46° Congresso Nazionale della Società Italiana di

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46° Congresso Nazionale SIBioC - Riassunti Poster
46° Congresso Nazionale della Società Italiana di
Biochimica Clinica e Biologia Molecolare Clinica
(SIBioC - Medicina di Laboratorio)
Roma, 13-15 ottobre 2014
Riassunti Poster
Codice Poster
Argomento
•
P001-P011
Varie
•
P012-P016
Patologie autoimmuni
•
P017-P018
Allergia
•
P019-P026
Analisi decentrate
•
P027-P030
Malattie infettive
•
P031-P033
Sport e nutrizione
•
P034-P088
Tecnologia, strumentazione e valutazione metodi
•
P089-P100
Patologia oncologica
•
P101-P118
Patologia cardiovascolare
•
P119-P130
Patologie renali
•
P131-P153
Ematologia
•
P154-P164
Coagulazione
•
P165-P188
Biologia molecolare clinica
•
P189-P195
Patologie genetiche
•
P196-P198
Farmacogenetica
•
P199-P210
Endocrinologia
•
P211-P215
Diabete e sindrome metabolica
•
P216-P219
Patologie epatiche
•
P220-P227
Controllo di qualità, standardizzazione, tracciabilità
•
P228-P236
Gestione del laboratorio, automazione e applicazioni informatiche
•
P237-P281, P305
Casi clinici
•
P282-P293
Farmacologia e tossicologia
•
P294-P299
Gravidanza, neonatologia e pediatria
•
P300-P303
Patologie neurologiche
•
P304
Patologie osteoarticolari
Nota dell’Editore: i riassunti sono stati riprodotti senza alcuna revisione dal materiale direttamente fornito dagli autori.
biochimica clinica, 2014, vol. 38, n. 5
429
P001
DEFINITION OF A MINIMUM DATA SET TO
ACCOMPANY INDICES OF BIOLOGICAL VARIATION
1,9
2,9
3,9
A. Carobene , F. Braga , C. Abdurrahman , R.
4,9
5,9
6
Prusa , P. Fernandez-Calle , T. Røraas , S. Sandberg
7
8,9
, W. Bartlett
1
Osp. San Raffaele, Milano, Italy
Osp. Sacco, Milano, Italy
3
Acibadem University, School of Med, Gülsuyu, Maltepe,
Istanbul, Turkey
4
University Osp. Motol, Prague, Czech Republic
5
Osp. Universitario La Paz, Madrid, Spain
6
Norwegian Quality Improvement of Primary Care
Laboratories (NOKLUS)
7
Haukeland University Osp., Bergen, Norway
8
Blood Sciences, Ninewells Osp. & Med. School,
Scotland, UK
9
Biological Variation WG, EFLM
2
Biological variation data are used by laboratory
professionals globally to enable interpretation of clinical
laboratory test results and to set quality standards. The
data are derived from varying populations with studies
utilising a variety of experimental models and approaches.
The data are of varying quality and sometimes poorly
characterised. These data are effectively reference data
and users of them need to be aware of the attributes
of the data that impact upon the transferability of
data across populations and time. There is a further
need for users to understand the uncertainty applying
to the estimates of published biological variation. The
Biological Variation Working Group (BVWG), set up by
the EFLM, have undertaken work to identify a minimum
data set (MDS) to accompany published indices of
within and between subject biological variations to enable
critical appraisal of their utility to prospective users.
The BVWG, as part of their remit to establish a critical
appraisal checklist for publication of biological variation
data, has studied existing literature and databases and
undertaken discussions to identify the MDS required by
users to enable transferability of biological variation data
safely, accurately and effectively. Results: Six main data
domains were identified with sub categories. The domains
with example sub categories are: - Target - analyte
and measurand, sample matrix, method characteristics.
Population characteristics- demographics, state of well
being, physical/physiological characteristics, medication.
Study Characteristics- study duration and design, power
of study to detect BV indices, model assumptions,
statistical approach. Data Characteristics- indices of
biological variability, confidence intervals, tests for model
assumptions. Publication Details- links to the original
publication. Data rating- new concept to be developed to
indicate the quality of the BV data against a set of key
criteria. The group has identified that wherever possible
international coding systems (e.g. LOINC, SNOMED)
should be used to facilitate the accurate transmission
of the relevant data. An MDS has been identified for
further development to enable safe, accurate and effective
transmission of biological variation data.
430
P002
GRANULOCYTE MACROPHAGE COLONYSTIMULATING FACTOR (GM-CSF) NEL LAVAGGIO
NASALE DI PAZIENTI CON FLOGOSI EOSINOFILA
CRONICA
1
1
2
2
E. De Corso , D. Lucidi , C. Autilio , R. Morelli , R.
2
1
1
Penitente , M. Battista , M. Romanello , G.
1
2
2
Paludetti , C. Zuppi , S. Baroni
1
Dipartimento di Scienze Chirurgiche della Testa e del
Collo, Università Cattolica del Sacro Cuore, Policlinico
Gemelli, Roma
2
Dipartimento di Diagnostica e Medicina di Laboratorio,
Università Cattolica del Sacro Cuore, Policlinico Gemelli,
Roma
Introduzione: Numerose infezioni croniche delle vie
aeree superiori sono caratterizzate dalla presenza
di ipereosinofilia tissutale. Diverse citochine, molecole
d’adesione, chemoattrattori e recettori sono implicati nella
regolazione del traffico e del reclutamento degli eosinofili
nel tessuto infiammatorio, ma i meccanismi fisiopatologici
appaiono complessi e non del tutto chiariti. In questo
studio abbiamo dasato il GM-CSF nel liquido di lavaggio
nasale di pazienti affetti da diversi tipi di flogosi rinosinusale eosinofila cronica, per ricercare una possibile
correlazione tra questa citochina, l’entità dell’infiltrazione
eosinofila ed il quadro clinico.
Metodi: Sono stati selezionati 70 pazienti (età media
41.8) con ipereosinofilia nasale cronica, distinti in: rinite
allergica persistente (gruppo 1), rinite non-infettiva nonallergica con sindrome eosinofila (gruppo 2), rino-sinusite
cronica con polipi (gruppo 3); 20 soggetti sani come
gruppo controllo. I pazienti sono stati sottoposti a
questionario per i “symptoms score”, endoscopia nasale
e test allergici, oltre al lavaggio nasale eseguito anche
ai controlli. I liquidi dopo centrifugazione, sono stati
conservati a -80°C fino al dosaggio, eseguito in una
singola seduta. Il GM-CSF è stato dosato con Quantikine
Human ELISA kits. La conta differenziale delle cellule è
stata effettuata con esame citologico microscopico del
tessuto nasale prelevato dal turbinato inferiore.
Risultati: Il GM-CSF era presente nel lavaggio nasale di
34/70 (48.57%) pazienti con una concentrazione media di
2.67±0.8 pg/mL; invece, in tutti i controlli eccetto uno era
indosabile. L’infiltrazione tessutale eosinofila è risultata
maggiore proprio nei 34 pazienti con GM-CSF dosabile
(49.4% vs. 39.28%; p <0.05) e la percentuale di eosinofili
correlava significativamente con i livelli della citochina. Il
GM-CSF mostrava nel gruppo 2, rispetto ai gruppi 1 e 3,
valori medi più alti (2.9 pg/mL vs.1.6 pg/mL e 1.8 pg/mL;
p <0.05) che correlavano significativamente anche con lo
score clinico.
Conclusione: I nostri dati confermano il ruolo del GMCSF nella complessa regolazione del reclutamento degli
eosinofili nel tessuto infiammatorio e nello sviluppo della
ipereosinofilia nasale nei disordini rino-sinusali eosinofili
cronici.
P003
SUPAR NEL LIQUIDO SEMINALE: POSSIBILE
BIOMARKER DI FLOGOSI?
