saturated saline solution

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INFLUENZA DEL TENORE DI SALE E DELLA TEMPERATURA DI
MAGAZZINAGGIO SULLA VITA COMMERCIALE E SULLA
FORMAZIONE D'ISTAMINA NELLA PASTA D'ACCIUGHE
EFFECT OF SALT CONCENTRATION AND STORAGE
TEMPERATURE ON SHELF-LIFE AND HISTAMINE FORMATION IN
ANCHOVY PASTE
Pietro Pirazzoli, Iller Incerti, Secondo Gola, Nicoletta Scaramuzza
SSICA Stazione Sperimentale per l'Industria delle Conserve Alimentari, V.le Tanara, 31/A - 43100
Parma (Italia)
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Riassunto
È stata studiata la formazione d’istamina in quattro campioni di pasta
d’acciughe a diverso tenore salino (P1, P2, P3 e P4 con NaCl nella fase acquosa
16,
20, 23 e 26 g/100 g, rispettivamente) conservati a 12, 22 e 30°C per un anno. Sono
state seguite anche le variazioni di altri parametri qualitativi: carica batterica,
valutazione sensoriale e indice di proteolisi. In tutti i campioni, nel corso del
magazzinaggio, sono stati rilevati formazione d’istamina (ad eccezione di P1 e P4
mantenuti a 12°C), lo sviluppo batterico (ad eccezione di P4), decadimento
organolettico (solo P4 conservato a 12°C manteneva ancora caratteristiche sensoriali
accettabili dopo un anno di magazzinaggio) e aumento dell’indice di proteolisi. Tutto
ciò è avvenuto generalmente in maniera più rapida e più intensa all’aumentare della
temperatura di conservazione e al diminuire del tenore salino del prodotto. Il
contenuto d’istamina non sempre è risultato correlato alla carica batterica, ai risultati
della valutazione organolettica o all’indice di proteolisi, facendo ritenere possibile
che la sua formazione fosse dovuta all’attività istidino-decarbossilasica dell’enzima
già presente nelle acciughe salate e formatosi durante la loro preparazione e/o
magazzinaggio
o
dell’enzima
derivante
dallo
sviluppo
di
Micrococcaceae
alotolleranti durante il magazzinaggio dei campioni.
Abstract
The formation of histamine in four samples of anchovy paste with different salt
concentrations (P1, P2, P3 and P4 with NaCl in the aqueous phase
16, 20, 23 e 26
g/100g, respectively) and stored at 12, 22 and 30°C for one year was studied and
compared with changes in other quality parameters: bacterial count, sensory
evaluation and proteolysis index. All samples showed histamine formation (except P1
and P4 stored at 12°C), bacterial growth (except P4), sensory deterioration (only P4
stored at 12°C had acceptable sensorial characteristics after one year of storage) and
proteolysis index increase during storage; rate and intensity of changes were, in
general, higher with increasing higher storage temperatures and decreasing salt
content of the product. Since histamine content did not show a good correlation with
microbial count, sensory data evaluation or proteolysis index, its formation probably
was due to the enzyme histidine-decarboxylase activity which being enzyme already
present in the salted anchovies, had formed during their processing and/or storage, or
of the enzyme resulting from the growth of the halotolerant Micrococcaceae in the
sample during storage.
Key words: anchovy paste, histamine, shelf-life
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INTRODUZIONE
Le ammine sono sostanze basiche azotate nelle quali uno, due o tre atomi di
idrogeno dell'ammoniaca sono sostituiti da gruppi alchilici o arilici; quelle che si
formano
negli
alimenti
per
azione
microbica
mediante
il
processo
di
decarbossilazione enzimatica degli amminoacidi sono dette biogene (istamina,
putrescina, cadaverina, tiramina, spermina, spermidina, ecc.) e possono causare
disturbi sanitari nell'uomo.
L'istamina, la più importante dal punto di vista epidemiologico, è quella
maggiormente studiata. La prima segnalazione d’intossicazione da istamina risale al
1828 in Gran Bretagna, in seguito a consumo di tonno (1). Successivamente, essendo
episodi analoghi frequentemente associati al consumo di pesci appartenenti alla
famiglia degli scombridi, tale patologia fu denominata "intossicazione da scombridi"
(scombroid fish poisoning). Attualmente si ritiene più corretta la definizione di
"intossicazione da istamina", in quanto anche altre specie ittiche e diversi alimenti (es.:
prodotti ittici, carnei e a base di soia, formaggi, vegetali fermentati, birra e vino) sono
stati coinvolti in questo tipo d'intossicazione. Essa si può presentare con diversi sintomi,
tra i quali: irritazione cutanea, nausea, diarrea, palpitazioni, cefalea e vertigini. La
gravità dei sintomi varia considerevolmente con la quantità d’istamina ingerita e con
la sensibilità individuale all'ammina.
L'istamina si forma per decarbossilazione dell'istidina e la sua origine è solo in
minima parte riconducibile a fenomeni autolitici di origine tissutale. Essa è infatti
generalmente di origine batterica, derivando dall'azione di un enzima specifico, che
può essere elaborato da numerosi microrganismi, sull'amminoacido libero presente
nell'alimento o prodottosi durante i processi degradativi delle proteine. Una volta che
l’enzima istidino-decarbossilasi si è formato, esso può continuare a produrre istamina
nell’alimento anche se i batteri non sono più attivi (2).
Tenori relativamente elevati d'istidina libera sono naturalmente presenti nel
tessuto muscolare di alcune specie ittiche, in particolare quelle a carne rossa, che
sono pertanto considerate alimenti a rischio istamina. Ciò ha portato alla definizione
di limiti di legge per il contenuto di tale sostanza nei prodotti della pesca in quasi tutti i
paesi del mondo. L’Unione Europea, in sintesi, ha fissato in 100 mg/kg il massimo
tenore d'istamina ammesso in pesci freschi o trasformati delle seguenti famiglie:
Scombridae (es.: tonno e sgombro), Clupeidae (es.: sardina e aringa), Engraulidae
(es.: acciuga) e Coryphaenidae (es.: lampuga). Tuttavia, i pesci di queste famiglie
che abbiano subito un trattamento di maturazione enzimatica in salamoia possono
presentare tenori d'istamina più elevati che non possono però superare il doppio del
valore suddetto (3).
