Anti-EBV VCA IgM ELISA

[IT]
Anti-EBV VCA IgM ELISA
Analisi immunoenzimatica per la determinazione in vitro
di anticorpi IgM contro l'antigene capsidico (VCA) p23/p18
del virus di Epstein-Barr (EBV) in siero o plasma.
Formato commerciale
807 018
96 test
[REF] 3
[IVD]
pacchetto test completo
Finalità d'uso
L'Anti-EBV VCA IgM ELISA è un sistema medico-diagnostico in vitro [IVD] impiegato per la determinazione di anticorpi IgM anti-antigene p23/p18 (VCA) dell'EBV. I
risultati ottenuti con questo test, unitamente ad altri dati clinici e relativi a pazienti,
ottenuti in analisi per altri anticorpi specifici per il virus Epstein-Barr, quali IgG/IgM
anti-EA, IgG anti-VCA e IgG anti-EBNA-1, agevolano la diagnosi sierologica
dell'infezione da EBV. L'infezione primaria da EBV può avere esito in mononucleosi
infettiva (IM = morbo di Pfeiffer, 1,2, 2). La malattia si verifica in modo predominante tra gli adolescenti più prossimi all'età adulta e tra gli adulti giovani. La malattia
acuta può essere caratterizzata dalla seguente sintomatologia: febbre, faringite,
tonsillite, linfoadenopatia, nausea, mal di testa, mialgia, epato-splenomegalia,
leucocitosi (2). Altri agenti infettivi patogeni, quali citomegalovirus, Toxoplasma
gondii, virus della rosolia, virus dell'epatite, virus dell'immunodeficienza umana
(HIV) possono causare sintomi simili. L'Anti-EBV VCA IgM ELISA può essere
impiegato per identificare un'infezione da EBV.
Principio
L'Anti-EBV VCA IgM ELISA è un’analisi immunoenzimatica (enzyme immuno
sorbent assay, ELISA) indiretta ad elevata sensibilità specifica per le IgM (catena
µ), impiegata per la determinazione di anticorpi specifici per l'EBV in siero o plasma
(4). Durante la prima fase di incubazione gli anticorpi IgM del campione si legano
alla [MTP]. Altri tipi di immunoglobulina saranno rimossi mediante lavaggio. Nel
corso di una seconda incubazione vengono rilevati gli anticorpi specifici anti-VCAp23-18 immobilizzati. Ciò si ottiene mediante l'aggiunta di un coniugato antigeneenzima. La proteina ricombinante (rec) p23-18 è marcata direttamente e covalentemente con perossidasi di rafano (HRP). Il coniugato legato in modo non specifico
verrà rimosso in un'ulteriore fase di lavaggio. Nella fase di incubazione finale, la
soluzione di substrato (TMB, 3,3´5,5´-tetrametilbenzidina) viene aggiunta nei
pozzetti. La reazione enzimatica viene interrotta aggiungendo acido solforico (il
colore cambia da blu a giallo) e la densità ottica (OD) viene misurata con uno
spettrofotometro a 450 nm e una lunghezza d'onda di riferimento di 615-690 nm.
Contenuto del kit
Micropiastra
1
[MTP]
12 singole strip con rispettivamente 8 pozzetti, rivestiti con
anticorpo policlonale anti-IgM umane (concentrazione:
> 0,5 µg/ml).
1,2 ml Controllo negativo IgM EBV (pronto per l'uso, umano)
[NC]
conservante: gentamicina 0,005%, streptomicina 0,05%,
penicillina V 0,05 % .
1,2 ml Controllo positivo IgM EBV (pronto per l'uso, umano)
[PC]
conservante: gentamicina 0,005%, streptomicina 0,05%,
penicillina V 0,05% .
45 ml Diluente campione (pronto per l’uso)
[DIL]
conservante: solfato di neomicina 0,01% , cloramfenicolo 0,03%
[CONJ] 15 ml Proteina di fusione p23-18 ricombinante coniugata (pronta
per l'uso)
conservante: penicillina V 0,025% , solfato di streptomicina
0,025%, proclin-300 0,2%
Tampone di lavaggio concentrato (da 500 )
6 ml
[WB]
conservante: 2-bromo-2-nitro-1,3-propandiolo 0,01%
13 ml Soluzione substrato (pronta per l’uso)
[SUB]
3,3´,5,5´soluzione di Tetrametilbenzidina (TMB) < 0,05 % in
H2O.
