pazienti e di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di
sicurezza1.
Maggiori dettagli possono essere ottenuti dal sito web www.evaluations-standards.org.uk. Contributi allo
sviluppo dei documenti possono essere forniti contattando l’indirizzo [email protected].
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aggiornata automaticamente.
Riferimento suggerito per questo documento:
Health Protection Agency (2007). Investigation of specimens for screening for MRSA. Standard
Operating Procedure BSOP 29 Emissione 5. http://www.hpastandardmethods
RICERCA DI SCREENING SU CAMPIONI DI MRSA
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INDICE
STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD ...................................................................................
2
INDICE ...................................................................................................................................................
3
PROCEDURA DI MODIFICA ................................................................................................................
4
SCOPO DEL DOCUMENTO ...................................................................................................................
5
INTRODUZIONE .....................................................................................................................................
5
INFORMAZIONE TECNICA ....................................................................................................................
9
1
CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA .....................................................................................
1.1
1.2
1.3
2
PRELIEVO DEL CAMPIONE ………..……..……………………………………………………………...
TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE ………………………………………………………..
PROCEDURA SUL CAMPIONE …………………………………………………………………………...
10
10
10
PRELIEVO DEL CAMPIONE ......................................................................................................
10
2.1
2.2
2.3
3
10
TEMPO OTTIMALE PER IL PRELIEVO DEL CAMPIONE ……………………………………………………..
TIPO DI CAMPIONE ADEGUATO E METODO DI PRELIEVO ………………………………………………….
QUANTITA’ ADEGUATA E NUMERO APPROPRIATO DI CAMPIONI ............................................................
10
10
10
TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE ...............................................................
10
3.1
3.2
TEMPO FRA PRELIEVO DEL CAMPIONE E PROCEDURA …………………………………………………..
CONSIDERAZIONI PARTICOLARI PER RIDURRE IL DETERIORAMENTO ………………………………..……
10
10
PROCEDURA SUL CAMPIONE ......................................................................................................
10
4.1
4,2
4,3
4,4
4,5
4,6
SELEZIONE DELLA PROVA ………..…….…………………………………………………………………
ASPETTO …………….…………………………………………………………………………………
MICROSCOPIA …………………………………………………………………………………….……
COLTURA E RICERCA …………………………………………………………………………………..
IDENTIFICAZIONE ……………………………………………………………………………………….
PROVE DI SENSIBILITA’ AGLI ANTIMICROBICI …….………….………………………………..…………
10
11
11
11
12
12
PROCEDURA DI REFERTAZIONE ............................................................................................
12
MICROSCOPIA…………………………..………………………………………………………………
COLTURA …………………………………………………………………………….………………..
12
13
6
SEGNALAZIONE ALLA HPA (LOCALE E SERVIZI REGIONALI ED AL CDSC CENTER FOR
INFECTIONS) ...............................................................................................................................
13
7
RINGRAZIAMENTI E CONTATTI ................................................................................................
14
ALLEGATO 1 .........................................................................................................................................
15
ALLEGATO 2 .........................................................................................................................................
17
BIBLIOGRAFIA ......................................................................................................................................
18
4
5
5.1
5.2
RICERCA DI SCREENING SU CAMPIONI DI MRSA
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PROCEDURA DI MODIFICA
Documento di riferimento controllato
Titolo del documento controllato
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Ricerca di screening su campioni per MRSA
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proprietario.
Modifica
Numero/
Data
Emissione
no.
Scartata
Inserita
Emissione
no.
Pagina
Sessione(i)
interessate
Modifica
6/
27.07.07
4.2
5
Tutte
Tutte
Meticillin usata al posto di
Methicillin
Tutte
Tutte
Allegato 1
Eliminata (Raccomandazioni
per lo screening di MRSA)
9
Informazione
tecnica
Inserita sezione
17
Bibliografia
Bibliografia revisionata ed
aggiornata
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RICERCA DI SCREENING SU
CAMPIONI PER MRSA
Tipo di campione: Screening su campioni per MRSA
SCOPO DEL DOCUMENTO
Questa Metodo Nazionale Standard descrive le procedure da applicare ai campioni per il rilievo di
Staphylococcus aureus meticillina resistente (MRSA). Alcuni campioni possono richiedere colture di routine
addizionali.
NB. In questo documento “meticillin” è stato usato al posto di “methicillin” in accordo con le recenti linee guida
dell’International Pharmacopeia.
INTRODUZIONE
La meticillina è stata la prima molecola di penicillina ad essere penicillinasi-resistente e pertanto è stata
ampiamente utilizzata per saggiare la sensibilità dello S. aureus ad agenti E-lactamici resistenti alle penicillinasi.
