KBBL™ Malonate Broth, Ewing Modified

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BBL Malonate Broth, Ewing Modified
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L007466 • Rev. 10 • Aprile 2015
PROCEDURE DI CONTROLLO DI QUALITÀ
I
INTRODUZIONE
Il Malonate Broth (brodo malonato), Ewing modificato è un terreno per la differenziazione di microrganismi enterici sulla base
della loro capacità di utilizzare il malonato.
II
PROCEDURA DEL TEST
1. Inoculare i campioni rappresentativi con le colture sotto elencate.
a. Con l’ausilio di un’ansa calibrata da 0,01 mL, inoculare le provette usando diluizioni 10-1 di colture di 18 – 24 h di
Trypticase Soy Broth.
b. Incubare le provette a 35 ± 2 °C con i tappi non completamente avvitati, in atmosfera aerobica.
2. Esaminare la crescita e le reazioni nelle provette dopo 18 – 24 h e 42 – 48 h.
3. Risultati attesi
Microrganismi
ATCC
Reazione
*Enterobacter aerogenes
Klebsiella pneumoniae ssp. pneumoniae
13048
33495
Reazione alcalina (colorazione blu nel terreno)
Reazione alcalina (colorazione blu nel terreno)
Salmonella enterica ssp. arizonae
13314
Reazione alcalina (colorazione blu nel terreno)
*Escherichia coli
25922
Nessuna variazione di colore (verde) o giallo (solo fermentazione
del destrosio)
*Ceppo batterico raccomandato per il controllo di qualità a cura dell’utente.
III
CONTROLLO DI QUALITÀ SUPPLEMENTARE
1. Esaminare le provette come descritto in “Deterioramento del prodotto”.
2. Eseguire un esame visivo delle provette rappresentative per garantire che l’eventuale presenza di difetti fisici non
interferisca con l’uso.
3. Determinare il pH mediante potenziometria a temperatura ambiente per verificare che rientri nel range specificato di 6,7 ± 0,2.
4. Incubare a 20 – 25 °C e a 30 – 35 °C le provette rappresentative non inoculate ed esaminarle dopo 7 giorni per verificare la
contaminazione microbica.
INFORMAZIONI SUL PRODOTTO
IV
USO PREVISTO
Il brodo malonato, Ewing modificato viene utilizzato per la differenziazione di coliformi ed altri microrganismi enterici.
V
SOMMARIO E SPIEGAZIONE
Leifson, nel 1933, ha sviluppato un terreno liquido sintetico che differenziava le specie Aerobacter (ora Enterobacter) dalle
specie Escherichia in base alla loro capacità di utilizzare il malonato.1 L’attuale formulazione di BBL è una modifica concepita
da Ewing et al. che include l'incorporazione di destrosio ed estratto di lievito.2,3
L’aggiunta di estratto di lievito, fonte di vitamine, e di una quantità di destrosio relativamente bassa, fonte di carbonio minimo
presenti nella formula modificata di Ewing, serve a stimolare la crescita di alcuni microrganismi. Di conseguenza, il terreno
favorisce la crescita di microrganismi incapaci di utilizzare il malonato o il sale di ammonio, mentre eventuali alcalinizzazioni
spontanee prodotte da tali microrganismi vengono tamponate dal sistema fosfato e contrastate dall’acido prodotto durante la
fermentazione della piccola quantità di destrosio.4 Un risultato alcalino (caratterizzato dal colore blu) in questo terreno viene
prodotto solo da microrganismi in grado di utilizzare il malonato ed il solfato di ammonio.
VI
PRINCIPI DELLA PROCEDURA
Un microrganismo in grado di utilizzare simultaneamente il malonato di sodio come fonte di carbonio ed il solfato di ammonio
come fonte di azoto, produce alcalinità dovuta alla formazione di idrossido di sodio.4
Gli alcali modificano il colore dell’indicatore blu bromotimolo nel terreno trasformandolo in blu chiaro o blu di Prussia. Il colore
del terreno rimane invariato in presenza di microrganismi incapaci di utilizzare tali sostanze. Alcuni ceppi negativi al malonato
producono un colore giallo dovuto esclusivamente alla fermentazione del destrosio, che induce un aumento dell'acidità con
conseguente variazione del colore dell’indicatore di pH che diventa giallo ad un pH di 6,0.
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1
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VII
REAGENTI
Malonate Broth, Ewing Modified
Formula approssimata* per L di acqua purificata
Estratto di lievito .............................................................1,0
Solfato di ammonio .........................................................2,0
Fosfato dipotassico .........................................................0,6
Fosfato monopotassico ...................................................0,4
Cloruro di sodio ...............................................................2,0
Malonato di sodio ............................................................3,0
Destrosio ........................................................................0,25
Blu bromotimolo ..............................................................0,025
g
g
g
g
g
g
g
g
*Compensata e/o corretta per soddisfare i criteri di performance.
Avvertenze e precauzioni: Per uso diagnostico in vitro.
Aprire con estrema cautela le provette con i tappi serrati allo scopo di evitare lesioni dovute alla rottura del vetro.
Durante tutte le procedure, adottare tecniche asettiche e seguire le precauzioni standard contro i rischi microbiologici. Dopo
l’uso, le provette preparate, i contenitori dei campioni e gli altri materiali contaminati devono essere sterilizzati in autoclave
prima dello smaltimento.
Istruzioni per la conservazione: Al ricevimento, conservare le provette al buio a 2 – 25 °C. Evitare di congelare e
surriscaldare. Aprire soltanto al momento dell’uso. Ridurre al minimo l’esposizione alla luce. I terreni in provetta conservati
come indicato sull'etichetta sino al momento dell’uso, possono essere inoculati fino alla data di scadenza e incubati per i tempi
di incubazione raccomandati. Prima dell’inoculo, attendere che il terreno si porti a temperatura ambiente.
