Yeast Traffic Light® PNA FISH

Reagenti
Yeast Traffic Light PNA FISH comprende i seguenti componenti del kit:
Yeast Traffic Light® PNA FISH®
Candida albicans + Candida parapsilosis
Candida tropicalis
Candida glabrata + Candida krusei
Kit per identificazione da coltura
C
h
X
Fixation Solution
Soluzione di fissaggio
3 ml di soluzione salina con
detergente tamponata con fosfato.
Yeast Traffic Light PNA
Yeast Traffic Light PNA
1,5 ml di sonde PNA in soluzione di
ibridazione. Contiene il 30% di
formamide.
60x Wash Solution
Soluzione di lavaggio 60x
50 ml di soluzione salina con
detergente tamponata con Tris
Mounting Medium
Soluzione di montaggio
3 ml di inibitore fotosbiancante in
glicerolo.
Precauzioni
UE: per uso diagnostico in vitro.
KT009
Esclusivamente per uso professionale da parte di personale addestrato
nelle tecniche di laboratorio e con esperienza nella microscopia a
fluorescenza.
50
Precauzioni di sicurezza
Yeast Traffic Light PNA contiene il 30% di formamide. Può essere nocivo
per i nascituri. Tenere lontano dalla portata dei bambini. Evitare
l’esposizione - Richiedere istruzioni speciali prima dell’uso. La scheda
tecnica di sicurezza è disponibile su richiesta. La formamide non è
pericolosa una volta diluita nella soluzione di lavaggio e durante la fase
di lavaggio.
Uso previsto
Yeast Traffic Light PNA FISH è un esame qualitativo e multicolore
basato sulla ibridazione dell’acido nucleico e che viene utilizzato per
l’identificazione di Candida albicans e/o Candida parapsilosis, per
l’identificazione di Candida tropicalis e per l’identificazione di Candida
glabrata e/o Candida krusei da emocolture positive. Il test non distingue
tra C. glabrata e C. krusei. Il test non distingue tra C. albicans e
C. parapsilosis.
Stabilire le precauzioni contro i rischi biologici.
UE: per uso diagnostico in vitro.
Precauzioni tecniche
I reagenti e i vetrini di controllo non devono essere utilizzati dopo le date
di scadenza riportate sulle etichette.
Non mangiare, bere, fumare, usare cosmetici, conservare o preparare
cibo nell’area di lavoro.
Smaltire i reagenti in conformità alle normative nazionali, regionali e
locali.
Riepilogo e spiegazione
I reagenti sono forniti in concentrazioni fisse. L’alterazione o la
conservazione dei reagenti in modo non conforme alle condizioni
raccomandate (descritte in “Conservazione dei componenti del kit”) può
influire sul rendimento dell’esame.
Le specie di Candida sono una delle cause principali di fungemie sia in
ambito comunitario che nosocomiale.
L’identificazione di specie di Candida nelle emocolture è normalmente
basata sull’identificazione presuntiva di lievito seguita da
un’identificazione finale dopo sottocoltura e analisi biochimica (1).
Evitare la contaminazione microbiologica dei reagenti.
Evitare la contaminazione crociata dei campioni e dei reagenti, in quanto
questo potrebbe causare risultati erronei.
Yeast Traffic Light PNA FISH è un metodo di ibridizzazione a
fluorescenza in situ (FISH, Fluorescence In Situ Hybridization) che
utilizza sonde a PNA che vanno a ibridarsi con le corrispondenti
sequenze di RNA ribosomiale specifiche di C. albicans, C. parapsilosis,
C. tropicalis, C. glabrata e C. krusei.
Non lasciare che la punta del flacone contagocce tocchi la superficie del
vetrino, in quanto ciò potrebbe provocare la contaminazione crociata del
materiale tra i vetrini o la contaminazione del reagente.
Non usare filtri diversi dal filtro a doppia banda (AC003).