Pertanto, nonostante la meticillina non sia più disponibile e l’oxacillina l’abbia sostituita per le prove di sensibilità,
i ceppi resistenti sono comunemente noti come MRSA. Il MRSA può anche essere refertato come S.aureus
oxacillina resistente (ORSA).
I ceppi MRSA sono un problema costante ed in progressivo aumento in molti ospedali. I pazienti colonizzati ed
infetti rappresentano la riserva più importante di MRSA negli ospedali. I MRSA sono trasmessi principalmente
per contatto diretto da persona a persona, di solito tramite le mani del personale sanitario 2-6 e contaminazione
ambientale7. Lo screening per i MRSA fornisce un mezzo per identificare i pazienti ed il personale sanitario
coinvolti nella trasmissione del microrganismo.
Emergenza di ceppi meticillina resistenti di S. aureus
I MRSA sono stati descritti per la prima volta negli anni “60”8 ed il loro riscontro è risultato diverso all’interno di
una Nazione e fra Nazioni. Alla fine degli anni “70” ed all’inizio degli anni “80”, i ceppi di S. aureus resistenti a
numerosi antibiotici, inclusa la meticillina e la gentamicina, sono stati responsabili in modo crescente di epidemie
con infezioni ospedaliere in tutto il mondo9,10 ed alcuni cloni hanno raggiunto diffusione internazionale11. Nel
Regno Unito il Laboratory of Hospital Healthcare Associated Infection ha definito e monitorato la comparsa dei
ceppi epidemici di MRSA (EMRSA).Gli EMRSA sono definiti come microrganismi che coinvolgono almeno due
pazienti in almeno due ospedali. Alcuni ceppi EMRSA hanno coinvolto molti ospedali ed i ceppi attuali (in modo
particolare l’EMRSA15 e 16) sono diffusi ovunque12. Gli EMRSA sono riconosciuti con la tipizzazione fagica e
con altre tecniche, quali quelle di tipizzazione molecolare13, 14. Lo spettro di sensibilità può inoltre fornire una
identificazione presuntiva degli EMRSA presso i laboratori di microbiologia diagnostica.
In Inghilterra e nel Galles la diffusione di MRSA è stata ben controllata fino ai recenti anni ‘90. Nel periodo 198991 solo l’1,6% degli S. aureus isolati da batteriemie risultava resistente alla meticillina12. Comunque, la
percentuale di resistenza alla meticillina è consistentemente aumentata negli anni “90” fino al 13,2% nel 1995 15
ed attualmente in alcune nazioni supera il 40%16. Negli anni “90” si è verificato anche un aumento percentuale
significativo di isolati con resistenza ad eritromicina, clindamicina, ciprofloxacina, gentamicina, trimethoprim e
rifampicina15. I MRSA sono spesso resistenti a molti agenti terapeutici attualmente disponibili per il trattamento di
gravi malattie stafilococciche.
La maggior parte delle infezioni da MRSA è associata alle strutture sanitarie, ma un numero crescente di loro è
di origine comunitaria in pazienti che non presentano specifici fattori di rischio predisponenti all’infezione. Quelle
da MRSA di tipo comunitario (CA-MRSA, community-acquired) sono di solito clinicamente lievi, e solo talvolta
severe. La presenza della leucocidina di Panton-Valentine (PVL, Panton-Valentine leucocidin) è frequente nei
ceppi CA-MRSA e gli isolati sono spesso resistenti ai ȕ-lattamici17 e circa il 2% possiede geni PVL18
RICERCA DI SCREENING SU CAMPIONI DI MRSA
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Prevalenza
In questo periodo EMRSA-3, EMRSA-15 ed EMRSA-16 sono i ceppi epidemici prevalenti nel Regno Unito 12 La
loro presenza è maggiore in alcune parti della nazione, con Londra che ora presenta la più elevata percentuale
di resistenze nelle batteriemie da MRSA19. Recentemente sono stati segnalati EMRSA -17 in alcuni ospedali del
Sud e del Centro20
Le infezioni ospedaliere da MRSA rappresentano attualmente il rischio maggiore per i pazienti ammessi in molti
ospedali del Regno Unito. La causa di questo drammatico incremento delle infezioni da MRSA nel Regno Unito
è probabilmente di origine multifattoriale. I ceppi prevalenti manifestano una particolare capacità di diffusione.
Questa caratteristica può essere correlata a modifiche nelle procedure ospedaliere per aumento dei trasferimenti
all’interno delle aree di degenza21 e ad un ridotto rapporto fra personale sanitario e paziente in alcuni reparti.
Inoltre, una consistente riserva di pazienti con MRSA è attualmente presente nella comunità e nelle case di cura
del Paese. E’ stato segnalato che i MRSA tendono a sostituire i ceppi sensibili alla meticillina di S. aureus
(MSSA)22, ma la maggior parte degli studi segnala che le infezioni da MRSA tendono a manifestarsi
addizionandosi alla percentuale ambientale attesa da parte dei MSSA23-28.