1
1
2
2
R. Morelli , C. Autilio , D. Milardi , G. Grande , C.
1
1
Zuppi , S. Baroni
1
Roma
2
Istituto Scientifico Internazionale Paolo VI di Ricerca
sulla Fertilità ed Infertilità Umana, Università Cattolica
del Sacro Cuore, Policlinico Gemelli, Roma
Introduzione: Le patologie infiammatorie del sistema
riproduttivo maschile rappresentano una possibile causa
di infertilità, ma sono spesso clinicamente silenti e
difficili da diagnosticare. Per la diagnosi eziologica,
infatti, la spermiocoltura non è sufficiente in quanto
le contaminazioni da commensali uretrali possono
causare falsi positivi. Individuare nel liquido seminale
un biomarcatore di flogosi potrebbe, pertanto, essere
utile al clinico per l’inquadramento diagnostico e
terapeutico di pazienti con spermiogrammi patologici.
Il suPAR (soluble urokinase-type plasminogen activator
receptor), considerato marker di infiammazione sistemica,
sembrerebbe coinvolto nella regolazione di alcune
funzioni spermatiche. Nel nostro studio abbiamo valutato
la presenza di suPAR nel plasma seminale come possibile
marker di infezione/infiammazione del tratto genitale.
Metodi: Abbiamo arruolato 96 soggetti sottoposti a
spermiogramma (linee guida WHO, V edizione) e
spermiocoltura. Dopo centrifugazione, il plasma seminale
è stato conservato a -80°C per poi dosare il suPAR
(suPARnostic ELISA, ViroGates), le proteine totali (PT)
e la proteina C-reattiva (PCR) (Roche), la procalcitonina
(PCT) (Brahms) e la perossidasi leucocitaria (PL) (ADVIA
2120i). I valori di suPAR sono stati espressi come ratio
suPAR/PT.
Risultati: La spermiocultura è risultata positiva in 40/96
soggetti. In tutti i campioni analizzati le concentrazioni
di PCR, PCT e PL non variavano. I valori di suPAR
erano significativamente più elevati (p <0.001) nelle
spermiocolture positive (M: 2.26 ng/g, Perc.25–75:
1.64-3.64 ng/g) rispetto a quelle negative (M: 1.21 ng/
g, Perc.25-75: 1.01-1.41 ng/g). Abbiamo selezionato un
sottogruppo (33/96), con colture positive e pH<7.6 o
colture negative e pH>8.0, in cui i valori di suPAR (p
<0.001) cadevano in un range intermedio (M: 1.59 ng/g;
Perc. 25-75: 1.33-1.88 ng/g), suggerendo una possibile
correlazione con lo stato flogistico.
Conclusioni: Lo studio, sebbene preliminare, suggerisce
una diretta correlazione tra i livelli di suPAR e l’infezione /
flogosi del sistema riproduttivo maschile. Ulteriori studi
sono comunque necessari per meglio chiarire il suo ruolo
fisiopatologico nel liquido seminale e la sua utilità clinica
e terapeutica.
P004
TAURINE IN THE INTERPHOTORECEPTOR MATRIX
M.C. Gueli
Dip. di Biomedicina Sperimentale e Neuroscienze
Cliniche (BIONEC), Università di Palermo
Taurine (Tau) is the most abundant amino compound free
in the retina. It is concentrated in the photoreceptor inner
segment, in the outer nuclear layer and in the synapses.
The retina synthesizes and receives Tau from choroidal
blood via the pigment epithelium (PE). The high content
in the retina suggest the possibily of verifying whether
it was present in the interphotoreceptor matrix (IPM),
which occupies the subretinal space. In this study we
have determined the Tau level in the IPM, separating it
from other soluble amino compounds. Bovine eyes were
obtained from local slaughterhouses and were bisected in
darkness.
After removal of the vitreos body, the eye cup was washed
with 0.14 M NaCl-5mM sodium phosphates, pH 7.4.
Preparation of the IPM was carried out by detaching the
retina from eye cup using the method of Pfeffer,1983.
PE were collected using the method of Feeney-Burns,
1982. Retinas deprived of IPM were homogenized using
0.32 M sucrose-50 mM phosphates, pH 7.2. Free amino
compounds in the various preparations were separated
using the procedure described by Borum, 1985.
Levels of Tau in bovine IPM; PE (homogenate and
sonicated); retina (homogenate and sonicated) were
(804.10 ± 79.22; 83.91 ± 7.90 and 85.30 ± 8.20;
5,170.50 ± 314.82 and 5,209.00 ± 498.00 nmoles/eye),
respectively. The chromatographic profile of a.a. in the
IPM was qualitatively more similar to that of retina than to
that of PE.
As expected, GABA was absent in the PE preparations.
It was not surprising to find Tau and amino compounds
in the IP space because of the transit role of this retinal
area. We believe that three sites could be considered for
the origin of Tau in the IPM. One is the PE, which takes up
Tau from the blood and accumulates it avidly, to send it via
the membrane apical process to photoreceptor cells. The
other possible sources are Mùller cells and photoreceptor
cells, which have the largest Tau pool.
In conclusion, the great similarity between the amino acid
profile in the IPM and in the retina suggests that a pool
of amino compounds and Tau might be present in the
subretinal space. Among the roles suggested for the IPM
is that of a route by which nutrients and other small
molecules reach the retinal photoreceptor from the apical
process of the PE cells.
431
P005
MECHANISM OF ALUMINIUM BIO-MINERALIZATION
IN THE APOFERRITIN CAVITY
1
1
2
4
M. Chiarpotto , G. Ciasca , M. Vassalli , G. Campi , A.
5
6
6
6
3
Ricci , B. Bocca , A. Pino , A. Alimonti , P. De Sole , M.
1
3
Papi , C. Rossi
1
Physics Institute, Catholic University, Rome, Italy
Institute of Biophysics, National Research Council
Genoa, Italy
3
Departement of Clinical Biochemistry, Catholic
University, Rome, Italy
4
Institute of Crystallography, CNR, Monterotondo Rome,
Italy
5
Deutsches Elektronen-Synchrotron DESY, Hamburg,
Germany
6
Applied Toxicology Laboratory, National Health Institute
Rome, Italy
2
The frequent isolation of Al-ferritin complexes, especially
from Alzheimer Disease (AD) patients, contributes to
strengthen the suggested role for ferritin in metal toxicity.
The observed increase of Al bound to brain ferritin has
been indeed proposed as a detoxification mechanism
which protects the brain metabolism from Al that cannot
be cleared by other mechanisms. By the way, the
mechanism behind the Al complex formation in vivo is still
controversial.
In this work, we investigated the in vitro Al-apoferritin
binding, with the aim to elucidate the mechanism behind
the formation of Al-ferritin complexes in-vivo [1]. To this
purpose, we studied the mineralization of Al in its ionic
and complexed form with citrate demonstrating that high
Al levels found in clinical studies can be obtained only
conveying Al by small physiological ligands.
The binding of Al to apoferritin was been investigated by
Sector Field Inductive Coupled Mass Spectroscopy (SFICP-MS) and Small-Angle X ray Scattering (SAXS).
In biological systems, aluminum can be found in its ionic
form or complexed with small ligands which increase its
solubility. Therefore, we focus on both cases, ionic Al and
Al complexed with citrate, the most likely Al ligand in blood.
To account for the latter, we incubated apoferritin 0.3 lM
in the presence of different concentrations of Al-citrate
ranging from 0.125mM to 2mM and in the presence of Fe
0.45 mM.
The number of mineralized Al atoms per apoferritin
molecule increases linearly with the Al-citrate
concentration in the reaction solution up to an Al content
of about 1250 atoms per apoferritin molecule. Such an
elevated Al amount is similar to that recently found in-vivo
in the serum ferritin
extracted from AD patients [1]. These results suggest that
this high amount of aluminum present in the apoferritin is
likely conveyed by small ligands, such as citrate, which
increases its solubility in physiological condition.
