package insert, afb iii staining kit, italian

AFB III Staining Kit
Materiali e reagenti necessari ma non forniti
1.
2.
3.
4.
860-027
05279437001
75
5.
USO PREVISTO
L’AFB III Staining Kit è concepito per l’uso come colorazione istologica qualitativa per la
determinazione selettiva del Mycobacterium e di altri organismi o componenti
acidoresistenti in tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina.
Questo prodotto deve essere interpretato da un patologo qualificato unitamente all’esame
istologico, alle informazioni cliniche pertinenti e ai controlli appropriati.
Il prodotto è destinato per l’uso diagnostico in vitro (IVD).
SOMMARIO E SPIEGAZIONE
L’AFB III Staining Kit è una variante della colorazione di Ziehl-Neelsen.1 Per la
colorazione rossa degli organismi e dei componenti acidoresistenti si utilizza una
soluzione di carbolfucsina. Si utilizza la controcolorazione con blu di anilina per ottenere
un fondo contrastante di colore blu.
PRINCIPIO DELLA PROCEDURA
Questo kit è stato ottimizzato per l’uso sui coloratori automatici di vetrini VENTANA
BenchMark Special Stains e NexES Special Stains. I reagenti vengono applicati al tessuto
su vetrini per microscopia e distribuiti sull’intero campione. La reazione colorante si basa
sull’applicazione di pararosanilina in fenolo e alcol, che amplifica la colorazione e dissolve
il colore per colorare tutti i componenti della sezione. Il Decolorizer, un reagente a base di
alcol acido, viene applicato per rimuovere il colore da tutti gli elementi tessutali diversi dai
componenti acidoresistenti. Si ritiene che gli organismi e i componenti che restano colorati
abbiano impermeabilità selettiva alla carbolfucsina. Possono, inoltre, avere una
componente lipidica che previene la decolorazione.2
MATERIALI E METODI
Reagenti forniti
I flaconi di reagenti vengono forniti in contenitori marcati con codici a barre da inserire nel
carosello dei reagenti del coloratore automatico di vetrini. Ciascun kit contiene reagenti
sufficienti per l’esecuzione di 75 test:
Un flacone da 22 ml di AFB Stain, contenente quantità opportune di carbolfucsina e di
fenolo.
Un flacone da 27 ml di AFB Decolorizer II, contenente il 18% di acido solforico e il 64% di
metanolo.
Un flacone da 27 ml di AFB III Blue, contenente lo 0,015% di blu di anilina e lo 0,25% di
acido acetico.
3 inserti per flacone con cannucce di aspirazione.
Ricostituzione, miscelazione, diluizione, titolazione
Non è necessaria alcuna ricostituzione, miscelazione, diluizione o titolazione. Un’ulteriore
diluizione di uno qualunque dei reagenti può portare a una qualità di colorazione
insoddisfacente. È necessario che l’utente convalidi qualunque modifica di questo genere.
I reagenti forniti in questo kit sono stati diluiti in modo ottimale per l’uso con i coloratori
automatici di vetrini BenchMark Special Stains e NexES Special Stains. Tali reagenti
possono non essere ottimali per procedure manuali oppure per l’uso con altri strumenti.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
Conservazione e manipolazione
L’AFB III Staining Kit deve essere conservato a 15-30 °C. Consultare le condizioni di
conservazione adeguate riportate sull’etichetta del flacone.
Se conservati adeguatamente, i reagenti sono stabili fino alla data di scadenza stampata
sull’etichetta del flacone. Non vi sono segni evidenti che indichino l’instabilità di questi
reagenti; pertanto è auspicabile utilizzare dei controlli assieme ai campioni da testare. Se
il tessuto di controllo positivo mostra una diminuzione della colorazione, può esservi una
certa instabilità nel reagente, quindi è necessario contattare immediatamente il
rappresentante locale per assistenza.
Prelievo dei campioni e preparazione per l’analisi
Ventana consiglia di eseguire il prelievo e la conservazione dei campioni in conformità con
le indicazioni riportate nel documento CLSI M29-T23 e di fissare il tessuto in formalina
neutra tamponata al 10%.4
1.