La presenza del substrato, pur costituendo il requisito primario per l'azione della
decarbossilasi
batterica,
non
rappresenta
l'unico
fattore
per
la
formazione
dell'istamina; di fondamentale importanza è infatti la temperatura. La temperatura
ottimale di formazione è generalmente individuata tra 20 e 37°C ed è correlata al tipo
di microrganismo istamino-formatore considerato. È stato ampiamente provato che la
formazione dell'istamina è rallentata dalla refrigerazione ed è prevenuta dal
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magazzinaggio congelato, in quanto lo sviluppo microbico e l’attività enzimatica
rallentano al diminuire della temperatura fino a bloccarsi a temperature negative (48). La congelazione può inattivare i batteri istamino-formatori, mentre il calore
(cottura, sterilizzazione) inattiva sia i batteri sia l’enzima. Quest’ultimo rimane stabile
allo stato congelato e si riattiva rapidamente dopo decongelazione. L’istamina, una
volta formatasi, non può essere eliminata dall’alimento con il calore o la
congelazione (2). Anche il sale, inibendo la moltiplicazione e l'attività della normale
flora microbica, può condizionare la formazione dell'istamina; sono stati però isolati da
pesce fresco e da prodotti ittici alcuni microrganismi alotolleranti in grado di
elaborare elevate quantità dell'ammina (9-19). Ciò induce a ritenere a rischio, oltre al
pesce fresco, anche alcuni prodotti salati e affumicati ottenuti da specie ittiche inclini
alla formazione dell’ammina (2). L'attività istidino-decarbossilasica dei batteri alofili e
alotolleranti è ridotta da elevati tenori di sale mentre è stimolata da basse
concentrazioni (19).
In base alle attuali conoscenze, si può affermare che la presenza d'istamina nei
pesci freschi o congelati sia sempre collegata a un processo d'alterazione più o meno
pronunciato, in conseguenza di abusi di temperatura e/o di tempo durante il
magazzinaggio
(prima
della
congelazione
o
durante
le
fasi
di
decongelazione/ricongelazione nel caso del pesce congelato). Poiché l’istamina è
altamente termostabile e non è denaturata dalla cottura e dai trattamenti termici di
stabilizzazione applicati nei processi d'inscatolamento, la sua presenza può essere
invece riconducibile a varie cause: uso di materia prima in non buone condizioni di
freschezza; abusi di temperatura e/o di tempo nei confronti della materia prima o del
semilavorato nel corso del procedimento di lavorazione; utilizzo di processi di
maturazione enzimatica (proteolisi) per la preparazione del prodotto finito (esempio
tipico le acciughe salate); abusi di temperatura e/o di tempo durante la
conservazione del prodotto finito non stabilizzato termicamente.
Shalaby (20), facendo una rassegna della letteratura internazionale, riporta in
una tabella i valori massimi d’istamina riscontrati in vari alimenti e nota che quelli con
valori superiori a 100 mg/kg sono tutti prodotti ittici. In particolare, valori elevati
d'istamina sono stati frequentemente rilevati in prodotti ittici conservati mediante
salagione, come acciughe salate e prodotti derivati, salse a base di pesce salato
fermentato, ecc. (16, 21-29). Tali alimenti sono semiconserve, cioè prodotti non
sottoposti a trattamenti termici di stabilizzazione, e la loro stabilità nel tempo è legata
all'elevato contenuto di sale. L'effetto inibente sulla crescita dei microrganismi è
dovuto al fatto che il sale, disciolto nell'acqua tissutale, riduce la disponibilità di
quest'ultima per il metabolismo microbico; l'effetto inibente dipende quindi dalla
concentrazione del sale nella fase acquosa (SFA). La disponibilità di acqua nel
sistema è rappresentata fisicamente dall'attività dell'acqua (aw), parametro correlato
alla concentrazione del soluto nella soluzione. I parametri "SFA" e "aw" sono pertanto
quelli più utili per permettere la previsione della vita commerciale di un prodotto
salato. Il massimo valore raggiungibile di SFA è quello di una soluzione salina satura
(circa 26,5 g/100 g), corrispondente ad un valore di aw di circa 0,75. Quanto più il
valore di aw è superiore a 0,75, o il valore di SFA inferiore a 26,5 g/100 g, tanto più il
prodotto è alterabile. Da non dimenticare tuttavia anche il valore del residuo secco;
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un valore elevato di tale parametro favorisce la stabilizzazione microbiologica del
pesce
salato, sia durante tutto il
processo di
maturazione, sia durante il
magazzinaggio del prodotto finito (30, 31).
Le acciughe salate sono preparate da pesci appartenenti alla famiglia
Engraulidae mediante un processo di salagione e maturazione di origine antichissima,
tradizionale nei paesi mediterranei. Durante la fase di maturazione, della durata di
alcuni mesi, le acciughe acquistano tipiche caratteristiche di odore, sapore,
consistenza e colore in seguito a una serie di modificazioni biochimiche a carico delle
proteine del tessuto muscolare. La lisi delle proteine comporta la formazione di
amminoacidi liberi, tra i quali l'istidina che, come detto, è uno dei principali fattori
legati alla formazione dell'istamina.
Un elevato tenore d'istamina nelle acciughe salate può derivare dalla materia
prima, ma anche dallo stesso processo di maturazione del pesce salato; inoltre,
essendo le acciughe salate e i prodotti da esse derivati (filetti di acciughe all'olio e
pasta d'acciughe) delle semiconserve, la proteolisi continua anche durante il
magazzinaggio del prodotto finito e la formazione d'istamina può essere imputata a
una vita commerciale troppo protratta nel tempo e/o a improprie condizioni di
conservazione (temperatura elevata).
Una corretta tecnologia di produzione, che permetta di ottenere prodotti con
valori ottimali di aw e SFA e di residuo secco >50 g/100 g, abbinata a idonea qualità
della materia prima, a buone condizioni igieniche di lavorazione, nonché al controllo
del tempo e della temperatura di conservazione del prodotto finito, dovrebbe
consentire di evitare una significativa formazione d'istamina (14, 17, 22, 25, 32-35).
Questo studio è stato effettuato allo scopo di valutare l'influenza del tenore
salino, nonché del tempo e della temperatura di magazzinaggio, sulla formazione
d'istamina nella pasta d’acciughe, una tipica semiconserva ittica salata che, in Italia,
è usualmente commercializzata a temperatura ambiente e per la quale viene
indicato un termine minimo di conservazione di 18 mesi.
