diastat anti-ro - Technogenetics

Transcript

BEIA EBV VCA IgM Mab
Quant
21851
Edizione
20-04-2013
Solo per uso professionale
TECHNOGENETICS SRL
N° 00529
Pag. 1 - 28 BEIA EBV VCA IgM Mab Quant Ed. 20-04-2013
INTRODUZIONE
Il kit BEIA EBV VCA IgM Mab Quant è un test immunoenzimatico
qualitativo/quantitativo (ELISA) per la determinazione nel siero o
nel plasma degli anticorpi di classe IgM specifici verso l’antigene
capsidico(VCA) dell’ Epstein Barr Virus (EBV).
SIGNIFICATO CLINICO
L'Epstein Barr Virus (EBV) appartiene alla famiglia erpetica e
rappresenta l'agente eziologico di numerose patologie umane tra le
quali la mononucleosi infettiva è la più frequente.
Durante l'infanzia l'infezione primaria da EBV è asintomatica
mentre nell'adolescenza circa la metà dei soggetti presentano segni
clinici caratteristici della mononucleosi infettiva. L'infezione da
Epstein Barr Virus comporta la produzione di anticorpi diretti verso
differenti complessi antigenici quali gli anticorpi anti-EBNA
(Nuclear Antigen), gli anticorpi anti-EA (Early Antigen) e gli
anticorpi anti-VCA (Viral Capsid Antigen). La rilevazione degli
anticorpi IgM anti-VCA consente, in presenza di IgG anti-VCA, di
diagnosticare la fase attiva dell'infezione.
PRINCIPIO DEL METODO
Il test BEIA EBV VCA IgM Mab Quant è un dosaggio ELISA basato
sulla tecnica “a cattura”. I campioni da esaminare vengono incubati
nei micropozzetti sensibilizzati con anticorpi policlonali anti-IgM
umane. Le IgM del campione vengono catturate dagli anticorpi
presenti sulla fase solida. Dopo eliminazione mediante lavaggio dei
componenti del siero non legati alla fase solida, la presenza di IgM
anti-VCA viene rilevata attraverso il legame con un complesso
costituito da antigene EBV gp 125 - anticorpo monoclonale anti-gp
125 – anticorpo anti-IgG di topo coniugato con perossidasi. Dopo
allontanamento del complesso non legato viene aggiunto il
Substrato-TMB che, per azione dell’enzima presente sulla fase
solida, sviluppa una colorazione azzurra. L’aggiunta di una
soluzione di acido solforico 1N blocca la reazione e provoca il
viraggio del colore dall’azzurro al giallo.
La densità ottica letta a 450/620 è direttamente proporzionale alla
quantità di IgM specifiche presenti nel campione in esame.
Nei kit BEIA EBV VCA IgM Mab Quant la concentrazione degli
anticorpi di classe IgM viene calcolata mediante l'utilizzo di una
curva di calibrazione ed espressa in Unità Arbitrarie/mL .
CONTENUTO DELLA CONFEZIONE
La confezione è sufficiente per 96 determinazioni.
Componente
SORB
A
Strip da 8 micropozzetti frazionabili
12x8x1
CAL
0
B
Calibratore 0 (0 UA/mL)
1 x 2 mL
CAL
1
C1
Calibratore 1 ( 10 UA/mL)
1 x 2 mL
CAL
2
C2
1 x 2 mL
CAL
3
C3
1 x 2 mL
CAL
4
C4
1 x 2 mL
DIL
SPE
D
Diluente Campioni BEIA System
1 x 120 mL
E
Complesso Ag EBV-Mab anti-gp125
1x6
F
Diluente Complesso
1 x 22 mL
G
Coniugato
1 x 0,5 mL
COMP
DIL
COMP
CONJ
BUF
WASH 20X
H
Tampone di Lavaggio
1 x 100 mL
SUBS
TMB
I
Substrato-TMB
1 x 13,5 mL
J
Soluzione Stoppante
1 x 25 mL
Istruzioni per l’uso
1
H2SO4
A.
B.
Strip sensibilizzate
Strip sensibilizzate con IgG da capra anti-IgM umane, in busta
ermetica richiudibile. Riporre le strip non utilizzate nella busta
e richiudere. Le strip sono frazionabili in pozzetti singoli.
Calibratore 0 UA/mL
Siero umano negativo per anticorpi IgM anti-VCA. Contiene
0,09%
p/p
di
sodio
azide
come
conservante.
Reagente pronto all'uso.
C.
D.
E.
F.
G.
H.
I.
J.
Calibratori 10, 20, 50 e 120 UA/mL
Siero umano a concentrazioni note di anticorpi IgM anti-VCA.
Contengono 0,09% p/p di sodio azide come conservante.
Reagenti pronti all’uso.
Diluente Campioni BEIA System
Soluzione salina tamponata (PBS) e proteine. Contiene 0,09%
di sodio azide come conservante e Tween 20.
Reagente pronto all'uso
Complesso Antigene EBV- Anticorpo Monoclonale anti-gp 125
6 flaconi monodose, in forma liofilizzata, contenenti antigene
EBV ed anticorpo monoclonale anti-gp 125. Vedi preparazione
dei reagenti
Diluente Complesso
Soluzione proteica tamponata, tensioattivi e conservanti.
Coniugato
Soluzione contenente anticorpo di capra anti-IgG di topo
marcato con perossidasi. Reagente pronto all'uso.
Tampone di Lavaggio
Soluzione salina tamponata (PBS) concentrata 20 volte. Contiene
0,1 % Kathon CG e Tween 20. Vedi preparazione dei reagenti
Substrato-TMB
Soluzione contenente H2O2/TMB stabilizzanti e colorante
(rosa). Reagente pronto all'uso.
Soluzione Stoppante
Soluzione 1N di acido solforico.
MODALITÀ DI CONSERVAZIONE
Tutti i reattivi devono essere conservati a 2-8°C al riparo dalla luce.
Non utilizzare i reattivi oltre la data di scadenza del kit riportata
sull’ etichetta.
REAGENTI INTERCAMBIABILI
Il Diluente Campioni BEIA System, il Tampone di Lavaggio, il SubstratoTMB e la Soluzione Stoppante sono intercambiabili tra i diversi kit
della linea BEIA.
MATERIALE E STRUMENTI RICHIESTI, MA NON FORNITI
 Lettore di colorimetria per micropiastre con filtro a 450/620 nm.
 Apparecchiatura manuale o automatica per il lavaggio di
micropiastre.
 Micropipette con puntali monouso da 10, 100, 1000 µL.
 Provette monouso e normale vetreria da laboratorio.
 Acqua distillata o deionizzata.
AVVERTENZE E PRECAUZIONI