Tagliare le sezioni, di solito da 3 a 5 µm, e stenderle sui vetrini.
2.
I vetrini possono essere cotti sullo strumento BenchMark Special Stains, altrimenti è
possibile utilizzare un altro metodo esterno.
•
Se si decide di cuocere i vetrini con lo strumento BenchMark Special Stains,
passare al punto 3.
•
Fuori dallo strumento, cuocere i vetrini per almeno 30 minuti a circa 70 °C.
Lasciare raffreddare.
3.
Stampare le opportune etichette con codice a barre.
4.
Applicare le etichette con codice a barre all’estremità smerigliata dei vetrini prima
della sparaffinatura (fare riferimento al manuale di istruzioni dello strumento per la
corretta applicazione delle etichette).
5.
Consultare la sezione Istruzioni per l’uso del protocollo consigliato per i coloratori
automatici di vetrini BenchMark Special Stains e NexES Special Stains.
AVVERTENZE E PRECAUZIONI
1.
2.
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4.
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Tessuto di controllo
Vetrini per microscopia (caricati positivamente)
Stufa di asciugatura in grado di mantenere una temperatura di 70 °C ± 5 °C
Coloratore automatico di vetrini BenchMark Special Stains o coloratore automatico
di vetrini NexES Special Stains
Reagenti sfusi per il coloratore automatico di vetrini BenchMark Special Stains:
•
BenchMark Special Stains Deparaffinization Solution (10X)
•
BenchMark Special Stains Liquid Coverslip
•
BenchMark Special Stains Wash Solution (10X)
Reagenti sfusi per il coloratore automatico di vetrini NexES Special Stains:
•
Liquid Coverslip (Low Temperature)
•
Special Stains Wash (10X)
Xilene o altro agente di chiarificazione (per istologia)
Etanolo o alcol reagente (per istologia)
Acqua deionizzata o distillata
Montante sintetico
Coverslip
Per uso diagnostico in vitro (IVD).
Solo per uso professionale.
Consultare le autorità locali e/o statali in relazione al metodo di smaltimento
consigliato.
I materiali di origine umana devono essere considerati materiali pericolosi di origine
biologica e vanno smaltiti adottando le dovute precauzioni. Usare precauzioni
universali quando si maneggiano e si smaltiscono i campioni.
Evitare la contaminazione microbica dei reagenti. La contaminazione potrebbe
produrre risultati errati.
Questi reagenti possono provocare irritazioni. Evitare il contatto con gli occhi e con
le mucose. Se il reagente entra in contatto con tali aree, sciacquare
abbondantemente con acqua corrente. Non ingerire o inalare i reagenti.
AFB Stain è infiammabile, corrosivo e provoca ustioni. È nocivo per inalazione, a
contatto con la pelle e in caso di ingestione. Possibile rischio di effetti irreversibili.
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8.
9.
AFB Decolorizer II è infiammabile, corrosivo, tossico e irritante e viene rapidamente
assorbito attraverso la pelle. Tossico: pericolo di effetti irreversibili molto gravi in
caso di inalazione, ingestione o contatto con la pelle. Provoca gravi ustioni.
Per ulteriori informazioni sulla sicurezza, consultare la Scheda dati di sicurezza del
prodotto e la Guida ai simboli e alle frasi di rischio alla pagina www.ventana.com.
ISTRUZIONI PER L’USO
Preparazione del flacone di reagente
Prima dell’utilizzo iniziale, è necessario posizionare gli inserti con cannuccia di aspirazione
nei flaconi dei reagenti.
1.
Rimuovere il tappo di spedizione dal flacone e collocarvi l’inserto con cannuccia.
Una volta aperto il flacone, è necessario lasciarvi l’inserto con cannuccia di
aspirazione.
2.
Quando il reagente è in uso, posizionare il tappo morbido nella fessura sul supporto
del reagente.
3.
