Risultati di prove di riproduzione artificiale di Garra rufa

ITTIOPATOLOGIA, 2012, 9: 73-87
SEMINARIO “GARRA DAY”
PER L’UTILIZZO CONSAPEVOLE DI GARRA RUFA (DOCTOR FISH) IN ITTIOTERAPIA E NEI CENTRI ESTETICI
TORINO, 30 MARZO 2012 – CESENATICO (FC), 20 APRILE 2012
Risultati di prove di riproduzione artificiale
di Garra rufa
Results of artificial reproduction trials
of Garra rufa
Giuseppe Bastone*, Andrea Di Biase, Oliviero Mordenti
Corso di Laurea in Acquacoltura e Igiene delle Produzioni Ittiche, Cesenatico (FC)
______________________________
RIASSUNTO - Una popolazione di Garra rufa proveniente dalla regione del Kangal in Turchia è stata indagata
al fine di identificare i principali parametri biologici, morfologici e riproduttivi della specie. Tale studio si pone
l’obiettivo di costituire uno stock di adulti da mantenere e riprodurre in cattività per una sua moltiplicazione su
grande scala al fine di fornire sul territorio nazionale, e non solo, pesci esclusivamente appartenenti alla specie in
questione da utilizzare nei trattamenti a scopo medico ed estetico.
SUMMARY - A Garra rufa population from the region of Kangal in Turkey has been investigated in order to
identify the main biological, morphological and reproductive parameters of the species. This study aims at
establishing a stock of adults to maintain and reproduce in captivity for its multiplication on a large scale in
order to provide the national territory, and beyond, only with fish of the species, to be used in medical and
aesthetic treatments.
Key words: Garra rufa; Doctor Fish; Artificial reproduction.
______________________________
* Corresponding Author: c/o Università Alma Mater Studiorum di Bologna, Corso di Laurea in Acquacoltura e
Igiene delle Produzioni Ittiche, via Doria, 5 - Cesenatico (FC); E-mail: [email protected]
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FINALITA’ DELLA RICERCA
Il crescente interesse verso i Doctor Fish e la pratica dell’ittioterapia spinge i
distributori europei ad acquistare questi pesci principalmente dai paesi asiatici.
Tuttavia, molto spesso alcune specie, come il “Chin-Chin” (Tilapia sp.), vengono
spacciate e quindi vendute come Garra rufa. Questi pesci non svolgono la stessa
azione curativa e possono risultare addirittura dannosi per la salute umana. A livello
scientifico, inoltre, esistono scarse informazioni sulla biologia (Akpinar & Aksoylar,
1988; Yalcin-Ozdilek & Ekmekci, 2006) e in particolar modo sulla riproduzione di
questa specie mantenuta in ambiente controllato (Sundarabarathy et al., 2005).
A tal proposito una popolazione di Garra rufa proveniente dalla regione del Kangal
in Turchia è stata indagata al fine di identificare i principali parametri biologici,
morfologici e riproduttivi della specie.
Tale studio si pone l’obiettivo di costituire uno stock di adulti da mantenere e
riprodurre in cattività per una sua moltiplicazione su grande scala. La
standardizzazione di tale tecnica permetterà, inoltre, di fornire sul territorio nazionale
e non solo, pesci esclusivamente appartenenti alla specie in questione da utilizzare
nei trattamenti a scopo medico ed estetico.
MATERIALI E METODI
La prova ha preso avvio nell’ottobre 2009 con l’acquisto di 200 giovanili di Garra
rufa provenienti dalla Turchia. Dopo averne accertato lo stato generale di salute, gli
esemplari sono stati sottoposti a un test di caratterizzazione genetico-molecolare
mediante moderne tecniche (loci microsatelliti e AFLP già disponibili in letteratura)
previo campionamento di tessuti che non pregiudicano la sopravvivenza dell’animale
(microcampionatura della pinna dorsale o caudale). Gli individui sono stati
genotipizzati al fine di confermare l’effettiva appartenenza alla specie oggetto di
studio (Ergene Gözükara & Cavas, 2004).
I pesci sono stati, in seguito, introdotti in un impianto a ricircolo presente all’interno
della serra ittiologica del Corso di Laurea in Acquacoltura e Igiene delle Produzioni
Ittiche di Cesenatico (FC). Dopo un periodo di ambientamento si è dato inizio al
programma alimentare che ha portato i pesci al raggiungimento della fase adulta e
della maturità sessuale in circa 8 mesi.