MATERIALI E METODI
È stata preparata un’adeguata quantità di pasta d'acciughe secondo una tradizionale ricetta
del commercio: acciughe salate mature sono state separate dal sale superficiale, spellate con
salamoia satura, triturate e miscelate in un cutter con ghiaccio, sale e olio; infine, l'impasto è stato
omogeneizzato in un molino colloidale. La pasta ottenuta è stata suddivisa in quattro aliquote,
ognuna delle quali è stata miscelata con un'adeguata quantità di acqua fredda per ottenere
quattro campioni (P1, P2, P3 e P4) a diverso tenore di sale nella fase acquosa (SFA
16, 20, 23 e 26
g/100 g, rispettivamente); le caratteristiche chimico-fisiche di tali campioni sono riportate nella
Tabella 1. I quattro campioni di pasta sono stati poi confezionati in tubetti di alluminio da 60 g,
ulteriormente suddivisi in tre aliquote e immagazzinati a 12, 22 e 30°C.
I campioni per le analisi sono stati prelevati ogni mese nell'arco di un anno di conservazione o
fino a intensa alterazione.
I valori riportati delle analisi chimico-fisiche e microbiologiche rappresentano la media di due
determinazioni.
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Esame sensoriale
A ogni prelievo sono stati rilevati i seguenti parametri: aspetto esterno della confezione (A);
odore (O) e consistenza (C) del prodotto; presenza di essudato acquoso (E).
Analisi chimico-fisiche
Sui campioni iniziali sono state effettuate le seguenti determinazioni:
–
umidità e ceneri, secondo i metodi descritti da Lima dos Santos et al. (36);
–
grassi, mediante estrazione con etere etilico, in apparecchiatura Soxhlet, del prodotto
miscelato con solfato di sodio anidro ed essiccato;
–
proteine, determinando l'azoto totale con il metodo di Kjeldahl (37) e moltiplicando il valore
ottenuto per 6,25. La distillazione e la titolazione dell'azoto proteico sono state effettuate
mediante l'analizzatore Kjeltec mod. 2300 (Foss Tecator);
–
cloruro di sodio (NaCl), secondo il metodo AOAC (37);
–
attività dell'acqua (aw) sul campione omogeneizzato utilizzando un apparecchio Aqua-Lab
della ditta Decagon;
–
pH, per infissione nel campione omogeneizzato di un elettrodo Hamilton collegato a un
pHmetro Radiometer M92.
Ad ogni prelievo sono state effettuate le seguenti determinazioni:
–
istamina, mediante HPLC seguendo il metodo di Pirazzoli e Incerti (38);
–
indice di proteolisi (I.P.), calcolando il rapporto percentuale tra i contenuti di azoto estraibile
non proteico e di azoto totale del prodotto. L'azoto estraibile non proteico è stato dosato
seguendo il metodo di Bellatti et al. (39).
Analisi microbiologiche
Sono stati utilizzati i seguenti terreni di coltura:
–
Plate Count Agar (Oxoid), incubato a 30°C per 3 giorni, per la determinazione della carica
microbica aerobi mesofili (CMA);
–
Mannitol Salt Agar (Oxoid), incubato a 30°C per 4 giorni, per la ricerca delle
Micrococcaceae;
–
Baird Parker (BioMérieux), incubato a 37°C per 48 ore, per la ricerca degli stafilococchi;
–
Staph-kit Slidex (BioMérieux) per l'identificazione dei ceppi di stafilococchi coagulasi positivi;
–
Brain Heart Infusion (Oxoid) contenente il 24% di NaCl, incubato a 30°C per 7 giorni, per la
ricerca di batteri alofili stretti.
Le analisi non sono state effettuate sui campioni prelevati all’ottavo mese di magazzinaggio.
RISULTATI E DISCUSSIONE
Le analisi microbiologiche eseguite sui quattro campioni subito dopo la loro
preparazione hanno evidenziato che la carica microbica aerobica era costituita
prevalentemente da micrococchi e da stafilococchi coagulasi negativi, con valori
compresi tra 1,9×104 e 1,2×105 ufc/g, e che i batteri alofili stretti erano assenti/g
(risultati non riportati).
Rodriguez-Jerez et al. (32) e Veciana-Nogués et al. (34) affermano che non c’è
alcuna relazione tra la formazione di ammine biogene nelle acciughe salate o nei
filetti di acciughe in olio e i microrganismi mesofili, psicrofili ed enterobatteri. In
particolare questi ultimi, generalmente descritti come i più forti istamino-formatori,
sono sensibili al sale; lo sviluppo quindi dell’istamina è dovuto a microrganismi alofili o
alotolleranti.
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Nel corso dei vari prelievi durante il magazzinaggio si è confermato che la carica
microbica era formata prevalentemente da Micrococcaceae, in accordo con
quanto rilevato da altri autori (17, 19, 28) che hanno isolato microrganismi della specie
Staphylococcus, ritenendoli alotolleranti e in grado di formare istamina.
Dalla Figura 1, nella quale sono riportati i risultati delle determinazioni della
carica di Micrococcaceae dei campioni esaminati nel corso dello studio, si evince
che l'accrescimento dei batteri è condizionato dal tenore salino del prodotto e dalla
temperatura di magazzinaggio. Per ogni campione, lo sviluppo dei micrococchi e
degli stafilococchi è avvenuto più velocemente alla temperatura più elevata; a una
determinata temperatura, lo sviluppo batterico è stato più rapido nel campione
meno salato. A 12°C i campioni P1 e P2 hanno raggiunto valori di CMA di 107 ufc/g
(considerato come soglia di alterazione) in 4 mesi, mentre si è rilevata una graduale
diminuzione del valore iniziale della CMA nel campione P4 durante i 12 mesi di
magazzinaggio; la diminuzione è avvenuta già dopo 1 mese e si è mantenuta tale
( 103 ufc/g) fino al termine della prova. Nel campione P3 si è rilevata una graduale
riduzione in 4 mesi del valore della CMA, che è poi aumentato nei successivi 8 mesi
fino a 106 ufc/g. A 22°C nel campione P1 si è riscontrato un valore di CMA >107 ufc/g
già dopo 1 mese, mentre i campioni P2 e P3 hanno raggiunto tale valore dopo 2 mesi.
