pastorextm meningitis - Bio-Rad

PASTOREXTM MENINGITIS
25 test
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61618
61717
RILEVAZIONE DEGLI ANTIGENI SOLUBILI
ED IDENTIFICAZIONE DI NEISSERIA MENINGITIDIS A, C,
Y/W135, B/E. COLI K1, HAEMOPHILUS INFLUENZAE b,
STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE, STREPTOCOCCUS B
1- VALORE CLINICO
La meningite batterica è una infezione delle meningi dovuta principalmente ai
seguenti germi: Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae,
Haemophilus influenzae tipo b, e Streptococcus grouppo B. La meningite è
una patologia molto seria, pertanto è importante diagnosticarla rapidamente,
al fine di definire un trattamento adeguato. La tecnica classica di
identificazione mediante coltura, per quanto essenziale per l’antibiogramma e
la conferma della diagnosi, risulta lenta e può dare risultati falsi negativi
qualora il campione prelevato sia stato trasportato e conservato in condizioni
inadeguate o se, prima del prelivo, sia stata iniziata la terapia antibiotica. La
ricerca, mediante tecniche immunologiche degli antigeni solubili liberati dal
germe nei liquidi biologici: liquido cefalorachidiano(C.S.F), urine, siero, nel
corso della infezione, permette di effettuare una diagnosi piu’ rapida. Gli
antigeni solubili ricercati mediante questo kit sono polisaccaridi specifici di
sierogruppi o sierotipi : Streptococcus pneumoniae (83 tipi); Haemophilus
influenzae tipo b, Neisseria meningitidis grouppo A, grouppo B/E.coli K1,
grouppo C, grouppo Y/W135, e Streptococcus grouppo B. L’antigene
polisaccaridico specifico del Meningococcus sierogruppo B presenta scarsa
antigenicità ed è sempre stato difficile ottenere anticorpi di coniglio
riproducibili specifici per questo antigene. La tecnologia degli anticorpi
monoclonali, applicata alla preparazopne di anticorpi specifici degli antigeni
polisaccaridici batterici, ha permesso di ottenere anticorpi monoclonali di topo
in grado di riconoscere in modo specifico e riproducibile l’antigene
polisaccaridico di Meningococcus sierogruppo B. Questo antigene è identico
ad un antigene polisaccaridico riscontrato in E.coli K1. Detta omologia tra
Meningococcus B e E.coli K1 permette la diagnosi delle meningite da E.coli
nei neonati, delle quali circa l’ 80 % sono causate dal ceppo K1. Bisogna
notare che sia E.coli che Streptococcus B sono i germi maggiormente
responsabili delle meningitis nei neonati e nei nati premature e che, d’altra
parte, l’infezione da meningococco è estremamente rara in questa fascia di
età.
2- PRINCIPIO
L'antigene presente nel campione testato viene identificato mediante particelle
di lattice ricoperte con anticorpi specifici. Dette particelle si agglutinano
saldamente in presenza dell'antigene omologo mentre in assenza di questo
restano in sospensione omogenea.
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3- PRESENTAZIONE
1. PASTOREXTM MENINGITIS, kit da 25 test, codice 61607, composto
da:
• Reagente 1 (R1): N. meningitidis B/E.coli K1
1 flacone da 0,40 ml di reagente al lattice rosso sensibilizzato con anticorpo
monoclonale di topo specifico per N. meningitidis gruppo B/E. coli K1.
• Reagente 2 (R2): Controllo negativo N. meningitidis B/E.coli K1
1 flacone da 0,40 ml di reagente al lattice rosso sensibilizzato con anticorpo
monoclonale di topo specifico per toxoide tetanico.
• Reagente 3 (R3): H. influenzae b
1 flacone da 0,40 ml di reagente al lattice bianco sensibilizzato con anticorpi
di coniglio specifici per H. influenzae di tipo b.
• Reagente 4 (R4): S. pneumoniae
1 flacone da 0,40 ml di reagente al lattice verde sensibilizzato con anticorpi
di coniglio specifici per S. pneumoniae.
• Reagente 5 (R5): Streptococcus B
1 flacone da 0,40 ml di reagente al lattice giallo sensibilizzato con anticorpi
di coniglio specifici per Streptococcus B.