Quando il reagente non è in uso, richiudere il flacone utilizzando il tappo morbido.
Procedura di colorazione
1.
2.
3.
Caricare i reagenti e i vetrini sullo strumento.
Eseguire la fase di colorazione in conformità al protocollo consigliato (fare
riferimento alla tabella 1 o 2) e alle istruzioni del manuale.
Una volta completata la procedura, rimuovere i vetrini dallo strumento.
Protocollo consigliato
Per visualizzare, stampare o modificare i parametri per le procedure automatiche,
attenersi alla procedura descritta nel manuale di istruzioni dello strumento.
Le procedure indicate di seguito garantiscono la flessibilità necessaria a consentire
spessori e dimensioni di tessuto variabili, nonché le diverse preferenze dell’utilizzatore. Si
consiglia di eseguire delle fasi di colorazione di prova con i protocolli al fine di regolare la
colorazione in base alle preferenze dell’utente.
Nel protocollo riportato nella tabella 1, le selezioni effettuate sono necessarie per attivare
la sparaffinatura e la cottura sullo strumento BenchMark Special Stains.
Tabella 1. Protocollo di colorazione consigliato per l’AFB III Staining Kit su coloratore
automatico di vetrini BenchMark Special Stains.
Fase del protocollo
Metodo
Sparaffinatura
Selezionare la sparaffinatura per la rimozione automatica
della paraffina.
Cottura
Selezionare la temperatura e il periodo di incubazione per
attivare la cottura.
Ottimizzazione
dell’intensità della
controcolorazione
(AFB III Blue)
Selezionare un tempo di incubazione incluso tra 4 e
12 minuti:
•
•
Opzioni
Controcolorazione
Protocollo preprogrammato
Protocolli per 37 °C
Processazione consigliata post-strumento
1.
2.
Un esempio di materiale di controllo positivo è costituito da tessuto umano positivo ai
batteri acidoresistenti, fissato in formalina e incluso in paraffina.4 Il tessuto di controllo
deve provenire da autopsia o biopsia recente o da campioni chirurgici preparati o fissati il
prima possibile dopo il prelievo con la medesima procedura usata per le sezioni da
analizzare. Tali tessuti di controllo vanno usati per controllare tutte le fasi dell’analisi, dalla
preparazione del tessuto fino alla colorazione.
L’uso di una sezione di tessuto fissata o processata diversamente rispetto al metodo
usato per i campioni da analizzare fornisce un controllo per tutti i reagenti e le fasi del
metodo, ad eccezione della fissazione e processazione del tessuto. I componenti cellulari
di altri elementi del tessuto possono servire come controllo negativo.
È necessario testare il tessuto di controllo a ogni corsa.
L’AFB III Staining Kit colora i batteri acidoresistenti di rosso vivace su un fondo azzurro.
I batteri compaiono come macchie rosse a basso ingrandimento. A 100X, sotto olio,
compaiono come strutture sovrapposte a forma di bastoncello, a volte descritte in
letteratura come “Chinese sticks”. Alcuni tipi di batteri acidoresistenti possono apparire
pleomorfi, in base al tipo di organismo e al piano della sezione.
Utilizzare i controlli positivi noti esclusivamente per verificare che i tessuti trattati e i
reagenti del test funzionino in modo corretto, non come aiuto per formulare una diagnosi
specifica dei campioni del paziente.
Se i componenti del tessuto positivo non si colorano positivamente, i risultati ottenuti con i
campioni analizzati non vanno considerati validi. Se i componenti negativi del tessuto
presentano una colorazione positiva, anche i risultati ottenuti con i campioni del paziente
vanno considerati non validi.
Riferire immediatamente al rappresentante locale dell’assistenza ogni discrepanza
inspiegabile nei risultati del campione di controllo. Se i risultati del controllo della qualità
non sono conformi alle specifiche, i risultati dei pazienti sono da considerarsi non validi. In
tal caso, è necessario identificare e correggere il problema e rianalizzare i campioni del
paziente.
Limitazioni generali
1.
2.