Linee guida per il controllo dei MRSA
Le linee guida per il controllo dei MRSA nelle istituzioni di assistenza29 sono state approntate in una riunione di
lavoro fra l’Hospital Infection Society, la British Society for Antimicrobial Chemotherapy e la Infection Control
Nurses Association. Queste linee guida raccomandano una valutazione dell’entità del rischio ed informano i
Comitati di Controllo di adottarle localmente, quando si definiscono le politiche per il controllo delle infezioni.
Altre raccomandazioni sono state pubblicate dal Scottish Infection Standards and Strategy Group30, e dal
Department of Health31.
Virulenza
Numerosi studi32 hanno dimostrato che la maggior parte dei pazienti dai quali sono stati isolati ceppi di MRSA
sono colonizzati piuttosto che infetti, sebbene la quota dei pazienti colonizzati che sviluppa infezione varia dal 5
al 60% in funzione della popolazione indagata 21, 33, 34. I fattori che predispongono la colonizzazione superficiale
includono le procedure che riguardano l’igiene ‘delle mani’ come si verifica nella chirurgia per acuti, dialisi renale
ed unità di terapia intensiva. Il rischio che la colonizzazione si trasformi in infezione aumenta in presenza di ogni
tipo di discontinuità cutanea, quali ferite chirurgiche e dispositivi che penetrano nella cute, come protesi, cateteri
ecc. che forniscono una porta d’ingresso ai batteri 35-38. Alcuni studi caso controllo hanno dimostrato che i MRSA
sono simili per quanto riguarda la virulenza ai ceppi MSSA39, 40. Le infezioni più gravi da CA-MRSA sono
principalmente correlate a produzione di PVL41-43. Quando trattate in modo appropriato con vancomicina, la
percentuale di mortalità delle infezioni da MRSA è simile a quella da ceppi sensibili alla meticillina44.
Resistenza multipla ai farmaci
Nel Regno Unito i ceppi prevalenti di EMRSA hanno mantenuto la sensibilità ad alcuni antibiotici, inclusi i
glicopeptidi vancomicina e teicoplanina (consultare l’Allegato 2). Sono stati comunque descritti In alcune nazioni,
quali Giappone45, USA46 e Francia47 e UK48 ceppi MRSA che presentano una ridotta sensibilità alla vancomicina
ed isolati clinici a resistenza elevata negli USA49, 50. Deve essere considerata questa eventualità quando si
ricoverano in ospedale pazienti provenienti da altri Paesi, specialmente nelle unità di terapia intensiva, ustionati
ed altre unità di tipo specialistico51 ed anche ogni paziente con MRSA in cui è risultato apparentemente
inefficace un trattamento con antibiotici glicopeptidici 47, 48. Alcuni ceppi possono dimostrare resistenza anche a
20 composti antimicrobici, inclusi antisettici e disinfettanti52 e questo andamento nell’acquisizione di extra
resistenze sembra essere in aumento19, 53, 54. Nonostante queste osservazioni, per il trattamento delle infezioni
da MRSA sono disponibili alcuni farmaci efficaci e ne sono stati sviluppati nuovi di prossima disponibilità55.
Meccanismi di resistenza
La resistenza intrinseca ai E-lattamici nei ceppi di S. aureus di provenienza clinica è spesso eterogenea. Un elevato
livello di resistenza è espresso da una minoranza di cellule cresciute sui comuni terreni a 37°C ma in modo più
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consistente nei terreni iperosmolari o a 30°C56, 57. Sebbene la maggior parte dei MRSA produca una E-lattamasi,
questa non è responsabile della loro resistenza alla meticillina. Tutti i MRSA possiedono il gene mecA, essenziale
nel determinare la resistenza alla meticillina. Il mecA è un segmento di DNA di 2.130 paia di basi che codifica
per una proteina legante la penicillina (PBP2’ o PBP2a), caratterizzata da una bassa affinità per la maggior pare
dei E-lattamici, e che si ritiene acquisisca le funzioni di tutte le altre PBS quando queste sono saturate dalla
meticillina o da altri antibiotici E-lattamici58. I MSSA non producono questa proteina ed il loro DNA non si
ibridizza con la sonda specifica per il gene mecA. Il determinante genetico della PBP 2a è trascritto in tutte le
cellule dei MRSA ed in tutte le classi fenotipiche di MRSA, ma fattori addizionali influenzano l’espressività della
resistenza alla meticillina59.