• Reagente 6 (R6): N. meningitidis A
1 flacone da 0,40 ml di reagente al lattice blu sensibilizzato con anticorpi di
coniglio specifici per N. meningitidis di gruppo A.
• Reagente 7 (R7): N. meningitidis C
1 flacone da 0,40 ml di reagente al lattice rosso sensibilizzato con anticorpi
di coniglio specifici per N. meningitidis di gruppo C.
• Reagente 8 (R8): N. meningitidis Y/W 135
1 flacone da 0,40 ml di reagente al lattice rosa sensibilizzato con anticorpi di
coniglio specifici per N. meningitidis Y/W 135.
• Reagente 9 (R9): Controllo negativo polivalente
1 flacone da 0,40 ml di reagente al lattice viola sensibilizzato con
immunoglobuline IgG provenienti da coniglio non immunizzato.
• Reagente 10 (R10): Controllo positivo polivalente
Controllo positivo: estratto antigenico liofilizzato da ricostituire con 1 ml di
acqua sterile. Contiene gli antigeni polisaccaridi di N. meningitidis A, C, B,
Y/W 135, H. influenzae b, Streptococcus B e S. pneumoniae. Volume
sufficiente per 20 reazioni.
Tutti i reagenti contengono 0,02% di thimerosal.
I reagenti R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 contengono meno dello 0,1% di
sodio azide.
• Cartine di agglutinazione monouso.
• Stick di miscelazione monouso.
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2. TEST AL LATTICE PASTOREXTM MENINGITIS DISPONIBILI SINGOLARMENTE (25 test ciascuno):
• Test al lattice disponibile singolarmente (senza controllo)
- N. meningitidis A (R6)
- N. meningitidis C (R7)
- N. meningitidis B / E. coli K1 (R1)
- Streptococcus B (R5)
- Streptococcus pneumoniae ( R4)
- Haemophilus influenzae b (R3)
code 61608
code 61610
code 61611
code 61613
code 61614
code 61616
• Controllo PASTOREXTM Meningitis
Kit di reagenti di controllo per test al lattice disponibili singolarmente
(per 2 x 25 test)
codice 61618
- 2 flaconi con contagocce contenenti 0,40 ml di controllo negativo
polivalente (R9)
- 2 flaconi di controllo positivo polivalente liofilizzato (R10) da ricostituire
con 1 ml di acqua sterile.
- 2 flaconi con contagocce contenenti 0,40 ml di controllo negativo per
N.m.B/E.coli K1 (R2)
- cartine monouso.
- stick di miscelazione monouso.
3. Diluente PastorexTM Meningitis
1 flacone da 40ml di diluente per il trattamento dei sieri.
code 61717
4- CONSERVAZIONE
I reagenti conservati a 2-8°C e in assenza di contaminazioni si mantengono
stabili fino alla data di scadenza indicata sull'etichetta (anche dopo l'apertura).
Una volta ricostituito e in assenza di contaminazioni, il controllo positivo (R10)
rimane stabile per 1 mese a 2-8°C. Tale durata di conservazione può essere
prolungata qualora il controllo positivo venga suddiviso in aliquote e congelato
immediatamente a – 20°C. Conservare i reagenti per i test di agglutinazione al
lattice in posizione verticale.
NON CONGELARE MAI I FLACONI CONTENENTI LATTICE.
5- MATERIALE NECESSARIO NON FORNITO
•
•
•
•
•
•
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Pipetta per distribuire da 40 a 50 µl di campione.
Provetta per emolisi o Eppendorf
Incubatore a secco o bagno-maria a 100°C.
Centrifuga per provetta per emolisi o Eppendorf
Vasca disinfettante.
Acqua distillata sterile, soluzione salina sterile o diluente (codice 61717)
6- PRECAUZIONI
La qualità dei risultati dipende dalla stretta osservanza delle Buone Pratiche di
Laboratorio.
• Tutti i reagenti ed il campione devono essere usati a temperatura ambiente
tra i 18 e i 25°C.
• Non toccare con le dita le superfici di reazione delle card per i test
diagglutinazione.
• Cambiare pipetta o cono di prelievo ad ogni campione analizzato.
• Agitare i flaconi di lattice prima dell'uso.
• Asciugare l'imbuto conta-gocce del reagente al fine di ottenere gocceben
calibrate.