Vedere avvertenze e precauzioni.
Soluzione bloccante (pronta per l’uso)
15
ml
[STOP]
Acido solforico < 1 N H2SO4
Sacchetto per conservazione
1
[SB]
Sacchetto in polietilene per conservare le strip per micropiastra
residue.
Pellicole trasparenti adesive
3
[FOL]
Pellicole trasparenti adesive per sigillare i pozzetti della micropiastra durante l'incubazione.
Foglietto illustrativo
1
I
de condizioni asettiche e microbiologicamente controllate. Se il kit originale è
danneggiato informare il produttore.
Conservazione
I reagenti restano stabili fino alla data di scadenza indicata su ciascuna singola
etichetta, a condizione che gli stessi siano conservati ad una temperatura di 2-8°C.
Dopo l'apertura, i reagenti devono essere utilizzati entro 30 giorni. In caso di test
ripetuti, avere cura di conservare i reagenti subito dopo l'utilizzo, ad una temperatura di 2-8°C. La [MTP] è sigillata in un involucro di alluminio contenente essiccante e
deve essere aperta solo una volta raggiunta la temperatura ambiente. Riporre le
strip non utilizzate insieme all'essiccante nella busta con chiusura a zip e conservare come indicato a 2-8°C. Non toccare il bordo superiore o il fondo dei pozzetti con
le dita.
Preparazione dei reagenti
Diluire il tampone di lavaggio con acqua demineralizzata o deionizzata (1:501). La
soluzione tampone così preparata rimane stabile per 1 settimana, a condizione che
sia conservata a 2-8°C. Tutti gli altri componenti per il test vengono preparati in
modo da essere pronti per l'uso. Tutti i reagenti sono specifici per lotto e non
possono essere utilizzati con kit di lotti diversi. Non utilizzare reagenti di altri
produttori.
Preparazione dei campioni
È necessario utilizzare campioni di siero o di plasma freschi, privi di emolisi. Campioni di siero o plasma fortemente lipemici, itterici o microbicamente contaminati e
preparati di immunoglobuline concentrati potrebbero compromettere l'affidabilità dei
risultati del test. Evitare di congelare e scongelare ripetutamente i campioni. Se è
necessario trasportare i campioni, confezionarli conformemente alle direttive in
vigore per il trasporto di materiale infetto. Non inattivare i campioni, per evitare
reazioni aspecifiche.
Performance
Si raccomanda di attenersi strettamente al protocollo (vedere la procedura di
pipettamento).
Diluizione campione 1:21 con prediluizione in provette: Diluire [PC], [NC] e i campioni a
1:21 in una provetta (ossia 25 µl di controllo o campione + 500 µl di [DIL]). Miscelare
accuratamente.
Diluizione del campione 1:21 con diluizione direttamente nella piastra:
Distribuire 200 µl di [DIL] in ciascun pozzetto. La diluizione direttamente nella
micropiastra è consigliata soprattutto con l'utilizzo di pipettatrici automatiche. Se la
diluizione effettuata nella piastra viene eseguita manualmente, è importante evitare
legami aspecifici di proteine, attenendosi alle seguenti fasi: Pipettare prima 200 µl
di [DIL] nel pozzetto, quindi aggiungere 10 µl di campione o controlli. Miscelare da
5 a 7 volte, aggiungendo 10 µl di campione o controllo.
Procedura di pipettamento per la determinazione qualitativa delle IgM (provetta diluizione)
Consentire a tutti i reagenti di raggiungere la temperatura ambiente prima
dell'uso.
I controlli e il bianco devono essere distribuiti per ultimi. Dopo avere pipettato i
controlli e i campioni, procedere immediatamente all'incubazione della piastra.
fase 1
pozzetto [µl]
A1/B1
C1/ D1
E1/ F1
G1...