Tabella 2. Protocollo di colorazione consigliato per l’AFB III Staining Kit (AFB III Flex)
su coloratore automatico di vetrini NexES Special Stains.
Sparaffinatura
1.
2.
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Risciacquare i vetrini due volte in alcol al 95% per rimuovere la soluzione Coverslip.
Disidratare, chiarificare e applicare Coverslip con montante permanente.
PROCEDURE DI CONTROLLO QUALITÀ
Per le istruzioni post-processazione, fare riferimento alla
sezione Processazione consigliata post-strumento.
Metodo
Usare i protocolli con numeri che iniziano con 7XX
LIMITAZIONI
4 minuti: colorazione sfondo più leggera
12 minuti: colorazione sfondo più forte
Tipo di procedura
Chiara o scura
Sparaffinare e idratare i vetrini seguendo le
procedure in vigore nel laboratorio.
Immergere i vetrini con le sezioni di tessuto nella
Special Stains Wash Solution (1X) finché non si
carica lo strumento. Si consiglia di caricare i vetrini
nello strumento entro un’ora. Se non è possibile,
lasciare i vetrini in acqua distillata o deionizzata per
un massimo di 24 ore, in frigorifero, in modo che il
tessuto non asciughi.
3.
2/3
La colorazione istologica è un processo diagnostico a più fasi che necessita di
formazione specialistica nella scelta dei reagenti appropriati, nella selezione dei
tessuti, nella fissazione, processazione, preparazione del vetrino e
nell’interpretazione dei risultati della colorazione.
La colorazione tessutale dipende dalla manipolazione e dalla processazione cui il
tessuto è soggetto prima della colorazione stessa. Eventuali differenze nella
processazione del tessuto e nelle procedure tecniche possono produrre una
variabilità significativa dei risultati, comportando la necessità di esecuzione di
regolari controlli procedurali (fare riferimento a Controllo qualità). Una
inadeguatezza nelle fasi di fissazione, congelamento, scongelamento, lavaggio,
asciugatura, riscaldamento, sezionamento o la contaminazione con altri campioni o
fluidi può produrre artefatti o falsi negativi.
L’interpretazione clinica di qualunque colorazione positiva o della sua assenza deve
essere valutata nel contesto dell’anamnesi clinica, della morfologia e di altri criteri
istopatologici. È responsabilità del patologo qualificato conoscere la modalità d’uso
dei reagenti così come le metodiche di colorazione. È necessario eseguire la
colorazione in un laboratorio certificato e autorizzato, sotto la supervisione di un
patologo responsabile della revisione dei vetrini colorati che garantisca
l’adeguatezza dei controlli positivi e negativi.
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PRESTAZIONI
1.
2.
3.
4.
Da strumento a strumento: usando l’AFB III Staining Kit, sono stati analizzati 100
vetrini di tessuto del polmone positivo all’AFB in 5 diversi strumenti BenchMark
Special Stains. I vetrini sono stati valutati per la colorazione con criteri di
superamento o fallimento. I risultati non hanno presentato differenze importanti in
termini di intensità di colorazione fra i vetrini.
Da corsa a corsa: usando l’AFB III Staining Kit sono stati analizzati 100 vetrini di
tessuto del polmone positivo all’AFB in 5 diversi strumenti BenchMark Special
Stains per un periodo di 5 giorni non consecutivi . I vetrini sono stati valutati per la
colorazione con criteri di superamento o fallimento. I risultati non hanno presentato
alcuna differenza significativa in termini di intensità di colorazione fra i vetrini.
La compatibilità con l’AFB III Staining Kit è stata testata con altri reagenti Special
Stains selezionati. Non è stata osservata alcuna interazione chimica avversa
significativa.
Da lotto a lotto: tre lotti diversi sono stati sottoposti a test su 14 tessuti positivi
all’AFB utilizzati in un confronto diretto tra la colorazione manuale e l’AFB III
Staining Kit. Sei vetrini per lotto sono stati sottoposti a test in 2 diversi strumenti
BenchMark Special Stains con l’AFB III Staining Kit. I vetrini sono stati valutati per la
colorazione con criteri di superamento o fallimento. I risultati non hanno presentato
differenze importanti in termini di intensità di colorazione o frequenza di
microrganismi fra i vetrini.