Il test consente di identificare rapidamente C. albicans e/o
C. parapsilosis, C. tropicalis, e C. glabrata e/o C. krusei su vetrini per
microscopia preparati da emocolture positive.
Non usare vetrini per microscopio diversi da quelli raccomandati (AC001).
È importante che il microscopio funzioni correttamente. Assicurarsi che
la lampadina del microscopio sia regolata correttamente e che non abbia
un tempo operativo superiore a quello raccomandato dalla casa
costruttrice.
Principio della procedura
Una miscela di sonde a PNA specifiche per C. albicans, C. parapsilosis,
C. tropicalis, C. glabrata, e C. krusei marcate con fluoresceina e
rodamina viene aggiunta su un vetrino per microscopia preparato da una
coltura. L’ibridazione viene effettuata a 55°C per 30 min. L’ibridazione è
seguita da un lavaggio di post-ibridazione a 55°C per 30 min. con una
soluzione di lavaggio. Infine al vetrino viene aggiunta la soluzione di
montaggio e viene quindi esaminato mediante microscopia a
fluorescenza.
1
Procedura d’esame
Tutte le fasi avvengono a temperatura ambiente, se non diversamente
indicato.
Conservazione e preparazione dei componenti del kit
Per garantire una prestazione ottimale del kit è importante che i
componenti siano conservati e preparati secondo le istruzioni seguenti:
Prima di iniziare la procedura d’esame, preparare la soluzione di
lavaggio alla concentrazione richiesta nella vaschetta di colorazione,
aggiungere il coperchio e iniziare il preriscaldamento a bagnomaria
(55 ±1°C). Non riutilizzare la soluzione di lavaggio, ma prepararne una
nuova alla concentrazione richiesta per ogni sessione.
Conservazione
Conservare i componenti del kit a 2-8°C. Portare i componenti del kit a
temperatura ambiente prima di usarli e riportarli a 2-8°C dopo l’uso.
Preparazione della soluzione di lavaggio
Preparare la soluzione di lavaggio alla concentrazione richiesta,
aggiungendo 4 ml di soluzione di lavaggio 60x, seguiti da 240 ml di
acqua fresca deionizzata o distillata direttamente nella vaschetta di
colorazione. Conservare il concentrato rimanente a 2-8°C.
Ibridazione
 Aggiungere una goccia di Yeast Traffic Light PNA al pozzetto sul
vetrino per microscopia.
 Aggiungere il coprioggetto. Evitare le bolle d’aria.
Preparazione della soluzione di montaggio
La soluzione di montaggio dovrebbe essere lasciata a temperatura
ambiente per almeno 5 min. prima dell’uso.
 Incubare per 30 ± 5 min. a 55 ± 1°C.
Lavaggio a stringenza controllata
Raccolta e preparazione dei campioni
 Immergere il vetrino nella soluzione di lavaggio preriscaldata a 55°C e
rimuovere con attenzione il coprioggetto. Spesso il coprioggetto
scivola via agitando delicatamente il vetrino nella soluzione di
lavaggio. Talvolta il coprioggetto deve essere rimosso con le pinze.
Preparazione dei vetrini
 Seguire le istruzioni del produttore dei flaconi per emocolture per la
corretta miscelazione dei flaconi per emocolture prima della
preparazione dei vetrini.
 Incubare per 30 ± 5 min. a 55 ± 1°C.
 Lasciare asciugare il vetrino all’aria.
 Collocare una goccia di soluzione di fissaggio in un pozzetto sul
vetrino per microscopia.
Montaggio
 Trasferire 10 µl o una piccola goccia da un ago di ventilazione di
emocoltura “contrassegnata positivamente” alla soluzione di fissaggio
e miscelare delicatamente per emulsionare.
 Aggiungere una goccia di soluzione di montaggio al vetrino.
 Aggiungere il coprioggetto. Evitare le bolle d’aria.
 Fissare i vetrini riscaldandoli per 20 min. a 55-80°C o lasciandoli
asciugare e fissarli mediante metanolo o fiamma.
