EN N-geneous® LDL Cholesterol Reagent Kit Catalog number

EN
N-geneous® LDL Cholesterol Reagent Kit
Catalog number LDCE-70-5170-04
Materials Required but not Provided
INTENDED USE
For the direct, quantitative determination of low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) in human
serum or plasma.
SUMMARY
Plasma lipoproteins are spherical particles containing varying amounts of cholesterol, triglycerides,
phospholipids and proteins. The phospholipid, free cholesterol and protein constitute the outer surface
of the lipoprotein particle, while the inner core contains mostly esterified cholesterol and triglyceride.
These particles serve to solubilize and transport cholesterol and triglyceride in the bloodstream.
The relative proportions of protein and lipid determine the density of these lipoproteins and provide
a basis on which to begin their classification.1 These classes are: chylomicrons, very-low-density
lipoprotein (VLDL), lowdensity lipoprotein (LDL) and high-density lipoprotein (HDL). Numerous
clinical studies have shown that the different lipoprotein classes have very distinct and varied effects
on coronary heart disease risk.2-4 The studies all point to LDL cholesterol as the key factor in the
pathogenesis of atherosclerosis and coronary artery disease (CAD)2-8, while HDL cholesterol has been
observed to have a protective effect. Even within the normal range of total cholesterol concentrations,
an increase in LDL cholesterol can occur with an associated increased risk for CAD.4
PRINCIPLE
The N-geneous® LDL-C assay is a homogeneous method for directly measuring LDL-C levels in serum
or plasma, without the need for any off-line pre-treatment or centrifugation steps. The method is in a
two reagent format and depends on the properties of a unique detergent. This detergent (Reagent 1)
solubilizes only the non LDL lipoprotein particles. The cholesterol released is consumed by cholesterol
esterase and cholesterol oxidase in a non color forming reaction. A second detergent (Reagent 2)
solubilizes the remaining LDL particles and a chromogenic coupler allows for color formation. The
enzyme reaction with LDL-C in the presence of the coupler produces color that is proportional to the
amount of LDL cholesterol present in the sample.
REAGENTS
Composition
Components
Ingredients
Concentration
Reagent 1
Buffer
Detergent 1
Cholesterol Esterase (Pseudomonas sp.)
Cholesterol Oxidase (Cellulomonas sp.)
Peroxidase (Horseradish)
4-aminoantipyrine
Ascorbic Acid Oxidase (Curcubita sp.) Preservative
<1.0%
<1500 U/L
<1500 U/L
<1300 ppg U/L
<0.1%
<3000 U/L
Reagent 2
Buffer
Detergent 2
N,N-bis(4-sulfobutyl)-toluidine, disodium (DSBmT)
Preservative
<1.0%
<1,9 mM
Precautions and Warnings
1. For in vitro diagnostic use
2. All specimens used in the test should be considered potentially infectious. Universal precautions as
they apply to your facility should be used for handling and disposal of materials during and after testing.
3. Do not use the LDL reagents after the expiration date printed on the label.
Preparation
The reagents are supplied ready for use.
Storage and Stability
Unopened Reagents are stable until the expiration date shown on the label when stored at
2–8°C. N-geneous® LDL Cholesterol, Reagent 1 and Reagent 2: Once opened is stable up to 4 weeks at
2–8°C. N-geneous® LDL Cholesterol, Reagent 1 and Reagent 2: Once opened the on board stability
is 4 weeks at 2–8°C.
Indications of Deterioration
Inability to recover control values. Presence of extreme turbidity or growth.
SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION
Patients are not required to fast prior to blood collection. Serum, EDTA-treated plasma or sodium
heparinized plasma are the recommended specimens.
Serum: Collect whole blood by venipuncture and allow to clot. Centrifuge and remove the serum as
soon as possible after collection (within 3 hours).10
Plasma: Specimens may be collected in EDTA or sodium heparin. Centrifuge and remove the plasma
as soon as possible after collection (within 3 hours).10
If not analyzed promptly, specimens may be stored at 2-8°C for up to 5 days. If specimens need to be
stored for more than 5 days, they may be preserved at -80°C. Samples may be frozen once. Refer
to NCCLS Document H18-A for further instructions on specimen collection, handling and storage.15
PROCEDURE
Assay
Below is a general example of the N-geneous® LDL test procedure for a two reagent automated
analyzer. All analyzer applications should be validated in accordance with NCEP and CLIA
recommendations.10,11
Sample + Reagent 1
3µL
300µL
Reagent 2
100µL
Measurement (absorbance differnce
between 660 nm and 546nm)
5 Minutes
Measurement (absorbance differnce
between 660 nm and 546nm)
5 Minutes
LDL-C
result
Sekisui has validated applications for several automated analysers. This information is available
through your distributor.
Materials Provided
Description
Configuration
Catalog number
Reagent 1
30mL
LDCE-70-5170-04
Reagent 2
10mL
KI5170A.03
Description
Configuration
LDL Cholesterol Calibrator Set
LCCE-70-5174
Calibration
The Sekisui N-geneous® LDL Cholesterol Calibrator kit is suggested for calibration. Other commercially
available LDL calibrators have not been tested with this assay and cannot be supported by Sekisui.