Nel campione P4 è stata rilevata una sostanziale diminuzione del valore della CMA
iniziale fino al quinto mese, seguito da un aumento al sesto mese, raggiungendo un
valore di 106 ufc/g che si è mantenuto tale fino al termine del magazzinaggio. A 30°C
la CMA ha raggiunto valori elevati (>107 ufc/g) già dopo 1 mese nei campioni P1 e P2
e dopo 2 mesi nel campione P3; nel campione P4, invece, si è rilevata una sensibile e
progressiva diminuzione della CMA nei primi 3 mesi, seguita da un aumento fino a un
valore di 105 ufc/g nei successivi 4 mesi.
In base ai rilievi sensoriali effettuati durante il magazzinaggio (Tabella 2) si può
notare che il tempo di comparsa dei difetti considerati nei vari campioni
(rigonfiamento del tubetto, nonché perdita di consistenza, comparsa di odore
anomalo
e
formazione
di
essudato
acquoso
nella
pasta)
è
direttamente
proporzionale al tenore di SFA (sale nella fase acquosa) e inversamente proporzionale
alla temperatura di conservazione.
Relativamente all’influenza del tenore salino a una certa temperatura di
magazzinaggio, per esempio 22°C, sono stati rilevati: il rigonfiamento del tubetto e la
formazione di essudato dopo 1 mese nel campione P1, nonché la perdita di
consistenza e la comparsa di odore anomalo dopo 2 mesi; il rigonfiamento del
tubetto, la perdita di consistenza e la formazione di essudato dopo 2 mesi nel
campione P2, nonché la comparsa di odore anomalo dopo 4 mesi; il rigonfiamento
del tubetto, la perdita di consistenza e la formazione di essudato dopo 4 mesi nel
campione P3; la formazione di essudato dopo 4 mesi, la perdita di consistenza dopo 8
mesi e il rigonfiamento del tubetto dopo 9 mesi nel campione P4. Considerando
invece l'effetto delle diverse temperature di magazzinaggio su un campione, per
esempio la pasta P2, si può notare che il tempo di comparsa del rigonfiamento dei
tubetti è stato di 7 mesi a 12°C, di 2 mesi a 22°C e di 1 mese a 30°C.
I campioni P1, P2 e P3 conservati a 22°C e tutti i campioni conservati a 30°C sono
stati scartati dopo 7 mesi di magazzinaggio perché molti tubetti, in conseguenza
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dell’intensa proteolisi della pasta con sviluppo di anidride carbonica, si erano gonfiati
al punto di perdere ermeticità con fuoriuscita di prodotto. Solo il campione P4
conservato a 12°C ha mantenuto caratteristiche organolettiche accettabili dopo un
anno di magazzinaggio. È interessante osservare che il gonfiore del tubetto non è
sempre legato allo sviluppo microbico; per esempio, il campione P4 mantenuto a
30°C è risultato leggermente gonfio dopo 5 mesi pur presentando bassi valori del
3
contenuto di Micrococcaceae (~10
ufc/g). I difetti considerati sono pertanto
attribuibili a un'alterazione microbica vera e propria e/o a una proteolisi molto
intensa. Infatti, è ormai appurato che il processo di lisi delle proteine delle acciughe
sottoposte a salagione, detto “maturazione”, ha luogo per via enzimatica e i
microrganismi giocano un ruolo trascurabile. A conferma di ciò, in uno studio sulla
maturazione delle acciughe salate, Triqui e Reineccius (40) hanno rilevato che il
pesce maturato in presenza di antibiotici come inibitori microbici aveva lo stesso
profilo aromatico di quello maturato normalmente.
Una maturazione troppo prolungata delle acciughe salate, o condotta a
temperature anomale, come pure abusi di tempo e/o di temperatura durante il
magazzinaggio
dei
prodotti
da
esse
derivati,
può
causare
la
cosiddetta
“sovrammaturazione” del prodotto; si sviluppa un’intensa lisi delle proteine fino a
comparsa di alcuni o tutti i difetti oggetto degli esami sensoriali effettuati. La
sovrammaturazione può essere valutata analiticamente determinando l’indice di
proteolisi (I.P.), un parametro relativo alla frazione di azoto derivante dalla lisi delle
proteine; la Figura 2 mostra le variazioni di tale indice nei campioni di pasta
d’acciughe studiati. Il valore di I.P. è aumentato più o meno rapidamente in tutti i
campioni durante il magazzinaggio, ha raggiunto un massimo e poi è rimasto
praticamente costante. Dall’esame dei grafici si possono notare le influenze del
tenore salino e della temperatura di conservazione del prodotto: a ogni temperatura
di magazzinaggio, la rapidità e l’intensità della proteolisi sono inversamente
proporzionali al tenore salino dei campioni; a parità di tenore salino del prodotto,
l’aumento e l’intensità dei valori di I.P. sono più limitati a 12°C rispetto alle altre due
temperature di magazzinaggio, nelle quali i campioni presentano un andamento
simile. Come detto precedentemente, la lisi delle proteine comporta la comparsa di
vari difetti; quello più appariscente è il rigonfiamento del tubetto fino alla perdita di
ermeticità con fuoriuscita di prodotto. Nell’ambito dello studio si è generalmente
rilevata la comparsa di tale difetto in corrispondenza del raggiungimento di un valore
di I.P. di circa 80%.
Nella Figura 3 sono riportate le variazioni del tenore d’istamina nei campioni di
pasta d’acciughe a diverso tenore salino durante il magazzinaggio a tre differenti
temperature. È evidente la formazione di significative quantità d’istamina in tutti i
campioni conservati a 22 e 30°C; a 12°C, invece, l’istamina si è formata solamente nei
campioni con valori di SFA
20 (P2) e 23 (P3) g/100 g. La stabilità a 12°C del
campione P4 nei confronti dello sviluppo dell’istamina è dipesa, oltre che dalla
temperatura di refrigerazione, dall’elevato tenore salino della pasta (SFA
26 g/100
g); tale maggiore stabilità si è contestualmente manifestata per gli aspetti
microbiologico, organolettico e proteolitico. Ciò è confermato anche dalla maggiore
stabilità del campione P4, rispetto agli altri tre, alle temperature di magazzinaggio di
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22 e 30°C. Risulta invece difficile spiegare la stabilità a 12°C del campione P1 (SFA
16
g/100 g) nei confronti dello sviluppo dell’istamina, quando dopo 2 mesi di
magazzinaggio aveva un indice di proteolisi >70%, dopo 3 mesi aveva raggiunto una
CMA di 107 ufc/g e dopo 5 mesi aveva caratteristiche organolettiche assolutamente
scadenti.
