La regolazione trascrizionale nei procarioti

La regolazione trascrizionale nei
procarioti
• Meccanismi (es. il fago lambda)
• Basi strutturali
Controllo trascrizionale del fago batterico SPO1
4 siti di legame posti a 150 bp
Proteina IHF
NtrC è una ATPasi che stimola la formazione
di un complesso aperto, tramite
riarrangiamento conformazionale della RNA
polimerasi
MerR si lega sul lato opposto a quello della RNA
polimerasi, che può quindi a sua volta legare il promotore e
MerR
Le due regioni -35 e -10 sono
distanziate da 19 bp invece che da
15/17
PRM attiva la trascrizione del solo gene cI
Il repressore si lega ad OR2 con un’affinità
10 volte inferiore che su OR1
Il repressore è in grado di dare origine ad un meccanismo di auto-regolazione
negativa formando ottameri su OL1 ed OL2 e tetrameri su OL3
Questa regolazione permette di controllare finemente i livelli di repressore nel
profago di un lisogeno
I geni cII e cIII vengono attivati subito dopo l’infezione del fago
Trascrizione di cIII
Trascrizione di cII
La proteina cII agisce come attivatore trascrizionale agendo su un sito a monte
di PRE (Repressor Establishment) e stimolando la trascrizione di cI
Meccanismo di autoregolazione positiva
Il repressore si lega su OR1 e OR2 e attiva PRM
Struttura della proteina Cro da fago λ (62 aa)
Dominio che lega il DNA del repressore di λ (la proteina intera è di 236 aa)
Regioni di legame riconosciute da Cro e Repressore del fago 434
Dimero del repressore del fago 434
La proteina è monomerica
anche ad alte
concentrazioni, e dimerizza
solo in presenza di DNA
Struttura del complesso Repressore 434 e DNA
Notare che non ci sono
interazoni tra proteina
e DNA nella parte
centrale!
La Gln28
forma due
legami
idrogeno
con l’A
della
posizione
1
La Gln29 forma un legame idrogeno con la G della posizione 2.
In posizione 3 non ci sono legami idrogeno, ma interazioni idrofobiche tra le
catene laterali della Thr27 e della Gln29 con il metile della T
*B* 5’ T-A-T-A-C-A-A-G-A-A-A-G-T-T-T-G-T-A-C-T
*A* 3’
T-A-T-G-T-T-C-T-T-T-C-A-A-A-C-A-T-G-A-A
434 Rep legato a OR1
1OR1.pdb
OR1
Gln 29
Gln 28
434 Rep legato a OR1
Gln 29
Gln 28
434 Rep legato a OR1
*B* 5’ T-A-T-A-C-A-A-G-A-A-A-G-T-T-T-G-T-A-C-T
*A* 3’
T-A-T-G-T-T-C-T-T-T-C-A-A-A-C-A-T-G-A-A
*B* 5' TATACAAGAAAAACTGTACT 3'
*A* 3' TATGTTCTTTTTGACATGAA 5'
OR3
1PER.PDB
434 Rep legato a OR3
Gln 29
Gln 28
*B* 5' TATACAAGAAAAACTGTACT 3'
*A* 3' TATGTTCTTTTTGACATGAA 5'
434 Rep legato a OR3
Gln 29
Gln 28
434 Rep legato a OR3
*B* 5' TATACAAGAAAAACTGTACT 3'
*A* 3' TATGTTCTTTTTGACATGAA 5'
I residui 40-44
(giallo e verde)
formano una
superficie in cui
sono presenti
legami idrogeno tra
catena principale
della proteina e
scheletro del DNA
Regioni di legame riconosciute da Cro e Repressore del fago 434
Le prime tre posizioni sui
siti OR1, OR2 ed OR3 sono
identiche!!!!
Quindi il legame delle due
Gln non rappresenta una
discriminante per il
riconoscimento da parte
di Cro e del Repressore!
Tuttavia la rimozione
delle due Gln determina
l’incapacità di riconoscere
il sito di legame per
queste proteine.
Fagi mutati in queste Gln
di Cro e Repressore non
sono vitali.
Avvengono molte interazioni tra scheletro della proteina e scheletro del DNA in
seguito alla formazione del dimero.
La posizione 4
della sequenza
di
riconoscimento
diventa
determinante
La struttura cristallografica del repressore legato al sito OR3 mostra che
l’emisito di destra è strutturalmente simile (soprattutto nella posizione del
pho11) allo stesso emisito impegnato nel legame con Cro.
Il Repressore non è in grado di imporre lo stesso ripiegamento che impone
Cro!
In the absence of an inducer,
the LacR tetramer binds to DNA at
two distinct operator sites.
Binding of an inducer
disorders a region of LacR and leads
to dissociation from the DNA.
The C-terminal oligomerization
domains help stabilize the LacR
tetramer.
In addition to an
oligomerization domain, each LacR
monomer consists of core, hinge, and
headpiece domains that are all
involved in regulating interaction with
DNA.
The two core domains of the
LacR dimer share an extensive
interface stabilized by hydrophobic
interactions.
Inducer binding affects key
electrostatic interactions at the
inducer-binding site.
Inducer binding affects key
electrostatic interactions at the
inducer-binding site.
Changes at the inducer-binding site lead to changes in the electrostatic interactions
around Lys84 that span the core-core interface.
Changes at the core-core
interface upon inducer binding may
affect interactions at the hinge-core
interface via the movement of a key a
helix.
The core domains of the
uninduced LacR dimer make close
contact with the two hinge domains.
The hinge domains in
uninduced LacR bend the DNA helix
by widening the minor groove.
Hinge-DNA contacts are
nonspecific, and are not involved in
recognition of the operator.
The headpiece domains of
LacR contact the major groove of
DNA at the operator site.
The DNA-binding element in
the headpiece is a helix-turn-helix
(HTH) motif.
Interactions between side
chains in the recognition helix and
bases in the DNA account for the
specificity of the HTH motif.
The recognition helix also
forms hydrogen bonds with the
backbone of the operator DNA.
The precise arrangement of
side chains in the headpiece is
disturbed, and binding to DNA is
disrupted, when the core domains
bind an inducer.