Prima dell'uso portare tutti i reattivi a temperatura ambiente
(18-25°C). Prelevare solo la quantità necessaria per l'analisi.
Evitare l'essiccamento dei pozzetti.
Usare esclusivamente vetreria accuratamente pulita.
Non utilizzare uno stesso puntale per pipettare reagenti
diversi.
Cambiare il puntale tra un campione e l’altro.
Qualora il Substrato-TMB evidenziasse un viraggio da rosa ad
azzurro, il reagente non deve essere utilizzato.
Se il dosaggio viene ripetuto, preparare una nuova diluizione
del campione.
Si raccomanda di inserire in ogni corsa analitica dei campioni
di controllo al fine di validare i risultati ottenuti, secondo
criteri e procedure che ciascun utilizzatore deve definire.
Procedere periodicamente alla manutenzione e taratura delle
pipette e del lettore.
AUTOMAZIONE
Il test può essere eseguito con sistemi automatici per kit ELISA, nel
qual caso Vi invitiamo a consultare il manuale specifico dello
strumento per una corretta esecuzione della corsa analitica.
PRELIEVO E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
Il dosaggio può essere eseguito su siero o plasma (Eparina o EDTA).
Se il dosaggio è eseguito entro 5 giorni dal prelievo, i campioni
possono essere conservati a 2-8 °C. In caso contrario aliquotare i
campioni e congelarli a -20°C.
Evitare ripetuti scongelamenti e congelamenti. Si sconsiglia l’uso di
campioni lipemici, torbidi ed emolizzati. I campioni devono essere
diluiti 1:81 con il Diluente Campioni BEIA System prima del
dosaggio
PREPARAZIONE DEI REAGENTI
Tampone di Lavaggio
Diluire il Tampone di Lavaggio(20x) 1:20 con acqua distillata o
deionizzata prima dell'uso. Dopo ricostituzione il tampone è stabile 15
giorni se conservato a 2-8°C e comunque non oltre la data di scadenza
riportata sull'etichetta originaria. Nel Tampone di lavaggio concentrato si
possono formare dei precipitati cristallini che si solubilizzano portando il
reagente a 37°C prima della diluizione. Si raccomanda di diluire la
quantità di tampone necessaria per eseguire i lavaggi dell'analisi in corso.
Complesso Antigene EBV gp 125 - Anticorpo Monoclonale anti-gp
125 - anti-IgG di topo-HRP
Ricostituire ogni flaconcino liofilo di Complesso Antigene EBV gp
125 - Anticorpo Monoclonale anti-gp 125 con 3 mL di Diluente
Complesso. Per una corretta ricostituzione, si consiglia di aggiungere
il volume prescritto di Diluente Complesso, richiudere il flacone,
lasciarlo 15 minuti a temperatura ambiente
ed agitarlo
delicatamente evitando la formazione di schiuma fino a completa
dissoluzione del liofilo.
Aggiungere alla soluzione così ricostituita 50 L di Coniugato,
avendo cura di agitare delicatamente per favorire la miscelazione.
Preparare esclusivamente la miscela Ag-Mab-coniugato necessaria
per eseguire l’analisi in corso. Qualora si rendesse necessario
utilizzare più di un flaconcino monodose, si raccomanda di
miscelarne i contenuti prima dell’uso. L'immunocomplesso deve
essere preparato 60 minuti prima del suo utilizzo.
CICLO DI LAVAGGIO
Si consiglia di procedere come segue sia nel caso in cui si utilizzi un
lavatore automatico di micropiastre sia nel caso in cui si operi
manualmente.
1. Svuotare completamente i pozzetti.
2. Riempirli con 300 µL di tampone di lavaggio.
3. Svuotare i pozzetti.
4. Ripetere i punti 2 e 3 per ulteriori 3 cicli.
5. Asciugare con carta assorbente la superficie esterna dei pozzetti
al termine del lavaggio.
ESECUZIONE DEL TEST
1.
2.
3.
4.
Portare i reagenti a temperatura ambiente (almeno 30-60 minuti
a 18-25°C).
Diluire (1:81) i campioni in esame con il Diluente Campioni
BEIA System (esempio 10 µL di siero e 800 µL di Diluente
Campioni BEIA System). Agitare su Vortex
Prelevare il numero di strip necessario per l'analisi in funzione
del numero di campioni in esame e dei Calibratori (vedi
“Schema del dosaggio”). Richiudere accuratamente la busta.
Quantitativo: Dispensare nei rispettivi pozzetti 100 L di
ciascun siero in esame prediluito e dei Calibratori.