Il gene mecA appartiene ad un elemento genetico mobile, lo staphylococcal chromosomal cassette mec
(SCCmec), incorporato nel cromosoma60. Sono noti cinque tipi diversi di SCCmec, classificati ad oggi come I, II
III, IV e V61, 62. La maggior parte dei MRSA acquisiti in ospedale sono di tipo , I, II o III, mentre la maggior parte
dei CA-MRSA sono di tipo IV o V17, sebbene EMRSA-15 sia di tipo IV.
La presenza del gene mecA e di una MIC per l’oxacillina >2mg/L63, 64 o >4mg/L per la meticillina64, 65, o>4mg/L
per la cefalotina64, sono criteri accettati per definire la resistenza alla meticillina.
Resistenza borderline
Possono essere isolati alcuni Staphylococcus aureus che non sono tipicamente ceppi di MRSA ma che
manifestano una resistenza borderline all’antibiotico. Ciò può essere dovuto ad iperproduzione di E-lattamasi
(particolarmente evidente quando si saggia la sensibilità all’oxacillina) od a modificazione delle PBP 66. I risultati
emersi da alcune sperimentazioni su animali indicano che l’iperproduzione di ȕ-lattamasi non è clinicamente
significativa; sono richiesti ulteriori accertamenti sulla virulenza e l’efficacia della terapia nei pazienti infettati da
ceppi a resistenza borderline per definire le opportune misure di controllo68, 69.
Tecniche per il rilievo delle resistenze
Le tecniche di biologia molecolare per il rilievo del mecA sono considerate “gold standard” per la determinazione
della resistenza. La polymerase chain reaction (PCR) per l’amplificazione del gene mecA dello stafilococco può
essere eseguita in poche ore. La PCR non è attualmente disponibile presso molti laboratori diagnostici ed i costi
aggiuntivi per il ricorso alla PCR devono essere giustificati. Comunque, la PCR è utile per confermare resistenze
equivoche e sono disponibili confezioni commerciali64. Le prove convenzionali per la sensibilità alla oxacillina
sono influenzate in modo significativo dalle condizioni analitiche; in modo minore lo è la disco diffusione con
cefalotina, più affidabile di quella con oxacillina71, 72. La disco diffusione ed i metodi breakpoint sono ampiamente
utilizzati. Tuttavia, possono essere considerati altri metodi più rapidi, quali l’agglutinazione con lattice per la
ricerca della proteina PBP2a, commercialmente disponibile presso alcuni fornitori.
Screening per MRSA
Nell’intento di ottenere il miglior utilizzo delle limitate risorse ospedaliere e ridurre al minimo la morbilità correlata
a questi microrganismi, è utile dotarsi di una politica di programmazione di screening per indirizzare le misure di
controllo e proteggere i pazienti dalla colonizzazione e dall’infezione da MRSA. In modo particolare, chi fra
pazienti e personale sanitario deve essere sottoposto a screening dipenderà dalle condizioni di endemia
presenti per questo problema e dall’insieme di casi nell’ambito dell’unità. Se il MRSA è altamente endemico,
come una sfida costante alla gestione delle unità, allora si raccomanda una procedura di verifica del rischio. Un
approccio operativo è quello di concentrare l’attenzione sui pazienti a maggior rischio. Lo screening può essere
appropriato anche nelle aree a basso rischio per il paziente, in modo particolare dove si realizzano numerose
interazioni e trasferimenti di pazienti con MRSA fra le corsie di degenza o a quelle di pazienti acuti. Le
raccomandazioni sono state pubblicate dalla Working Party of the Hospital Infection Society, dalla British Society
for Antimicrobial Chemotherapy e dalla Infection Control Nurses Association29 dalla Scottish Infection Standards
and Strategy Group30, e dal Department of Health31. I Comitati locali per il Controllo delle Infezioni possono
adattare queste linee guida alle loro situazioni locali.
METODI DI SCREENING PER MRSA
I metodi convenzionali utilizzati per lo screening dovrebbero rilevare i ceppi di MRSA inibendo i contaminanti e
selezionando i ceppi di S. aureus resistenti alla meticillina. La semina diretta su terreni selettivi presenta il vantaggio
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che i risultati possono essere disponibili dopo 24 ore, ma la maggior parte delle ricerche dimostrano che questo
metodo è meno sensibile dell’arricchimento in brodo seguito dalla semina su terreni solidi 70. Deve essere
verificato quale è il ruolo dei più recenti terreni cromogeni. Il cloruro di sodio, gli antibiotici o altri composti
selettivi possono essere addizionati ai terreni per ridurre la contaminazione, e l’aggiunta di oxacillina seleziona i
ceppi resistenti a questo antibiotico.