Scelta dei riproduttori
Una volta raggiunta la fase adulta, i soggetti di taglia maggiore sono stati raccolti per
le prove di riproduzione. Dopo essere stati anestetizzati con un bagno in
fenossietanolo (0,1 cc/l di acqua) si è proceduto al sessaggio dei soggetti.
Le femmine si distinguevano per la papilla genitale arrossata e per la conformazione
addominale più arrotondata (Figura 1), dovuta alla maggiore voluminosità delle
ovaie rispetto ai testicoli, mentre i maschi si distinguevano per una conformazione
più slanciata del corpo. Questo metodo di selezione è stato necessario in quanto i
pesci, anche se sessualmente maturi, non presentano dimorfismo sessuale.
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Dagli stock di riproduttori raccolti sono stati scartati i soggetti che non presentavano
caratteristiche idonee alla riproduzione: sono state eliminate le femmine che non
presentavano addome rigonfio e morbido mentre, per i maschi, la selezione è
avvenuta sulla base del grado di maturità dei gameti trattenendo solamente i soggetti
che risultavano “fluenti” (emissione di liquido seminale) in seguito a pressione
addominale.
Nel corso della verifica sono stati selezionati per la prova un totale di 154 pesci (56
soggetti di sesso femminile e 98 pesci di sesso maschile).
Figura 1 – Femmina con evidente conformazione addominale arrotondata.
Figure 1 - Female of Garra rufa with obvious rounded shape of abdomen.
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I riproduttori, prima della riproduzione, sono stati mantenuti suddivisi per sesso per 3
settimane e stabulati in due vasche della capacità di 200 litri ciascuna funzionante a
ciclo chiuso e dotata di sistema di filtraggio meccanico-biologico, di aerazione e di
regolazione della temperatura dell’acqua (Figura 2).
Condizionamento ambientale
Durata: 3 settimane
Temperatura: 27±1°C
Fotoperiodo: 14 h luce/10 h buio
Maschi
Femmine
Tesi G-NF
Tesi G-N2F
Tesi G-AN
Tesi G-A
Figura 2 – Schema del programma riproduttivo adottato su Garra rufa.
Figure 2 - Scheme of the reproductive program adopted about Garra rufa.
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Determinazione dei parametri biometrici
Ai pesci utilizzati per la sperimentazione è stato rilevato il parametro peso (Figura 3)
utilizzando una bilancia elettronica specifica per animali vivi con grado di precisione
± 0,01 g e la lunghezza totale mediante calibro digitale (Figura 4).
Figura 3 - Pesatura di un adulto di Garra rufa.
Figure 3 - Weighing of a Garra rufa adult.
Figura 4 - Misurazione della lunghezza di un adulto di Garra rufa.
Figure 4 - Measurement of the length of an adult of Garra rufa.
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Dal parametro peso e lunghezza è stato, inoltre, determinato l’indice di Condizione
K, espresso dalla formula:
3
Indice Condizione K = W100/LT
dove: W = peso in grammi
LT = lunghezza totale in centimetri
Tale rapporto varia a seconda della specie ittica considerata, in quanto pesci di forma
più slanciata hanno valori più bassi ma, in ogni caso, evidenzia in modo efficace la
condizione corporea del pesce esaminato e quindi il suo stato nutrizionale.
Il fattore di condizione risulta dunque influenzato da innumerevoli situazioni
ambientali e, soprattutto trofiche; esso esprime quantitativamente lo stato di
maggiore o minore benessere degli individui in relazione alla loro corposità.
Asportazione delle gonadi
Otto soggetti (4 maschi e 4 femmine) sono stati sacrificati con un bagno in overdose
di fenossietanolo (0,5 cc/l di acqua) e sottoposti a biopsia ovarica (Figura 5) per la
determinazione dell’Indice Gonado-Somatico (IGS) iniziale (100 x peso gonade/peso
Figura 5 – Soggetto di sesso femminile (sopra) e maschile (sotto) con gonadi in buono stato di maturazione.
Figure 5 – Female subject (above) and male (below) with gonads in a good state of maturation.
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totale soggetto) (Frenkel & Goren, 1997) e l’individuazione dello stato di
maturazione gonadica attraverso l’osservazione con microscopio binoculare di
campioni di tessuto ovocitario.
Il livello di maturazione è stato determinato utilizzando le indicazioni di Frenkel &
Goren (1997):
- Stadio 1: vescicola germinale in posizione centrale (oogonia)
- Stadio 2: inizio migrazione della vescicola germinale (primary oocytes)
- Stadio 3: termine migrazione vescicola germinale (secondary oocytes)
- Stadio 4: vescicola germinale in posizione periferica (mature ova).