200 [DIL]
Bianco
Doppio test [NC]
--
200 [NC]
Doppio test [PC]
--
--
Campione 1:21
--
--
-200 [PC]
--
--200
Sigillare la [MTP] utilizzando le pellicole adesive (non richiesto in sistema ELISA)
Incubazione 60 ± 1 min, 37 ±
1°C
Sistema*: 60 ± 1 min, 37 ± 1 °C
Lavaggio 5 x (s. W1 )
[WB]
550
fase 2
[CONJ]
550
550
550
pozzetto [µl]
100
100
100
100
Sigillare la [MTP] utilizzando le pellicole adesive (non richiesto in sistema ELISA)
Incubazione 30 ± 1 min, 37 ±
1°C
Sistema*: 30 ± 1 min, 37 ± 1°C
Lavaggio 5 x (s. W1 )
[WB]
550
fase 3
Conservanti: concentrazione totale < 0,11%
Materiale necessario ma non fornito
Micropipette, spettrofotometro (450 nm, lunghezza d'onda di riferimento 615 -690
nm), sistema di lavaggio micropiastra (con lavaggio del fondo), incubatrice (37°C)
per [MTP].
[SUB]
Avvertenze e precauzioni
Non incorporare reagenti. Evitare il contatto con la cute e con gli occhi. Tutti i campioni
e i materiali utilizzati per l'analisi devono essere trattati come potenzialmente infetti,
adottando adeguate precauzioni di sicurezza. I controlli sono negativi per anti-HIV
1/2, anti-HCV, HBSAg, anti-sifilide e transaminasi elevate. Non pipettare con la
bocca. Adottare idonee pratiche di laboratorio indossando guanti, abbigliamento e
occhiali protettivi adeguati. I liquidi e i materiali non combustibili devono essere
decontaminati con ipoclorito di sodio (concentrazione finale: 3 %, con tempo di
attività di almeno 30 minuti). I rifiuti liquidi che contengono acidi devono essere
neutralizzati prima di essere eliminati. Le [MTP] e tutti i materiali da riutilizzare
devono essere autoclavati per 1 ora a 121°C. Il [SUB] è sensibile alla luce ed è
quindi necessario proteggerlo dalla luce stessa. Il test deve essere eseguito da
tecnici di laboratorio autorizzati ed adeguatamente addestrati. La procedura richie-
[STOP]
Incubazione 30 ± 1 min,
a temperatura ambiente e al
buio
550
550
550
pozzetto [µl]
100
100
100
100
Sistema*: 15 ± 1 min,
a temperatura ambiente e al buio
100
100
100
100
Misurare l'estinzione immediatamente o entro 15 minuti dopo il bloccaggio a 450
nm utilizzando uno spettrofotometro (lunghezza d'onda di riferimento: 615 -690
nm).
*Se viene impiegato un sistema Elisa, è responsabilità dell'operatore convalidare il test.
Procedura di lavaggio
La procedura di lavaggio ha un'importanza primaria. Un lavaggio insufficiente
potrebbe compromettere la precisione e provocare reazioni aspecifiche.
W1: lavare 5 volte con soluzione tampone di lavaggio. Rimuovere il liquido nel
pozzetto ed erogare 300µl di soluzione tampone di lavaggio. Riempire il pozzetto
con almeno 250µl di soluzione tampone di lavaggio (volume complessivo 550µl).
|
187830/07 – 07/2010
Ripetere la procedura di lavaggio 5 volte. A lavaggio terminato, picchiettare sulla
piastra. Non lasciare che la piastra si secchi.
Calcolo della determinazione qualitativa
Dopo la misurazione dei valori di estinzione a 450 nm in tutti i pozzetti (filtro di
riferimento: 615 -690 nm), il valore medio dei bianchi viene sottratto dai valori di
estinzione dei controlli e dei campioni. Estinzione media dei bianchi ≦ 0,150 OD.
Dopo la sottrazione del bianco, i valori di controllo devono soddisfare i seguenti
criteri di validità:
Valore OD medio di [NC]: ≦ 0.200;
Valore OD medio di [PC]: ≧ 0.400
Calcolo del valore di cut-off e dell'area grigia
Il valore di cut-off viene calcolato dal valore medio OD (densità ottica) del controllo
negativo (NC x ) più 0,200. Valore di cut-off = NC x +0,200. L'area grigia si estende tra il valore di cut-off e il valore di cut-off meno 10%.