Qualitativo : Dispensare nei rispettivi pozzetti 100 L di
ciascun siero in esame prediluito, del Calibratore 0 (0 UA/mL),
del Calibratore 1 (10 UA/mL) e del Calibratore 4 (120 UA/mL)
Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25°C) per 60
minuti.
5.
Eseguire la procedura di lavaggio dei pozzetti seguendo il
procedimento raccomandato (vedi Ciclo di lavaggio).
6. Dispensare in ciascun pozzetto 100 µL del complesso Ag-MabConiugato (vedi preparazione dei reagenti).
7. Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25°C) per 60
minuti.
8. Eseguire la procedura di lavaggio dei pozzetti seguendo il
procedimento raccomandato (vedi Ciclo di lavaggio).
9. Dispensare in ciascun pozzetto 100 µL di Substrato-TMB.
10. Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25°C) per 30
minuti.
11. Bloccare la reazione cromogenica dispensando in ciascun
pozzetto 100 µL di Soluzione Stoppante.
12. Leggere la densità ottica (DO) in bicromatismo a 450/620 nm.
CALCOLO ED INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
VALIDAZIONE DELLA SEDUTA ANALITICA
Le condizioni che consentono l’accettazione dei risultati sono :
 il rapporto tra la DO del Calibratore 4 (120 UA/mL) e la DO
del Calibratore 1 (10 UA/mL) dev’essere  4.0.
 il rapporto tra la DO del Calibratore 0 (0 UA/mL) e la DO del
Calibratore 1 (10 UA/mL) dev’essere  0.5.
Qualora la seduta dia risultati non conformi alle condizioni sopra
elencate, essa non è validabile ed i risultati relativi ai campioni non
possono essere refertati senza analisi critica documentata. La non
conformità va qualificata e trattata secondo le procedure di
Assicurazione Qualità proprie del laboratorio. Si consiglia di
instaurare ed attuare procedure di Controllo Qualità interne al
laboratorio, i cui risultati concorrano alla validazione delle sedute ed
alla gestione di eventuali non conformità.
CALCOLO QUANTITATIVO DEI RISULTATI
Calcolare la media dei valori di densità ottica per ogni calibratore e
campione (i duplicati dovrebbero presentare un CV minore del
20%). Elaborare la curva di calibrazione riportando la media delle
densità ottiche di ogni calibratore sull’asse delle ordinate e le
corrispondenti concentrazioni sull’asse delle ascisse.
Disegnare la migliore curva che passi attraverso i punti della
calibrazione. Per calcolare la concentrazione di IgM anti-VCA di
ogni campione riportare il valore della densità ottica sull’asse delle
ordinate e collegare con una linea retta alla curva di calibrazione. Al
punto di intersezione, collegare con una linea verticale all’asse delle
ascisse e leggere il corrispondente valore di IgM anti-VCA. Qualora
si disponesse di un sistema di calcolo automatico si consiglia di
utilizzare una delle seguenti funzioni matematiche: spline cubica,
iperbolica e lineare punto a punto. I seguenti valori devono essere
considerati solo come un esempio e non devono essere usati in
luogo dei dati ottenuti dall'utilizzatore.
Esempio di calcolo con interpolazione spline cubica:
Calibratori
Cal 0
Cal 1
Cal 2
Cal 3
Cal 4
Campione A
Campione B
Campione C
UA/mL
0
10
20
50
120
Densità Ottica
0.092
0.386
0.640
1.321
2.171
0.196
0.496
1.383
UA/mL
3.4
14.2
53.2
CALCOLO QUALITATIVO DEI RISULTATI
Al fine di correlare il risultato analitico allo stato immunitario del
campione si suggerisce di determinare i risultati calcolando l’index
anticorpale (I.A.) con la seguente formula:
DO campione
Index anticorpale (I.A.)
=
________________________________________
DO Calibratore 1 (10 UA/mL)
Per il Calibratore 1 (10 UA/mL) calcolare, se eseguito in multiplo, il
valore medio di densità ottica (DO). I seguenti valori devono essere
considerati solo come un esempio e non devono essere usati in
luogo dei dati ottenuti dall'utilizzatore.
Esempio di calcolo:
Campione A
Campione B
Campione C
1ª DO
2ª DO
DO
I.A.
0.098
0.375
2.167
0.196
0.496
1.383
0.086
0.397
2.174
0.092
0.386
2.171
0.24
5.62
0.51
1.28
3.58