Rodriguez-Jerez et al. (16, 17) affermano che il livello d'istamina in un prodotto è
correlato significativamente con la sua carica batterica e che, nel caso dei prodotti
trasformati, è di fondamentale importanza la qualità della materia prima. Su
quest’ultimo aspetto concordano altri autori (25, 33, 41) che hanno effettuato studi
sulla formazione di ammine biogene in pesce salato, rilevando che il grado di
freschezza della materia prima determina il contenuto iniziale di ammine e, di
conseguenza, anche quello finale. Brillantes et al. (41), in un lavoro su pesce
fermentato in salamoia, riscontrano la formazione d’istamina non solo prima della
salagione, nella materia prima, ma anche durante la fermentazione, a differenza da
quanto riportato da Sato et al. (42), probabilmente per azione dell’enzima istidinodecarbossilasi formatosi precedentemente.
Per quanto riguarda la relazione tra istamina e microrganismi, alcuni autori
affermano che la carica batterica è correlata alla velocità di formazione
dell’ammina e alla sua quantità finale nel prodotto (28, 41, 43-45) e Karnop (14)
ipotizza che l'aumento d'istamina in filetti di acciughe in olio deve essere previsto solo
quando la carica batterica totale del prodotto supera i 5 log ufc/g. Dai risultati del
nostro lavoro si evince invece che, come per il rigonfiamento del tubetto, anche la
produzione d'istamina e il suo livello finale non sempre sono correlati all'entità della
carica batterica del prodotto e al tenore iniziale di ammina delle acciughe salate
usate come materia prima, concordemente a quanto riscontrato da Rodriguez-Jerez
et al. (32) e da Veciana-Nogués et al. (34) in un prodotto analogo (filetti di acciughe
in olio). In accordo con Fujii et al. (15) e con Brillantes et al. (41), la formazione
d'istamina
nel
pesce
salato
sembra
quindi
più
legata
all’attività
istidino-
decarbossilasica che alla carica batterica, probabilmente per azione dell’enzima
formatosi durante il magazzinaggio della materia prima e/o durante la fase iniziale
della salagione. Ciò è in relazione anche con l’effetto del grado di acidità, poiché la
massima attività dell’enzima si manifesterebbe a pH 6,5 (46), valore vicino a quelli dei
quattro campioni preparati e varianti da 6,06 a 6,27.
La formazione d’istamina è condizionata dalla concentrazione del sale, come
rilevato anche da altri autori (19, 28, 43-45); nel nostro caso però l’influenza si
manifesta nel rallentamento della formazione dell’istamina piuttosto che sulla
quantità.
Anche se la conservazione in frigorifero non previene completamente la
formazione d’istamina (34, 44, 47), risulta evidente l’effetto inibente della temperatura,
in accordo con quanto riportato in numerosi lavori su prodotti a base di pesce salato
(14, 19, 25, 28, 32, 48). Alcuni autori, per prevenire il pericolo istamina, ritengono
opportuno il magazzinaggio refrigerato delle semiconserve di acciughe salate,
specialmente dei filetti all’olio (19, 22, 32). Il magazzinaggio refrigerato, oltre a
rallentare la formazione d’istamina, prolunga la vita commerciale delle acciughe
9
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salate e dei prodotti derivati rallentando anche il decadimento organolettico, in
particolare la perdita di consistenza (49-51).
CONCLUSIONI
I risultati ottenuti confermano l’asserto che la presenza d’istamina in un alimento
è sempre indice di una avvenuta alterazione, microbiologica o enzimatica, mentre
l’assenza non esclude un’eventuale alterazione.
In tutti i campioni, ad eccezione di P1 e P4 mantenuti a 12°C, si rileva la
formazione d’istamina nel corso del magazzinaggio; ciò avviene generalmente in
maniera più rapida e più intensa all’aumentare della temperatura di conservazione e
al diminuire del tenore salino del prodotto. Analoghe conclusioni si possono fare
anche per il decadimento sensoriale; solo il campione P4 conservato a 12°C ha
ancora caratteristiche organolettiche accettabili dopo un anno di magazzinaggio.
Concentrazione salina, temperatura e tempo di magazzinaggio sono pertanto
importanti parametri che possono influire sulla vita commerciale delle semiconserve a
base di acciughe salate, in quanto permettono di mantenere sotto controllo la
formazione dell’istamina e la perdita di consistenza del prodotto.
La formazione dell’istamina nei sistemi modello preparati potrebbe essere
dovuta all’azione istidino-decarbossilasica dell’enzima già eventualmente presente
nelle acciughe salate utilizzate come materia prima e formatosi durante la loro
preparazione e/o conservazione o dell’enzima derivante dalla carica microbica di
Micrococcaceae
alotolleranti
sviluppatasi
nel
prodotto
finito
durante
il
magazzinaggio.
Considerando che nessun campione ha superato il valore di 200 mg/kg, previsto
come il limite di accettabilità del contenuto d’istamina nelle semiconserve a base di
acciughe salate (prodotto che ha subito un trattamento di maturazione enzimatica in
salamoia), e che tale tipo di prodotti è di norma consumata in modeste quantità, si
può ritenere improbabile una grave intossicazione da istamina. Inoltre, c’è da
considerare che quasi sempre la presenza di elevati tenori dell’ammina corrisponde a
un prodotto molto proteolizzato, quindi con caratteristiche organolettiche talmente
scadenti da stimolarne il rifiuto.
Tenori di umidità <50 g/100 g e di SFA >25 g/100 g, a cui corrisponde un valore di
aw <0,76, sono i parametri consigliabili per una pasta d’acciughe con buona
conservabilità; il magazzinaggio a temperatura controllata e/o una vita commerciale
non troppo prolungata ridurrebbero ulteriormente il potenziale rischio sanitario per i
consumatori.
Parma, 16 febbraio 2006
10
11
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12
13
INTRODUCTION
Amines are basic nitrogen-like substances in which one, two or three ammonia
hydrogen atoms are replaced by alkyl or aryl groups; those forming in foods by
microbial action through enzymatic decarboxylation of aminoacids are defined
biogenic amines (histamine, putrescine, cadaverine, tyramine, spermine, spermidine
etc.) and may cause health problems in humans.