1. De Sole P, Rossi C, Chiarpotto M, et al. Possible
relationship between Al/Ferritin complex and Alzheimer's
disease. Clin Biochem 2013;46:89-93.
432
P006
VALORE PROGNOSTICO DEI ROMS NEI PAZIENTI
CRITICI RICOVERATI IN RIANIMAZIONE
1
1
2
3
C. Rossi , P. De Sole , M.A. Pennisi , M. Calabrese , A.
1
2
2
Minucci , M. Antonelli , L. Montini
1
Dip. di Medicina di Laboratorio, Lab. di Biochimica
Clinica, Università Cattolica, Roma
2
Ist. di Anestesia e Rianimazione, Università Cattolica,
Roma
3
Dip. di Medicina Vascolare, Università Cattolica, Roma
Introduzione: Nei pz con processi infiammatori acuti
e danno d’organo c’è aumento dello stress ossidativo
e quindi della produzione dei ROMs (specie reattive
dell’ossigeno e dei suoi metaboliti). E’ stato osservato
che i ROMs hanno un ruolo nel regolare la risposta
dell’organismo verso insulti patogeni.
Lo scopo di questo studio è quello di valutare la
correlazione tra produzione temporale dei ROMs e il
tempo di sopravvivenza nei malati critici ricoverati in
rianimazione.
Materiale e metodi: Nello studio sono stati inclusi
33 pazienti: 12 con sepsi grave e 21 con shock
settico. Per ogni paziente sono state eseguite in
media 4 determinazioni dei Roms. In corrispondenza di
ogni determinazione è stato determinato un indice di
danno d’organo (SOFA score: sequential organ failure
assessment).
Il livello plasmatico è stato determinato con un kit
in commercio della Diacron-Italia, automatizzato su
Olympus AU640.
Risultati: L’analisi statistica è stata eseguita utilizzando
il Mann-Whitney test, il t-test e la regressione lineare,un
p<0.005 è stato considerato statisticamente significativo.
Il valore mediano dei ROMs e del SOFA nei pz
deceduti era statisticamente diverso da quello dei vivi,
rispettivamente: 164 U.Carr vs 325 (p=0.0023) e 9 vs 7
(p=0.0066).
Prendendo in considerazione il valore assoluto dei ROMs
(<150 U.Carr) oppure una riduzione dei ROMS il numero
dei pz con tale caratteristica è di 1/13 nel gruppo dei vivi
e di 15/20 nel gruppo dei deceduti.
Nei pz deceduti, in cui il valore dei ROMs si abbassa
oltre 150 U.Carr (N=15), il tempo con cui si raggiunge
tale valore correla con il tempo di sopravvivenza (r2=
0.87, p <0.001); nello specifico abbiamo individuato un
sottogruppo di 10 pz in cui il valore dei ROMs era <150 già
alla prima determinazione e di questi 8 avevano un tempo
di sopravvivenza inferiore ad 1 settimana.
Nei pz deceduti il coefficiente di variazione del SOFA
era di 39.2% vs 63.84% dei sopravvissuti, mentre il
coefficiente di variazione dei ROMs nei deceduti era del
78.1% vs 41.5% dei sopravvissuti.
Discussione: Concludendo, i ROMs esprimono
qualitativamente la stessa informazione del SOFA però
hanno una potenza significativamente maggiore nel
discriminare il gruppo dei sopravvissuti dai deceduti.
Magder S. Reactive oxygen species: toxic molecules or
spark of life? Crit Care 2006;10:208.
P007
BONE TURNOVER MARKERS IN MULTIPLE
MYELOMA PATIENTS: AN EVIDENCE BASED
METHOD FOR CLINICAL LABORATORY
P008
DIAGNOSTIC UTILITY OF PROCALCITONIN
DOSAGE AND APPROPRIATENESS IN THE
REQUESTS IN AOSTA HOSPITAL
V. Pecoraro , L. Roli , L. Germagnoli , G. Banfi
E. Perri, R. Daniele, M. Di Benedetto
1
S. C. Analisi Cliniche, Osp. "U. Parini", Aosta
1
2
3
1
IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi, Milano
2
Laboratorio di Patologia Clinica, Azienda USL Modena,
Modena
3
Laboratorio Unilabs Ticino, Breganzona, Svizzera
Background: Multiple Myeloma(MM) is characterized by
the progressive destruction of bone tissue due to the
uncontrolled immunoglobulin proliferation. Bone turnover
markers(BTMs) may represent a non-invasive method to
assess the bone involvement and to predict the risk of
1
bone morbidity.
Objective:This systematic review evaluated the impact of
changes in BTMs levels and evaluate the prognostic role
in MM patients.
Methods: We searched Medline, Embase, WOS and
Scopus. All eligible articles were examined and the
risk of bias was evaluated by the QUIPS checklist.
Results about C- and N-terminal telopeptide type I
collagen (PICP, PINP), osteocalcin (OC), bone alkaline
phosphatase (BAP), C- and N-terminal cross-linking
telopeptide type I collagen (CTX, NTX), C-terminal crosslinked telopeptide type I collagen (ICTP), tumor necrosis
factor related activation induced cytochine (RANKL) and
osteoprotegerin (OPG) were extracted. We recorded
design and experimental characteristics. Weighted mean
difference and hazard ratios were pooled.
Results: We included 30 studies and more than 2500
patients. The majority of studies (50%) used ELISA, 10
studies used RIA and only 4 studies not reported the
laboratory methods. In MM patients, the concentration
of NTX and ICTP increased by about 45% and 36%
respectively. Instead, the concentrations of BAP and
OC reduced by about 43% e 27% respectively. High
levels of ICTP were predictive of bone events (HR
1.18) and they were associated with poor survival (HR
1.08). NTX correlated with progression disease, but
it was not statistically significant (HR 1.02). Most of
the included studies were considered to be at high
risk of bias, in fact the majority of studies did not
reported essential information about the methodology, the
reporting of the results is often incomplete too. Withinstudies heterogeneity was high.
Conclusions: BTMs measurement may be very useful
in the management of MM patients, but better method
standardization is needed for implementing in clinical
practice. Further high-quality randomized trials are
needed to conclusively establish their utility.
1. Terpos E, Dimopoulos MA, Sezer O, et al. The use
of biochemical markers of bone remodeling in multiple
myeloma: a report of the International Myeloma Working
Group. Leukemia 2010;24:1700-12.
Procalcitonin (PCT) is a peptide consisting of 116
amino acids with a molecular weight of 14 kDa.
The PCT belongs to the family of proteins called
calcitonin gene-related peptide-amylin-procalcitoninadrenomedullin family (CAPA). In physiological conditions
plasma concentrations of PCT are below 0.05 ng/mL,
whereas in the presence of bacterial infection and sepsis
the PCT levels increase quickly. The PCT values found in
plasma correlate whit the severity of the infection and with
the response to antibiotic treatment. In addition, low PCT
values allow to exclude the presence of bacterial infection.
The aim of this study is to evaluate the diagnostic utility of
PCT and the appropriateness in the use by the clinicians
of the Aosta “U. Parini” Hospital.
In 2013 departments requiring more PCT dosages
were Intensive Care Unit, Oncology, Medicine, Infectious
Diseases and Coronary Care Unit. From 2009 to 2013
we observed an important increase in the majority of
departments (96% in Coronary Care Unit, 279% in
Infectious Diseases department and 636% in Medicine
where the requests were 35 in 2009 and 273 in 2013).