Nell’occasione sono stati inoltre determinati:
 peso medio delle gonadi;
 numero medio di oociti/g di gonade;
 numero medio di oociti/femmina.
Predisposizione delle tesi sperimentali
Al fine di ottenere la deposizione dei gameti, tutti i soggetti sono stati portati ad un
regime ambientale che prevedeva un fotoperiodo lungo (14 ore di luce/10 ore di
buio) e una temperatura dell’acqua di 27 ± 1°C; tali condizioni sono state mantenute
per tutta la durata della prova.
Per la sperimentazione sono state eseguite quattro metodiche riproduttive ciascuna
replicata in doppio (Figura 2):
- la prima (Tesi G-NF) prevedeva il mantenimento di 28 maschi e 14
femmine (sex ratio 2:1) equamente suddivisi in 2 acquari della capacità di
150 litri caratterizzati da fondo costituito da ciottoli di fiume (2-6 cm di
diametro). I pesci sono stati mantenuti per 48 ore nelle medesime vasche, in
attesa della riproduzione naturale, dopodiché gli animali sono stati rimossi
dagli acquari;
- la seconda (Tesi G-N2F) prevedeva il mantenimento di 28 maschi e 14
femmine (sex ratio 2:1) equamente suddivisi in 2 acquari della capacità di
150 litri caratterizzati da fondo in rete metallica rialzato di 15 cm sul quale
erano posizionati ciottoli di fiume. Anche in questo caso i pesci sono stati
mantenuti in acquario per 48 ore in attesa della riproduzione naturale,
dopodiché gli animali sono stati rimossi.
L’utilizzo del doppio fondo aveva lo scopo di favorire il passaggio e di
conseguenza l’allontanamento delle uova appena deposte dai riproduttori;
- la terza (Tesi G-AN) prevedeva il mantenimento di 28 maschi e 14 femmine
(sex ratio 2:1) equamente suddivisi in 2 acquari della capacità di 150 litri
caratterizzati da fondo costituito da ciottoli di fiume. Prima della loro
immissione in vasca le femmine sono state sottoposte ad induzione ormonale
mediante trattamento con ipofisi di carpa, mantenute per 24 ore nelle
medesime vasche in attesa della riproduzione naturale, dopodiché gli animali
sono stati rimossi;
- la quarta (Tesi G-A) prevedeva il mantenimento di 14 maschi e 14 femmine
(sex ratio 1:1) mantenuti separati in 2 acquari della capacità di 150 litri
caratterizzati da assenza di fondo. Prima della loro immissione in vasca le
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femmine sono state sottoposte ad induzione ormonale mediante trattamento
con ipofisi di carpa. Al termine del periodo di latenza gli animali sono stati
sottoposti alla pratica della riproduzione artificiale mediante tecnica “a secco”
(Billard, 1995).
Le ipofisi utilizzate presentavano un peso variabile di 2-7 mg ciascuna, erano
disidratate in acetone e conservate in ambiente secco. L'estratto ipofisario per
l'iniezione è stato preparato immettendo la quantità di ipofisi prestabilita in un
piccolo omogenizzatore congiuntamente a soluzione fisiologica (Figura 6).
La sospensione così ottenuta, qualora non iniettata immediatamente, può essere
conservata in frigorifero a 4°C per molte ore (Rothbard, 1981).
La sospensione così ottenuta, qualora non iniettata immediatamente, può essere
conservata in frigorifero a 4°C per molte ore (Rothbard, 1981).
Figura 6 – Preparazione dell’estratto ipofisario.
Figure 6 - Preparation of the extract of pituitary.
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Figura 7 - Bagno in acqua contenente fenossietanolo.
Figure 7 - Water bath containing phenoxyethanol.
Figura 8 - Iniezione con estratto ipofisario.
Figure 8 - Injected with pituitary extract.
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I dosaggi ormonali utilizzati sono stati pari a 5 µg/g peso vivo; per le iniezioni sono
state utilizzate siringhe da 1 cc, utilizzate solitamente in campo umano per la
somministrazione di insulina. Al fine di ridurre l'effetto stressante di questi
trattamenti, i riproduttori, prima di essere iniettati, sono stati sottoposti ad un bagno
in acqua contenente fenossietanolo (Figura 7) alla dose di 0,1 cc/l di acqua
(Myszkowski et al., 2003).