Interpretazione del risultato
I campioni con un valore di estinzione al di sotto dell'area grigia sono da considerarsi negativi. Un campione che presenti un valore di estinzione uguale o
maggiore della zona grigia, è da considerarsi positivo per anticorpi IgM specifici per
VCA EBV. Se il valore OD del campione ritestato è compreso nella zona grigia
(risultato non affidabile), si consiglia di richiedere un campione di controllo.
Interpretazione di risultati positivi per il test Anti EBV VCA IgM.
Stato dell'infezione
IgM VCA
IgG VCA
IgG EBNA
Bibliografia
Linde, A. (1992). Rev. Med. Microbiol. 3, 43-51.
Straus, S., Cohen, J.I., Tosato, G. and Meier, J. (1993). Ann. Int. Med. 118,
45-58.
3. DIN EN ISO 980 Graphic symbols for use in the labelling of medical devices.
4. Hinderer, W., Lang D., Rothe M., Vornhagen R., Sonneborn H-H., and Wolf H.
(1999), J. of Clin. Microbiol., Vol. 37, No. 10, p3239-3244.
5. Färber, I., Hinderer, W., Rothe M., Lang D., and Wutzler, P. (2001). J. of Med. Virol.
63, 271-276.
1.
2.
Guida per la risoluzione di problemi
1) Inatteso alto tasso di risultati reattivi: I campioni e i controlli sono stati pipettati
prima di pipettare il [DIL] o la miscelazione è stata insufficiente.
2)
informazioni
-
-
-
1
Fase precoce
+
-
-
-
Fase acuta
+
+
-
-
Fase tardiva
-
+
-
2
Infezione pregressa
-
+
+
-
IgM persistenti
+
+
+
3
Riattivazione
-
+
+
4
Non plausibile
-
-
+
5
Non plausibile
+
-
+
5
Sieronegativo
Studio sulla precisione
La variabilità intra-analisi dell' Anti-EBV VCA IgM ELISA è stata studiata pipettando un
campione con reattività negativa, un campione a bassa reattività e un campione con forte
reattività, ciascuno in 6 pozzetti e ripetutamente in un solo ciclo di test. Sono stati rispettivamente ottenuti i seguenti coefficienti di variazione (CV): 11,7%, 2,3% e 4,4%.
La variabilità inter-analisi è stata misurata analizzando 3 campioni, uno con reattività
negativa, uno con debole reattività e uno con forte reattività, ciascuno in 6 pozzetti in 3
cicli di test successivi. Sono stati ottenuti i seguenti coefficienti di variazione (CV): 7,4%,
3,5% e 4,8%.
Infezione primaria
3)
Infezione pregressa
4)
Non definito
1: Nella fase molto precoce di un'infezione primaria, la sierologia può risultare
ancora negativa. In caso di risultato IgM VCA compreso nella zona grigia, si consiglia di trattare il campione come "possibile fase precoce di infezione primaria" e di
confermare o escludere tale risultato analizzando un campione di controllo.
2: Come eccezione in caso di paziente immunideficiente o immunosoppresso, tale
tipologia potrebbe essere secondaria, cioè causata dalla perdita di IgG EBNA. In
una situazione di questo tipo, si consiglia di considerare i valori compresi nella zona
grigia come positivi e di indicare il campione come ”infezione pregressa”.
3: In molti casi le IgM persistono per oltre 6 mesi, venendo quindi a coincidere con
un risultato positivo per le IgG EBNA. Tuttavia, si può confermare una "fase tardiva
di un'infezione primaria" solo in caso di EBNA molto debole (OD < 0,500). Diversamente, la diagnosi deve essere quella di "Infezione pregressa".
4: Una riattivazione non può essere definita sulla base di una sierologia VCA. La
quantificazione delle IgG VCA può essere d'aiuto. I valori che si estendono al di
sopra del range normale (> 2,500 RU/ml) sono da considerarsi sospetti. Il marker
classico per la definizione sierologica della riattivazione EBV sono gli anticorpi IgG
anti-antigene precoce (EA) (ad esempio anti-EBV EA IgG ELISA, Art. No. 807 016).
Se si sospetta una riattivazione EBV è necessario determinare le IgG anti-EA.