Il brodo di arricchimento (nutrient broth o cooked meat medium) contenente il 7% di cloruro di sodio (NaCl) è
stato raccomandato dal HIS/BSAC/ICNA working party65, sebbene siano stati utilizzati alcuni altri terreni70, 74-77 e
non siano contenuti specifici suggerimenti nelle recenti linee guida del HIS/BSAC/ICNA 70. I brodi di
arricchimento che contengono il 7% di NaCl possono inibire la crescita di alcuni isolati di MRSA qualora presenti
in numero ridotto75. Gli antibiotici consigliati come alternativa al NaCl includono aztreonan78 acido nalidixico più
colistina79; o cefoxitina; questi sono stati valutati nei terreni solidi ma non nei brodi di arricchimento.
Per la semina diretta e da brodo di arricchimento finalizzata a selezionare gli S. aureus resistenti, il recente
HIS/BSAC/ICNA working party70 ha pubblicato i dati di comparazione ottenuti con alcuni terreni ed ha suggerito
l’utilizzo dell’agar di Baird Parker con ciprofloxacina (BPC) o del mannitol salt agar (MSA) 80-82 con 7% di NaCl.
Sono stati utilizzati MSA83-85 e sue varianti, ma le prove di agglutinazione dei MRSA sviluppati su questi terreni
presentano lo svantaggio di non essere affidabili per l’identificazione di S. aureus82 o la crescita dei MRSA è
lenta86. Il (BPC) è stato utilizzato dove la maggior parte dei MRSA è resistente alla ciprofloxacina74, 87 e, anche
se i MRSA sensibili alla ciprofloxacina possono non essere riconosciuti quando si utilizza questo terreno per lo
screening, la percentuale di isolamento su BPC à segnalata superiore a quella ottenuta con MSA 74,86,87.
L’HIS/BSAC/ICNA working party70 ha segnalato la recente disponibilità di un terreno cromageno con
caratteristiche promettenti per lo screening dei MRSA e dati più recenti dimostrano in modo evidente che questo
terreno funziona bene88-92.
Un metodo di screening dovrebbe teoricamente consentire la crescita di tutti i MRSA, inibire o differenziare gli
altri microrganismi, e consentire prove di identificazione diretta sulle colonie. Sfortunatamente alcune di queste
caratteristiche sono contrastanti, ed è necessaria una soluzione di compromesso. Pochi sono gli studi
comparativi sull’efficacia di differenti approcci in condizioni cliniche.
Una significativa limitazione di tutti gli esami che si avvalgono dei metodi colturali di screening è condizionata dal
tempo di sviluppo delle colonie. L’efficacia dello screening è maggiore se i risultati sono rapidamente disponibili,
ed esiste una evidente richiesta di strategie rapide per gli screening. Sono disponibili metodi molecolari per il
rilievo di S. aureus per la ricerca del gene mecA70 e questi sono stati adottati per lo screening di MRSA,
solitamente associati ad una fase di arricchimento in brodo93, 94. La possibilità di falsi positivi dovuta alla miscela
di S. aureus meticillina sensibile e stafilococchi coagulasi-negativi resistenti alla meticillina dotati di gene mecA
può essere ridotta includendo l’oxacillina nel brodo di arricchimento, ma ciò può ridurre l’isolamento di MRSA ed
il tempo per l’arricchimento della coltura riduce il vantaggio rispetto alla ricerca rapida con PCR. E’ stato
descritto95, ed è commercialmente disponibile, un metodo molecolare su tamponi di screening che associa
l’identificazione diretta dei MRSA alla presenza di mecA. Le valutazioni eseguite sono favorevoli ed i risultati
sono disponibili in 2-3 ore96-100.
Metodi raccomandati
Screening di routine con semina diretta
Agar selettivo cromogeno per MRSA
Screening con arricchimento
In particolari condizioni (ricerca in pazienti per eliminazione di MRSA) si può usare un metodo di screening con
arricchimento. E’ possibile inserire alcuni tamponi dello stesso paziente in un solo brodo nutriente con 7% di
NaCl. Il metodo è economico ed indica la presenza di MRSA e non la sede del portatore.
Si possono usare il metodo di semina diretto e quelli di arricchimento. Questi ultimi ritardano i risultati di 24 ore,
ma possono essere richiesti risultati negativi con il metodo più sensibile (arricchimento) prima dell’interruzione
dei controlli per MRSA nei pazienti101. Il vantaggio dell’arricchimento nei confronti della semina diretta su terreni
cromogeni non è ancora stato confermato.
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Il rilievo di ceppi presumibilmente classificabili come MRSA deve essere seguito da una completa identificazione
come S. aureus, conferma della resistenza alla meticillina e prove di sensibilità ad altri antimicrobici. Questi
ultimi possono essere utili ad identificare ceppi EMRSA o tipologie locali (consultare l’Allegato 2)
Screening con metodi molecolari:
Se sono richiesti risultati particolarmente urgenti, considerare l’utilizzo di un metodo commerciale applicabile
direttamente ai tamponi di screening.
