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© Springer-Verlag 2001
Pathologica (2001) 93:662-667
A RT I C O L O O R I G I NA L E
F. Scarpellini · G. Marucci · M.P. Foschini
Marcatori di differenziazione mioepiteliale nelle neoplasie delle ghiandole
salivari
Myoepithelial markers in salivary gland tumors
Riassunto Molte neoplasie delle ghiandole salivari presentano una differenziazione mioepiteliale, che non è sempre di
semplice identificazione nei preparati di routine. Recentemente sono stati identificati nuovi marcatori di cellule mioepiteliali, quali calponina (CALP), caldesmone (CALD) e miosina a
catene pesanti (MCP). Scopo del presente lavoro è di indagare
se l’impiego combinato di questi tre marcatori e di actina muscolo liscio (AML) può essere utile per evidenziare la componente mioepiteliale nelle neoplasie benigne e maligne delle
ghiandole salivari. Sono stati studiati, con metodica immunocitochimica, mediante sieri anti-CALP, -CALD, -MCP e -AML,
23 casi di neoplasie delle ghiandole salivari, così suddivise:
adenoma pleomorfo (n=8), adenoma a cellule basali (n=3),
mioepitelioma a cellule plasmocitoidi (n=2), carcinoma epimioepiteliale (n=6), carcinoma adenoido-cistico (n=4). In tutti
i casi, almeno uno dei quattro marcatori studiati è risultato positivo. CALP e AML sono risultati i marcatori più frequentemente espressi. La positività era sempre localizzata nelle cellule mioepiteliali che costituivano lo strato esterno delle strutture ghiandolari e tubulari. Nelle neoplasie meno differenziate,
le colorazioni immunoistochimiche hanno evidenziato rudi-
M.P. Foschini () • G. Marucci
Anatomia Patologica, Dipartimento di Oncologia,
Università di Bologna, Ospedale Bellaria,
Via Altura 3, I-40139 Bologna, Italia
e-mail: [email protected]
Tel.: +39-051-6225523
Fax: +39-051-6225759
F. Scarpinelli
Anatomia Patologica, Ospedale Civile “Bufalini”, Cesena, Italia
mentali strutture ghiandolari. AML e CALP erano positive anche nei due casi di mioepitelioma a cellule plasmocitoidi. In
conclusione, l’impiego di più marcatori di cellula mioepiteliale è utile per evidenziare la differenziazione mioepiteliale e anche per una corretta diagnosi differenziale con altre forme neoplastiche. In particolare l’uso combinato di AML e CALP permette un approccio ottimale per l’identificazione della differenziazione mioepiteliale.
Parole chiave Mioepitelio • Actina muscolo liscio •
Calponina • Caldesmone • Miosina a catene pesanti •
Ghiandola salivare
Key words Myoepithelial cells • Smooth muscle actin •
Calponin • Caldesmon • Heavy chain myosin • Salivary gland
Introduzione
Le cellule mioepiteliali hanno caratteristiche morfofunzionali
in comune fra le cellule muscolari lisce e le cellule epiteliali.
Esse formano lo strato esterno di dotti e acini delle ghiandole
salivari, della mammella e delle ghiandole sudoripare, dove facilitano la secrezione ghiandolare e producono la membrana
basale [1]. Tali cellule solitamente hanno nucleo allungato e citoplasma chiaro per accumulo di acqua, glicogeno o lipidi.
Con le normali colorazioni routinarie con ematossilina-eosina
si riconoscono con qualche difficoltà [2], pertanto solo tecniche ultrastrutturali e immunoistochimiche hanno consentito di
evidenziare meglio e di studiare le cellule mioepiteliali.
Le cellule mioepiteliali esprimono citocheratine e filamenti contrattili. Tra i vari filamenti di citocheratine quelli
più espressi nel mioepitelio sono le citocheratine 4, 6, 13, 14
e 16 [3, 4]. La citocheratina 14, una proteina di 50 kDa, è
presente nel mioepitelio e nelle cellule basali delle ghiandole salivari, ma non negli elementi epiteliali [5, 6].
Le cellule mioepiteliali sono inoltre intensamente positive
alla marcatra con siero anti-alpha-actina muscolo liscio (AML)
F. Scarpellini et al.: Marcatori mioepiteliali
663
[6, 7]. Tuttavia, anche i miofibroblasti possono esprimere AML
[8], rendendo così difficoltoso identificare correttamente le
cellule mioepiteliali nelle sezioni colorate con AML.