Refer to the N-geneous® LDL Cholesterol Calibrator kit package insert for a description of assignment
procedures and instructions. The value of the Genzyme N-geneous® LDL calibrator was assigned
by procedures traceable to the Center for Disease Control (CDC). Calibration materials have
concentrations around the medical decision level. For automated assays refer to the instrument
manufacturer’s recommendation for calibration frequency.
Quality Control
Reliability of test results should be routinely monitored with quality control materials or serum pools that
reasonably represent performance on patient specimens.10 Controls or serum pools should be run
with each assay to ensure that the reagents are functioning properly and that correct procedures
have been followed. Quality control materials are intended for use only as monitors of accuracy and
precision. An acceptable range for each lot of control material should be established by the laboratory.
If control values are not within the expected range confirm procedures were performed correctly
and follow normal troubleshooting measures. Quality control requirements should be established in
accordance with local, state and/or federal regulations or accreditation requirements.
RESULTS
Patient results may be reported in mg/dL. To convert from conventional units to S.I. unit, multiply the
conventional units by 0.02586.14
mg/dL x 0.02586 = mmol/L LDL-cholesterol
Limitations/Interfering Substances
All interference studies were conducted according to NCCLS guideline No. EP7-P for interference
testing in clinical chemistry.12 No significant interference was detected in the N-geneous® LDL assay
up to and including the concentrations stated below:
Mid
130-159 mg/dL
High
>160mg/dL
n
20
20
20
Mean (mg/dL)
98.1
146.5
209.8
Standard Deviation (mg/dL)
Coefficient of Variation (%)
0.72
0.73
0.96
1.31
0.66
0.62
Between-run precision was determined using three levels of frozen pooled human serum. The
N-geneous® LDL Cholesterol assay was run twice per day in duplicate over 10 days. Betweenrun precision studies produced the following results on the Roche Diagnostics Hitachi 911:
Serum Pool
Low
(<40mg/dL)
Mid
(40-59 mg/dL)
High
(≥60mg/dL)
n
40
40
40
Mean HDL-C (mg/dL)
98.1
142.7
207.3
Standard Deviation (mg/dL)
2.2
2.8
3.6
Coefficient of Variation (%)
2.27
1.95
1.73
Linearity
The N-geneous® LDL Cholesterol method is linear from 6.6 mg/dL to 992 mg/dL.
Limit of Detection
The analytical sensitivity of the assay was determined to be 0.278 mg/dL.
Gelleferte Materiallen
ANWENDUNGSGEBIET
Für die direkte quantitative Bestimmung von Lipoprotein-Cholesterin niedriger Dichte (LDL-C) in
Humanserum oder Plasma.
ZUSAMMENFASSUNG
Plasmalipoproteine sind kugelförmige Teilchen, die Cholesterin, Triglyceride, Phospholipide und
Proteine in unterschiedlichen Mengen enthalten. Phospholipid, freies Cholesterin und Protein stellen
die Außenfläche des Lipoproteinteilchens dar, während der innere Kern hauptsächlich verestertes
Cholesterin und Triglyceride enthält. Diese Teilchen dienen als Löslichmacher und transportieren
Cholesterin und Triglyceride in den Blutkreislauf.
Die relativen Protein- und Lipidanteile bestimmen die Dichte dieser Lipoproteine und bieten eine
Grundlage für ihre Klassifizierung.1 Die Klassen sind: Chylomikron, Lipoprotein sehr niedriger Dichte
(VLDL), Lipoprotein niedriger Dichte (LDL) und Lipoprotein hoher Dichte (HDL). Zahlreiche klinische
Studien belegen, dass die verschiedenen Lipoprotein-Klassen sich sehr deutlich und unterschiedlich
auf das Risiko koronarer Herzkrankheiten auswirken.2-4 Die Studien weisen alle auf LDL-Cholesterin
als Schlüsselfaktor in der Pathogenese der Arteriosklerose und koronaren Herzkrankheit (KHK)
hin2-8, während HDL-Cholesterin eine Schutzwirkung ausübt. Selbst innerhalb des Normalbereichs
der Gesamtcholesterinkonzentrationen kann ein rhöhter LDL-Cholesterinspiegel zu einem erhöhten
Risiko der KHK führen.4
PRINZIP
Der N-geneous® LDL-Cholesterin-Assay ist ein homogenes Verfahren zur direkten Messung von
LDL-C-Spiegeln im Humanserum oder Plasma ohne notwendige Offline-Vorbehandlung oder
Zentrifugationsschritte. Das Verfahren verwendet ein zwei Reagenzien-Format und beruht, wie
dargestellt, auf den Eigenschaften des einzigartigen Detergenzes. Dieses Detergenz (Reagenz
1) solubilisiert nur die Nicht-LDL-Lipoprotein-Teilchen. Das freigesetzte Cholesterin wird von der
Cholesterinesterase und der Cholesterinoxidase in einer Reaktion ohne Farbentwicklung umgesetzt.