Only in very few cases (below 1%) low PCT values were
associated to positive bacterial cultures confirming the
negative predictive value of procalcitonin already reported
in literature. As regards the diagnostic utility, there was a
rapid increase of PCT starting before than other markers
of infection. In detail, in all clinical cases considered during
the early stage of bacterial infection PCT values were
very high (over 50 ng/mL) while the C-reactive protein
(CRP) values did not show significant raises comparing
with the previous ones and the bacterial researches were
negative.
In conclusion, it is necessary a more appropriate request
of PCT by our clinicians and it should be encouraged
the use of IPAT (Individual, Patient-adapted, Antibiotic
Treatment), i.e. an antibiotic therapy guided by PCT
whose effectiveness has been recently assessed. Clearly,
this new approach is possible only in departments
achieving already a good experience in the PCT use and
a proper interpretation of results.
Simon L, Gauvin F, Amre DK, et al. Serum Procalcitonin
and C-Reactive Protein Levels as Markers of Bacterial
Infection: A Systematic Review and Meta-analysis. Clin
Infect Dis 2004;39:206-17.
433
P009
CUTOFF VALUES FOR SIGNIFICANT BACTERIURIA
USING UF1000 FLOW CYTOMETER ANALYZER
F. De Gregorio, A. De Stefano, M. Pieri, F. Duranti, S.
Bernardini, R. Zenobi, M. Dessi
Department of Experimental Medicine and Surgery, "Tor
Vergata" University Hospital, Rome (Italy)
Several studies suggested that urinary tract infections
(UTI) are the most frequent infections in the community
and in the hospitals. Urine culture is essential to
confirm that the patient has UTI and to ensure that the
causative agent is identified so an appropriate therapy
can be started. This study was undertaken to evaluate
urine constituents, including bacteria, by means of the
UF-1000i™ flow cytometer (1).
In this study we have analyzed urine samples and
determined bacteria levels in order to establish a cut off to
reduce the number of specimens cultured.
We have performed the urine screening of 1583 healthy
non-hospitalized patients. All these urine samples were
tested by using a Sysmex UF-1000i analyzer. The
UF-1000i is a fluorescence flow cytometer based on diode
laser technology together with hydrodynamic focusing
conductometry. Moreover all urine specimens included
in this study were tested at the same time by culture.
Statistical analysis has been performed by ROC curve
analysis to determine cutoff value, diagnostic sensitivity
and specificity of bacteriuria.
The results obtained with urine screening by Sysmex
UF-1000i for UTI showed a cut-off value of 800 bacteria/
µL with diagnostic performance in terms of sensitivity and
specificity of 76% and 90% respectively.
The bacterial screening generated using this flow
cytometer, may be useful to exclude UTI and may
contribute to the reduction of unnecessary urine cultures
and empirical antibiotic prescriptions. Furthermore the
screening by Sysmex UF-1000i could have an important
impact in the reduction of National Healthcare System
costs.
1. Manoni F, Fornasiero L, Ercolin M, et al. Cutoff
values for bacteria and leukocytes for urine flow
cytometer SysmexUF-1000i in urinary tract infections.
Diagn Microbiol Infect Dis 2009;65:103-7.
434
P010
DOSAGGIO DI PEPSINOGENO I E II, UTILIZZO
DEL LORO RAPPORTO NELLA VALUTAZIONE DI
GASTRITE ATROFICA CRONICA
M. Brugia, V. Viola, F. Balducci, M. Piaggesi, G.
Ciarrocchi, M. Tocchini
Lab. di Biochimica Clinica e Microbiologia, azienda
Ospedali Riuniti, Ancona
Premesse e scopo dello studio: La Gastrite Atrofica è
definita come un processo infiammatorio cronico a livello
della mucosa gastrica, che conduce alla progressiva
perdita delle cellule ghiandolari dello stomaco. È
considerata una condizione pre-cancerosa, e pertanto la
sua diagnosi precoce risulta particolarmente importante.
Lo scopo dello studio è stato di valutare l’utilizzo di
marcatori sierologici quali pepsinogeno I; pepsinogeno II;
il loro rapporto, gastrina e anticorpi anti-Helicobacter pylori
possano essere introdotti in un approccio preliminare.
Recenti studi hanno dimostrato una correlazione tra la
diminuzione dei livelli di Pepsinofeno e del rapporto
PEPI/PEPII quando la gastrite atrofica del corpo-fondo
peggiora.
Materiali
e
metodi:
Sono
stati
analizzati
retrospettivamente 84 campioni di sangue, mantenuti
congelati a -20°C, di 79 pazienti (33 maschi e 46 femmine,
età media 56,5 anni) pervenuti presso il nostro laboratorio.
I marcatori biologici utilizzati nello studio sono: PGI e
PG II dosati con metodo chemiluminescente (CMIA)
(Abbott Architect i2000); la gastrina con metodo
chemiluminescente (Immulite 2000, Siemens HealthCare
Diagnostics); gli anticorpi anti-Helicobacter pylori (antiHp) con metodo ELISA (DSX Automated ELISA System
Diamedix Dynex). I cut-off utilizzati nella valutazione dei
dati sono stati:
Pepsinogeno I (PGI) <70 ng/mL
PG I/PG II <3
GASTRINA >115 pg/mL
anti-Helicobacter pylori IgG >11,6 IA ; IgA >10 U/ml.
Risultati: Dei 79 pazienti
5 avevano valori PG I, PG II, PGI/PGII, gastrina inferiori
ai cut-off e non presentavano infezioni da H. pylori
2 PG I, PG II, PGI/PGII, gastrina inferiori ai cut-off,
presentavano infezioni da H. pylori;
38 PG I <70 ng/mL e/o rapporto PGI/PGII <3, gastrina
elevata e infezione da H. pylori
8 PG I <70 ng/mL e/o rapporto PGI/PGII <3, gastrina
elevata non presentavano infezioni da H. pylori
Conclusioni: I risultati ottenuti mostrano che il quadro
sierologico può fornire, a fonte di quadri clinici riferibili
alle prime vie digestive, utili informazioni della presenza
di gastrite, di H. pylori e del funzionamento della gastrina
che governa la produzione di acido cloridrico. Si può
ritenere pertanto che l’utilizzo dei marcatori sierologici
possa aumentare l’appropriatezza di esami invasivi come
la gastroscopia.
P011
GASTROPANEL: BIOPSIA GASTRICA
SIEROLOGICA... FUNZIONALE!
M.A. Isgro', A. Giannace, C. Zuppi, T. De Michele
Policlinico Gemelli, Roma
Il GastroPanel® (EuroClone®, BIOHIT HealthCare) è
un innovativo test di laboratorio in grado di fornire
utili informazioni riguardo allo stato funzionale della
mucosa gastrica, mediante un semplice prelievo di
sangue venoso. Il test prevede la misura di Pepsinogeno
I e II, Gastrina 17 rapida ed Anticorpi IgG anti
Helicobacter pylori. I risultati vengono poi elaborati
mediante il software GastroSoft®, una rete neurale in
grado di fornire le seguenti indicazioni diagnostiche:
mucosa sana e normale, gastrite non atrofica, gastrite
atrofica, infezione da H. pylori, predisposizione allo
sviluppo di ulcera peptica e degenerazione neoplastica.