Among biogenic amines, histamine, the most important from an epidemiological
point of view, is also the most widely studied. The first outbreak of histamine intoxication
dates back to 1828 and was associated with consumption of tuna fish in Great Britain
(1). Subsequently, since similar outbreaks are often associated with eating fish
belonging to the scombroid family, this foodborne disease was called “scombroid fish
poisoning“. At present, the definition “intoxication by histamine“ is considered more
correct, because also other fish species and different foods (fish products, meat
products, soy-based foods, cheese, fermented vegetables, beer and wine) have been
involved in this kind of intoxication. Symptoms include red rash, nausea, diarrhea,
palpitations, headhache, dizziness. Severity of symptoms varies considerably with the
amount of histamine ingested and with individual sensitivity.
Histamine results from decarboxylation of histidine and its formation is traceable
only to a minimum extent to autolytic phenomena of tissue origin. In fact, it is generally
of bacterial origin and results from the action of a specific enzyme, which may be
developed by several micro-organisms, on the free aminoacid present in the food or
formed during degradation processes of proteins. Once the histidine decarboxylase
enzyme has been formed, it can continue to produce histamine in the food even if
bacteria are no longer active (2).
Comparatively high levels of free hystidine are naturally present in the muscle
tissue of some fish species, especially red meat fish, which are therefore considered
high histamine-hazard foods. This has led countries all over the world to lay down law
limits for the contents of this substance in fish products. The European Union has fixed
100 mg/kg as the maximum average value allowed for histamine content in fresh fish
or canned fish of the following families: Scombridae (ex. tuna fish and mackerel),
Clupeidae (ex.: sardine and herring), Engraulidae (ex. anchovy) e Coryphaenidae (ex.
dolphinfish ). However, fish of these families submitted to enzymatic ripening treatment
in brine may present higher histamine levels which, cannot be more than twice as
much as the above value (3).
The presence of the medium, although being the primary requirement for
bacterial decarboxylase action, is not the only factor for histamine formation, since
temperature is of pivotal importance. Optimum temperature is generally considered to
be between 20 and 37°C and is correlated to the type of histamine forming microorganism considered. It has been widely shown that histamine formation is slowed
down by cold storage and is prevented by frozen storage, since microbial growth and
enzymatic activity rate decrease with decreasing temperature and stop at negative
temperatures (4-8). Freezing can inactivate histamine forming bacteria, whereas heat
(cooking, sterilisation) inactivates both bacteria and enzyme. The latter remains stable
13
14
in the frozen state and rapidly reactivates after thawing. Once histamine has been
formed, it cannot be eliminated from the food by heating or freezing it (2). Also salt, by
inhibiting growth and activity of normal microbial flora can affect histamine formation;
however, some halotolerant micro-organisms able to process high amine amounts
have been isolated from fresh fish and fish products (9-19). This is the reason why,
besides fresh fish, also some salted and smoked products obtained from fish species
prone
to
the
formation
of
this
amine
are
considered
hazardous.
Histidine
decarboxylase activity of halophilic or halotolerant bacteria is reduced by high salt
levels whereas it is fostered by low levels (19).
Based on present knowledge, it can be stated that histamine presence in fresh or
frozen fish is always related to a more or less pronounced spoilage process resulting
from abuse temperature and/or time during storage (before freezing or during
thawing/re-freezing steps). Since histamine is highly heat-stable and is not denaturated
by cooking or by the heat stabilisation treatments applied in canning processes, the
presence of this amine in processed fish products can be due to different causes: use
of raw material with a low degree of freshness; abuse temperature and/or time for raw
material or semi-processed products during processing; use of enzymatic browning
processes (proteolysis) for the preparation of the finished product (typical example:
salted anchovies); abuse temperature and/or time during storage of the finished
product not stabilized by heat.
Shalaby (20), in a review on international literature, reports in a table maximum
histamine levels found in foods while observing that those higher than 100 mg/kg
always pertain to fish products. In particular, high histamine levels were frequently
found in fish products preserved by salting, such as salted anchovies and their
products, salted fermented fish sauces, etc. (16, 21-29). These foods are semi-preserved
foods, i.e. products not submitted to stabilisation heat treatments and their stability
over time is related to their high salt content. The inhibitory effect on the growth of
micro-organisms is due to the fact that salt, dissolved in tissue water, reduces water
availability for microbial metabolism; therefore, the inhibitory effect thus depends on
salt concentration in the aqueous phase (SFA). Water availability in the system is
physically represented by water activity (aw), a parameter related to solute
concentration in the solution. SFA and aw parameters are therefore the most useful to
forecast the shelf-life of a salted product. The maximum value achievable for SFA is
that of a saturated salt solution (about 26.5 g/100 g) corresponding to an aw value of
about 0.75. The more the aw value is higher than 0.75, or the SFA value is lower than
26.5 g/100 g, the more the product is prone to spoilage. Dry matter value is also of
importance; a high value of that parameter favours microbial stabilization of salted
fish, during both the ripening process and the storage of the finished product (30, 31).
Salted anchovies are manufactured from fish belonging to the family Engraulidae
by a salting and ripening process of very ancient origins, which is traditional in the
Mediterranean countries. During the ripening phase, lasting some months, anchovies
achieve typical features of odour, taste, texture, and colour resulting from a series of
biochemical changes relating to the proteins of the muscle tissue. Protein breakdown
involves the formation of free aminoacids including histidine which, as already said, is
one of the main factors linked to histamine formation.
14
15
A high histamine level in salted anchovies may result from raw material, but also
from the ripening process of the salted fish; moreover, as salted anchovies and their
products (anchovy fillets packed in oil and anchovy paste) are semi-preserved foods,
proteolysis progresses also during storage of the finished product; histamine formation
can therefore be attributed to either to an exceedingly long shelf-life and/or to
unsuitable storage conditions (high temperature).
A correct production technology allowing products to be obtained with optimum
aw, SFA and dry matter >50 g/100 g values, along with suitable quality of raw material,
good hygienic processing practices as well as with the monitoring of storage time and
temperature in the finished product should prevent a significant histamine formation
from occurring (14, 17, 22, 25, 32-35).
The objective of this study was to evaluate the influence of salt content as well as
of storage time and temperature on histamine formation in anchovy paste, a typical
salted semipreserved fish product which, in Italy, is usually marketed at ambient
temperature and for which a best before date of 18 months is recommended.