Ein zweites Detergenz (Reagenz 2) solubilisiert die restlichen LDL-Teilchen und ein chromogener
Kuppler ermöglicht die Farbentwicklung. Die durch die Enzymreaktion bewirkte Farbentwicklung mit
LDL-C in Anwesenheit des Kupplers ist der der Probe anwesenden LDL-Cholesterinmenge
proportional.
Concentration with no
significant Interference
REAGENZIEN
Zusammensetzung
1293 mg/dL
20 mg/dL
20 mg/dL
500 mg/dL
50 mg/dL
5000 mg/dL
Bestandteil
Inhaltsstoffe
Konzentration
Reagenz 1
Puffer
Detergenz 1
Cholesterinesterase (Pseudomonas sp.)
Cholesterinoxidase (Cellulomonas sp.)
Peroxidase (Meerrettich)
4-Aminoantipyrin
Ascorbinsäureoxidase (Curcubita sp.)
Konservierungsmittel
<1.0%
<1500 U/L
<1500 U/L
<1300 ppg U/L
<0.1%
<3000 U/L
Puffer
Detergenz 2
N,N-bis(4-sulfobutyl)-Toluidin, Dinatrium (DSBmT)
Konservierungsmittel
<1.0%
<1,9 mM
Triglyceride
Bilirubin (conjugated)
Bilirubin (unconjugated)
Hemoglobin
Ascorbic Acid
Gamma Globulins
1. Refer to the work of Young et al13 for a review of the effects of drugs on clinical laboratory tests.
2. Protect the reagent from direct sunlight.
3. Samples with levels of interfering substances higher than the upper limit should be diluted with
physiological saline before assaying. Multiply the result to correct for the dilution. Samples with
triglyceride level >1293 mg/dL should not be diluted.
4. Anticoagulants containing citrate should not be used.
5. Patient samples may only be frozen once.
6. Do not freeze reagents.
Expected Values
The following NCEP cutpoints for patient classification are used for the prevention and management
of coronary heart disease.8
LDL Cholesterol Classification
<130 mg/dL (<3.36 mmol/L) Desirable
130-159 mg/dL (3.36 - 4.11 mmol/L) Borderline High Risk
≥160 mg/dL (≥4.14 mmol/L) High Risk
It is recommended that each laboratory establish the normal range for its patient population.
SPECIFIC PERFORMANCE CHARACTERISTICS
Accuracy
Accuracy of the N-geneous® LDL Cholesterol method was verified by comparison to the Reference
Method (Ultracentrifugation and cholesterol analysis)10 and produced the following results on the
Roche Diagnostics Hitachi 911:
Method
N-geneous® LDL Cholesterol
Reference Method
n
54
54
Mean (mg/dL)
122.5
125.1
Standard Deviation (mg/dL)
30.7
30.9
Regression Analysis
Y=0.95x + 3.02mg/dL
N/A
Correlation Coefficient
R=0.96
Studies comparing the N-geneous ® LDL Cholesterol method to the Direct LDL Cholesterol
Immunoseparation method produced the following results on the Roche Diagnostics Hitachi 911:
Method
Low
<130mg/dL
Catalog number
2 x 1mL vials
Interfering Substances
Serum Pool
DE
N-geneous® LDL Cholesterol Reagent Kit
Bestellnummer LDCE-70-5170-04
N-geneous® LDL Cholesterol
Direct Immunoseparation
Method
n
92
92
Mean (mg/dL)
120.0
122.8
Standard Deviation (mg/dL)
30.5
31.6
Regression Analysis
Y=0.94x + 4.46mg/dL
N/A
Correlation Coefficient
R=0.97
Precision
Within-run precision of the N-geneous® LDL Cholesterol method was determined using three levels
of frozen pooled human serum. Each run consisted of 20 replicate samples. Within-run precision
studies produced the following results on the Roche Diagnostics Hitachi 911:
Reagenz 2
Vorsichtsmaßnahmen und Warnhinweise
1. Nur zur in-vitro Diagnostik.
2. Alle im Test benutzten Proben sind als potenziell infektiös zu betrachten. Beachten Sie bitte die für
Ihre Einrichtung gültigen Laborrichtlinien für den Umgang mit solchen Materialien und deren Entsorgng.
3. LDL-Reagenzien nach Ablauf des auf dem Etikett aufgedruckten Verfalldatums nicht mehr
verwenden.
Vorbereitung
Die Reagenzien werden gebrauchsfertig geliefert.
Lagerung und Stabilität
Im ungeöffneten Zustand sind die Reagenzien bei Aufbewahrung bei 2-8°C bis zu dem auf dem
Etikett aufgedruckten Verfalldatum haltbar. N-geneous® LDL-Cholesterin, Reagenz 1 und Reagenz
2: Haltbarkeit nach dem Öffnen bis zu 4 Wochen bei 2-8°C. N-geneous® LDL-Cholesterin, Reagenz
1 und Reagenz 2: Haltbarkeit nach dem Öffnen bis zu 4 Wochen bei 2-8°C.