 Esaminare il vetrino entro 2 ore, come descritto di seguito.
Non esporre i vetrini alla luce solare diretta o ad altre sorgenti di luce, in
quanto ciò può provocare l’indebolimento della fluorescenza.
Procedura del test
Controllo della qualità
Il materiale di controllo deve essere testato secondo le linee guida o i
requisiti delle normative locali, regionali e/o nazionali o delle
organizzazioni accreditate, inclusi i controlli cresciuti in mezzi liquidi.
Materiale fornito
Yeast Traffic Light® PNA FISH®
KT009
Ogni kit contiene materiale sufficiente per 50 test. I reagenti sono forniti
pronti per l’uso, tranne dove espressamente indicato diversamente. La
data di scadenza del kit è indicata sull’etichetta della scatola esterna.
Il controllo della qualità per testare la fluorescenza deve essere eseguito
a ogni test. I risultati del CdQ dovrebbero consentire il monitoraggio delle
condizioni di test adeguate, specialmente per quanto riguarda la
stringenza dell’ibridazione e la penetrazione della parete cellulare,
poiché la metodologia PNA è concepita per ottimizzare la penetrazione
nella parete cellulare più facilmente.
Materiale necessario e disponibile da AdvanDx
Microscope Slides Vetrini per microscopio a 1 pozzetto
AC001
Coverslips Coprioggetti, 22 x 22 mm, spessore: 0,15 mm
AC002
Dual Band Filter Filtro a doppia banda
AC003
Staining Dish
AC004
Vaschetta di colorazione con coperchio e supporto per vetrino
PNA FISH Workstation
Utilizzare il vetrino di controllo AdvanDx Yeast Traffic Light (CS009)
oppure preparare dei vetrini da colture liquide di laboratorio o da ceppi di
riferimento di C. albicans o C. parapsilosis, C. glabrata o C. krusei e
C. tropicalis come controllo positivo su vetrini separati oppure mescolati
su un vetrino e altre specie di lieviti, per esempio S. cerevisiae, come
controllo negativo come descritto in precedenza alla voce “Raccolta e
preparazione dei campioni”. I vetrini possono essere conservati fino a 1
mese a temperatura ambiente. Durante l’utilizzo del vetrino di controllo
AdvanDx Yeast Traffic Light (CS009), rimuovere semplicemente il
vetrino dalla busta e seguire la procedura PNA FISH, a partire dalla fase
dell’ibridazione.
Piastra riscaldante per vetrini (55 ± 1°C) AC005
Water Bath Bagnomaria (55 ± 1°C).
AC006
Yeast Traffic Light Control Slide Vetrino di controllo Yeast Traffic Light CS009
Contiene un controllo positivo preparato da coltura liquida a base di una
miscela di C. albicans, ATCC n. 18804, C. tropicalis, ATCC n. 750 e
C. glabrata, ATCC n. 2001 e un controllo negativo preparato da coltura
liquida di S. cerevisiae, ATCC n. 18824.
Le prestazioni del controllo positivo sono state dimostrate utilizzando
C. albicans, C. glabrata e C. tropicalis presenti sullo stesso vetrino e
separatamente su singoli vetrini di controllo positivi per ciascun
organismo.
C. albicans e C. parapsilosis devono apparire in verde, C. glabrata e
C. krusei devono apparire in rosso e C. tropicalis deve apparire in giallo
in accordo con l’interpretazione dei risultati indicata di seguito.
Materiale necessario ma non fornito
 Acqua, deionizzata o distillata.
 Microscopio a fluorescenza con obiettivo in olio da 60x o 100x.
 Olio per immersione. Deve essere conforme all’obiettivo del
microscopio e non fluorescente.
2
Note procedurali
Preparazione dei vetrini
Si raccomanda di usare lo stesso tipo di fissaggio (calore, metanolo o
fiamma) utilizzato per la colorazione di Gram. Per ridurre il tempo di
determinazione, i vetrini per il PNA FISH possono essere preparati in
parallelo con i vetrini per la colorazione di Gram.