MATERIALS AND METHODS
A proper amount of anchovy paste was prepared according to a traditional commercial
recipe: salted ripened anchovies were separated from surface salt; after skin removal with a
saturated brine, the fish were minced and blended with ice, salt and oil using a cutter. The mixture
was then homogenised in a colloid mill. The paste obtained was divided into four aliquots, each
being blended with a suitable amount of cold water to obtain four samples (P1, P2, P3 e P4) with
different salt contents in the aqueous phase (SFA
16, 20, 23 e 26 g/100 g, respectively); the
physico-chemical features of the samples are reported in Table 1. The four samples were then filled
into 60-g aluminum tubes further divided into three aliquots and stored at 12, 22 and 30°C.
The samples to be analysed were taken monthly during a year’s storage or until badly spoiled.
The results of the physico-chemical and microbiological analyses are the average of two
determinations.
Sensory evaluation
On each sampling, the following parameters were evaluated: external appearance of the
pack, (A); odour (O) and firmness (C) of the product; presence of drip loss (E).
Physico-chemical analyses
Initial samples were analysed for :
–
humidity and ash according to the methods described by Lima dos Santos et al. (36);
–
fats, by extraction with ethyl ether using the Soxhlet apparatus, of the product mixed with
anhydrous sodium sulphate and dried;
–
proteins, by determining total nitrogen (Kjeldahl method) (37) and multiplying the value
obtained by 6.25. Distillation and titration of protein nitrogen were carried out using the mod.
2300 Kjeltec analyser (Foss Tecator);
–
sodium chloride (NaCl), according to the AOAC method (37);
–
water activity (aw ) on the homogenised sample using an Aqua-Lab apparatus (Decagon);
–
pH, by inserting a Hamilton electrode connected to a Radiometer M92 pHmeter in the
homogenised sample.
On each sampling the following determinations were performed:
–
histamine by HPLC according to the Pirazzoli and Incerti method (38);
15
16
–
proteolysis index (I.P.) obtained by calculating the percent ratio between the contents of
non-protein extractable nitrogen and total nitrogen in the product. Non-protein extractable
nitrogen content was determined according to the Bellatti et al. method (39).
Microbiological analyses
The following culture media were used :
-
Plate Count Agar (Oxoid), incubated at 30°C for 3 days for microbial aerobic mesophilic
count;
-
Mannitol Salt Agar (Oxoid), incubated at 30°C for 4 days, for Micrococcaceae detection;
-
Baird Parker (BioMérieux), incubated at 37°C for 48 hours, for staphylococci detection;
-
Staph-kit Slidex (BioMérieux) for the identification of coagulase-positive staphylococci strains;
-
Brain Heart Infusion (Oxoid) containing 24% NaCl, incubated at 30°C for 7 days for the
detection of strict halophilic bacteria.
Analyses were not performed on samples taken at month 8 of storage.
RESULTS AND DISCUSSION
The microbiological analyses performed on the four freshly prepared samples
showed that the aerobic plate count mainly consisted of micrococci and coagulasenegative staphylococci, their values ranging between 1.9×104 and 1.2×105 cfu/g, and
that strict halophilic bacteria were absent/g (results not reported).
Rodriguez-Jerez et al. (32) and Veciana-Nogués et al. (34) argue that there is no
relation between the formation of biogenic mines in salted anchovies or in anchovy
fillets packed in oil and mesophiles, psycrophiles and enterobacteria. In particular the
latter, usually described as being the major histamine-formers, are salt-sensitive;
therefore, histamine formation is due to halophilic or halotolerant microorganisms.
In the course of sampling, it was confirmed that microbial load mainly consisted
of Micrococcaceae, in accordance with what reported by other authors (17, 19, 28)
who isolated microorganisms of the species Staphylococcus, regarding them as
halotolerant and able to form histamine.
Figure 1, which reports the results of the determination of Micrococcaceae count
in the samples investigated in the course of the study, shows that bacterial growth is
affected by product salt content and storage temperature. For each sample, growth
of micrococci and stahylococci was more rapid at the highest temperature; at a
certain temperature, bacteria grew at a higher rate in the least salted sample. At 12°C
samples P1 e P2 reached AMC of 107 cfu/g (regarded as being the threshold value for
spoilage) in 4 months, whereas sample P4 showed a gradual decrease in initial AMC
during the 12 months’; the decrease already occurred after 1 month and remained
unchanged ( 103 cfu/g) until completion of the trial. Sample P3 displayed a gradual
reduction in the AMC value in 4 months; this value then increased during the following
8 months up to 106 cfu/g. At 22°C sample P1 showed an AMC >107 cfu/g already after
1 month, whereas samples P2 and P3 reached that value after 2 months. Sample P4
showed a substantial decrease in initial AMC value until the fifth month, followed by an
increase until the sixth, reaching a value of 106 cfu/g which remained unchanged until
end of storage. At 30°C AMC reached high values (>107 cfu/g) already after 1 months
in samples P1 and P2 and after 2 months in sample P3; in sample P4, instead, a
16
17
considerable and progressive decrease in AMC was observed during the first 3 months
followed by an increase up to 105 cfu/g in the following 4 months.
Results of sensory evaluation during storage (Table 2) show that onset time for the
defects considered in the various samples (tube swelling, loss of consistency, off-odour,
drip loss in the paste) is directly related to SFA content and inversely related to storage
temperature.
With regard to the influence of salt content at a certain storage temperature, for
instance 22° C, the following observations were made: tube swelling and drip
formation after 1 month in sample P1 along with loss of firmness and onset of off-odour
after 2 months; tube swelling, loss of consistency and drip formation after 2 months in
sample P2 along with onset of off-odour after 2 months; tube swelling, loss of
consistency and drip formation after 4 months in sample P3, drip formation after 4
months, loss of consistency after 8 months and tube swelling after 9 months in sample
P4. Instead, regarding the effect of the different storage temperatures on a sample, for
instance P2, it can be observed that onset time for tube swelling was 7 months at 12°C,
2 months at 22°C and 1 months at 30° C.
Samples P1, P2 and P3 stored at 22°C and all samples stored at 30°C were
rejected after 7 months’ storage because several tubes, as a result of strong proteolysis
of the paste with carbon dioxide production swelled to such an extent as to lose
tightness with resulting product outflow. Only sample P4 stored at 12°C maintained
acceptable sensory traits after 1 year’s storage. It is interesting to observe that tube
swelling is not always linked to microbial growth; for instance, sample P4 kept at 30°C
looked slightly swollen after 5 months although Micrococcaceae levels were low (~10
3
cfu/g). The defects observed can therefore be attributed to real microbial spoilage
and/or very strong proteolysis. In fact, it has been clearly ascertained that protein
breakdown submitted to salting (“ripening”) is an enzymatic process and that microorganisms play only a negligible role. In confirmation of this, in a study on ripening of
salted anchovies, Triqui and Reineccius (40) showed that the fish ripened in the
presence of antibiotics as microbial inhibitors has the same aroma profile as that of the
fish ripened in the traditional way.