Deterioramento del prodotto: Non usare le provette se presentano tracce di contaminazione microbica, alterazione di colore,
essiccamento o altri segni di deterioramento.
VIII RACCOLTA E TRATTAMENTO DEI CAMPIONI
I campioni idonei per coltura possono essere manipolati con varie tecniche. Per informazioni specifiche, consultare i testi
opportuni.5,6 Raccogliere i campioni prima della somministrazione di antibiotici. Predisporre una consegna tempestiva al
laboratorio.
IX
PROCEDURA
Materiale fornito: Malonate Broth, Ewing Modified
Materiali necessari ma non forniti: Terreni di coltura accessori, reagenti, microrganismi per controllo di qualità e
apparecchiature di laboratorio necessarie.
Procedura del test: Adottare tecniche asettiche.
Inoculare le provette, utilizzando un inoculo leggero, con crescita proveniente da una coltura pura di 18 – 24 h. Incubare le
provette per 24 – 48 h a 35 ± 2 °C con i tappi non completamente avvitati, in atmosfera aerobica.
Controllo di qualità a cura dell’utente: Vedere “Procedure di Controllo di qualità”.
Le procedure prescritte per il controllo di qualità devono essere effettuate in conformità alle norme vigenti o ai requisiti di
accreditazione e alla prassi di controllo di qualità in uso nel laboratorio. Per una guida alla prassi di controllo di qualità
appropriata, si consiglia di consultare le norme CLIA e la documentazione CLSI in merito.
Per determinare fotometricamente il pH dei terreni in provetta, usare un singolo elettrodo di dimensioni sufficientemente ridotte
da permetterne l’inserimento nelle provette. Posizionare la punta dell’elettrodo al di sotto della superficie del brodo.
X
RISULTATI
I generi batterici in cui la maggior parte delle specie produce una reazione alcalina positiva (da blu chiaro a blu di Prussia in
tutto il terreno) comprendono:
Enterobacter
Klebsiella
Citrobacter
I generi in cui la maggior parte delle specie produce una reazione negativa (colore invariato o giallo) comprendono:
Escherichia
Serratia
Salmonella
Morganella
Shigella
Proteus
Edwardsiella
Providencia
Yersinia
Consultare la documentazione appropriata per le reazioni attese per ogni specifica specie microbica.5-7
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XI
LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA
Ai fini dell’identificazione, i microrganismi devono essere in coltura pura. Per l’identificazione finale, è necessario eseguire test
morfologici, biochimici e/o sierologici. Per informazioni dettagliate e procedure raccomandate, consultare la documentazione
appropriata.5-7
Alcuni ceppi negativi al malonato producono un colore giallo dovuto esclusivamente alla fermentazione del destrosio, che
induce un aumento di acidità con conseguente variazione del colore dell’indicatore di pH che diventa giallo ad un pH di 6,0.8
Alcuni microrganismi positivi al malonato producono solo una leggera alcalinità. Confrontare ciascuna provetta incerta con una
provetta non inoculata di malonato.9
XII
PERFORMANCE
Prima della spedizione, vengono testate le performance di tutti i lotti di Malonate Broth, Ewing Modified. Campioni
rappresentativi del lotto vengono inoculati con 0,001 mL di coltura di 24-h in Trypticase Soy Broth di Enterobacter aerogenes
ATCC 13048, Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 33495 e Salmonella enterica ATCC 13314, per
produrre 1 x 106 UFC/provetta. Le provette vengono incubate a 35 – 37 °C con i tappi non completamente avvitati, per un
massimo di 2 giorni in atmosfera aerobica. Per E. aerogenes, K. pneumoniae e S. enterica viene osservata una reazione
positiva (variazione di colore da verde a blu), mentre non viene osservata alcuna reazione con E. coli.
XIII DISPONIBILITÀ
N. di cat.
Descrizione
221322
BD BBL Malonate Broth, Ewing Modified, Conf. da 10 provette misura K
XIV BIBLIOGRAFIA
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Leifson, E. 1933. Fermentation of sodium malonate as a means of differentiating Aerobacter and Escherichia. J. Bacteriol. 26:329-330.
Ewing, W.H., B.R. Davis, and R.W. Reavis. 1957. Phenylalanine and malonate media and their uses in enteric bacteriology. Public Health
Lab. 15:153.
Ewing, W.H. 1986. Edwards and Ewing's identification of the Enterobacteriaceae, 4th ed. Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York.
MacFaddin, J.F. 1985. Media for isolation-cultivation-identification-maintenance of medical bacteria, vol. I. Williams & Wilkins, Baltimore.
Murray, P.R., E.J. Baron, J.H. Jorgensen, M.A. Pfaller, and R.H. Yolken (ed.). 2003. Manual of clinical microbiology, 8th ed. American
Society for Microbiology, Washington, D.C.
Forbes, B.A., D.F. Sahm, and A.S. Weissfeld. 2002. Bailey & Scott's diagnostic microbiology, 11th ed. Mosby, Inc., St. Louis.
Holt, J.G., N.R. Krieg, P.H.A. Sneath, J.T. Staley, and S.T. Williams (ed.). 1994. Bergey's Manual™ of determinative bacteriology, 9th ed.
Williams & Wilkins, Baltimore.
Power, D.A. and P.J. McCuen. 1988. Manual of BBL products and laboratory procedures, 6th ed., Becton Dickinson Microbiology Systems,
Cockeysville, Md.
Becton Dickinson. 1997. Difco manual, 11th ed., Becton, Dickinson and Company, Sparks, Md.
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