Anzeichen auf Beeinträchitigung des Produkts
Kontrollwerte können nicht wiedergefunden werden. Vorliegen extremer Trübung oder Wachstum.
PROBENENTNAHME UND - VORBEREITUNG
Die Patienten müssen vor der Blutentnahme nicht nüchtern sein. Als Proben werden Serum, mit EDTA
behandeltes Plasma oder mit Natriumheparin behandeltes Plasma empfohlen.
Serum: Vollblut durch Venenpunktion entnehmen und gerinnen lassen. Nach der Entnahme Vollblut
Zentrifugieren und das Serum möglichst bald entnehmen (innerhalb von 3 Stunden).10
Plasma: Die Proben können in EDTA oder Natriumheparin entnommen werden. Nach der Entnahme
Vollblut Zentrifugieren und Plasma möglichst bald entnehmen (innerhalb von 3 Stunden).10
Wenn die Proben nicht sofort analysiert werden, können sie bis zu 5 Tage bei 2-8°C aufbewahrt
werden. Wenn die Proben länger als 5 Tage gelagert werden müssen, können sie bei –80°C konserviert
werden. Die Proben dürfen nur einmal eingefroren werden. Weitere Anweisungen zu Entnahme,
Behandlung und Aufbewahrung von Proben siehe NCCLS Dokument H18-A.15
VERFAHREN
Test
Das folgende Diagramm zeigt ein allgemeines Beispiel für die Durchführung des N-geneous® LDLTests für einen automatischen Analysator mit zwei Reagenzien. Alle Analysator-Anwendungen sollten
gemäß den Empfehlungen von NCEP und CLIA validiert werden.10,11
Probe + Reagens 1
3µL
300µL
Reagens 2
100µL
5 Minuten
Messung (Absorptions-unterschied
zwischen 660 nm und 546 nm)
Konfiguration
Katalognummer
Reagenz 1
30mL
LDCE-70-5170-04
Reagenz 2
10mL
Erforderliche, aber nicht gelieferte Materialien
Beschreibung
Konfiguration
Katalognummer
LDL Cholesterolkalibrator Set
2 x 1mL Fläschchen
LCCE-70-5174
Kalibration
Der Sekisui N-geneous® LDL-Cholesterinkalibrator-Kit wird für die Kalibration empfohlen. Andere
handelsübliche LDL-Kalibratoren wurden im Zusammenhang mit diesem Assay noch nicht überprüft
und können von Sekisui nicht empfohlen werden. Weitere Einzelheiten zur Beschreibung der
Zuteilungsverfahren und Anweisungen entnehmen Sie bitte der Packungsbeilage des N-geneous®
LDL-Cholesterinkalibrator-Kits. Der Wert des Sekisui N-geneous® LDL-Kalibrators wurde mit Verfahren
ermittelt, vom Center for Disease Control (CDC). Die Kalibrationsmaterialien weisen Konzentrationen
um die medizinische Entscheidungsgrenze auf. Für automatisierte Assays bitte die Empfehlungen
des Instrumentenherstellers zur Kalibrationshäufigkeit beachten.
Qualitätskontrolle
Die Zuverlässigkeit der Testergebnisse sollte routinemäßig mit Qualitätskontrollmaterialien oder
Serenpools überprüft werden. Diese Kontrollmaterialien sollten die Leistung an Patientenproben
sinnvoll repräsentieren.10 Die Kontrollen oder Serenpools sollten bei jedem Assay mitlaufen, um
sicherzustellen, dass die Reagenzien ordnungsgemäß funktionieren und dass die korrekten Verfahren
befolgt wurden. Qualitätskontrollmaterialien dienen lediglich zur Überwachung von Genauigkeit und
Präzision. Jedes Labor sollte für jede Kontrollmaterialcharge einen akzeptablen Bereich festlegen.
Wenn die Kontrollwerte nicht im erwarteten Bereich liegen, muss bestätigt werden, dass die Verfahren
korrekt durchgeführt wurden und es müssen die normalen Maßnahmen zur Fehlerbehebung befolgt
werden. Die Qualitätskontrollanforderungen sollten im Einklang mit den lokalen, staatlichen und/oder
bundesweit geltenden Vorschriften oder Akkreditierungsanforderungen festgelegt werden.
ERGEBNISSE
Die Patientenergebnisse können in mg/dl angegeben sein. Zur Umrechnung konventioneller Einheiten
in S.I. Einheiten multiplizieren Sie die konventionellen Einheiten mit 0,02586. 14
mg/dl x 0,02586 = mmol/l LDL-Cholesterin.