A ripening of salted anchovies which is either too long or performed at
anomalous temperatures, as well as abuse times and/or temperatures during storage
of products obtained from the anchovies may cause the so-called over-ripening of the
product; an intense protein breakdown develops until onset of some or all the defects
which are the subject of the sensory evaluation performed. Over-ripening can be
analytically assessed by determining the proteolysis index (I.P.), a parameter relating to
the nitrogen fraction deriving from protein breakdown; Figure 2 shows the changes in
that index in the samples of anchovy paste investigated. The I.P. value increased more
or less rapidly in all samples during storage, reached a maximum and then remained
practically the same. The plots show the effects of product salt content and storage
temperature: at each storage temperature, proteolysis rate and intensity are inversely
related to sample salt content; for equal salt contents, increase and intensity of I.P.
values are more limited at 12°C than at the other two storage temperatures, when
samples show similar behaviours. As previously said, protein breakdown involves the
onset of several defects; the most evident of which is swelling of the tube until lack of
17
18
tightness with product outflow. Within the study the onset of the defect was observed
on reaching an I.P. value of about 80%.
Figure 3 reports the changes in histamine levels in anchovy paste samples at
different salt contents during storage at three different temperatures. The formation of
significant amounts of histamine in all samples stored at 22 e 30°C is quite evident; at
12°C, instead, histamine formed only in samples with SFA values
20 (P2) e 23 (P3)
g/100 g. Stability of sample P4 to histamine formation at 12°C depended not only on
refrigeration temperature but also on the high (SFA
26 g/100 g) salt content of paste;
higher stability also involved the microbiological, sensory and proteolytic aspects. This
was also confirmed by the higher stability of sample P4, compared to the other three,
to storage temperatures of 22 e 30°C. Instead, it is difficult to explain stability of sample
P1 (SFA
16 g/100 g) at 12°C to histamine formation since after 2 months’ storage it
had a proteolysis index >70%, after 3 months it had reached an AMC of 10 7 cfu/g and
after 5 months it showed decidedly poor sensory traits.
Rodriguez-Jerez et al. (16, 17) point out that that histamine level in a product is
significantly related to bacterial load and, in the case of processed products, quality
of raw material is of major importance. Also other authors (25, 33, 41) who investigated
into the formation of biogenic amines in salted fish, agree on this point observing that
raw material freshness degree determines the initial, and therefore also the final,
amount of amines. Brillantes et al. (41), in a work on fermented fish packed in brine,
observe that histamine formation occurs not only before salting, in raw material, but
also during fermentation, unlike what reported by Sato et al. (42), probably by action
of the histidine-decarboxylase enzyme previously formed.
As to the relation between histamine and micro-organisms, some authors point
out that the bacterial load is correlated with amine formation rate and to its final
amount in the product (28, 41, 43-45); Karnop (14) assumes that histamine increase in
anchovy fillets in oil should be expected only when bacterial load exceeds 5 log cfu/g.
The results of this study show that, as in the case of tube swelling, also histamine
production and its final level are not always correlated with the extent of bacterial
load in the product and initial amount of amine in the salted anchovies used as raw
material, in accordance with what found by Rodriguez-Jerez et al. (32) and by
Veciana-Nogués et al. (34) in a similar product (anchovy fillets in oil). In accordance
with Fujii et al. (15) and with Brillantes et al. (41), histamine formation in the salted
product seems to be more closely related to the histidine decarboxylase activity than
to bacterial load, probably by action of the enzyme formed during strage of raw
material and/or during the initial part of salting. This is also related to the effect of
acidity degree, since maximum enzyme activity would appear at pH 6,5 (46), a value
close to those of the four samples prepared (from 6.06 to 6.27).
Histamine formation is affected by salt concentration, as was observed by other
authors as well (19, 28, 43-45); in our case, however, the influence shows itself rather in
slowing down the process of histamine formation than in its quantity.
Even if refrigerated storage does not completely prevent histamine formation (34,
44, 47), temperature inhibiting effect is evident, in accordance with what reported in
several studies on products prepared from salted fish (14, 19, 25, 28, 32, 48). To prevent
histamine hazard, some authors consider refrigerated storage of semi-preserved salted
18
19
anchovies, especially fillets in oil, useful (19, 22, 32). Refrigerated storage, beside
slowing down the process of histamine formation, extends the shelf-life of salted
anchovies and their products while slowing down also deterioration of sensory traits, in
particular loss of firmness (49-51).
CONCLUSIONS
The results obtained confirm the assumption that, if the presence of histamine in
food products is always an indicator of microbial or enzymatic spoilage, its absence
does not rule it out.
All samples, with the exception of P1 and P4 kept at 12°C, show the formation of
histamine during storage; this usually occurs more rapidly and more intensely with
increasing storage temperature and decreasing salt content. Similar conclusions can
be drawn for sensory deterioration; only sample P4 stored at 12°C still had acceptable
traits after one year’s storage.
Salt concentration, storage time and temperature are therefore important
parameters which can affect the shelf-life of semi-preserved salted anchovies, in that
they allow histamine formation and product loss of firmness to be kept under control.
Histamine formation in the model systems prepared might be due to the histidinedecarboxylase activity potentially present in the salted anchovies used as raw material
and formed during their preparation and/or storage or to the action of the enzyme
originating from the microbial load of halotolerant Micrococcaceae formed in the
finished product during storage.
Since no sample exceeded the value of 200 mg/kg, laid down as acceptability
limit for histamine content in semi-preserved anchovies (a product undergoing an
enzymatic ripening treatment in brine) and that this kind of product is consumed only in
moderate amounts, severe intoxication by histamine is considered highly improbable.
Moreover, it must be observed that high histamine contents almost always relate to a
highly proteolysed product, whose sensory traits are so poor as to determine its
rejection.
Moisture contents <50 g/100 g and SFA >25 g/100 g, with a corresponding aw
<0.76, are the parameters recommended for an anchovy paste with a good shelf-life;
storage at controlled temperature and/or a shelf-life not too long would further reduce
the potential sanitary hazard for consumers.
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