Nonostante le numerose informazioni che il GastroPanel
è in grado di fornire, non sono state ancora formulate
specifiche linee guida riguardo al suo utilizzo clinicodiagnostico, facendo ritenere erroneamente il suddetto
test una valida alternativa alla gastroscopia. Sulla base
della nostra esperienza, riteniamo che il GastroPanel
andrebbe effettuato, al fine di valutare lo stato funzionale
della mucosa gastrica: 1) in soggetti giovani, senza
familiarità per cancro gastrico, in presenza di sintomi
clinici quali dispepsia, reflusso, pirosi; 2) come screening
di popolazione per infezione da H. pylori e 3) nel followup del paziente 6 mesi dopo terapia di eradicazione
per H. pylori. Può risultare inoltre un utile complemento
alla gastroscopia quando i dati istologici dell’esame
endoscopico non siano in grado di dare una spiegazione
alla sintomatologia del paziente. Di contro, pazienti
con anemizzazione, anoressia, calo di peso, sarcofobia,
ematemesi, familiarità per ulcera peptica e cancro
gastrico, dovrebbero essere indirizzati direttamente alla
gastroscopia. Concludendo, in alternativa alla definizione
di GastroPanel data da Di Mario et al. nel 2003
di “biopsia sierologica”, alla luce delle informazioni
clinico-funzionali che il test GastroPanel è in grado di
fornire, proponiamo una definizione in termini di “biopsia
sierologica funzionale”, al fine di sottolinearne il duplice
aspetto di complementarietà ed al contempo autonomia
rispetto alla gastroscopia.
P012
ORMONE ANTI-MULLERIANO E RISERVA OVARICA
IN PAZIENTI ADULTE AFFETTE DA LUPUS
ERITEMATOSO SISTEMICO E IN PAZIENTI ADULTE
AFFETTE DA ARTRITE IDIOPATICA GIOVANILE
1
1
2
2
C. Di Mario , S. Canestri , A. Barini , A. Barini , L.
1
1
1
1
Messuti , M.R. Gigante , B. Tolusso , M.C. Miceli , E.
1
Gremese
1
Istituto di Reumatologia e Scienze Affini, Divisione di
Reumatologia, Università Cattolica del Sacro Cuore
(UCSC), Roma
2
Dipartimento di Medicina di Laboratorio, Istituto di
Biochimica e Biochimica Clinica, Università Cattolica del
Sacro Cuore (UCSC), Roma
Introduzione: I livelli sierici di ormone anti-Mulleriano
(AMH), prodotto nell’ovaio dalle cellule della granulosa
sono proporzionali al numero dei follicoli preantrali e
rappresentano un ottimo marcatore predittivo della riserva
ovarica. Scopo dello studio è quello di confrontare i
livelli sierici di AMH in pazienti con Lupus Eritematoso
Sistemico (LES), in pazienti con Artrite Idiopatica
Giovanile (AIG) e nei controlli sani, per valutare se la
malattia o le terapie effettuate possano influenzare la
riserva ovarica.
Materiali e metodi: Sono state valutate 75 pazienti
con LES (età media: 30.2±6.3 anni, durata di malattia
8.4±5.1 anni e il 33% con coinvolgimento d’organo
severo) e 29 con AIG (età media 21.6±2.8 anni e
durata di malattia 12.0±6.1 anni, DAS: 1.25±0.65), con
controlli sani paragonabili per età e sesso alle due coorti
separatamente. Le concentrazioni di AMH sono state
misurate su siero con metodica ELISA utilizzando il kit
AMH Gen II (Beckman Coulter).
Risultati: Nei pazienti con LES i livelli sierici di AMH
erano sovrapponibili ai controlli (4.3±3.3 vs 5.2±3.2 ng/
mL; p=0.15). Le pazienti con impegno d’organo maggiore
presentavano concentrazioni di AMH inferiori rispetto ai
controlli (3.4±2.7 ng/mL; p=0.04). Nessuna differenza
è stata riscontrata tra pazienti con impegno d’organo
minore (4.7±3.4 ng/mL) e controlli (p=0.45). Le pazienti
trattate con ciclofosfamide presentavano livelli di AMH
inferiori rispetto ai controlli (3.3±4.0 ng/mL; p=0.04) e
tendenzialmente più bassi rispetto ai pazienti non trattati
con ciclofosfamide (4.5±3.0 ng/mL; p=0.09).
Le pazienti con AIG presentavano livelli di AMH simili
ai controlli di pari età e sesso(6.1±2.3 vs 6.3±2.4 ng/
mL; p=0.77). Venti pazienti (69%) sono state trattate con
methotrexate (periodo 4.2±3.6 anni) e 15 (51.7%) con
farmaci anti TNF (periodo 4.9±1.9 anni), 12 (41.3%) con
terapia di combinazione; non sono emerse differenze
significative nei livelli di AMH tra i diversi sottogruppi di
trattamento.
Conclusioni: La riserva ovarica sia nelle pazienti con LES
sia con AIG era in generale paragonabile ai controlli sani.
Una riduzione si osserva nelle pazienti con LES trattate
con ciclofosfamide e con malattia più severa mentre nelle
AIG i livelli di AMH non sembrano essere compromessi
dalla presenza e dalla durata di malattia e dalle terapie
assunte.
435
P013
ASSOCIAZIONE DI AUTOANTICORPI
ANTIFOSFOLIPIDI CON DIFFERENTI SPECIFICITA'
ANTIGENICHE E CORRELAZIONE CON LE
MANIFESTAZIONI CLINICHE
P014
EMA BIOPSY IN SUSPECTED COELIAC DISEASE:
CORRELATION WITH SEROLOGICAL MARKERS
AND HISTOPATHOLOGICAL FINDINGS
1
1
1
1
G. Lobreglio, S. Serra, M. Renis
G. Mazzei , L. Ferrari , R. Casnici , M.E. Manfredini , M.
1
1
2
1
Arrigoni , P. Nolli , E. Iiritano , S. Testa
U.O. Patologia Clinica, Presidio Ospedaliero "Vito
Fazzi", ASL Lecce
1
Introduzione e obiettivi: La sindrome da anticorpi
anti fosfolipidi (APS) è caratterizzata dalla presenza
simultanea e/o dalla progressiva comparsa nello
stesso paziente di autoanticorpi con specificità
diretta verso differenti antigeni cellulari rappresentati
da fosfolipidi, proteine associate o dalla loro
combinazione. L’associazione tra anticorpi anti fosfolipidi
(aPL), evidenziati dalla positività del test per il
Lupus Anticoagulant (LAC) e/o del test per gli
anticorpi anticardiolipina (aCL) e/o anti-β2-glicoproteina I
(antiβ2GPI) correla maggiormente con eventi trombotici
e patologie della gravidanza. Lo scopo del lavoro è
stato quello di valutare la tipologia di anticorpi presenti,
eventuali associazioni e correlazioni con le manifestazioni
cliniche.
Materiali e metodi: Lo studio è stato condotto su
70 pazienti, provenienti dai diversi dipartimenti di un
ospedale di medie dimensioni, in un periodo di 17 mesi:
da Ottobre 2012 a Marzo 2014. L’età media dei soggetti
esaminati era di 51 anni (range: da 16 a 85 anni),
25 (35,7%) di sesso maschile e 45 (64,3 %) di sesso
femminilee. Nei campioni di siero la ricerca degli anticorpi
aCL e antiβ2GPI è stata eseguita con metodica EIA (DIA
MEDIX anti-Cardiolipin IgG/IgM e anti-β2-Glycoprotein I
IgG/IgM), mentre la ricerca qualitativa e la conferma della
presenza del LAC su plasma citratato è stata eseguita
con il test integrato HemosIL dRVVT Screen e HemosIL
dRVVT Confirm (I L), basati sul Tempo di Veleno di Vipera
Russel diluito.
Risultati e conclusioni: Dei 70 pazienti esaminati, 27
(38,6%) erano negativi alla ricerca degli anticorpi aPL
e 43 (61,4%) positivi. Di questi ultimi: 19 risultavano
positivi solo al LAC e 4 solo ad aCL. 13 presentavano
doppia positività, di cui: 8 verso LAC e aCL, 2 verso
il LAC e antiβ2GPI e 3 verso aCL e antiβ2GPI. 7
manifestavano positività per tutti i tipi di aPL ricercati.
