Sanquin Reagents

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Website: www.sanquinreagents.com
M1174 / August 2006
AGGL
PeliClass human IgG subclass kit
−
REF M1174
PeliClass
SHP
Ab
HUM
IgG1
REF M1099
PeliClass
SHP
Ab
HUM
IgG2
REF M1101
PeliClass
SHP
Ab
HUM
IgG3
REF M1103
PeliClass
SHP
Ab
HUM
IgG4
REF M1105
PeliClass
SHP
CONTROL
-
REF M1397
Kit per la determinazione delle sottoclassi di IgG umane per mezzo del test di agglutinazione (it)
it
Ab
AGGL
Anticorpi diretti contro Agglutinazione
CONTROL
HUM
Controllo
Umano
1
SHP
Pecora
Negativo
+
Positivo
it
I.
INTRODUZIONE
Le patologie emolitiche in adulti e neonati possono essere causate dalla presenza di autoanticorpi diretti contro gli eritrociti. Tali anticorpi,
legati alla membrane dei globuli rossi in vivo, possono essere rivelati con il test antiglobulina diretto (DAT). In caso di risultato positivo al
DAT, dovuto alla presenza di IgG, è importante determinare l’isotipo IgG dell’anticorpo in quanto da questo dipende il sequestro degli
eritrociti sensibilizzati. Ciò è dovuto alle differenze tra le sottoclassi di IgG nella capacità di attivare il complemento e di legarsi ai
recettori Fc sui fagociti. In generale, l’effetto emolitico delle sottoclassi IgG varia da alto a basso nel seguente ordine:
IgG3>IgG1>IgG2>IgG4.
Le malattie emolitiche dei neonati (Haemolytic disease of the new-born – HDN) e l’anemia emolitica autoimmune (auto-immune
haemolytic anaemia - AIHA) rappresentano due esempi di patologia caratterizzata da un DAT positivo. L’HDN è una malattia in cui gli
eritrociti del neonato sono distrutti da anticorpi materni diretti contro antigeni presenti sugli eritrociti del bambino. L’AIHA è una malattia
autoimmunitaria in cui sono prodotti autoanticorpi diretti contro gli eritrociti del paziente stesso.
II.
RIFERIMENTI TECNICI
Gli eritrociti sono incubati con reagenti specifici anti sottoclasse di IgG umane. Se i globuli rossi sono sensibilizzati (presentano anticorpi
IgG legati sulla loro superficie) l’antisiero anti sottoclasse di IgG umane induce l’agglutinazione delle cellule.
Sanquin ha progettato un kit di antisieri monospecifici, diretti contro le sottoclassi di IgG, che possono essere utilizzati nella tecnica di
agglutinazione in micropiastra. Introdurre diluizioni seriali di antisiero specifico anti sottoclasse di IgG nei pozzetti a V di una micropiastra.
Successivamente, aggiungere gli eritrociti (sensibilizzati). Dopo un’incubazione di una notte a 2-8°C, inclinare le micropiastre a 60°.
Valutare macroscopicamente l’agglutinazione.
III.
CONSERVAZIONE E STABILITÀ
Conservare il kit a temperature comprese tra -18 e -32°C. Non congelare e scongelare per più di tre volte. Non utilizzare il prodotto oltre
la data di scadenza.
Le condizioni di trasporto possono differire dalle condizioni di conservazione.
IV.
CONTENUTO DEL KIT
Il kit contiene tutti i componenti elencati nella prima pagina di questo foglietto illustrativo. I componenti possono essere ordinati anche
separatamente.
Tutti i flaconcini contengono 1 mL di prodotto.
V.
−
−
−
ALTRO MATERIALE RICHIESTO
Micropiastre
Tampone fosfato isotonico (PBS)
Siero fetale bovino (Fetal calf serum – FCS)
VI.
TRATTAMENTO DEI CAMPIONI DA ANALIZZARE
I campioni di sangue devono essere prelevati in condizioni asettiche con o senza l'aggiunta di anticoagulanti. In caso di rinvio dell'analisi,
la conservazione dei campioni ematici dovrà avere luogo a una temperatura di 2-8 °C.
La preparazione del campione è descritta nella metodica.
VII.