Limitazioni
I risultati falsi positivi (rosso) possono verificarsi con Nakaseomyces
delphensis, Candida bracarensis, e Candida nivariensis a causa della
somiglianza di sequenza. I risultati falsi positivi (verde) possono verificarsi
con Candida orthopsilosis, una specie descritta di recente, strettamente
correlata a C. parapsilosis, a causa della somiglianza di sequenza.
Alcuni tipi di lievito possono mostrare una fluorescenza gialla più chiara
comportante un risultato falso positivo, ad es., Candida sojae.
Controllo della temperatura
È importante che la temperatura della stazione di lavoro PNA FISH abbia
raggiunto i 55°C prima di iniziare l’ibridazione e che la soluzione di
lavaggio abbia raggiunto i 55°C prima dell’immersione dei vetrini. La
temperatura del bagnomaria deve essere controllata con un termometro,
in quanto le letture esterne della temperatura potrebbero non essere
accurate.
L’autofluorescenza falsa positiva può verificarsi in caso di uso di un filtro
standard al posto del filtro a doppia banda.
I risultati falsi negativi possono verificarsi più raramente a causa di crescita
mista o per un errore nella tecnica d’esame.
Test in parallelo mediante test PNA FISH differenti. I kit PNA FISH sono
concepiti per il test in parallelo. Soluzione di fissaggio, soluzione di
lavaggio 60x e mezzo di montaggio sono identici e possono essere
scambiati tra loro in test differenti.
Il tipo e la condizione della strumentazione usata influenzeranno l’aspetto
visivo dell’immagine ottenuta. La fluorescenza può variare a causa del tipo
di microscopio impiegato, della sorgente luminosa e del livello di rRNA
nelle cellule. Ogni laboratorio deve stabilire i propri criteri per la lettura dei
risultati, adottando controlli adeguati.
Principali sistemi di emocoltura e compatibilità dei tipi di flaconi. La
piattaforma PNA FISH è compatibile con tutti i principali sistemi di
emocoltura e tipi di flaconi, inclusi quelli forniti di carbone, resine e/o
sodio polianetolsulfonato.
L’isolamento su mezzi solidi è necessario per differenziare la crescita
mista con altri organismi e l’identificazione è necessaria per differenziare
C. albicans da C. parapsilosis e C. glabrata da C krusei.
Interpretazione dei risultati
Esaminare i vetrini con un microscopio a fluorescenza. Il vetrino per
l’emocoltura appare generalmente rossastro. L’identificazione si basa sul
colore della fluorescenza:
Il fissaggio mediante metanolo non è stato valutato in studi clinici. Tutti i
dati relativi al fissaggio mediante metanolo sono basati solamente su studi
analitici interni.
 Cellule verde vivo fluorescente in campi visivi multipli: C. albicans
e/o C. parapsilosis.
I flaconi di emocoltura Versa Trek non sono stati valutati nel corso degli
studi clinici. Tutti i dati relativi ai flaconi di emocoltura Versa Trek sono
basati solamente su studi analitici interni.
 Cellule giallo vivo fluorescente in campi visivi multipli: C. tropicalis.
 Cellule rosso vivo fluorescente in campi visivi multipli: C. glabrata
e/o C. krusei
I campioni pediatrici non sono stati analizzati estensivamente nel corso di
sperimentazioni cliniche; pertanto le prestazioni di questo esame con
campioni pediatrici non sono note.
NOTA: il presente test non distingue tra C. albicans e C.
parapsilosis OPPURE tra C. glabrata e C. krusei. Ulteriori test sono
necessari per la speciazione. Le cellule di lievito possono apparire
come gemme o pseudoife.
Il prodotto non è stato validato con campioni diversi dalle emocolture
“contrassegnate positivamente”.