• Mentre si versa la goccia, il flacone di lattice deve essere tenuto inposizione
verticale.
• Cambiare bastoncino per mescolare ad ogni reazione.
• Dopo l'uso, eliminare le pipette di prelievo dei prodotti patologicinonché le
card dei test di agglutinazione e i bastoncini in unapattumiera autoclavabile
o in una vasca disinfettante.
• Ricostituire il controllo positivo con acqua distillata sterile ed
evitarequalunque contaminazione.
IGIENE E ISTRUZIONI DI SICUREZZA
Rispettare per ciascuna fase le tecniche e le precauzioni in vigore in materia di
protezione contro i pericoli microbiologici.
• Tutti i prelievi devono essere considerati potenzialmente contagiosi.
7- PROCEDURA: FCS, siero, urina
Campioni
I campioni devono essere trattati prima possibile dopo la raccolta. Se ciò non
è possibile, possono essere conservati per alcune ore a una temperatura tra
+2 e +8 °C o per un periodo più lungo a –20°C (in questo caso, conservare
solo il supernatante a –20°C dopo la centrifugazione). Evitare di congelare e
scongelare ripetutamente. Gli esami batteriologici (coltura) devono essere
eseguiti con priorità per evitare la contaminazione del campione. Il volume
minimo di campione per eseguire il test con il kit al lattice è di 0,5 ml.
A) PREPARAZIONE DEI CAMPIONI CLINICI
ATTENZIONE : Con il bagnomaria, usare provette a tenuta d’acqua per
evitare che l’acqua entri all’interno delle provette. Usare possibilmente un
incubatore a secco.
a) FCS (fluido cerebrospinale)
Sei il FCS è molto torbido o contiene cellule eritrocitarie, centrifugarlo per
5 minuti a 350 g e raccogliere il supernatante.
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• Riscaldare il campione per 3 minuti a 100°C (incubatore a secco o
bagnomaria).
• Lasciare raffreddare il campione a temperatura ambiente, poi centrifugare
per 5 minuti a 3000 g o filtrare usando un filtro da 0,45 µm.
b) SIERO
• Aggiungere 3 volumi (1,5 ml) di diluente (codice 61717) per un volume (0,5
ml) di siero.
• Riscaldare per 3 minuti a 100°C a bagnomaria o in un incubatore a secco.
• Centrifugare per 5 minuti a 3000 g.
ATTENZIONE : Non usare campioni di plasma. Le interferenze dovute ad un
sovraccarico di albumina, lipidi, emoglobina e bilirubina non sono state testate.
Si ottengono risultati migliori usando siero fresco.
c) URINA
Per aumentare la concentrazione antigenica, prima di eseguire il test il
campione può essere concentrato fino a 25 volte su una membrana Amicon
B15 (Amicon France).
• Riscaldare l’urina per 3 minuti a 100°C (incubatore a secco o bagnomaria).
• Centrifugare per 5 minuti a 3000 g o filtrare usando un filtro da 0,45 µm.
B) PROCEDURA DI TEST
• Depositare una goccia (40 - 50 µl) di surnatante del campione pretrattato in
ogni cerchio della card per il test di agglutinazione.
• Agitare delicatamente i flaconi di reagente al lattice.
• Tenendo il flacone in posizione verticale, depositare una goccia di ogni
reagente al lattice nella card monouso secondo lo schema di distribuzione
indicato: R9, R6, R7, R1 e R2 nei cerchi bianchi e R8, R3, R4 e R5 nei cerchi
neri.
• Miscelare i reagenti al lattice e il campione con un bastoncino; usarne uno
nuovo per ogni lattice.
• Roteare lentamente la card (~120 giri al minuto) per 10 minuti e osservare
l'eventuale comparsa di agglutinazione visibile a occhio nudo entro
10 minuti (l'agitatore di tipo orbitale può essere utilizzato a una velocità di
~120 giri al minuto).
8- PROCEDURA: EMOCOLTURA
Per un'identificazione presuntiva, osservare la morfologia e la colorazione di
Gram.
• Prelevare 1 - 2 ml di un'emocoltura positiva.
• Centrifugare per 5 minuti a 2.000 g.
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• Depositare una goccia (40 - 50 µl) di surnatante in ogni cerchio della card
monouso corrispondente ai reagenti al lattice da analizzare, a seconda della
colorazione di Gram.