L'iniezione è stata praticata sulla porzione superiore del muscolo dorsale nell'area
immediatamente posteriore alla pinna dorsale (Figura 8).
Lo stato di torpore dovuto all'anestesia si è risolto rapidamente una volta liberati i
pesci nelle vasche da cui erano stati prelevati e nelle quali sono rimasti fino al
momento della spremitura (Figura 9).
Figura 9 – Fase di spremitura.
Figure 9 - Squeezing phase of the Garra rufa female.
In occasione della fase di riproduzione artificiale a secco sono stati determinati i
seguenti parametri:
- periodo di latenza (ore);
- numero di femmine che hanno deposto;
- quantitativo totale di uova ottenute (g);
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- quantitativo di uova/femmina (g);
- numero medio di uova in 1 g di peso;
- numero di uova/femmina;
- diametro medio delle uova (mm);
- durata dello sviluppo embrionale (gradi/giorno).
RISULTATI E DISCUSSIONE
I parametri biometrici evidenziano un maggiore sviluppo dei soggetti di sesso
femminile rispetto a soggetti maschili di pari età: per le femmine, infatti, i valori
registrati sono risultati 7,23 ± 1,61 g di peso medio e 79,1 ± 5,8 mm di lunghezza
totale mentre, per i maschi i valori registrati sono stati rispettivamente di 4,89 ± 1,06
g e 73,4 ± 5,4 mm (Tabella 1).
Il fattore di Condizione K è risultato pienamente favorevole al parametro peso in
entrambe i sessi. I maschi, tuttavia, hanno presentato valori inferiori rispetto alle
femmine grazie alla conformazione maggiormente slanciata che favorisce il
parametro lunghezza (Tabella 1).
L’IGS delle femmine è risultato pari a 13,53±2,63 e 5,19±0,60 nei maschi (Tabella
1). Questi valori evidenziando il buono stato di maturazione gonadica dei soggetti
esaminati di entrambe i sessi e risultano pienamente in linea con una popolazione
ciprinicola in periodo riproduttivo (Billard, 1995).
Peso medio (g)
Lunghezza media (mm)
Indice K
IGS
Maschi ♂
4,89±1,06
73,4±5,4
1,22±0,11
5,19±0,60
Femmine ♀
7,23±1,61
79,1±5,8
1,44±0,13
13,53±2,63
Tabella 1 – Valori medi e deviazione standard di peso, lunghezza, indice K e Indice gonado-somatico (IGS)
nei soggetti in sperimentazione.
Table 1 - Mean values and standard deviation of weight, length, index K and gonad-somatic index (IGS)
in subjects being tested.
L’osservazione al microscopio dei campioni di tessuto gonadico ha messo in
evidenza in tutti i soggetti la presenza di 3 stadi di maturazione ovarica (Figura 10).
Sono stati individuati oociti primari (II), oociti secondari (III) ed è stata registrata la
presenza di oociti maturi (IV), indice di una buona attività gametogenetica da parte
delle femmine grazie ad un idoneo programma di condizionamento ambientale
adottato per la sperimentazione.
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La presenza contemporanea di più stadi ovocitari fa inoltre rientrare Garra rufa nelle
specie a maturazione “asincrona”. Questa caratteristica solitamente garantisce periodi
di riproduzione lunghi che possono protrarsi anche per parecchi mesi ed è tipica di
altre specie che vivono ambienti residuali e “difficili” come Aphanius fasciatus
(Mordenti et al., 2007).
Figura 10 – Immagini al microscopio di oociti con diversi stadi di maturazione.
Figure 10 - Microscope images of oocytes with different stages of maturation.
Il numero medio di oociti per grammo di gonade è risultato di 960 ± 59 (Tabella 2)
che corrisponde ad una potenzialità produttiva di circa 1.000 uova/femmina (941 ±
58), valore che risulta, in proporzione, notevolmente superiore con quanto osservato
da Billard (1995) in ciprinidi termofili di origine asiatica (carpa testa grossa ed
argento), mentre risulta inferiore rispetto a femmine di Tilapia zillii (1350 uova)
della medesima taglia (El-Sayed & Moharram, 2007).
IGS
Stadio di maturazione
Peso medio gonade (g)
N° medio oociti/g gonade
N° medio oociti/femmina
13,53±2,63
II-IV
0,98±0,25
960±59
941±58
Tabella 2 – Valori medi e deviazione standard del peso delle gonadi, dello stadio di maturazione, del numero di
oociti per grammo di gonade e per femmina.
Table 2 – Mean values and standard deviation of the weight of the gonads, of their stage of maturation, the
number of oocytes per gram of gonad and for female.