Verfahrensgrenzen/Interferierende Substanzen
Alle Intereferenzstudien wurden nach der NCCLS Richtlinie Nr. EP7-P für Interferenztests der
klinischen Chemie durchgeführt.12 Im N-geneous® LDL-Assay wurde bis auf die unten aufgeführten
Konzentrationen keine signifikante Interferenz festgestellt:
Interferiende substanzen
Konzentration ohne
signifikante Interferenz
Triglyceride
Bilirubin (konjugiert)
Bilirubin (unkonjugiert)
Hämoglobin
Ascorbinsäure
Gamma-Globuline
1293 mg/dL
20 mg/dL
20 mg/dL
500 mg/dL
50 mg/dL
5000 mg/dL
1. Ein Überblick über Arzneimittelwirkungen auf die HDL-Cholesterinspiegel im Serum findet
sich in der Arbeit von Young.13
2. Die Reagenzien müssen vor direkter Sonneneinstrahlung geschützt werden.
3. Proben mit Mengen an störenden Substanzen, die über der Obergrenze liegen, sollten
vor der Durchführung mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt werden. Ergebnis zur
Korrektur für die Verdünnung multiplizieren. Proben mit einem Triglyceridgehalt >1293 mg/dl
sollten nicht verdünnt werden.
4. Zitrathaltige Antikoagulanzien sollten nicht verwendet werden.
5. Die Patientenproben dürfen nur einmal eingefroren werden.
6. Die Reagenzien dürfen nicht eingefroren werden.
Referenzbereich
Die folgenden NCEP-Grenzwerte für die Patientenklassifikation werden zur Prävention und
Behandlung der koronaren Herzkrankheit herangezogen.8
LDL-Cholesterin Klassifikation
<130 mg/dl (<3,36 mmol/l) wünschenswert
130-159 mg/dl (3,36 – 4,11 mmol/l) grenzwertig erhöhtes Risiko
≥160 mg/dl (≥4,14 mmol/l) hohes Risiko
Es wird empfohlen, dass jedes Labor den Referenzbereich für sein Patientenkollektiv festlegt.
SPEZIFISCHE LEISTUNGSDATEN
Richtigkeit
Die Genauigkeit der N-geneous® LDL-Cholesterinmethode wurde durch den Vergleich mit der
eferenzmethode (Ultrazentrifugation und Cholesterinanalyse)10 überprüft und ergab die folgenden
Ergebnisse auf dem Roche Diagnostics Hitachi 911
Methode
N-geneous® LDL-Cholesterin
n
54
54
Mittelwert (mg/dL)
122,5
125,1
Standardabweichung (mg/dL)
30,7
30,9
Regressionsanalyse
Y=0,95x + 3,02mg/dL
n.z.
Korrelationskoeffizient
Messung (Absorptions-unterschied
zwischen 660 nm und 546 nm)
LDL-C
resultat
Sekisui verfügt über validierte Anwendungen für mehrere automatisierte Analysatoren. Diese
Informationen sind über Ihren Lieferanten erhältlich.
Referenzmethode
R=0,96
Studien zum Vergleich der N-geneous LDL-Cholesterin-Methode mit der direkten LDLCholesterin-Immunseparationsmethode ergaben die folgenden Ergebnisse auf dem Roche
Diagnostics Hitachi 911:
®
5 Minuten
Methode
Beschreibung
N-geneous® LDL-Cholesterin
Direkte Immunspearation
n
92
92
Mittelwert (mg/dL)
120,0
122,8
Standardabweichung (mg/dL)
30,5
31,6
Regressionsanalyse
Y=0,94x + 4,46mg/dL
n.z.
Korrelationskoeffizient
R=0,97
Präzision
Die Präzision der N-geneous® LDL-Cholesterin-Methode innerhalb einzelner Testläufe wurde mit
drei Konzentrationen gefrorenem und gepooltem Humanserum bestimmt. Jeder Testlauf umfasste
20 Replikatproben. Die Studien zur Bestimmung der Präzision innerhalb einzelner Testläufe ergaben
die folgenden Ergebnisse auf dem Roche Diagnostics Hitachi 911:
Serenpools
Niedrig
<130mg/dL
Mittel
130-159 mg/dL
Hoch
>160mg/dL
n
20
20
20
Mittelwert (mg/dL)
98,1
146,5
209,8
Standardabweichung (mg/dL)
0,72
0,96
1,31
Variationskoeffizient (%)
0,73
0,66
0,62
Die Präzision zwischen einzelnen Testläufen wurde mit drei Konzentrationen gefrorenem
gepooltem Humanserum bestimmt. Der N-geneous® LDL-Cholesterin-Assay erfolgte in
Doppelbestimmung zweimal am Tag für 10 Tage. Die Studien zur Bestimmung der Präzision
zwischen einzelnen Testläufen ergaben die folgenden Ergebnisse auf dem Roche Diagnostics
Hitachi 911:
Serenpools
Niedrig
(<40mg/dL)
Mittel
(40-59 mg/dL)
Hoch
>160mg/dL
n
40
40
40
Mittelwert (mg/dL)
98,1
142,7
207,3
Standardabweichung (mg/dL)
2,2
2,8
3,6
Variationskoeffizient (%)
2,27
1,95
1,73
Linearität
Die N-geneous® LDL-Cholesterinmethode ist zwischen 6,6 mg/dl und 992 mg/dl linear.
Nachweisgrenze
Es wurde festgestellt, dass die analytische Sensitivität des Assays bei 0,278 mg/dl liegt.