• Agitare delicatamente i flaconi di reagente al lattice selezionati per il test.
• Tenendo il flacone in posizione verticale, depositare una goccia di ogni
reagente al lattice selezionato sul margine esterno delle gocce di
surnatante.
• Miscelare i reagenti al lattice e il campione con un bastoncino, usandone
uno nuovo per ogni lattice.
• Roteare la card a ~120 giri al minuto per 5 minuti. Durante questi 5 minuti,
osservare l'eventuale comparsa di agglutinazione.
Alcuni terreni di emocoltura possono implicare reazioni non specifiche o
problemi di leggibilità. Come controllo negativo, utilizzare un'emocoltura
inoculata con sangue sterile o un organismo diverso da quelli rilevati dal kit
PASTOREX™ Meningitis.
9- INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
REAZIONE POSITIVA
Una reazione positiva è indicata da una sottile agglutinazione, visibile ad
occhio nudo, rispetto ai controlli negativi.
L'intensità dell'agglutinazione e il momento della comparsa dipendono dalla
concentrazione di antigene presente nel campione analizzato.
L'eventuale discordanza tra un test dell'antigene positivo e una coltura
negativa può trovare spiegazione nell'assenza di batteri vitali nel campione di
coltura (trattamento antibiotico iniziato prima del prelievo del campione o
condizioni di trasporto non idonee alla sopravvivenza dei batteri fragili).
Nella maggior parte dei casi, una reazione positiva al lattice antiN. meningitidis B/E. coli K1 nei neonati o nei bambini nati prematuri indica
un'infezione da E. coli K1. Nei soggetti di età più avanzata, indica con maggiori
probabilità un'infezione da Meningococco B. La coltura del campione deve
confermare la diagnosi.
REAZIONE NEGATIVA
Sospensione omogenea, senza agglutinati.
RISULTATI NON INTERPRETABILI
Una reazione non è interpretabile se il campione si agglutina con i controlli
negativi al lattice (R2 o R9) e/o con più di un reagente al lattice nel kit. In tal
caso, si consiglia di ripetere il test con un altro campione e attendere il risultato
della coltura. (In casi particolarmente rari, un'infezione può essere dovuta a
due diverse specie batteriche).
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10- PROCEDURA: DETERMINAZIONE DEL GRUPPO DI CEPPI
BATTERICI ISOLATI SU AGAR (Colonie provenienti da una coltura
fresca e pura)
Il lattice Y/W135 non può essere utilizzato per la determinazione del
gruppo dei ceppi batterici. Per individuare questi gruppi, si consiglia di
utilizzare antisieri convenzionali (Kit Y,W135, 29E: Rif. n. 58704, 3 x 1 mL)
Per un'identificazione presuntiva prima di eseguire il test:
• Osservare la morfologia e la colorazione di Gram.
• Per i batteri Gram-negativi, eseguire il test dell'ossidasi (Positivo per
N. meningitidis, negativo per E. coli K1).
• Per i cocchi Gram-positivi eseguire un test della catalasi. (Non analizzare i
ceppi positivi alla catalasi.
I ceppi S. pneumonia e Haemophilus influenzae non incapsulati non possono
essere identificati mediante questa tecnica.
a) Determinazione del gruppo: N. meningitides (solo A, B e C),
H. influenzae, E. coli, S. pneumoniae
• Depositare una goccia di soluzione salina sterile da 30 µl in un cerchio della
card monouso.
• Campione:
- Per Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae ed Escherichia coli,
l'equivalente di un loop da 1 µl, corrispondente a un massimo di 2 - 3 colonie.
- Per Streptococcus pneumoniae, l'equivalente di un loop da 5 µl,
corrispondente a un minimo di 10 - 12 colonie.
• Emulsionare accuratamente le colonie campionate in modo da ottenere una
sospensione omogenea.
• Agitare delicatamente il flacone di reagente al lattice scelto per
l'identificazione; tenendo il flacone in posizione verticale, depositare una
goccia di questo lattice sul margine esterno della goccia di sospensione
batterica.
• Miscelare il lattice e la sospensione con un bastoncino.
• Roteare la card (~120 giri al minuto).