INFORMAZIONE TECNICA
I terreni cromogeni sono sensibili alla luce e le piastre devono essere conservate al buio e non espostI alla luce
prima e dopo la semina. Per il periodo d’incubazione seguire le indicazioni del produttore.
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Revisione no. 5 Data di revisione: 27.07.07 Emesso da: Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory, Pagina 9 di 24
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1
CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA102-107
1.1
PRELIEVO DEL CAMPIONE
N/D
1.2
TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE
Contenitori di plastica chiusi.
1.3
PRACEDURA ANALITICA SULL CAMPIONE
Livello di contenimento 2.
Le linee guida precedentemente esplicitate devono essere implementate con il COSHH locale e con la
valutazione del rischio.
2
PRELIEVO DEL CAMPIONE
2.1
TEMPO OTTIMALE PER IL PRELIEVO
N/D
2.2
TIPO DI CAMPIONE APPROPRIATO E METODO DI PRELIEVO
Tamponi di screening, urine da catetere – ecc. come appropriato.
I tamponi possono essere ricevuti asciutti108, 109, in terreno di trasporto di Amies con carbone110 o in
brodo di arricchimento.
I tamponi per prove molecolari devono seguire le raccomandazioni specifiche del metodo.
2.3
QUANTITA’ ADEGUATA E NUMERO APPROPRIATO DI CAMPIONI
N/D
3
TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE
3.1
TEMPO FRA PRELIEVO DEL CAMPIONE E RPOCEDURA ANALITICA
I campioni devono essere trasportati ed analizzati il più presto possibile.
3.2
ACCORGIMENTI PARTICOLARI PER RIDURRE IL DETERIORAMENTO
Se la procedura sui tamponi è ritardata, si preferisce la conservazione refrigerata a quella a temperatura
ambiente. Si devono evitare ritardi superiori a 48 ore.
I tamponi possono essere inseriti direttamente nei brodi di arricchimento in reparto. Nei brodi di
arricchimento i tamponi non devono essere refrigerati. Se il personale di reparto viene coinvolto deve
essere adeguatamente preparato.
4.0 PROCEDURA SUL CAMPIONE
4.1
SELEZIONE DELLA PROVA
N/D
RICERCA DI SCREENING SU CAMPIONI DI MRSA
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4.2
ASPETTO
N/D
4.3
MICROSCOPIA
N/D
4.4
COLTURA E RICERCHE
N/D
4.4.1 PRE-TRATTAMENTO
N/D
4.4.2
PROCEDURA SUL CAMPIONE
Coltura diretta
Inoculare ciascuna piastra con tampone o altro tipo di campione (consultare BSOP 54 - Semina del
terreno di coltura).
Coltura di arricchimento
Rimuovere asetticamente il tappo del contenitore ed inserire il tampone(i) nel brodo, rompere (o tagliare)
il bastoncino(i) e rimettere il tappo.
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4.4.3
TERRENI DI COLTURA, CONDIZIONI E MICRORGANISMI
Per tutti i campioni*:
Aspetti clinici/
condizioni
Terreni standard
Coltura diretta
Terreno selettivo
cromogeno per MRSA
Incubazione
Temp
* C°
Atmosfera
Tempo
37
Aerobica
18-48 ore**
Brodo nutriente con 7%
NaCl
*** poi sottocoltura in
30
Aerobica
18-24 ore
Terreno selettivo
cromogeno per MRSA
30
Aerobica
18-48 ore**
Lettura
colture
Microrganismo
ricercato
giornaliera MRSA
E/O
Coltura di arricchimento
N/D
giornaliera MRSA
* Per esami urgenti considerare un metodo molecolare
**Per terreni cromogeni fare riferimento alle istruzioni del produttore per i tempi di incubazione raccomandati
***Nel contenitore deve essere presente un volume di brodo sufficiente a ricoprire i tamponi. La concentrazione di NaCl può essere
ridotta se i ceppi localmente presenti sono noti per essere inibiti dal 7% di NaCl
4.5
IDENTIFICAZIONE
4.5.1 LIVELLO MINIMO
S. aureus livello di specie, meticillino resistente
4.5.2 INVIO ALLABORATORIO DI RIFERIMENTO
Consultare l’Allegato 1
Staphylococcal Section
Laboratory for HealthCare Associated Infection
Specialist and Reference Microbiology Division
61 Colindale Avenue
London
NW9 5HT
Contattare Centralino principale della Health Protection Agency
Tel + (44) 0820 200 4400
4.6
PROVE DI SENSIBILITA’ AGLI ANTIMICROBICI
Fare riferimento alla BSOP - Prove di sensibilità.