Si sono cercati anche altri marcatori delle cellule mioepiteliali, quali la proteina S100 e la proteina acida gliofibrillare (GFAP). La proteina S100, viene considerata un marcatore tipico delle cellule mioepiteliali [9]. La GFAP non è una
proteina specifica del mioepitelio, in quanto è presente negli elementi epiteliali sia acinari che duttali [10].
Recentemente, sono state riconosciute due proteine che
regolano la contrazione del muscolo liscio, la calponina
(CALP) e il caldesmone (CALD) e una componente strutturale dei filamenti spessi dell’apparato contrattile del muscolo liscio: la miosina a catene pesanti (MCP). Queste ultime
proteine sono presenti nelle cellule mioepiteliali normali
[11] e sono utili per differenziare le cellule mioepiteliali dalle cellule epiteliali [12] e dai miofibroblasti che talora circondano le strutture ghiandolari [8].
Tuttavia, malgrado l’ausilio di questi anticorpi, l’identificazione del mioepitelio resta talora problematica, soprattutto nelle neoplasie dove, in alcuni casi, la differenziazione
mioepiteliale è apprezzabile solo all’esame ultrastrutturale.
Scopo del presente lavoro è studiare neoplasie delle
ghiandole salivari a componente mioepiteliale mediante anticorpi anti-CALP, -CALD, -MCP e -AML per capire se queste colorazioni possano essere d’ausilio diagnostico.
chimica con il sistema avidina-biotina-perossidasi su sezioni
precedentemente trattate con poli-l-lysine (Sigma p-1524) [13].
Sono stati utilizzati i seguenti anticorpi: anti-AML, anti-CALP,
anti-CALD e anti-MCP. L’utilizzo dell’anticorpo anti-MCP ha
previsto lo smascheramento antigenico secondo la seguente metodica: le sezioni vengono poste in tampone citrato per 6 min in
pentola a pressione e quindi raffreddate in acqua corrente prima
di iniziare la metodica immunoistochimica. Un elenco degli anticorpi utilizzati, la loro provenienza, il clone e la diluizione sono riportati nella Tabella 1. In ogni caso, la parete muscolare dei
vasi è stata considerata come controllo positivo interno.
È stata eseguita una valutazione semiquantitativa del numero di cellule mioepiteliali positive, attribuendo a ciascun
caso un punteggio nel seguente modo: +++, > 75% delle cellule positive; ++, tra 75% e 25% delle cellule positive; +, <
25% delle cellule positive; +/−, rare cellule positive. Inoltre,
è stata valutata la distribuzione delle cellule positive con i
marcatori in studio.
Risultati
Sono stati studiati 23 casi così distribuiti: adenoma pleomorfo (8 casi), adenoma monomorfo (3 casi), mioepitelioma
a cellule plasmocitoidi (2 casi), carcinoma epi-mioepiteliale
(6 casi), carcinoma adenoidocistico (4 casi).
I dati clinici, riguardanti età e sesso dei pazienti e la sede della neoplasia sono riassunti nella Tabella 2; i risultati
Materiali e metodi
I casi studiati sono stati selezionati dall’archivio della
Sezione di Anatomia, Istologia e Citologia Patologica “M.
Malpighi” del Dipartimento di Oncologia dell’Ospedale
Bellaria, Università di Bologna.
I tessuti sono stati fissati in formalina tamponata e inclusi
in paraffina secondo metodica di routine. Da blocchetti selezionati sono state allestite sezioni seriate di 3 mm di spessore,
colorate con ematossilina-eosina e sottoposte ad immunoisto-
Tabella 1 Anticorpi utilizzati in immunoistochimica
Nome
M/P Ditta
Actina muscolo liscio
Calponina
Caldesmone
Miosina catene pesanti
M
M
M
M
Clone
DAKO
BIOGENEX
BIOGENEX
BIOGENEX
1A4
CALP
h-CD
SMMS-1
Diluizione
1:100
1:800
1:800
1:300
M, monoclonale; P, policlonale
Tabella 2 Dati clinici dei pazienti
Neoplasia
Sesso (n)
Età (anni)
Sede (n)
Adenoma pleomorfo
F (4) \ M (4)
27-74 (media 54)
Parotide (6)
Palato (1)
Labbro (1)
Adenoma a cellule basali
F (3)
53-76 (media 65)
Parotide (3)
Mioepitelioma
M (2)
49-53 (media 51)
Palato (1)
Parotide (1)
Carcinoma epi-mioepiteliale