Coloratore automatico di vetrini NexES Special Stains
1.
2.
3.
4.
L’AFB III Staining Kit è stato sottoposto a test in 28 casi in un confronto diretto tra la
colorazione manuale e l’AFB III Staining Kit. Per ogni caso sono stati preparati e
sottoposti a test cinque vetrini. La colorazione dell’organismo e lo sfondo erano
superiori o pari al 90% dell’intensità di colorazione rispetto ai vetrini colorati
manualmente e ai vetrini colorati con AFB III.
La riproducibilità della colorazione con l’AFB III Staining Kit all’interno della stessa
corsa è stata determinata in 3 corse colorando 20 vetrini di un unico tessuto per
corsa. I vetrini sono stati valutati per la colorazione con criteri di superamento o
fallimento ai sensi di microrganismi e sfondo. I risultati non hanno presentato alcuna
differenza significativa in termini di intensità di colorazione fra i vetrini.
La riproducibilità fra una corsa e l’altra con l’AFB III Staining Kit è stata determinata
colorando 20 vetrini in 3 corse su 3 strumenti diversi. I vetrini sono stati valutati per
la colorazione con criteri di superamento o fallimento ai sensi di microrganismi e
controcolorazione. I risultati non hanno presentato alcuna differenza significativa in
termini di intensità di colorazione fra i vetrini.
Da lotto a lotto: tre lotti diversi sono stati sottoposti a test su 13 tessuti positivi all’AFB
utilizzati in un confronto diretto tra la colorazione manuale e l’AFB III Staining Kit. Sei
vetrini per lotto sono stati sottoposti a test in 2 strumenti NexES Special Stains con
l’AFB III Staining Kit. I vetrini sono stati valutati per la colorazione con criteri di
superamento o fallimento. I risultati non hanno presentato differenze importanti in
termini di intensità di colorazione o frequenza di microrganismi fra i vetrini.
BIBLIOGRAFIA
1.
2.
3.
4.
Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and Practice of Histotechnology. 2nd edition.
St. Louis, MO: C.V. Mosby Company; 1980:235-237.
Bancroft JD, Gamble, M. Theory and Practice of Histological Techniques. 2nd
edition. Edinburgh: Churchill-Livingston; 1982:244.
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). CLSI Web site.
http://www.clsi.org/. Accessed November 3, 2011.
Carson F, Hladik C. Histotechnology: A Self Instructional Text, 3rd edition. Hong
Kong: American Society for Clinical Pathology Press; 2009.
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BENCHMARK, NexES, VENTANA e il logo VENTANA sono marchi di fabbrica di Roche.
Tutti gli altri marchi commerciali sono di proprietà dei rispettivi titolari.
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Sandhofer Strasse 116
D-68305 Mannheim
Germany
RISOLUZIONE DEI PROBLEMI
1.
2.
3.
4.
5.
Lo spessore delle sezioni può influenzare la qualità e l’intensità della colorazione.
Se la colorazione è inadeguata, contattare il rappresentante locale dell’assistenza.
Il tessuto necrotico o autolisato può presentare una colorazione non specifica.
Se il campione di controllo positivo non si colora adeguatamente, verificare che il
vetrino abbia l’etichetta con codice a barre giusta e che questa sia applicata
correttamente. Se l’etichetta è corretta, ma non si ottiene alcuna colorazione oppure
si ottiene una colorazione inaspettata, contattare il rappresentante locale
dell’assistenza.
L’intensità e il tono della controcolorazione con blu di anilina dipendono dallo
spessore delle sezioni di tessuto. Le sezioni più sottili assumeranno una
controcolorazione più tenue.
I vetrini che presentano un artefatto che consiste in aggregati sferici con fondo
colorato non devono essere interpretati. Rivolgersi al distributore locale per
assistenza.
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