5
PROCEDURE DI REFERTAZIONE
5.1
MICROSCOPIA
N/D
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5.2
COLTURA
Negativa
“MRSA non isolato”
Positiva
“Isolato MRSA”
5.2.1
TEMPO DI REFERTAZIONE
Risultati colturali urgenti possono essere trasmessi per via telefonica o informatica quando disponibili.
Referto scritto, 16 – 72 ore segnalando, se appropriato, l’invio di un referto successivo.
5.3
PROVE DI SENSIBILITA’
Refertare le sensibilità come clinicamente suggerito.
I MRSA non devono essere refertati come sensibili a qualsiasi E-lattamico disponibile8.
6
SEGNALAZIONE ALLA HPA111 (SERVIZI LOCALI E
REGIONALI ED AL CDSC CENTER FOR INFECTION)
Fare riferimento a:
Pubblicazioni della Health Protection Agency:
“ Reporting to the CDR: A guide for laboratories”
“ Hospital infection control: guidance on the control of infection in hospital”
Fare riferimento alle attuali linee guida del CDSC ed alle indicazioni del COSURV
Linee guida locali che includono la Politica per il Controllo delle Infezioni ed un Memorandum di
Interpretazione
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7
RINGRAZIAMENTI E CONTATTI
Questi Standard Method sono stati sviluppati, controllati e revisionati dallo Standards Methods Working
Group for Bacteriology (http://www.hpa.-standardmethods.org.uk/wg_bacteriology.asp). Si ringraziano
per il contributo i numerosi soggetti appartenenti a laboratori clinici di microbiologia ed alle
organizzazioni specialistiche che hanno fornito informazioni e commenti nel corso della preparazione di
questo documento, ed infine il Redattore Medico.
I National Standards Methods sono emessi dalla Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory,
Centre for Infections, Health Protection Agency London.
Per ulteriori informazioni contattateci a:
Standards Unit
Evaluations and Standards Laboratory
Centre for Infections
Health Protection Agency
Colindale, London
NW9 SEQ
e-mail [email protected]
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ALLEGATO
1:
INVIO
DI
ISOLATI
DI
STAPHYLOCOCCUS AUREUS A STAPHYLOCOCCUS
REFERENCE LABORATORY OF THE LABORATORY
OF HEALTHCARE ASSOCIATED INFECTION (LHCAI,
CFI, COLINDALE) (2005)
Si raccomanda di fare in modo che il LCAHI possa contenere i tempi di risposta e migliorare la qualità
del servizio:
1. Richiedere la tipizzazione solo se si intende intervenire sui risultati
2. Assicurarsi che il Consulente Microbiologo e/o il Gruppo per il Controllo delle Infezioni abbiano
confermato che esistono motivazioni certe per l’invio
3. Per tutte le richieste, valutare l’opportunità dell’accertamento, vale a dire, in quale modo
l’accertamento consente una differenza
Nelle epidemie (raggruppamento temporale e spaziale al di sopra della linea di base):
Inviare il numero minimo di isolati richiesti per informare la sanità locale (questo dovrebbe raramente
superare la metà degli isolati), e conservare temporaneamente gli isolati correlati.
Dare la priorità ad isolati che causano infezioni gravi od invasive durante il corso dell’epidemia, evitare
l’invio di isolati multipli dello stesso paziente o isolati ambientali senza discussione con il LHCAI.
Ove possibile, utilizzare marcatori sostitutivi, quali l’ureasi e le resistenze antimicrobiche ed includere
isolati rappresentativi con fenotipi significativamente differenti, quali le sensibilità agli antibiotici,
pigmentazione ed/o emolisi.
In situazioni endemiche:
Se si utilizzano marcatori sostitutivi per caratterizzare qualsiasi ceppo endemico locale (ad esempio, per
identificare i vostri EMRSA come EMRSA-15 e EMRSA-16) il LHCAI è disponibile a controllare pochi
vostri isolati rappresentativi inviati di volta in volta, ad esempio ogni 5, 6 mesi.
Sospetta malattia mediata da tossina:
Il LHCAI desidera ricevere un isolato dai casi sospetti di malattia causata dalla tossina stafilococcica,
come da pazienti con sindrome stafilococcica da shock tossico, impetigine e sindrome della cute
ustionata, per definirne le caratteristiche del gene. Il LHCAI è interessato inoltre all’invio di isolati da casi
sospetti di PVL quali infezioni cutanee gravi, infezioni dei tessuti molli e polmoniti necrotizzanti. Per
ulteriori informazioni rivolgersi a:
http://www.hpa.org.uk/cdr/archives/2003/cdr1503.pdf e
http://www.hpa.org.uk/cdr/archives/2005/cdr 1105.pdf.
Il referto è accompagnato da un semplice questionario, del quale il LHCAI gradirebbe la compilazione ed
il successivo invio.