F (3) \ M (3)
49-88 (media 69)
Parotide (5)
Metastasi cerebrale (1)a
Carcinoma adenoidocistico
F (1) \ M (3)
47-77 (media 54)
Palato (3)
Sottomandibolare (1)
M, maschi; F, femmine
a La neoplasia primitiva non è stata inclusa nel presente studio in quanto, essendo stata asportata presso un altro ospedale, non erano disponibili
sezioni per immunoistochimica
664
F. Scarpellini et al.: Marcatori mioepiteliali
Tabella 3 Risultati immunoistochimici ottenuti nelle neoplasie benigne
Neoplasia
No. caso
CALP
CALD
MCP
AML
1
2
3
4
5
6
7
8
+
–
+++
+
+
+
+
+
–
–
++
+
+
–
+
–
–
+
++
–
+
–
+++
+
+
+
++
+
+
+
+++
–
Adenoma a cellule basali
9
10
11
++
+++
+
–
+
+
+
++
+++
++
+++
+++
Mioepitelioma
12
13
+++
+
++
–
+
–
+++
+
Adenoma pleomorfo
CALP, calponina; CALD, caldesmone; MCP, miosina a catene pesanti; AML, actina muscolo liscio
Tabella 4 Risultati immunoistochimici ottenuti nelle neoplasie maligne
Neoplasia
No. caso
CALP
CALD
MCP
AML
Carcinoma epi-mioepiteliale
14
15
–
+
–
–
–
+
++
++
Carcinoma epi-mioepiteliale a cellule chiare
16
+
–
–
+
Carcinoma epi-mioepiteliale solido
17
+
+
++
+
18
19
+++
++
–
+
–
++
+
+++
20
21
22
23
+
+++
+
+
+
+
–
–
+
+
++
+
+++
+++
++
++
Carcinoma epi-mioepiteliale solido,
metastasi cerebrale
Carcinoma adenoidocistico
CALP, calponina; CALD, caldesmone; MCP, miosina a catene pesanti; AML, actina muscolo liscio
delle colorazioni immunoistochimiche sono riassunti nelle
Tabelle 3 e 4.
Adenoma pleomorfo (8 casi). In tre casi la neoplasia aveva aspetto classico, caratterizzato da strutture ghiandolari,
bordate da doppio stato di cellule e da cellule allungate o
stellariformi, immerse in stroma mixoide o simil-cartilagineo. In un caso, lo stroma mixoide era particolarmente abbondante; in quattro casi, si trattava di forma cellulata. La
positività immunoistochimica per i marcatori utilizzati era
prevalentemente localizzata nelle cellule che formano lo
strato esterno (non luminale) delle strutture ghiandolari (Fig.
1). I marcatori più rappresentati erano CALP e AML, presenti in 7 casi. Solo rare cellule allungate, localizzate nello
stroma mixoide sono risultate positive con CALP (2 casi),
CALD, MCP e AML (1 caso).
Adenoma a cellule basali (3 casi). Due casi presentavano aspetto tubulare, caratterizzato da strutture ghiandolari
bordate da uno strato interno di cellule a citoplasma eosinofilo che borda i lumi ghiandolari (cellule luminali) e da uno
strato di cellule esterne (cellule non luminali). Il terzo caso
presentava aspetto trabecolare, caratterizzato da cellule analoghe a quelle osservate nei due casi precedenti, ma organizzate in strutture trabecolari. AML, CALP e MCP sono risultati positivi nelle cellule non luminali, con una distribuzione e un’intensità della positività maggiore rispetto a quella vista nell’adenoma pleomorfo.
Mioepitelioma a cellule plasmocitoidi (2 casi). Entrambi
i casi erano costituiti da cellule con aspetto plasmocitoide,
caratterizzate da citoplasma ampio ed eosinofilo e nucleo
eccentrico. In un caso, sono risultati focalmente positivi al-
F. Scarpellini et al.: Marcatori mioepiteliali
665
A
Fig. 1 Adenoma pleomorfo. L’anticorpo anti-CALP è risultato positivo nelle cellule che formano lo strato esterno (non luminale)
delle strutture ghiandolari. Le cellule allungate stromali sono in
gran parte negative
cuni nidi di cellule per AML e CALP, negativi per CALD e
MCP. Nell’altro caso, tutti i marcatori studiati sono risultati
positivi, con una più marcata e diffusa espressione di AML
e CALP (Fig. 2).
B
Fig. 3 Carcinoma epi-mioepiteliale, metastasi cerebrale. La neoplasia era costituita da nidi di cellule a citoplasma chiaro. Sono presenti ampie aree di necrosi (A). L’anticorpo anti-MCP è risultato
positivo in alcune cellule neoplastiche (B)
A
B
Fig. 2 Mioepitelioma con cellule ad aspetto plasmocitoide (A).