Risultati previsti
Il tasso di risultati positivi previsti per C. albicans + C. parapsilosis,
C. tropicalis e C. glabrata + C. krusei da flaconi di emocoltura di lievito è di
circa il 66%, 11% e 19% rispettivamente, ma può variare a seconda che la
popolazione sia costituita da pazienti nosocomiali o istituzionali (2).
Caratteristiche prestazionali
Studi clinici
Le prestazioni di Yeast Traffic Light PNA FISH su 191 flaconi di
emocolture positive a lieviti e batteri sono state analizzate in quattro siti di
sperimentazione negli Stati Uniti e in Europa (NY, OH e Danimarca) e
sono state riassunte qui di seguito comparando i risultati a quelli ottenuti
dalla sottocoltura e dalla conseguente identificazione tramite metodi
standard (4,5). Negli studi sono stati valutati due sistemi di emocoltura a
monitoraggio continuo disponibili in commercio e i risultati hanno mostrato
un totale del 97,9% (187/191) di concordanza tra Yeast Traffic Light PNA
FISH e i metodi convenzionali.
Risoluzione dei problemi
 I risultati falsi positivi del campione e del controllo possono verificarsi
se non viene utilizzato il filtro a doppia banda (AC003) oppure in
seguito a contaminazione dei campioni.
 I risultati falsi negativi del campione o del controllo possono verificarsi
se non vengono utilizzati i vetrini per microscopio AdvanDx (AC001)
oppure se la temperatura non viene accuratamente controllata
durante l’ibridazione e il lavaggio.
Consultare le sezioni “Precauzioni” e “Limitazioni” nel foglietto illustrativo
o rivolgersi ad AdvanDx.
3
Sensibilità
C. albicans
Studio C. parapsilosis
A
B
C-1
C-2
Totale
Sensibilità
Sensibilità
C. tropicalis
100%
(16/16)
100%
(6/6)
100%
(15/15)
92,9%
(13/14)
95% CI
(82,9-100)
95% CI
(60,7-100)
95% CI
(81,9-100)
95% CI
(66,1-99,8)
100%
(14/14)
100%
(5/5)
100%
(11/11)
100%
(15/15)
95% CI
(80,7-100)
95% CI
(54,9-100)
95% CI
(76,2-100)
95% CI
(81,9-100)
100%
(16/16)
100%
(1/1)
100%
(5/5)
50%
(2/4)
95% CI
(82,9-100)
95% CI
(5,0-100)
95% CI
(54,9-100)
95% CI
(6,8-93,2)
94,7%
(18/19)
100%
(1/1)
95% CI
(74,0-99,9)
95% CI
(5,0-100)
100%
(49/49)
95% CI
(94,1-100)
--(0/0)
4. Merz, W., M. Gherna, G. Hall, D. Wilson, G. Procop, M. J.
Fiandaca, J. R. Shepard. 2007. Evaluation of Yeast Traffic Light PNA
FISH for Detection of High Prevalence Candida Species. Abstract #F027, 107th Annual Meeting of American Society for Microbiology,
Toronto, Canada.
Emocoltura
Specificità
Sistema
C. glabrata
C. krusei
100%
(95/95)a
100%
(12/12)b
98,0%
(49/50)c
91,2%
(31/34)d
95% CI
(96,9-100)
95% CI
(77,9-100)b
95% CI
(89,4-100)
95% CI
(76,3-98,1)
5. Wu, F., S. Whittier, P. Della-Latta. 2007. Tri-Color PNA FISH
Detection of Five Candida Species Directly from Positive Blood
Culture Bottles. 17th European Congress of Clinical Microbiology and
Infectious Diseases Meeting. München, Germany.