MRSA comunitari
Sono noti numerosi profili diversi di MRSA comunitari, tutti differenziabili da quelli delle strutture
sanitarie. In modo caratteristico, i CA-MRSA sono resistenti in modo eterogeneo all’oxacillina ed
insolitamente sensibili ad altri antimicrobici diversi dai ȕ-lattamici, in modo particolare la ciprofloxacina. Il
LHCAI richiede l’invio di questi isolati per una successiva caratterizzazione. Informazioni successive
sono disponibili al: http://www.hpa.org.uk/cdr/archives/2005/cdr1105.pdf.
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Isolati anomali
Segnalare anomalie/resistenze che devono essere valutate, quali MRSA coagulasi negativi su vetrino; per
cortesia verificare prima dell’invio le colture miste, coagulasi, catalasi e colorazione Gram.
Resistenza agli antibiotici
Richiedere le prove di sensibilità agli antibiotici solo quando necessario per verificare vostri studi locali quali
risultati anomali o dubbi, inusuali o risultati clinicamente significativi, determinazioni quantitative necessarie
(quali MIC per i primi isolati mupirocin resistenti), resistenze inattese (quali quelle alla vancomicina).
Isolati correlati agli alimenti
Tutti gli isolati che provengono da condizioni di intossicazione o da contaminazione alimentare devono essere
inviati al Food Hygiene Laboratory (020 8200 4400 extn 7116).
Isolati non correlati agli alimenti
Per cortesia, inviare tutti gli isolati non correlati agli alimenti al Staphylococcus Reference Laboratory
accompagnati dal modulo di richiesta. Successive copie ed informazioni possono essere ottenute telefonando
allo 020 8327 7228. Informazioni sulle prove di antibiotico resistenza eseguite possono essere ottenute
telefonando allo 020 8327 7237 (MICs) o allo 020 8327 7255 (mecA/mupA).
Per qualsiasi dubbio contattare il LHCAI e richiedere (020 8327 7227)
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Allegato 2. CARATTERISTICHE DEI MRSA EPIDEMICI NEL
REGNO UNITO
Dati del Laboratory of HealthCare-Associated Infection, CFI
MRSA Epidemici
Profilo fagicob
Profilo di resistenza agli
antibioticic
Tossinad
EMRSA–1a
(84)/85/88A/(90)/932
P T E (K) (G) S
A
EMRSA–2
80/85/90/932
PE
A
EMRSA–3 a
75/83A/(83C)/932
P E (K) (G) (N) (Cip) (S)
-
EMRSA–4
85/(90)/932
PTES
A
EMRSA–5
29/6/42E/47/54/75/77/84/85/81 P T K G Rif
A,B,C
EMRSA–6
90/932wk
P T E K N Ba S
A
EMRSA–7
85/932
PTES
A,C
EMRSA–8
83A/83C/932
PTS
-
EMRSA–9
77/84/932
PTEKGS
-
EMRSA–10
29/75/77/83A/85
PTEKG
A,B
EMRSA–11
83A/84/85
P T E K G N Ba S
A
EMRSA–12
75/83A/83C/932
PTEKNFS
-
EMRSA–13
29/6/42E/47/54
P T K G N Ba F S
-
EMRSA–14
29/6/47/54
PTKNFS
-
EMRSA–15 a
75wk
P (E) Cip
C
EMRSA–16 a
29/52/75/77/83A/83C
P E (K) (G) (N) Cip
EMRSA–17 a
29/77/932
P T (E) Rif F K G (N) S
Tp Cip (Mup)
A
TSST1
A
PAROLE CHIAVE
a
Ceppo Epidemico di MRSA attualmente circolante nel Regno Unito
Profilo fagico a 100 x RTD (diluizione di routine della prova)
variabile
B
C
wk = (reazione debole)
( ) = reazione
Profilo di resistenza agli antibiotici
Ba, bacitracina; Cip, ciprofloxacina; E, eritromicina; F, acido fusidico; G, gentamicina; K, kanamicina (o tobramicina);
Mup, mupirocina; N, neomicina; P, penicillina; Rif, rifampicina; S, streptomicina; T, tetracicline; Tp, teicoplanina MIC a
valori soglia 4-8 mg/l; ( ), Sensibilità variabile fra gli isolati.
La resistenza alla neomicina è difficile da rilevare su alcuni ceppi isolati con il saggio che utilizza un dischetto. Con
isolati sensibili alla gentamicina, la tobramicina o la kanamicina sono indicatori più affidabili del gene aadD
responsabile della resistenza alla neomicina.
d Tossina: A, B, C, Endotossine
TSST1 Tossiina-1 dello Shock da Sindrome Tossica
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SCREENING IN CAMPIONI PER RICERCA DI MRSA
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