L’anticorpo anti-CALP ha evidenziato una positività diffusa (B)
Carcinoma epi-mioepiteliale (6 casi). In due casi, la neoplasia aveva un aspetto istologico classico, caratterizzato da
strutture tubulari ben riconoscibili, circondate da uno strato
di cellule luminali a citoplasma eosinofilo e da uno strato di
cellule esterne, con citoplasma chiaro. In un caso, la neoplasia era costituita prevalentemente da ampi lembi di cellule chiare. In tre casi (uno dei quali era metastatico all’encefalo), la neoplasia era costituita da ampi lembi di cellule poligonali o fusate, a citoplasma talora chiaro e talora eosinofilo, con ampie aree di necrosi (Fig. 3). In due casi, si è osservata positività per tutti i marcatori. AML e CALP sono risultati i marcatori più frequentemente espressi (rispettivamente, in 6 e 5 casi). Nei casi nei quali la componente tubulare era ben evidente, la positività era prevalentemente localizzata alle cellule chiare che costituivano lo strato esterno dei tubuli. Nei restanti casi, la positività tendeva comunque a delineare strutture tubulari (Fig. 4).
Carcinoma adenoido-cistico (4 casi). Tutti i casi in esame avevano un’architettura prevalentemente di tipo cribriforme. All’indagine immunoistochimica, le cellule risultate positive sono quelle periferiche ai dotti e ai nidi epite-
666
Fig. 4 Carcinoma epi-mioepiteliale della ghiandola parotide.
L’anticorpo anti-CALP evidenzia rudimentali strutture tubulari
liali neoplastici. La massima espressione si è ottenuta con
AML; CALP e MCP sono risultate focalmente espresse.
CALD era presente in rare cellule in due soli casi.
In tutti i 23 casi studiati, almeno uno dei quattro marcatori
di cellula mioepiteliale era espresso. In particolare, in 22 casi
si è osservata positività per AML. Il caso negativo era positivo
con CALP. Gli stessi marcatori in nessun caso sono risultati
positivi nelle cellule luminali delle strutture ghiandolari.
Discussione
Il ruolo del mioepitelio e il suo rapporto con l’istogenesi dei
tumori misti delle ghiandole salivari è, da sempre, un argomento molto dibattuto. Già Azzopardi ipotizzava un’origine
da cellule mioepiteliali modificate [14]. Studi più recenti,
prevalentemente basati su dati ultrastrutturali, suggeriscono
che la maggior componente cellulare, negli adenomi pleomorfi, sia rappresentata da cellule mioepiteliali neoplastiche
[15-17]. Tuttavia, spesso le cellule neoplastiche mancano delle caratteristiche immunofenotipiche e ultrastrutturali delle
cellule mioepiteliali normali; pertanto, resta difficile stabilire l’origine mioepiteliale nei diversi tipi cellulari [12].
Nel presente lavoro, sono stati studiati 23 casi di neoplasie benigne e maligne delle ghiandole salivari con differenziazione mioepiteliale, mediante anticorpi anti-CALP,
-CALD, -MCP e -AML, che riconoscono filamenti contrattili, presenti sia nelle cellule muscolari lisce che nelle cellule mioepiteliali. In tutti i casi, almeno uno dei marcatori è risultato positivo. I due marcatori più frequentemente espressi sono risultati CALP e AML. In particolare, AML ha permesso di evidenziare la componente mioepiteliale in 22 casi. Nel restante caso, era positiva la CALP. Pertanto, l’uso
combinato di questi due marcatori permette un approccio ottimale sotto il profilo della sensibilità e specificità per l’identificazione della differenziazione mioepiteliale.
F. Scarpellini et al.: Marcatori mioepiteliali
Non si è riscontrata nessuna relazione tra espressione dei
diversi marcatori e benignità o malignità della lesione, oppure con il grado di differenziamento. La positività era generalmente localizzata nelle cellule che costituivano lo strato esterno (non luminale) delle strutture ghiandolari. Questa
distribuzione era particolarmente evidente negli adenomi
pleomorfi, adenomi a cellule basali, carcinoma adenoidocistico e nei casi di carcinoma epi-mioepiteliale con architettura tubulare. Nei casi di carcinoma epi-mioepiteliale costituiti da aggregati cellulari solidi, la positività con marcatori
di cellula mioepiteliale ha comunque contribuito ad evidenziare rudimentali strutture ghiandolari. Solamente nei due
casi di mioepitelioma puro la positività era diffusa e non evidenziava alcuna organizzazione architetturale.