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Studi effettuati su campioni di popolazione equivalente a quella
europea hanno condotto a stabilire i seguenti criteri interpretativi:
Qualitativo
Quantitativo
IA
UA/mL
> 1.1
> 11.5
Il campione è da considerare POSITIVO per la
presenza di anticorpi di classe IgM anti-VCA
 0.9
 8.5
Il campione è da considerare NEGATIVO per la
presenza di anticorpi di classe IgM anti-VCA
0.9 1.1
8.5 11.5
ZONA GRIGIA: Il campione è da considerare
DUBBIO per la presenza di anticorpi di classe
IgM anti-VCA
INTERPRETAZIONE
Va tenuto presente che:
- il test indica solo la presenza o assenza di anticorpi specifici di
classe IgM. Non è di per sé e univocamente indice di uno stato
infettivo;
- una decisione medica non può essere basata sul risultato di un solo
test, ma va fondata sull’insieme dei dati clinici disponibili. Dati
clinici discrepanti vanno risolti prima di prendere la decisione,
eventualmente con il conforto di test di conferma o di II livello;
- risultati compresi entro la zona grigia vanno chiariti: con la
ripetizione del test sullo stesso campione; con la ripetizione del test
su un prelievo successivo; con il confronto con un test di
riferimento.
La sierodiagnosi dell' EBV richiede la determinazione di più di un
parametro e al momento non esiste un accordo universale di
interpretazione del profilo sierologico. Nella tabella seguente viene
riportato un criterio interpretativo dei test sierologici per l'EBV:
VCA-IGG
VCA-IGM
EBNA-1 IGG
Neg
Neg
Neg
Neg/ Pos
Pos
Neg
Pos
Pos/Neg
Neg/ Pos
Pos
Neg
Pos
Pos
Pos
Pos
INDICAZIONI
Nessuna indicazione di
infezione (soggetto
suscettibile )
Infezione primaria acuta
Infezione primaria
recente
Infezione pregressa
Possibile riattivazione o
infezione cronica
Sono noti casi di perdita di produzione di IgG anti-EBNA-1 in fase
pregressa dell’infezione (ad es. soggetti immunodepressi ), casi di
infezione primaria acuta senza produzione di IgM anti-VCA ( molto
rari ) e casi di persistente presenza di IgM anti-VCA nella fase
pregressa dell’infezione ( rari ). In questi casi il test IgG/IgM anti
EA-D ed il test di avidità IgG VCA possono essere utilizzati per
meglio interpretare lo stato clinico del paziente. La concentrazione
di IgG anti-VCA gp 125 nell’infezione pregressa tende a diminuire
nel tempo e può in alcuni casi presentare valori inferiori a 10
UA/mL.
PRESTAZIONI DEL KIT
AVVERTENZA: i dati presentati sotto questa voce non rappresentano
le specifiche di funzionamento del kit, ma costituiscono evidenza
sperimentale di come il kit funzioni entro tali specifiche nel modo
previsto dal fabbricante.
SENSIBILITÀ E SPECIFICITÀ
Sensibilità e specificità diagnostiche sono state valutate
confrontando le prestazioni del kit BEIA EBV VCA IgM Mab Quant
nei confronti di un kit già immesso sul mercato con prestazioni
accettabili (EIA VCA IgM)
BEIA
EBV VCA IgM Mab Quant
+
-
EIA VCA IgM
+
19
0
0
215
Da questi dati si ottiene:
Sensibilità relativa
Specificità relativa
Concordanza
100%
100%
100%
LIMITE DI RILEVAZIONE
Prove condotte in replicato sullo standard 0 indicano il limite di
rilevazione in 0.5 UA/mL.
SPECIFICITÀ ANALITICA
Non è stata rilevata alcuna interferenza in sieri contenenti fino a 10
mg/mL di emoglobina, fino a 1 mg/mL di bilirubina e fino a 30
mg/mL di trioleina. L’uso di campioni lipemici, torbidi o emolizzati
viene comunque sconsigliato.
RIPETIBILITÀ
La variabilità intra-saggio ed inter-saggio è stata determinata
valutando un campione negativo con concentrazione < 5 UA/mL e
due campioni positivi a due concentrazioni di circa 14 UA/mL e 50
UA/mL. I campioni sono stati replicati 6 volte per seduta in
ciascuna di 12 sedute diverse. Sono stati ottenuti coefficienti di
variazione inferiori al 15% per il campione negativo ed inferiori al
10% per i due campioni positivi..
LIMITAZIONI
Contaminazione batterica dei campioni o ripetuti scongelamenti e
congelamenti possono alterare i livelli rilevabili di IgM specifiche.
PRINCIPI GENERALI DI SICUREZZA