Alla verifica degli esiti clinici tutti i pazienti con tripla
positività presentavano eventi trombotici arteriosi e/o
venosi (frequenza 100%) e perdita fetale ricorrente. Dei
13 soggetti con doppia positività, 7 presentavano eventi
tromboembolici o patologie ostetriche (frequenza 53,8%);
tra i 19 soggetti con singola positività solo 3 presentavano
manifestazioni cliniche (frequenza 15,8%).
436
U.O Lab. Analisi, Az. Ist. Osp. Cremona
U.O. Gastroenterologia, Az. Ist. Osp. Cremona
2
Background: EMA antibodies can be detected in the
supernatants of cultured intestinal biopsies from CD
patients with Ema biopsy (EB) Eurospital® kit.
Material and methods: 46 patients (12M/26F, mean age
38.4 years) with a CD clinical suspect underwent antitTG, IgA serum assay and upper endoscopy with biopsy.
Duodenal biopsies were performed in order to collect 4
biopsies for histological examination and 2 biopsies for
EB. These specimens were cultured for 72 hours at 37 °C
with EMA biopsy Eurospital® kit and next detection in IFA.
Results: 15 of 46 patients had positive serological markers
with villous atrophy at histological examination (Marsh IIIA
or more). 13 of these 15 patients had positive EB findings
(86.7%); 28 of 46 patients had both serological markers
and histological findings (including Marsh I with H. pylori
infection) negative. All of these 28 patients had negative
EB findings (100%). 3 of 46 patients had discordance
between serological markers and histopathology. EB was
positive in 1 patient with negative anti-TTG and Marsh
IIIB at histological findings; EB was also positive in 1
patients with both anti-tTG and histology negative; EB was
negative in 1 patient with positive serological markers and
negative histology.
Conclusions: In our series EB well agrees with serological
and histological findings. EB is an useful tool and it
could increase the diagnostic rate of CD especially
in patients on gluten-free diet, negative serological
profile or discordance between serological markers and
histopathological findings.
©
P015
VARIAZIONE DEI LIVELLI PLASMATICI DELLE
CITOCHINE IN PAZIENTI AFFETTI DA LUPUS
ERITEMATOSO SISTEMICO
1
1
1
2
S. Pinna , S. Pasella , E. Canu , P. Pileri , V.
1
1
2
3
Ventura , I. Vidili , A. Masala , M. Deiana , A.
1
1
Zinellu , L. Deiana
1
Biochimica Clinica e Biologia Molecolare Clinica, Dip.
Scienze Biomediche, Università di Sassari
2
Patologia Medica, AOU Sassari
3
Ass. "Isola dei centenari", Sassari
Il Lupus Eritematoso Sistemico (LES) è una malattia
autoimmune sistemica nella quale vengono coinvolti
diversi organi. In questa patologia si osserva
un’elevata produzione di autoanticorpi e deposizione
di immunocomplessi, che danno luogo al successivo
fenomeno autoimmune. Da diversi studi presenti in
letteratura è emerso un ruolo cruciale di varie citochine
nella patogenesi del LES. Le citochine sono fattori
solubili, coinvolti nella differenziazione, maturazione e
attivazione delle diverse cellule immunitarie. Una migliore
comprensione del loro funzionamento e della loro
espressione potrebbe essere utile per la progettazione di
biomarcatori e agenti terapeutici.
In collaborazione con la clinica di Patologia Medica
dell’AOU di Sassari sono stati arruolati 21 pazienti
affetti da LES, 12 pazienti affetti da artrite reumatoide
(AR) e 21 controlli sani abbinati per sesso ed età.
Sono stati determinati i livelli plasmatici di 18 citochine
simultaneamente per ogni campione tramite lo strumento
Bio-Plex MAG PIX Multi Reader (Biorad, tecnologia
Luminex). L'analisi statistica è stata effettuata con il
Kruskall Wallis Test e il metodo di Dunn; sono state
considerate solo le citochine statisticamente significative
(p-values <0,05). Abbiamo osservato una differente
espressione di 13 citochine, di cui 7 (MIP-1ß, IL-5, IL-7,
IL-1ra, IP-10, IFN-γ, IL-1ß) iperespresse solo nei pazienti
LES, 5 (IL-6, IL-9, IL-10, TNFα, IL-13) solo nei pazienti
AR e 1 (MCP-1) sia nei pazienti LES che AR rispetto ai
controlli sani. Sebbene non esista una omogeneità dei
risultati riportati in letteratura, i nostri dati al momento
confermano quelli presenti in alcuni lavori scientifici per
quanto riguarda gli aumentati livelli di IP-10, MCP-1,
IL-1ra e IFN-γ.
Il completamento dello studio prevede l’ultilizzo di curve
R.O.C (Receiver Operating Characteristic) per l’analisi dei
dati che ci permettano di discriminare tra soggetti sani e
pazienti affetti da LES con una performance diagnostica
significativa. Crediamo che questo tipo di studio possa
essere utile per definire meglio i complessi meccanismi
di alterazione nella produzione delle citochine che si
osservano nel LES.
P016
IMPATTO DELL’APPLICAZIONE DELLE LINEE
GUIDA MINISTERIALI PER LA DIAGNOSI
SIEROLOGICA DI CELIACHIA SULL’ATTIVITA' DEL
LABORATORIO ANALISI DELL’AZIENDA ISTITUTI
OSPITALIERI DI CREMONA
G. Mazzei, L. Ferrari, R. Casnici, M.E. Manfredini, P.
Nolli, M. Arrigoni, S. Testa
Lab. Analisi, Az. Ist. Osp. Cremona
Background: L’applicazione delle linee guida Ministeriali,
per la diagnosi sierologica della Malattia Celiaca è stata
applicata rigidamente, all’interno della nostra U.O., da
ottobre 2010, prevedendo in fase diagnostica il dosaggio
delle Transglutaminasi IgA e delle IgA totali. Le richieste
non appropriate sono commentate con brevi note che
motivano la variazione prescrittiva. Si è voluto pertanto
valutare l’impatto sia dei dati qualitativi (nuovi casi di
possibili celiaci), che quantitativi (n° di esami totali per la
diagnosi sierologica di MC) rispetto agli anni precedenti,
2008 e 2009, al nuovo approccio.
Materiali e metodi: Prima del 2010 per la
diagnosi sierologica di malattia celiaca si eseguivano
esclusivamente gli esami prescritti. Successivamente
all’applicazione delle linee guida vigenti, vengono testate
le Transglutaminasi IgA e le IgA totali, con esecuzione
degli anticorpi anti-Endomisio IgA solo come test di
conferma dei valori dubbi o positivi della tTG. Nei casi
di deficit delle IgA totali si effettuano gli anticorpi antiEndomisio di classe IgG e i Peptidi deamidati IgG. Nei
bambini fino a 2 anni, si testano in aggiunta i Peptidi
deaminati IgA e IgG.
Risultati: L’analisi dei dati ha evidenziato che il numero
totale di esami per la diagnosi di celiachia eseguiti prima e
dopo l’applicazione delle linee guida è diminuito del 25%
con una migliore definizione dei pazienti con sospetta
celiachia.
Conclusioni: L’appropriatezza del percorso diagnostico
indicato anche dalle Linee guida Ministeriali risulta
essere molto più efficace sia in termini di una migliore
razionalizzazione delle richieste, che per l’andamento
della sensibilità per patologia.
437
P017
SENSIBILIZZAZIONE AL LATTICE NEI NEOASSUNTI:
UTILITA' DELLA CRD
P018
ANAFILASSI INTRAOPERATORIA: RUOLO
DELL'OSSIDO DI ETILENE
B. Cinti, G. Ciarrocchi, T. Santini, M. Tocchini
B. Cinti , M.F. Brianzoni , L. Antonicelli , M. Tocchini
Laboratorio Analisi, A.O.U. Ospedali Riuniti, Ancona
1
Le reazioni allergiche causate dall’esposizione a prodotti
in lattice di gomma sono notevolmente aumentate negli
ultimi anni, soprattutto nel settore sanitario. La prevalenza
di sensibilizzazione al lattice negli operatori sanitari va dal
3 al 17%.