Questi dati confermano che le neoplasie in esame presentano una differenziazione in senso mioepiteliale. Inoltre,
si precisa che si tratta di un mioepitelio modificato, che solo in parte presenta le caratteristiche fenotipiche delle cellule mioepiteliali normali.
Risultati analoghi sono stati ottenuti da Savera e coll.
[12] che hanno analizzato l’espressione di AML, CALP e
MCP su 65 adenomi pleomorfi. Nessuno degli anticorpi utilizzati ha evidenziato le cellule epiteliali dello strato luminale. AML e MCP erano essenzialmente limitate alle cellule localizzate alla periferia delle strutture ghiandolari.
Inoltre, una positività all’anticorpo anti-CALP è stata riscontrata anche nel 60% delle cellule stromali. Gli Autori
concludono che l’espressione di queste proteine, specifiche
della differenziazione muscolare liscia, è associata a differenziazione morfologica nel mioepitelio neoplastico.
I mioepiteliomi ad aspetto plasmocitoide delle ghiandole salivari presentano un’espressione non uniforme né costante di AML [7]. Questo ha portato alcuni Autori a dubitare della reale natura mioepiteliale di tali neoplasie [18].
Entrambi i casi qui studiati presentavano una positività per
marcatori AML e CALP. Inoltre, in uno dei due casi, tutti i
marcatori utilizzati sono risultati diffusamente positivi.
Questi dati confermano pertanto la natura mioepiteliale anche delle neoplasie ad aspetto plasmocitoide.
Evidenziare il mioepitelio neoplastico è importante, non
solo a fini speculativi, ma anche a livello diagnostico, in quanto permette una diagnosi corretta anche quando la neoplasia è
poco differenziata. Nella nostra casistica, l’utilità diagnostica
delle colorazioni immunoistochimiche, che evidenziano la
differenziazione mioepiteliale, si è riscontrata in particolare in
due casi: nel caso di metastasi cerebrale, è stato possibile confermare la compatibilità con la neoplasia parotidea asportata
circa due anni prima; nel caso di carcinoma epi-mioepiteliale
a cellule chiare, ha permesso la diagnosi differenziale con gli
altri tipi di neoplasie a cellule chiare delle ghiandole salivari.
In conclusione, i nostri risultati confermano l’espressione di AML, CALP, MCP e in misura minore di CALD, in
elementi che circondano cellule epiteliali di adenoma pleomorfo, adenoma a cellule basali, mioepitelioma, carcinoma
epi-mioepiteliale, carcinoma adenoido-cistico, confermando
F. Scarpellini et al.: Marcatori mioepiteliali
la natura mioepiteliale di tali cellule. Tra questi marcatori
AML e CALP erano più frequentemente espressi. Pertanto,
l’uso combinato di questi due marcatori permette un approccio ottimale sotto il profilo di sensibilità e specificità
per l’identificazione della differenziazione mioepiteliale.
Si suggerisce, inoltre, che l’applicazione di più marcatori può essere utile per evidenziare la differenziazione mioepiteliale e quindi nella diagnosi differenziale delle varie lesioni neoplastiche delle ghiandole salivari.
Summary Salivary gland tumors frequently present myoepithelial cell differentiation that is not always easily identified
on routinely stained sections. Recently novel markers of myoepithelium have been studied, such as calponin (CALP),
caldesmon (CALD), and smooth muscle myosin heavy chain.
These markers, together with smooth muscle actin may be
useful tools for identifying myoepithelial cells. We immunohistochemically studied a series of 23 benign and malignant
salivary gland tumors using antibodies to these four markers.
The tumors were classified as follows: pleomorphic adenoma
(n=8), basal cell adenoma (n=3), myoepithelioma with plasmacytoid cells (n=2), epithelial-myoepithelial cell carcinoma
(n=6) and adenoid cystic carcinoma (n=4). All tumors were
positive for at least one of the four markers. CALP and
smooth muscle actin were the markers more frequently expressed. Positivity was mostly located in the myoepithelial
cells that constitute the external layer of the glandular or
tubular neoplastic structures. In poorly differentiated epithelial myoepithelial carcinomas, composed of solid sheets of
neoplastic cells and sometimes of clear cells, immunohistochemical staining for myoepithelial markers evidenced rudimentary glandular structures. CALP and smooth muscle
actin were positive in the two cases of myoepithelioma with
plasmacytoid cells. In conclusion, the combined staining with
four markers helps to disclose myoepithelial cell differentiation and can be a useful tool for the correct histopathological diagnosis of salivary gland tumors. Among the four markers studied, CALP and smooth muscle actin were the most
useful to identify myoepithelial cell differentiation.
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