BACTEC
BacT/Alert
Definizioni
h
i
X
M
P
H
g
l
BacT/Alert
BacT/Alert
a. 95 campioni hanno compreso C. albicans (83) e C. parapsilosis (12).
b. 12 campioni hanno compreso C. tropicalis (12).
c. 50 campioni hanno compreso C. glabrata (42), C. krusei (7) e C.
dubliniensis/C.glabrata (1).
d. 34 campioni hanno compreso batteri (25) e 4 specie fungine rappresentate da
C. dubliniensis (5), Cryptococcus albidus (1), Cryptococcus neoformans (2) e
C. lusitaniae (1).
Sensibilità analitica
Il limite di rilevamento per C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata,
C. krusei e C. tropicalis è risultato corrispondere approssimativamente a
105 unità formanti colonie per ml tramite le diluizioni seriali di colture
positive. È coerente con la sensibilità analitica delle tecniche di colorazione
basate su vetrini.
Codice prodotto/numero di catalogo
Consultare le istruzioni per l’uso
Contenuto sufficiente per <n> test
Produttore
Rappresentante autorizzato
Usare entro
Codice lotto
Limiti della temperatura di conservazione
Consulenza tecnica e assistenza clienti
Specificità analitica
Yeast Traffic Light PNA FISH è stato inoltre testato in 61 ceppi di
laboratorio e di riferimento comprendenti specie di Candida e altre specie
strettamente correlate e una varietà di altri organismi frequentemente
isolati (3).
Per qualsiasi richiesta contattare AdvanDx o il proprio distributore locale:
Neomed s.r.l. – Via G. Di Vittorio, 2/a – 20017 Mazzo di Rho (Milano) –
Italia
Tel. 02 93900652 – Fax 02 93900968
e-mail : [email protected]
 Tutti (8/8) i ceppi di C. albicans e tutti (4/4) i ceppi di C. parapsilosis
sono apparsi in verde.
 Tutti (4/4) i ceppi di C. glabrata e tutti (4/4) i ceppi di C. krusei sono
apparsi in rosso.
 Tutti (2/2) i ceppi di C. tropicalis sono apparsi in giallo.
 Dei 39 ceppi rappresentanti 18 specie fungine e 13 specie batteriche,
Nakaseomyces delphensis, Candida nivariensis e Candida bracarensis
hanno avuto una reazione crociata a creare un segnale rosso, Candida
orthopsilosis ha avuto una reazione crociata a creare un segnale verde
e tutti gli altri ceppi sono risultati negativi.
Bibliografia
M
P
AdvanDx, Inc.
400 TradeCenter
Woburn, MA 01801
USA
AdvanDx A/S
Bygstubben 11
2950 Vedbæk
Danimarca
Tel.:
Fax:
Tel.:
Fax:
+1 781 376 0009
+1 781 376 0111
+45 45 16 07 99
+45 45 16 07 98
[email protected]
www.PNA-FISH.com
1. Baron, E.J. 1998. Processing and interpretation of blood cultures,
chap. 2.3. In: H.D. Isenberg (Ed.) Essential procedures for clinical
microbiology, ASM Press, Washington DC.
2. Messer SA, Jones RN, Fritsche TR. 2006. International surveillance
of Candida spp. and Aspergillus spp.: report from the SENTRY
Antimicrobial Surveillance Program (2003). J Clin Microbiol. 44:17827.
Prodotto su licenza di Boston Probes, Inc.
Il prodotto non deve essere usato per citochimica umana basata su vetrini, citogenetica
oncologica basata su ISH e citometria a flusso.
3. Stender, H., M. J. Fiandaca, J. R. Shepard. 2006. Three Color PNA
FISH for Identification of Clinically Prevalent Fungi by Fluconazole
Susceptibility Profiles. Abstract #87, 16th Annual Meeting of Focus on
Fungal Infections, Las Vegas, NV.
14 October 2011
PN2011A
L’acquisto di questo kit consente l’utilizzo dello stesso su licenza ai sensi dei seguenti numeri di
brevetto: US 5,985,563; US 5,888,733; US 6,395,474; US 6,357,163; US 5,539,082;
US 7,223,833; EP 862,650; EP 804,456
4