Nella gestione delle criticità del rischio lavorativo l’Azienda
Ospedali Riuniti di Ancona prevede dal 01/01/2010 per
gli operatori obbligati ai DPI (dispositivi di protezione
individuale) un pannello di esami ematochimici da testare
al momento dell’assunzione. In questo pannello è inserito
il dosaggio delle IgE specifiche (sIgE) per il lattice (k82).
Solo in caso di sIgE >0,10 KU/L, si procede con la ricerca
delle sIgE verso le singole molecole allergeniche per
fornire un preciso profilo di sensibilizzazione.
Nel periodo compreso dal 01/01/2010 al 10/06/2014
sono state dosate le sIgE per il lattice sui sieri di 1150
operatori assunti anche a tempo determinato (ausiliari,
infermieri, tecnici di laboratorio, medici, biologi,.) inviati al
Laboratorio dal DSTB (Ufficio Medico Competente).
Il dosaggio delle sIgE è stato eseguito su UniCap 250 ThermoFisher. Dei 1150 campioni testati, 37 (3,2%) sono
risultati positivi al k82 (0,27 KU/L–14,9 KU/L); nei positivi,
la ricerca di sIgE verso le singole molecole allergeniche
ha evidenziato in 26 campioni la sola positività verso la
profilina, rHev b8 e in 6 campioni verso i determinanti
carboidratici cross-reattivi, i CCD. Tre operatori sanitari
riportavano sIgE per rHev b5 (0,28 KU/L - 4,77 KU/L),
mentre le sIgE di altri due operatori sono risultate positive
per rHev b 6.01(0,80 KU/L - 1,32 KU/L) e rHev b 6.02 (0,72
KU/L - 1,49 KU/L).
In questo studio quindi la prevalenza di vera
sensibilizzazione al lattice di gomma negli aspiranti
operatori sanitari scende al 0,43%.
Conclusioni. La CRD nella diagnostica allergologica in
vitro è fondamentale per smascherare le cross-reattività.
In particolare, nella sensibilizzazione al lattice di gomma,
la CRD permette di distinguere una sensibilizzazione
alla profilina o ai CCD, panallergeni comuni all'ambiente
vegetale di scarso significato allergologico, da una più
grave verso componenti molecolari, quali rHev b5 e rHev
b6, che rivestono una rilevanza clinicamente significativa
soprattutto negli operatori sanitari esposti al lattice.
438
1
2
2
1
SOD Allergologia, A.O.U. Ospedali Riuniti Ancona
2
Introduzione: L’ossido di etilene (EtO) è il più
semplice composto eterociclico contenente ossigeno;
è un gas incolore dall’odore dolciastro, estremamente
infiammabile, esplosivo se mescolato all’aria, tossico per
inalazione.
L’EtO, utilizzato per sterilizzare presidi medici e
farmaceutici non in grado di sopportare la tradizionale
sterilizzazione ad alta temperatura (dispositivi che
includono componenti elettronici, imballaggi o contenitori
di plastica, drenaggi, membrane biologiche, materiali
di sutura …), è stato in passato associato a reazioni
allergiche importanti, in particolare in pazienti dializzati.
Il conseguente minore utilizzo di EtO e lo sforzo delle
industrie produttrici per rimuovere la maggior parte di EtO
residuo hanno contribuito ad una netta riduzione delle
reazioni avverse.
Caso clinico: Un ragazzo K.R., di anni 21, affetto da
idrocefalo congenito e quindi sottoposto sin dai primi
mesi di vita ad interventi chirurgici, aveva manifestato una
reazione allergica intraoperatoria nel 93, all’età di 6 mesi,
con riscontro di sensibilizzazione IgE mediata al lattice
di gomma. Il conseguente allontanamento da materiali a
rischio e l’utilizzo di camera operatoria latex-safe hanno
evitato reazioni anafilattiche negli anni successivi.
Recentemente, in corso di un intervento chirurgico
volto alla sostituzione di una valvole da deflusso, il
ragazzo ha avuto una seconda grave reazione anafilattica
intraoperatoria; è stato richiesto il dosaggio delle IgE
specifiche (sIgE) per lattice, farmaci (penicilline e
cefalosporina), gelatina, formaldeide, ossido di etilene.
Il dosaggio delle sIgE, eseguito su un analizzatore UniCap
250- metodo FEIA (Thermo Fisher), oltre a confermare la
già nota sensibilizzazione al lattice (k82) = 5,9 KU/L ed
in particolare alle molecole rHev b5 = 0,82 KU/L, rHev b
6.01 = 4,15 KU/L, rHev b 6.02 = 4,17 KU/L, ha evidenziato
un elevato livello di sIgE per l’ossido di etilene (k78) = 6,9
KU/L.
Conclusioni: In soggetti sottoposti a numerosi interventi
chirurgici o in soggetti sottoposti ad interventi di
posizionamento di valvole, drenaggi,.., l’insorgenza di
reazioni anafilattiche intraoperatorie, non imputabili a
farmaci o ad esposizione al lattice, può essere correlata
ad una sensibilizzazione all’ossido di etilene.
P019
INDICATORI DI QUALITÀ NEI POINT OF CARE
TESTING (POCT): SONO EFFICACI?
P020
LA CONSULENZA DEL LABORATORIO NELLA
GESTIONE DEL POINT OF CARE TESTING (POCT)
A. Aita, E. Babetto, P. Carraro, L. Sciacovelli, M. Plebani
A. Aita, E. Babetto, P. Carraro, L. Sciacovelli, M. Plebani
Dipartimento di Medicina di Laboratorio, Azienda
Ospedaliera-Universitaria di Padova
Dipartimento di Medicina di Laboratorio, Azienda
Ospedaliera-Universitaria di Padova
Il ruolo del professionista di laboratorio risulta cruciale
nella riduzione del rischio d’errore e nella ricerca delle
soluzioni più idonee a migliorare il processo. Il POCT
costituisce un esempio significativo di come la difficoltà
a conciliare le necessità cliniche, quelle del laboratorio
e le aspettative del paziente possa generare problemi
nei flussi operativi se non sono implementate adeguate
procedure e sistemi di assicurazione per la qualità
che garantiscano la qualità dei risultati. L’adozione
di appropriati Indicatori di Qualità (IQs) può risultare
uno strumento efficace per identificare e monitorare gli
eventi indesiderati e valutare l’efficacia delle azioni di
miglioramento intraprese.
Scopo di questo lavoro è riportare i risultati, raccolti
dal 2009 ad aprile 2014, relativi a 3 IQs- risultati non
accettabili nel CQI (PNA); coefficiente di variazione
fuori target (VCV); mancanza/ritardo di manutenzione o
sostituzione degli elettrodi per emogasanalizzatori (RIT)identificati per il monitoraggio dei problemi dei POCT (54
glucometri e 37 emogasanalizzatori) sotto il controllo del
nostro Dipartimento.
I risultati ottenuti dimostrano un generale miglioramento
delle prestazioni. In particolare:
Glucometri. La percentuale di PNA è diminuita nel corso
degli anni, da 8,6 (2009) a 1,5 (2013), e pari a 1,1 nei
primi mesi del 2014. La percentuale dei VCV è diminuita
da 1,6 (2010), per entrambi i livelli di CQI, a 0,3 e 0 (2013)
rispettivamente per il livello 1 e 2. Nei primi mesi del 2014
è pari a 0,7 per il livello 1 e a 0 per il livello 2.
Emogasanalizzatori. Il numero medio annuale di RIT
risulta costante nel tempo (3,68), dal 2009 al 2013, ma
ridotto (1,50) nei primi mesi del 2014.