Tenere in ordine il laboratorio ed effettuare con cura le
operazioni previste per l'esecuzione del test.
Non mangiare, bere, fumare o usare cosmetici nell’area di
laboratorio designata.
Non pipettare soluzioni o campioni con la bocca.
Evitare il contatto diretto con i reattivi ed i campioni
indossando guanti monouso e camici.
Lavare accuratamente le mani al termine del dosaggio.
Pulire immediatamente con opportuni detergenti le superfici
di lavoro eventualmente contaminate.
Raccogliere il materiale solido o liquido utilizzato per il
dosaggio in appositi contenitori ed effettuare lo smaltimento
secondo le norme vigenti.
Controllare periodicamente il grado di contaminazione
dell'ambiente di lavoro e degli operatori.
Reagenti contenenti siero

I derivati da sangue umano inclusi nel kit sono stati analizzati
e trovati negativi per HbsAg, anti-HCV ed anticorpi anti-HIV.
Poiché nessun metodo può garantire che tali derivati non
possano trasmettere epatite, AIDS o altre infezioni, si
raccomanda di manipolare i reagenti con le opportune cautele.
Reagenti pericolosi

Soluzione Stoppante (Council Directive 88/379/EEC)
R36/38
Irritante per gli occhi e per la pelle
S2-26
Conservare fuori dalla portata dei bambini; In
caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente ed
abbondantemente con acqua e consultare un medico.
SCHEMA DEL DOSAGGIO












Preparare i reattivi
Diluire i campioni 1:81 con il Diluente Campioni
Dispensare:
Metodo Qualitativo
100 L di Calibratore 0 (0 UA/mL) in doppio
100 L di campione prediluito in singolo o doppio,
Metodo Quantitativo
100 L di campione prediluito in singolo o doppio,
Incubare 60 minuti a T.A. (18-25°C)
Eseguire 4 cicli di lavaggio
Dispensare 100 L di complesso Ag-Mab-Coniugato
Eseguire 4 cicli di lavaggio
Dispensare 100 L di Substrato-TMB
Dispensare 100 L di Soluzione Stoppante
Leggere le densità ottiche al fotometro a 450/620 nm
Test qualitativo
A
B
C
D
E
F
G
H
Qual
Cal 0
Cal 0
Cal 10
Cal 10
Cal 120
Cal 120
P1
P2
Test quantitativo
2
P3
…
…
…
..
..
..
3
A
B
C
D
E
F
G
H
Quant
Cal 0
Cal 0
Cal 10
Cal 10
Cal 20
Cal 20
Cal 50
Cal 50
2
Cal 120
Cal 120
P1
P2
P3
….
….
….
3
BEIA EBV VCA IgM Mab
Quant
21851
Version
20-04-2013
For professional use only
TECHNOGENETICS SRL
INTENDED USE
The BEIA EBV VCA IgM Mab Quant kit is a
qualitative/quantitative enzyme-linked immunosorbent assay
(ELISA) for the detection of specific IgM antibodies to Epstein Barr
Viral Capsid Antigen (VCA), in human serum or plasma samples.
CLINICAL RELEVANCE
Epstein Barr Virus (EBV), belonging to the Herpers virus family, is
the etiological agent triggering many different human infections
among wich infectiuos mononucleosis is he most frequent. During
childhood a primary EBV infection is usually asymtomatic while
during adolescence half of the subjects show typical clinical
evidence of infectious mononucleosis.
During EBV infection
antibodies directed against different antigen complexes are
developed, like anti-EBNA (Nuclear Antigen), anti-EA (Early
Antigen), and anti-VCA (Viral Capsid Antigen) antibodies. The
presence of anti-VCA IgM antibodies associated to anti-VCA IgG
antibodies leads to the diagnosis of an active infection.
PRINCIPLE OF THE ASSAY
The BEIA EBV VCA IgM Mab Quant kit is an qualitative/qualitative
enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based on “capture
method”. During the first incubation, any IgM antibodies present in
serum or plasma bind to the inner surface of the wells coated with
the policlonal anti-human IgM. After the first incubation the wells
are washed to remove non-reactive serum components.
During the second incubation a complex (EBV antigen gp 125 monoclonal antibody anti-gp 125 - goat antibody-anti-mouse IgG
labelled with HRP) binds only to the specific IgM anti-VCA, bound
in the anti-IgM-IgM complex present on the wells.After a second
washing cycle, a substrate-TMB solution is dispensed into the wells
in order to detect specific antibodies during a subsequent
incubation. The enzymatic reaction is then stopped by adding a
Stop Solution which changes to yellow the blue colour developed
into the wells.
The amount of colour is directly proportional to the specific IgM
anti-VCA concentration in the patient samples.
Since no International references were available, the BEIA EBV VCA
IgM Mab Quant has been arbitrarly calibrated.
KIT COMPONENTS
Package size: 96 tests.
Componente
SORB
A
Coated Strip
12x8x1
CAL
0
B
Calibrator 0 (0 AU/mL)
1 x 2 mL
CAL
1
C1
Calibrator 1 ( 10 AU/mL)
1 x 2 mL
CAL
2
C2
1 x 2 mL
CAL
3
C3
1 x 2 mL
CAL
4
C4
1 x 2 mL
DIL
SPE
D
Sample Diluent BEIA System
1 x 120 mL
E
Complex Ag-EBV Mab anti-gp125
1x6
F
Complex Diluent
1 x 22 mL
G
Conjugate
1 x0,5 mL
COMP
DIL
COMP
CONJ
BUF
WASH 20X
H
Wash Buffer
1 x 100 mL
SUBS
TMB
I
Substrate-TMB
1 x 13,5 mL
J
Stop Solution
1 x 25 mL
Package Insert
1
H2SO4
A.
B.
Coated strips
Breakable strips coated with goat anti-human IgM antibodies
packed in sealed pouch. Place the unused strips in the pouch
and reseal.
Calibrator 0 AU/mL
Negative human serum for IgM antibodies anti-VCA.
Contains 0.09% w/w of Sodium azide as preservative. Ready
to use reagent.
C.
D.
E.
F.
G.
H.
I.
J.
Calibrators 10, 20, 50 e 120 AU/mL
Human serum, containing IgM antibodies anti-VCA with
different known concentrations. Contain 0.09% w/w of
Sodium azide as preservative.
Ready to use reagents.
Sample Diluent BEIA System
Buffered salt solution (PBS). Contains protein, 0,09 % Sodium
azide and Tween 20. Ready to use reagent.
Complex EBV Antigen gp125 - Mab anti-gp125
6 Single-dose lyophilised vials.
Reconstitute before use. See “Preparation of reagents”.
Complex Diluent
Buffered salt solution with proteins. Contains Tween 20 and
preservative. Ready to use reagent
Conjugate
Goat anti-mouse IgG labelled with HRP.
See “Preparation of reagents”.
Wash Buffer
Buffered salt solution (PBS) 20x concentrated. Contains 0,1 % di
Kathon CG and Tween 20. See “Preparation of reagents”.
Substrate-TMB
Tetramethylbenzidine (TMB)/H2O2 in stabilizing buffered
solution. Contains pink dye. Ready to use reagent.
Stop Solution
1N Sulphuric acid solution. Ready to use reagent.
STORAGE OF REAGENTS
Store all reagents at 2-8°C avoiding exposure to light. Do not use
reagents after the expiry date indicated on the label.
INTERCHANGEABLE REAGENTS
The Sample Diluent BEIA System, Wash Buffer, Substrate-TMB and Stop
Solution are common to all BEIA kits.
MATERIALS/EQUIPMENT REQUIRED BUT NOT PROVIDED