IT
N-geneous® LDL Cholesterol Reagent Kit
Numero di catalogo LDCE-70-5170-04
Sekisui ha applicazioni convalidate per diversi analizzatori automatizzati. Queste informazioni sono
disponibili presso il vostro distributore.
USO PREVISTO
Per la determinazione quantitativa diretta del colesterolo lipoproteina a bassa densità (LDL-C) in
siero o plasma umano.
RIASSUNTO
Le lipoproteine plasmatiche sono particelle sferiche contenenti quantità variabili di colesterolo,
trigliceridi, fosfolipidi e proteine. La superficie esterna della particella lipoproteica è costituita da
fosfolipidi, colesterolo libero e proteine, mentre la parte interna contiene soprattutto colesterolo
esterificato e trigliceridi. Queste particelle hanno la funzione di rendere solubile e trasportare il
colesterolo e i trigliceridi nel sangue.
Le proporzioni relative di proteine e lipidi determinano la densità di queste lipoproteine e forniscono
una base per iniziare a classificarle.1 Le classi definite sono: chilomicrone, lipoproteina a densità molto
bassa (Very Low Density Lipoprotein, VLDL), lipoproteina a bassa densità (Low Density Lipoprotein,
LDL) e lipoproteina ad alta densità (High Density Lipoprotein, HDL). Numerosi studi clinici hanno
dimostrato che le lipoproteine hanno effetti molto caratteristici sul rischio di patologie coronariche, a
seconda della classe cui appartengono.2-4 Tutti gli studi identificano il colesterolo LDL come il fattore
chiave nella patogenesi dell’aterosclerosi e di patologie coronariche2-8, mentre è stato osservato
che il colesterolo HDL ha un effetto protettivo. Anche quando le concentrazioni di colesterolo totale
rientrano nei valori normali, può verificarsi un aumento del colesterolo LDL associato ad un aumento
del rischio di patologie coronariche.4
PRINCIPIO
Il dosaggio LDL-C N-geneous® è un metodo in fase omogenea per la misurazione diretta dei livelli
di LDL-C nel siero o nel plasma, senza la necessità di effettuare pretrattamenti o centrifugazioni. Il
metodo è disponibile in un formato a due reagenti e dipende dalle proprietà di un detergente esclusivo.
Questo detergente (Reagente 1) solubilizza solo le particelle lipoproteiche non LDL. Il colesterolo
rilasciato viene consumato dalla colesterolo esterasi e dalla colesterolo ossidasi con una reazione
incolore. Un secondo detergente (Reagente 2) solubilizza le restanti particelle LDL e un cromogeno
consente la formazione del colore. La reazione dell’enzima con l’LDL-C in presenza del cromogeno
produce un colore proporzionale alla quantità di colesterolo LDL presente nel campione.
REAGENTI
Composizione
Componente
Ingredienti
Reagente 1
Tampone
Detergente 1
Colesterolo esterasi (Pseudomonas sp.)
Colesterolo ossidasi (Cellulomonas sp.)
Perossidasi (Rafano)
4-Aminoantipirina
Acido ascorbico ossidasi (Curcubita sp.)
Conservante
Reagente 2
Tampone
Detergente 2
N,N-bis(4-solfobutil)-toluidina disodio (DSBmT)
Conservante
Concentrazione
<1.0%
<1500 U/L
<1500 U/L
<1300 ppg U/L
<0.1%
<3000 U/L
<1.0%
<1,9 mM
Precauzioni e avvertenze
1. Per uso diagnostico in vitro.
2. Tutti i campioni utilizzati per il test devono essere considerati come potenzialmente infettivi. Durante
e dopo il test, osservare le precauzioni normalmente adottate all’interno del vostro laboratorio per il
trattamento e lo smaltimento di questo tipo di materiali.
3. Non utilizzare i reagenti per l’LDL oltre la data di scadenza riportata sull’etichetta.
Preparazione
I reagenti vengono forniti pronti all’uso.
Conservazione e stabilità
I reagenti in confezione integra sono stabili fino alla data di scadenza riportata sull’etichetta, se
conservati a 2–8 °C. Reagenti 1 e 2 per il colesterolo LDL N-geneous®: una volta aperti rimangono
stabili per un massimo di 4 settimane a una temperatura compresa fra 2–8 °C. Reagenti 1 e 2 per il
colesterolo LDL N-geneous®: una volta aperti, la stabilità dopo il caricamento sull’analizzatore è di 4
settimane a una temperatura compresa fra 2–8 °C.
Indicazioni di deterioramento
Controlli che danno sempre valori diversi da quelli previsti. Estrema torbidità o crescita microbica.
RACCOLTA E PREPARAZIONE DEL CAMPIONE
Non è necessario che il paziente rimanga a digiuno prima del prelievo di sangue. I campioni consigliati
sono siero oppure plasma trattato con EDTA o con sodio eparina.