• Osservare l'eventuale comparsa di agglutinazione chiara entro 2 minuti.
• Confermare l'identificazione della specie mediante un metodo di test
biochimico convenzionale.
b) Determinazione del gruppo: Streptococco B (colonie ß-emolitiche)
• Sospendere 5 colonie in 2 ml di brodo di coltura Todd Hewitt.
• Incubare in bagnomaria a 37°C per 2 - 3 ore.
• Centrifugare per 5 minuti a 3.000 g.
• Depositare una goccia (40 - 50 µl) di surnatante in un cerchio della card
monouso.
58
• Agitare delicatamente il flacone di reagente al lattice; tenendo il flacone in
posizione verticale, depositare una goccia di questo lattice sul margine
esterno della goccia di surnatante.
• Miscelare il lattice e il campione con un bastoncino.
• Roteare la card (~120 giri al minuto).
• Osservare l'eventuale comparsa di agglutinazione chiara entro 1 minuto.
• Confermare l'identificazione della specie mediante un metodo di test
biochimico convenzionale.
Per un'estrazione diretta dalle colonie isolate, utilizzare il kit PASTOREX™
STREP (Codice 61721)
11- CONTROLLO DI QUALITÀ DEL TEST
I reagenti al lattice devono essere completamente omogenei dopo la
centrifugazione.
Il controllo polivalente positivo R10 viene utilizzato per verificare
l'immunoreattività di ogni lattice.
• Per eseguire questo test di controllo qualità, depositare una goccia (40 µl) di
controllo positivo (R10) in ogni cerchio della card monouso.
• Agitare delicatamente i flaconi di reagente al lattice.
• Tenendo il flacone in posizione verticale, depositare una goccia di ogni
reagente al lattice nella card monouso secondo lo schema di distribuzione
indicato: R9, R6, R7, R1 e R2 nei cerchi bianchi e R8, R3, R4 e R5 nei cerchi
neri.
• Miscelare i reagenti al lattice e il campione con un bastoncino, usandone
uno nuovo per ogni lattice.
• Roteare la card a ~120 giri al minuto per 10 minuti. Durante questi
10 minuti, osservare l'eventuale comparsa di agglutinazione visibile ad
occhio nudo (confrontare le reazioni del lattice del test con quelle dei
controlli negativi del lattice).
L'intensità di agglutinazione e la velocità di comparsa dipendono dall'avidità di
legame tra antigene e anticorpo. Per tale ragione, le reazioni osservate con
ogni lattice sono variabili. Quelle del lattice NmB/Coli K1 sono meno evidenti
rispetto alle altre.
• Una soluzione salina o il diluente (codice 61717) controlla l'assenza di
agglutinazione non specifica di ogni lattice.
Per eseguire questo test di controllo qualità, si utilizzano una soluzione
fisiologica o il diluente R11 (codice 61717) conformemente al protocollo per
il controllo positivo polivalente (cfr. procedura precedente).
• Non utilizzare i reagenti al lattice quando non si agglutinano con il controllo
positivo polivalente (R10), o quando si agglutinano in modo non specifico
con la soluzione salina o il diluente (codice 61717) (questo potrebbe essere
dovuto a condizioni di conservazione del kit non idonee o a una
contaminazione del reagente al lattice)
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12- CONTROLLO DI QUALITÀ DEL PRODUTTORE
Tutti i prodotti fabbricati e commercializzati dalla società Bio-Rad sono
sottoposti ad un sistema di assicurazione di qualità dal ricevimento delle
materie prime fino alla commercializzazione dei prodotti finiti. Ciascun lotto di
prodotto finito è soggetto a un controllo di qualità e viene messo in commercio
soltanto se risulta conforme ai criteri di approvazione. La documentazione
relativa alla produzione e al controllo di ciascun lotto è conservata presso il
produttore.
13- RENDIMENTO DEL TEST
SENSIBILITÀ
La sensibilità di ciascun reagente del kit è stata determinata mediante analisi
di:
• antigeni purificati diluiti in soluzione salina
• campioni clinici di fluido cerebrospinale documentato mediante tecniche di
analisi convenzionali (coltura, esame microscopico)
• ceppi isolati da colture su agar Mueller Hinton, agar cioccolato + agar PVS
+ 5% agar sangue di pecora.