5: I pattern di reattività non plausibili sono aleatori e non si trovano in studi clinici. I
valori IgG VCA compresi nella zona grigia sono da considerarsi positivi. In questo
caso l'interpretazione è di "Infezione pregressa". Per valori IgG VCA al di sotto della
zona grigia, è necessario ripetere integralmente l'analisi sierologica EBV, per
escludere qualsiasi errore nella procedura del test. Se si ottiene di nuovo un
risultato non plausibile, si consiglia di richiedere un nuovo campione. Se il risultato
è invariato, il riporto deve essere di "infezione pregressa".
5)
Valore di bianco medio maggiore rispetto al criterio di validità, ≧ 0,150 OD:
a) Il [SUB] ha assunto colorazione blu a causa di ossidazione o contaminazione.
b) Errore lavaggio: Eseguire la fase di 5 cicli di lavaggio. Se si utilizza un dispositivo di lavaggio manuale, eseguire una fase di 7 cicli di lavaggio. Utilizzare Bio-Rad [WB] se contenuto nel kit.
c) Errore durante l'incubazione: Temperatura troppo elevata, il tempo di incubazione è stato superato o la piastra non è stata incubata direttamente dopo il
pipettamento.
d) Errore di lunghezza d'onda: La misurazione senza un filtro di riferimento determina un aumento dei valori OD di circa +0,120 OD
Colorazione gialla in tutti i pozzetti: (vedere 2a, 2b)
a) Contaminazione del [WB]; preparare un nuovo [WB]
b) Contaminazione del [DIL] o del [CONJ]; ripetere il test con reagenti provenienti da fiale sigillate. Utilizzare i reagenti in condizioni di ridotta presenza
microbica.
Valore medio di [PC] inferiore a ≦ 0,400 OD:
a) Superamento della data di scadenza.
b) Temperatura troppo bassa o scesa durante l'incubazione.
c) Errore lavaggio: Lavaggio troppo intensivo o contatto meccanico del collettore
e della fase solida del pozzetto.
d) Contaminazione di [PC] o 3b.
Valore medio di [NC] maggiore di ≧ 0,200 OD: (vedere 1 e 2 a-d)
a) [NC] non è stato pipettato dopo il pipettamento dei campioni; pipettare tutti i
campioni prima di pipettare i bianchi e i controlli.
b) Contaminazione con il coperchio del [PC]
Limiti del metodo
Un risultato negativo nel test ottenuto con l'analisi Anti-EBV VCA IgM ELISA non è
sufficiente per escludere completamente un'infezione da EBV. I risultati dell’analisi
vanno quindi interpretati unitamente alle informazioni disponibili sulla valutazione
clinica del paziente e ad altre procedure diagnostiche. I risultati delle analisi di
campioni prelevati da pazienti immunosoppressi potrebbero essere di difficile
interpretazione. I risultati positivi del test potrebbero non essere affidabili per
individui che abbiano ricevuto trasfusioni di sangue o altri emoderivati nei mesi
immediatamente precedenti. L'Anti-EBV VCA IgM ELISA è stato analizzato con i
seguenti campioni potenzialmente cross-reattivi: campioni con presenza del fattore
reumatoide nel siero (23), con anticorpi positivi per anti-Epatite B, stato acuto (6);
anticorpi positivi per anti-Epatite C, stato acuto (6); anticorpi positivi per antiVaricella, stato acuto (3); anticorpi positivi per anti-Citomegalovirus, stato acuto (3);
anticorpi positivi per anti Toxoplasmosi, stato acuto (4). Un solo campione con
positività per HCV ha fornito un risultato positivo nell'Anti-EBV VCA IgM ELISA.
Performance
I risultati ottenuti con il test Anti EBV VCA IgM, congiuntamente ad altre analisi
cliniche quali IgG anti-VCA e IgG anti-EBNA-1, agevolano la diagnosi sierologica
dell'infezione da EBV. Su 69 sieri di pazienti con infezione primaria da EBV, 67
(97,1%), erano positivi (5). Tutti i 46 i campioni sieronegativi sono risultati negativi
(specificità del 100%) impiegando il sistema Anti EBV VCA IgM ELISA (5).
MBio-Rad Medical Diagnostics GmbH
Industriestr. 1, D-63303 Dreieich, Germany
Tel.: +49-6103-801-95, Fax: +49-6103-801-724
www.bio-rad.com, [email protected]
|
187830/07 – 07/2010