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Per quanto riguarda la riproduzione, la tesi G-NF ha fatto registrare una produzione
di larve pari a 7 e 19 soggetti, la tesi G-N2F ha portato alla produzione di 141 e 116
larve, mentre nelle tesi G-AN il numero di pesci ottenuto è stato di 16 e 6. Solamente
la tesi G-A, che prevedeva la riproduzione artificiale a secco, non ha portato alla
produzione di larve.
In termini numerici, i risultati migliori, quindi, si sono ottenuti adottando la
riproduzione naturale su doppio fondo (G-N2F) mentre non sono state registrate
differenze tra le tesi G-NF e G-AN.
La maggiore fecondità in G-N2F, può essere giustificata dall’impossibilità da parte
dei riproduttori di poter cibarsi delle uova deposte. In questo caso, infatti, le uova
appena emesse e fecondate raggiungevano istantaneamente il fondo dell’acquario
rimanendo separate dai riproduttori. Durante la sperimentazione, inoltre, è stata
verificata da parte degli operatori la forte voracità dei riproduttori G-NF e G-AN nei
confronti delle uova appena emesse.
Questo forte cannibalismo può, infine, aver mascherato l’effetto dell’induzione
ormonale e l’eventuale differenza di produttività tra le femmine non trattate (G-NF) e
quelle trattate con ipofisi di carpa (G-AN).
Per quanto riguarda la tesi G-A, i risultati del tutto negativi in termini di numero di
larve ottenute non oscurano le numerosi informazioni di carattere biologico ottenute
adottando la riproduzione artificiale.
L’assenza di larve, infatti, non è derivata dal mancato ottenimento delle uova, ma
esclusivamente dalla difficoltà che è stata registrata in occasione della fase di
fecondazione.
Il numero di femmine che hanno raggiunto l’ovulazione mediante spremitura
manuale è risultato di 12 su 14 (85,7%), garantendo una produzione totale di 11,3 g
di uova.
Peso medio femmine
Periodo di latenza (h)
Femmine che hanno deposto
Totale g uova
g uova/femmina
N° uova/g
N° uova/femmina
Diametro uova (mm)
Durata sviluppo embrionale
(gradi/giorno)
7,53±1,81
da 9 a 12
12 su 14 (85,7%)
11,3±1,12
0,94±0,09
607±89
571±84
1,05±0,1
46±9
Tabella 3 – Quadro generale della deposizione delle femmine trattate.
Table 3 – Overview of the deposition of the females treated.
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In termini numerici il quantitativo di uova ottenuto da ciascuna femmina è risultato
di 571 ± 84 (Tabella 3), valore che corrisponde a circa il 60% del potenziale
produttivo della specie.
Il diametro delle uova è risultato molto elevato rispetto alla dimensione degli animali
(1,05 ± 0,1 mm).
Dall’analisi al microscopio si è potuto, inoltre, constatare la completa assenza di
mucoproteina colloidale e/o di filamenti adesivi sul guscio, aspetto che solitamente
caratterizza la maggior parte delle uova di ciprinidi.
Attraverso l’osservazione delle uova presenti sotto il doppio fondo (Tesi G-N2F) è
stato possibile, infine, risalire alla durata dello sviluppo embrionale (46 ± 9
gradi/giorno).
CONSIDERAZIONI CONCLUSIVE
La sperimentazione ha dimostrato che gli aspetti riproduttivi del Garra rufa possono
essere controllati in ambiente artificiale. La specie ha evidenziato, infatti, una
perfetta capacità di adattamento alla cattività, dote indispensabile per un processo
produttivo di tipo acquacolturale ed una positiva risposta al programma di
condizionamento ambientale adottato che ha portato all’emissione spontanea dei
gameti di una buona parte dei pesci trattati.
La sperimentazione ha, inoltre, evidenziato come il forte cannibalismo degli animali
nei confronti delle uova emesse rischia di compromettere il risultato in termini di
numero di larve prodotte.
L’utilizzo della tecnica di riproduzione artificiale a secco, infine, ha messo in luce sia
la sensibilità della specie al trattamento ormonale adottato, sia l’elevato potenziale
riproduttivo degli animali, ma altresì, ha dimostrato l’inadeguatezza di tale metodica
nella fase di fecondazione delle uova. A tal proposito è utile evidenziare una certa
difficoltà nella manipolazione di soggetti di taglia ridotta soprattutto in fase di
raccolta dei gameti maschili.
BIBLIOGRAFIA
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