Microplate reader with 450/620 nm filters.
Manual or automated microplate washing device.
Precision pipettes with disposable tips 10,100,1000 L .
Disposable pipettes and normal glassware.
Distilled or deionised water.
WARNINGS AND PRECAUTIONS








Bring all reagents to room temperature (18-25°C) before use.
Use clean glassware.
Use a clean disposable pipette tip for each reagent.
Use a clean disposable pipette tip for each sample.
If the chromogenic substrate shows a change from pink to blue
colour, discard the reagent.
For repeated assays, each time provide for new diluted
samples.
Every analytical run should include control samples in order
to validate the results, according to criteria and procedures
established by each laboratory.
Periodical maintenance and calibration of pipettes and
microplate reader are required.
AUTOMATION
The test can be performed on automated ELISA processor. Please
refer to specific instrument manual for proper applications.
SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION
The test can be performed on serum or plasma (heparin – EDTA).
Specimens may be stored refrigerated at 2-8 °C up to 5 days. For longer
storage they should be aliquoted and stored frozen at – 20°C. Avoid
repeated thawing and freezing. Do not use haemolyzed, lipemic or turbid
specimens. All serum and plasma samples must be pre-diluted with
Sample Diluent prior to assay. See assay protocol.
PREPARATION OF REAGENTS
Wash Buffer (20 X)
Dilute 1:20 the content of the Wash Buffer bottle with distilled or
deionised water. The diluted Wash Buffer is stable 15 days when
stored at 2-8 °C; in any case, do not use it after expiry date printed
on the original label. If crystallization occurs in the concentrated
Wash Buffer, warm the solution to 37 °C before diluting. Only dilute
the quantity necessary for the assay.
Complex EBV Antigen gp-125 - Mab anti-gp125 - goat anti-mouse
IgG - HRP
Reconstitute each lyophilized vial of the complex with 3 mL of
Complex Diluent. It's recommended to add the volume of Complex
Diluent into the vial, close the cap, wait 15' at room temperature and
gently mix in order to avoid foaming. Add 50 L of conjugate to the
reconstitute vial and gently mix. Dilute only the quantity necessary
for the analytical run. If the analytical run requires the reconstitution
of more than one single-dose vial, it's recommended to mix contents
of the vials before use. The complex must be prepared 1 hour before
use.
WASHING CYCLES
Both using a microplate washer and washing the plate manually,
perform the following steps.
1.
Empty the wells
2.
Fill them with 300 µL of Wash Buffer.
3.
Empty the wells
4.
Repeat steps 2 and 3 for other 3 cycles
5.
Dry the rim of the wells with blotting paper at the end of the
washing cycles.
ASSAY PROTOCOL
Allow all reagents to reach room temperature leaving them at
least 30-60 minutes at 18-25 °C.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
Dilute the samples to be assayed (1 :81) with the Sample
Diluent BEIA System (i.e. 10 µL of serum and 800 µL of
Sample Diluent BEIA System). Shake on Vortex.
Select the number of strips required for the assay according to
the number of samples to be assayed and the Calibrators (see
paragraph “Summary of protocol” below). Reseal the pouch.
Quantitative: Dispense 100 µL of each Calibrator and of the
diluted sample.
Qualitative: Dispense 100 µL Calibrator 0 (0 AU/mL),
Calibrator 1 (10 AU/mL), Calibrator 4 (120 AU/mL) and of
the diluted samples.
Incubate the plate at room temperature (18-25 °C) for 60
minutes.
Perform a washing cycle following the suggested procedure
(see Washing Cycles).
Dispense 100 µL of Ag-Mab-Conjugate complex in each well.
minutes.
Perform a washing cycle following the suggested procedure
(see Washing Cycles).
Dispense 100 µL of Substrate-TMB in each well .
minutes.
Stop the chromogenic reaction dispensing 100 µL of Stop
Solution into each well.
Read the optical density (OD) at 450 nm (preferably in bichromatism at 450/620 nm).
CALCULATION AND INTERPRETATION OF RESULTS
RUN VALIDATION CRITERIA
Criteria used to validate the obtained results are the following:
 The ratio of the OD for Calibrator 4 (120 AU/mL) to the OD
for the Calibrator 1 (10 AU/mL) must be ≥ 4.0