Siero: prelevare il sangue mediante venopuntura e lasciarlo coagulare. Centrifugare e rimuovere il
siero il più presto possibile dopo il prelievo (entro 3 ore).10
Plasma: i campioni raccolti possono essere trattati con EDTA o sodio eparina. Centrifugare e rimuovere
il plasma subito dopo il prelievo (entro 3 ore).10
Se i campioni non vengono analizzati immediatamente è possibile conservarli a 2-8 °C per un massimo
di 5 giorni. Se è necessario conservare i campioni per più di 5 giorni è possibile congelarli a -80 °C. I
campioni possono essere congelati una sola volta. Per ulteriori informazioni sul prelievo, il trattamento
e la conservazione dei campioni, consultare il documento H18-A dell’NCCLS.15
PROCEDURA
Dossagio
Di seguito è riportato un esempio generale del procedimento per il dosaggio del colesterolo LDL
N-geneous® eseguito utilizzando un analizzatore automatizzato a due reagenti. Tutte le applicazioni
dell’analizzatore devono essere convalidate a fronte delle raccomandazioni dell’NCEP e della CLIA.10,11
Campione + Reagente 1
3µL
300µL
Reagente 2
100µL
5 Minuti
5 Minuti
Misurazione (differenza tra le
assorbanze a 660 nm e 546 nm)
Misurazione (differenza tra le
assorbanze a 660 nm e 546 nm)
LDL-C
Risultato
Materiali forniti
Metodo
Colesterolo LDL
N-geneous®
Methodo
dell’immunoseparazione diretta
n
92
92
Descrizione
Configurazione
Numero di catalogo
Media (mg/dL)
120,0
122,8
Reagente 1
30mL
LDCE-70-5170-04
Deviazione standard (mg/dL)
30,5
31,6
Reagente 2
10mL
Analisi della regressione
Y=0,94x + 4,46mg/dL
n.z.
Coefficiente di correlazione
R=0,97
Materiali richiesti ma non in dotazione
Descrizione
Configurazione
Numero di catalogo
Set calibratore colesterolo LDL
2 fiale x 1mL
LCCE-70-5174
Calibrazione
Per la calibrazione è consigliato il kit di calibrazione del colesterolo LDL N-geneous® della Sekisui.
Gli altri calibratori per l’LDL disponibili in commercio non sono stati testati con questo dosaggio e la
Sekisui non ne consiglia l’uso. Per la descrizione delle procedure di assegnazione e per le istruzioni
consultare l’inserto del kit per la calibrazione del colesterolo LDL di N-geneous®. Il valore del calibratore
per il colesterolo LDL N-geneous® della Sekisui è stato assegnato mediante procedimenti riconducibili
al sistema di Center for Disease Control (CDC). I materiali di calibrazione hanno concentrazioni attorno
ai livelli critici che richiederebbero valutazione medica. Per la frequenza della calibrazione con dosaggi
automatizzati, vedere le raccomandazioni del produttore della strumentazione.
Controllo di qualità
L’affidabilità dei risultati deve essere verificata di routine con materiali per il controllo di qualità o pool
di sieri che danno prestazioni il più possibile simili a quelle ottenute sui campioni dei pazienti.10 È
necessario analizzare i controlli o pool di sieri con ogni dosaggio per verificare che i reagenti funzionino
correttamente e che il dosaggio sia stato eseguito correttamente. I materiali per il controllo di qualità
devono essere utilizzati esclusivamente per la verifica dell’accuratezza e della precisione. Il laboratorio
deve stabilire un intervallo di valori accettabili per ogni lotto di materiale per il controllo di qualità. Se i
valori di controllo non rientrano nell’intervallo previsto, verificare che i procedimenti siano stati eseguiti
correttamente e adottare le normali misure di risoluzione dei problemi. Si devono stabilire requisiti per
il controllo di qualità in conformità alle normative locali, statali e/o federali o degli enti di certificazione.
RISULTATI
I risultati sui campioni dei pazienti possono essere espressi in mg/dl. Per effettuare la conversione
dalle unità di misura convenzionali alle unità S.I., moltiplicare il valore in unità convenzionali per
0,02586 .14
mg/dl x 0,02586 = mmol/l di colesterolo LDL
Limitazioni/Sostanze interferenti
Tutti gli studi relativi all’interferenza sono stati condotti nel rispetto della direttiva N. EP7-P
dell’NCCLS riguardante i test delle interferenze in chimica clinica.12 Non sono state rilevate interferenze significative nel dosaggio LDL N-geneous® fino a valori di concentrazione uguali a quelli
riportati in tabella:
Sostanza interferente
Concentrazione senza
interferenza significativa
Trigliceride
Bilirubina (coniugata)
Bilirubina (non coniugata)
Emoglobina
Acido ascorbico
Gammaglobuline
1293 mg/dL
20 mg/dL
20 mg/dL
500 mg/dL
50 mg/dL
5000 mg/dL
1. Per un compendio degli effetti dei farmaci sui test clinici di laboratorio, vedere lo studio di Young
et al13.
2. Proteggere il reagente dall’esposizione diretta ai raggi solari.
3. I campioni con livelli di sostanze interferenti maggiori del limite superiore devono essere diluiti con
soluzione fisiologica prima di procedere al dosaggio. Moltiplicare il risultato per il fattore di diluizione
applicato. I campioni con livelli di trigliceridi >1293 mg/dl non devono essere diluiti.