Antigene o batterio Antigene diluito
presente nel campione
(NaCl, 9 ‰)
Concentrazione
limite rilevata
N. meningitidis A
2,5 ng/mL
N. meningitidis B
62,5 ng/mL
FCS
Numero di Numero di Numero di Numero di
campioni positivi al campioni positivi al
analizzati
lattice
analizzati
lattice
12
2,5 ng/mL
12
ND
E. coli K1
N. meningitidis C
Ceppi
3
3
22
22
10
10
1
1
16
16
-
N. meningitidis Y
5 ng/mL
ND
-
N. meningitidis W
2,5 µg/mL
ND
-
-
S. pneumoniae
95 ng/mL
22
15
15
24
Streptococcus B
20 ng/mL
1
1
15
15
H. influenzae type b
0,1 ng/mL
34
33
17
17
60
SPECIFICITÀ
La specificità di ciascun reagente è stata determinata mediante analisi di:
• FCS sterile (a) o FCS contaminato da batteri responsabili della meningite e
diversi da quelli rilevati dal test al lattice (b)
• Ceppi appartenenti a genuses Neisseria, Branhamella, Moraxella,
Acinetobacter, Kingella, Klebsiella, Streptococcus, Haemophilus testati con
reagente al lattice eterologo.
Antigene o batterio
rilevato mediante
lattice
FCS sterili (a)
FCS contaminati (b)
Ceppi (c)
Numero di Numero di Numero di Numero di Numero di Numero di
campioni negativi campioni negativi
campioni
negativi
analizzati al lattice analizzati al lattice analizzati al lattice
N. meningitidis A
52
52
50
N. m. B / E. coli K1
25
25
N. meningitidis C
52
52
56
S. pneumoniae
60
60
Streptococcus B
49
H. influenzae type b
61
50
122
122
41
40*
56
127
127
39
39
33
33
49
58
58
17
17
61
32
32
31
31
-
-
ND
FCS non selezionati
Numero di campioni
analizzati
Numero di negativi
al lattice
40
40
N. meningitidis Y/W 135
*1 ceppo di Klebsiella pneumoniae ha dato una reazione non specifica.
COLTURE DI SANGUE
Il rendimento del test MENINGITIS PASTOREXTM sono state testate su colture
di sangue. I risultati di questa valutazione sono:
• Sensibilità: 100 % (4/4 incluso 2 ceppi di S. pneumoniae e 2 ceppi di
Streptococcus B).
• Specificità: 100 % (37/37). Per i reagenti R3, R4, R5, R6, R7 e R8.
• Specificità: 98,2% (54*/55). Per il reagente R1. *Tra i 19 ceppi di
stafilococchi coagulasi-negativi testati, 1 ceppo ha dato una reazione non
specifica, risultato non confermato sul ceppo testato dalla sottocoltura su
agar a seguito di procedura di raggruppamento.
61
14- LIMITI DELLA TECNICA
• In numerosi casi, la tecnica immunologica al lattice consente una diagnosi
presuntiva del microrganismo. Tuttavia, la concentrazione antigenica nel
campione può essere al di sotto del limite inferiore di rilevamento del
reagente al lattice e generare pertanto un risultato negativo. In questo caso
può essere utile ripetere il campione successivamente.
• Questa tecnica non può sostituire la coltivazione dei batteri, che è la sola a
consentire di stabilire un risultato di sensibilità antimicrobica.
• Considerando l’ampia varietà di terreni di coltura del sangue, le prestazioni
non possono essere garantite per tutti i terreni. (Cf. 7–D).
• I dati clinici e bibliografici relativi al rilevamento degli antigeni nei sieri e
nell’urina usando reagenti al lattice sono attualmente limitati.
• Sono stati riportati alcuni esempi di batteri isolati che possiedono antigeni
simili. Deve sempre essere presa in considerazione la possibilità di reazioni
crociate (1, 4, 5).
• La diagnosi finale, come per tutte le diagnosi di laboratorio, non può essere
basata sui risultati di un singolo test, ma sull’insieme dei dati clinici e sui
risultati immunologici, citologici e biochimici.
• Il rilevamento di antigeni solubili in colture di sangue così come il raggruppamento di ceppi isolati su agar deve essere completato dall’identificazione
della specie del ceppo batterico.
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15- RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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