The ratio of the OD for Calibrator 0 (0 AU/mL) to the OD for
the Calibrator 1 (10 AU/mL) must be ≤ 0.5
If the above criteria are not met, the run is invalid and the results
cannot be reported without a documented critical review of the data.
The non conformity must be addressed and treated according to
each laboratory’s Quality Assurance procedures.
Each lab should establish and follow its own internal Quality
Control procedures and use the QC results to validate runs and
manage non conformities.
QUANTITATIVE CALCULATION OF RESULTS
Calculate the average O.D. values for each set of duplicate
calibrators and samples (duplicates should have a CV < 20%).
Create a calibration curve by plotting the mean of O.D. for each
calibrator concentration on the ordinate against the IgM anti-VCA
concentration on the abscissa. Draw a best fit curve through the
points of the graph. To determine the concentration of IgM antiVCA for each sample, first find the O.D. value on the ordinate and
extend a horizontal line to the calibration curve. At the point of
intersection, extend a vertical line to the abscissa and read the
corrisponding IgM anti-VCA concentration. If an automated
processor is available it’s advise to select among the following curve
fit types: cubic spline, hyperbolic and point-to-point straigth line.
The data below show typical results for the test. These data are
intended as an example only and should not be used to calculate
results from another run. Example of calculation with cubic spline
fit.
Calibrators
Cal 0
Cal 1
Cal 2
Cal 3
Cal 4
Sample A
Sample B
Sample C
AU/mL
0
10
20
50
120
O.D.
0.092
0.386
0.640
1.321
2.171
0.196
0.496
1.383
AU/mL
3.4
14.2
53.2
QUALITATIVE CALCULATION OF RESULTS
In order to correlate the analytical results to the immunity of the
sample results should be determined calculating the antibody index
(A.I.) using the following formula:
O.D. sample
________________________________________
Antibody Index (A I) =
O.D. Calibrator 1 (10 AU/mL)
For the Calibrator 1 (10 AU/mL) calculate, if assayed in duplicate,
the mean OD value (mOD). The data below show typical results for
the test. These data are intended as an example only and should not
be used to calculate results from another run.
Sample A
Sample B
Sample C
1ª OD
0.098
0.375
2.167
0.196
0.496
1.383
2ª OD
0.086
0.397
2.174
O.D
0.092
0.386
2.171
A.I.
0.24
5.62
0.51
1.28
3.58
INTERPRETATION OF RESULTS
(Laboratory staff should establish their own specific cut-off in order
to tell positive from negative patient samples). Results from our
clinical trials, performed on samples representative of the European
population, suggest the following interpretative criteria:
QUALITATIVE
A.I.
QUANTITATIVE
AU/mL
INTERPRETATION
> 1.1
 11.5
Sample should be considered POSITIVE for
the presence of anti-VCA IgM antibodies.
< 0.9
 8.5
Sample should be considered NEGATIVE for
the presence of anti-VCA IgM antibodies.
0.9  1.1
8.5 11.5
GREY ZONE: Sample should be considered
BORDERLINE for the presence of anti-VCA
IgM antibodies.
Please consider that:
- the test only detects specific IgM antibodies. It cannot per se and
univocally be referred to as evidence of infection;
- a medical decision cannot be made on the basis of a single test
result but should be grounded on all the available clinical data;
discrepancies in clinical data should be clarified prior to final
decisions, also, if necessary, by confirmatory or 2 nd level tests;
- results within grey zone should be made clear: re-testing the same
sample; testing a sample from another collection from the same
patient; comparing the results with those of a reference test.
Although EBV serodiagnosis requires measurement of more than
one analyte, universal agreement of a serological profile does not
exist. One profile criterion is shown in following table:
VCA-IGG
Neg
VCA-IGM
Neg
EBNA-1 IGG
Neg
Neg/Pos
Pos
Neg
Pos
Pos/Neg
Neg/Pos
Pos
Neg
Pos
Pos
Pos
Pos
ITERPRETATION
EBV negative: no
indication of Infection
Primary EBV Infection
(early phase)
Primary EBV Infection
(transient phase)
Past EBV Infection
Reactivated EBV Infection
/Cronic EBV Infection
Cases, in which loss of IgG anti-EBNA-1 production has occurred
during a past infection (i.e. immunosuppressed patients), have
been reported as well as cases of primary acute infection without
any IgM anti-VCA production (very unusual) and cases in which
IgM anti-VCA persisted throughout a past infection (unusual). In
these cases, both IgG/IgM anti-EA-D and IgG VCA Avidity tests
can be utilised to better diagnose the clinical picture of a patient.
IgG anti-VCA gp 125 concentration tends to decrease as time goes
on and, sometimes, it can even be less than 10 AU/mL.
PERFORMANCE DATA
WARNING:
Data below do not represent the performance specifications of the
kit, but only experimental evidence that the performance of the kit is
within such specifications, as intended by the manufacturer.
SPECIFICITY AND SENSITIVITY
The sensitivity and specificity were evaluated comparing the BEIA
EBV VCA IgM Mab Quant results versus an established EIA
commercial kit (VCA IgM).
BEIA
EBV VCA IgM Mab Quant
+
-
EIA VCA IgM
+
19
0
0
215
From which the following table can be calculated:
Relative Sensitivity
Relative Specificity
Agreement
100%
100%
100%
DETECTION LIMIT
Trials in replicate on the standard 0 lead to calculate the detection
limit in 0.5 AU/mL.
ANALYTICAL SPECIFICITY
No interference has been observed in samples with hemoglobin up
to 10 mg/mL, bilirubin up to 1 mg/mL, triolein up to 30 mg/mL.
Lipemic, turbid or hemolyzed samples, however, should not be
used.
REPEATABILITY
The within-run and run-to-run variability were determined using
one negative sample with concentration of < 5 AU/mL and two
positive samples, containing different concentration : about 14
AU/mL and 50 AU/mL. These samples were tested 6 times per
single run in 12 different analytical runs. Coefficients of variation
lower than 1% have been obtained for the negative sample and
lower than 10% for the two positive samples.
LIMITATIONS
Bacterial contamination or repeated freeze-thaw cycles of specimens
may affect the detectable levels of specific IgM
GENERAL DIRECTIONS FOR A SAFE USE