4. Non utilizzare anticoagulanti contenenti citrato.
5. I campioni dei pazienti possono essere congelati una sola volta.
6. Non congelare i reagenti.
Risultati attesi
La NCEP ha stabilito delle soglie per la classificazione dei pazienti. Questi valori vengono utilizzati per la
prevenzione e la gestione delle patologie coronariche.8
Colesterolo LDL Classificazione
<130 mg/dl (<3,36 mmol/l) Auspicabile
130-159 mg/dl (3,36 -4,11 mmol/l) Linea di demarcazione alto rischio
≥160 mg/dl (≥4,14 mmol/l) Alto rischio
È consigliabile che ciascun laboratorio stabilisca i propri intervalli.
CARATTERISTICHE SPECIFICHE DELLA PRESTAZIONE
Accuratezza
L’accuratezza del metodo colesterolo LDL N-geneous® è stata verificata tramite confronto con il
metodo di riferimento (ultracentrifugazione e analisi del colesterolo)10 e sono stati ottenuti i seguenti
risultati utilizzando lo strumento Roche Diagnostics Hitachi 911:
Metodo
Colesterolo LDL N-geneous®
n
54
Metodo di riferimento
54
Media (mg/dL)
122,5
125,1
Deviazione standard (mg/dL)
30,7
30,9
Analisi della regressione
Y=0,95x + 3,02mg/dL
n.z.
Coefficiente di correlazione
R=0,96
Gli studi in cui il metodo colesterolo LDL N-geneous® è stato messo a confronto con il metodo
dell’immunoseparazione diretta del colesterolo LDL hanno fornito i seguenti risultati utilizzando lo
strumento Roche Diagnostics Hitachi 911:
Precisione
La precisione intra-test del metodo colesterolo LDL N-geneous® è stata determinata utilizzando tre pool
di sieri umani congelati, corrispondenti a tre diversi intervalli di concentrazione. Ogni test consisteva di
20 repliche dello stesso campione. Gli studi sulla precisione intra-test hanno fornito i seguenti risultati
utilizzando lo strumento Roche Diagnostics Hitachi 911:
Pool di sieri
Basso
<130mg/dL
Medio
130-159 mg/dL
Alto
>160mg/dL
n
20
20
20
Media (mg/dL)
98,1
146,5
209,8
Deviazione standard (mg/dL)
0,72
0,96
1,31
Coefficiente di correlazione (%)
0,73
0,66
0,62
La precisione fra un dosaggio e l’altro é stata determinata utilizzando tre pool di sieri umani congelati,
corrispondenti a tre diversi intervalli di concentrazione. Il dosaggio del colesterolo LDL N-geneous®
LDL è stato eseguito due volte al giorno in duplicato per oltre 10 giorni. Gli studi sulla precisione fra
un dosaggio e l’altro hanno fornito i seguenti risultati utilizzando lo strumento Roche Diagnostics
Hitachi 911:
Pool di sieri
Basso
(<40mg/dL)
Medio
(40-59 mg/dL)
Alto
(≥60mg/dL)
n
40
40
40
Media HDL-C (mg/dL)
98,1
142,7
207,3
Deviazione standard (mg/dL)
2,2
2,8
3,6
Coefficiente di correlazione (%)
2,27
1,95
1,73
Linearità
Il metodo del colesterolo LDL N-geneous® è lineare da 6,6 mg/dl a 992 mg/dl.
Limiti della rilevazione
La sensibilità analitica del dosaggio è risultata essere 0,278 mg/dl.
REFERENCES, LITERATURSTELLEN, BIBLIOGRAFIA
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Biomedical Labaoratories”, 1988. Also seen as: Richardson J.H and Barkley W.E eds. Biosafety
in Microbiological and Biomedical laboratories, U.S. Dept of Health and Human Services, Public
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in the Clinical Laboratory – Third Edition: Approved Guideline NCCLS Document C3-A3, 1997.
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4. Crouse, J.R. et al. Studies of low density lipoprotein molelcular weight in human beings with coronary
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1977; 55:767.
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Am J Med 1977; 62:707.
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Biomedical Laboratories”, 1988.
10. Bachorik P.S. et al. National Cholesterol Education Program Recommendations for Measurement
of Low-Density Lipoprotein Cholesterol: Executive Summary. Clin Chem 1995; 41(10):1414.
11. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Procedures for the Handling and Processing
of Blood Specimens, Approved Guideline NCCLS Document H18-A. Number 12, Vol. 10, 1990.
12. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Internal Quality control Testing: Principles
and Definitions, Approved Guideline NCCLS Document C24-A, Number 6, Vol. 11, 1991.
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Interference Testing, Evaluation Protocol, Proposed Guideline NCCLS Document EP7-P Number 7,
Vol. 6, No. 13, August, 1986.
15. Young, D.S. Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests, 3rd ed. AACC Press, Washington,
D.C., 3-104 (1990).
Definicion for Symbols, Definitionen der Symbole, Definizioni dei simboli
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