METODICA
Procedura, utilizzando micropiastre (pozzetti con fondo a V).
Per escludere la possibilità di falsi positivi indotti dalla presenza di conglutinina, si consiglia l’uso di siero normale di pecora come
controllo negativo.
1. Lavare gli eritrociti da analizzare tre volte con PBS e con questi preparare una sospensione cellulare al 0,04% in PBS.
2. Utilizzare sempre l’antisiero a tre diverse diluizioni, preferibilmente a partire da 1:10 fino a 1:2.430, in PBS contenente il 5% di FCS.
3. Aggiungere una goccia di sero anti umane.
4. Aggiungere una goccia di sospensione cellulare.
5. Miscelare bene e incubare durante la notte a 2-8°C (sigillare le piastre).
6. Inclinare le micropiastre a 60° per 10 minuti.
7. Invertire l’angolo di inclinazione delle piastre (sempre a 60°) e lasciare che le cellule si muovano per 5-10 minuti.
8. Procedere alla lettura macroscopica dell'agglutinazione.
VIII.
RISULTATI ED INTERPRETAZIONE DEI DATI
Vedere la tabella alla fine del foglietto illustrativo.
IX.
INDICAZIONI TECNICHE
a.
Immunogeno
Sottoclassi di IgG isolate da campioni di siero patologici con la tecnica di precipitazione seguita da cromatografie o altre tecniche
avanzate di purificazione.
b.
Purificazione
I reagenti di pecora anti sottoclassi di IgG umane sono resi specifici per la catena pesante della sottoclasse IgG per mezzo di
assorbimento con paraproteine isolate delle sottoclassi IgG indesiderate (1,2) e, se necessario, per mezzo di assorbimento con frazioni di
siero isolate. L’antisiero ottenuto è inattivato e assorbito con eritrociti rh positivi A, B e O e buffycoat.
Il controllo negativo è costituito dal siero di diverse pecore standardizzato per fornire un siero normale di pecora ottimale.Questo è
assorbito con eritrociti umani, leucociti e trombociti.
2
c.
−
−
−
−
Specificità
La tecnica di inibizione dell’emoagglutinazione, che utilizza come inibitori un pannello di sieri normali, sieri privi della sottoclasse IgG
e proteine isolate della sottoclasse IgG, tutti tipizzati per gli allotipi Ig, è utilizzata per dimostrare la presenza di anticorpi anti
sottoclasse e anti allotipo (3,4).
Per l’IgG1 non è stato rivelato alcun ulteriore anticorpo.
Per l’IgG2, anticorpo aggiuntivo: a-nG4m(b), posizione del determinante G4m(b): IgG4b, nG4m(b) è un isotipo di IgG2 ed un
allotipo di IgG4. Per questo motivo non è possibile trarre conclusioni sulla presenza o assenza di IgG2 se sulla cellula è presente
molto IgG4.
Per l’IgG3, anticorpo aggiuntivo: a-nG3m(b), posizione del determinante G3m(b): IgG3.
X.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
LIMITAZIONI
L’utente deve essere istruito e deve familarizzare con la procedura dell’analisi.
Non usare alcun reagente oltre la data di scadenza riportata sull'etichetta.
I reagenti di lotti differenti non sono interscambiabili.
Non miscelare residui di reagenti con il contenuto di flaconcini appena aperti.
I tappi ed i flaconcini non sono interscambiabili. Rimettere il tappo sul flaconcino corrispondente.
Conservante: NaN3 0,1% (w/v).
Lo smaltimento dei rifiuti dovrà essere eseguito nel rispetto delle normative del laboratorio.
XI.
1.
2.
3.
4.
RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI
Giessen, M. van der, et al., Immunology, 27, 655 (1974).
Goosen, P.C.M., et al., J. Immunol. Methods, 40, 339 (1981).
Engelfriet, C.P., et al., Biotest Bulletin, 1, 2-6 (1986).
Schanfield, M.S., Loghem, E. van, Human Immunoglobulin Allotypes, in Handbook of Experimental Immunology 94, Weir, D.M.
(editor), Blackwell Scientific Publ., 4th edition (1986).
Meulen, F.W. van der, et al., Brit. J. of Haematology, 46, 47 (1980).
5.
-
_
+
3