Keep the laboratory clean and tidy and strictly follow the
procedural directions.

Do not eat, drink, smoke or apply cosmetics in a clinical lab.

Do not pipette solutions or samples by mouth.

Wear disposable gloves and overalls when handling reagents and
samples. Avoid direct contact.

Wash hands thoroughly after assay.

Thoroughly clean working area with proper detergent solutions.

Collect solid and liquid waste material in proper containers and
provide for disposal according to the local regulations.

Periodically check contamination level of operators and rooms.
Reagents containing serum

All components of human origin have been tested and found
negative for HBsAg, anti-HCV and anti-HIV antibodies. Since no
known test can guarantee, however, that products derived
from human blood will not transmit Hepatitis, AIDS or other
infectious diseases, these reagents should be handled as hazardous
material.
Hazardous Reagents

Stop Solution (Council Directive 88/379/EEC)
R36/38
Irritating to eyes and skin.
S2-26
Keep out of reach of children; In case of contact with
eyes, rinse immediately with plenty of water, and seek for medical
advice.
SUMMARY OF PROTOCOL












Prepare reagents
Pre-dilute samples 1:81 with BEIA System Sample Diluent
Dispense:
Qualitative Test
100L of Calibrator 0 (0 AU/mL) in duplicate
100 L of pre-diluted samples in single or duplicate
Quantitative Test
100 L of pre-diluted samples in single or duplicate
Incubate 60 minutes at R.T. (18-25°C)
Perform 4 washing cycles
Dispense 100 L of Ag-Mab-Conjugate
Perform 4 washing cycles
Dispense 100 L of Substrate-TMB
Dispense 100 L of Stop Solution
Read the O.D. at 450/620nm
Qualitative Test
A
B
C
D
E
F
G
H
Qual
Cal 0
Cal 0
Cal 10
Cal 10
Cal 120
Cal 120
P1
P2
Quantitative Test
2
P3
…
…
…
..
..
..
3
A
B
C
D
E
F
G
H
Quant
Cal 0
Cal 0
Cal 10
Cal 10
Cal 20
Cal 20
Cal 50
Cal 50
2
Cal 120
Cal 120
P1
P2
P3
….
….
….
3
BIBLIOGRAFIA / REFERENCES
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