Il miglioramento osservato dimostra l’efficacia delle
azioni correttive intraprese (sostituzione dei glucometri in
uso con glucometri più efficienti; sostituzione anticipata
degli elettrodi degli emogasanalizzatori in caso di
deriva del CQI) e l’utilità degli IQs come strumento di
assicurazione per la qualità. Inoltre l’uso degli IQs si è
dimostrato fondamentale nel migliorare la collaborazione
tra il personale clinico, che deve segnalare i problemi
evidenziati, ed i professionisti di laboratorio suggerendo
le più opportune azioni di miglioramento.
La piena responsabilità del Laboratorio ed il costante
supporto del personale del laboratorio alla gestione dei
POCT sono elementi strategici per garantire la sicurezza
del Paziente. Fra i compiti del personale del laboratorio
riguardo alla gestione dei POCT vi è la definizione delle
modalità di segnalazione dei problemi e la consulenza alla
loro risoluzione.
Lo scopo di questo lavoro è riportare i dati relativi
alle richieste di suggerimenti/interventi (RSI) inoltrate
telefonicamente dal personale che gestisce i POCT nei
reparti clinici al personale del laboratorio, o individuate dal
personale di laboratorio stesso attraverso il monitoraggio
giornaliero, mediante software di connessione dedicati,
delle prestazioni del controllo interno di qualità e delle
calibrazioni.
Sono riportati le RSI raccolte nel mese di marzo e
novembre, dal 2009 al 2013: guasti strumentali (GS),
5%; irregolarità (I), 25%; prestazioni non accettabili (PNA)
del Controllo Interno di Qualità (CQI), 39%; problemi di
calibrazione, 7%; altro, 4%.
Il 70% delle RSI riguarda gli emogasanalizzatori (EG),
il 27% i glucometri (GM) ed il 3% i coagulometri (CM).
Il numero delle RSI relative agli EG, è diminuito da
44 (2010) a 21.5 (2013): 53%, PNA; 20%, I; 17%,
GS; 10%, altro. L’87% delle PNA è dovuto alla deriva
del livello basso del CQI del lattato, che mostra una
diminuzione da 15 (2010) a 4.5 (2013). Per i GM,
il trend è variabile nel tempo: 12 (2009); 17 (2010);
23 (2011); 6 (2012); 11 (2013). I GS (37%) ed I
(34%), mostrano un incremento nel 2011, seguito da
un decremento negli ultimi due anni (rispettivamente da
11.5 e 15, nel 2011, a 0.5 e 6, nel 2013). In generale i
risultati dimostrano che le azioni correttive suggerite dal
laboratorio (per esempio: sostituzione degli elettrodi degli
EG alla deriva del CQI; sostituzione dei GM in uso con
GM più performanti, alla fine del 2011) si sono dimostrate
efficaci confermando l’utilità del monitoraggio delle RSI
e l’importanza laboratorio nella gestione dei processi di
miglioramento della qualità dei POCT.
439
P021
APPLICATION OF THE GUIDELINES FOR THE
MONITORING OF POCT: THE CASTELFRANCO
VENETO EXPERIENCE
P022
EMOGASANALIZZATORI (EGA) IN REGIME DI
POINT-OF-CARE TESTING (POCT): GESTIONE
CENTRALIZZATA E CONTENIMENTO DEI COSTI
G. Visconti, P. Clemen, L. Zardo, G. Piaserico
B. Bernardi, N. Jordaney, A. Panetto, G. Bonfant, P.
Belfanti, M. Di Benedetto
Laboratory Medicine, ULSS 8, General Hospital “San
Giacomo”, Castelfranco Veneto, Treviso, Italy
POCT is a solution that permits the rapid acquisition
of laboratory information at the point of need. Errors in
POCT are due to little attention on quality assurance
issues and insufficient training of personnel. The aim of
this work is to highlight the application of the guidelines
(SIBioC) on the management of POCT and the production
of internal quality control (IQC) and non-compliance
periodical reports. We monitor 8 POCT analyzers for
blood gas used by more than 20 departments. They
perform about 4,800 tests per year. A multi-disciplinary
committee was formed. It has been implemented a
course of training that consisted in a basic course and
periodic refresher sessions for all staff. Specific training
courses are built to the Supervisor of the Ward and the
Nurse Coordinator of the instrument. They respectively
have the task of monitoring the process in their unit
and performing the IQC. The laboratory POCT referent
provides all departments documentation for the execution,
evaluation and corrective actions of IQC. The laboratory is
responsible for the evaluation of IQC data in the medium
and long term. The laboratory also monitors the noncompliance of the entire POCT process (acceptance,
identification codes, sending data to the LIS, printing of
the report). The development of IQC charts has enabled
Laboratory to have control of the performance of POCT, to
compare the results obtained by the various departments
and to schedule actions to resolve situations of poor
performance. The graphic details of non-compliance are
sent to the Supervisor. The report of non-compliance has
allowed us to identify what are the most common errors
and to monitor the entire path. In 2013, the POCT in
the emergency department (ED) has performed about
2,300 requests for blood gas and has performed 14
sessions of IQC at the opening of each new batch of
cartridges. None of these had an out of control. The most
frequent non-compliances were: request ID input errors
(29%), operator ID entry errors (18%), errors in sending
data to the LIS (15%). The ED has reported 71% of
completed jobs properly. The statistical analysis of the
data has allowed us to define the state of the art of
the decentralized activities and create a starting point to
encourage continuous quality improvement.
440
S.C. Analisi Cliniche, Osp. U. Parini, Aosta
Dal 2012 all’interno della SC Analisi Cliniche opera
il Gruppo POCT, che ha preso in carico la gestione
di tutti gli EGA decentrati aziendali, ha organizzato
la formazione degli operatori e la realizzazione di un
network di referenti nelle diverse sedi, e ha verificato
la possibilità di migliorarne l’efficienza senza incidere
sulla qualità delle prestazioni. Metodi: predisposizione di
un modulo informatizzato personalizzato per strumento
(scorte minime, tipologia di prodotti) che impedisce le
richieste superiori al fabbisogno minimo stabilito su
dati storici, compilato mensilmente dalle sedi POCT
e approvato dal Gruppo. Gestione membrane: dal
2013, considerando il prezzo singolo elevato e il
confezionamento multiplo che comporterebbe stoccaggi
eccessivi nelle varie sedi POCT, il Gruppo le ordina e
distribuisce in funzione del consumo dei singoli EGA,
mantenendo scorte di 1 membrana per tipo in ogni POCT.
Spesa membrane nel triennio 2012-14 (6 EGA in attività
per l’intero periodo considerato): esaminando gli acquisti,
rispetto al 2012 risulta una significativa variazione della
spesa sia nel 2013 (-16,2%) sia nella previsione per
il 2014 (-9,1%), a fronte di una variazione di campioni
rispettivamente del -7,4% e del -2,7%. Campioni/anno:
totale 57.704 (per singolo strumento, range 1.302-20.793)
nel 2012, 53.456 (983-17.690) nel 2013, 56.153 nel
2014 (proiezione sui primi 5 mesi). La spesa media/
campione per reattivi e membrane nei primi 5 mesi di
ogni anno appare costante (rispettivamente 3,1, 3,0 e
3,1 €/campione), ma esaminando i singoli strumenti tale
valore si situa in un range tra 18,6 e 1,56 €/campione,
con un effetto “massa critica” dipendente dal numero
di campioni processati. La spesa/campione presenta un
andamento inversamente proporzionale al numero di
campioni e, superato il n° di circa 10.000 campioni/anno/
strumento tende asintoticamente ad una spesa stabile,
compresa tra 1,5-2,9 €/campione. Nel triennio di gestione
il Gruppo è riuscito a ridurre significativamente la spesa
per le membrane senza variare la tipologia e il numero di
controlli di qualità, mantenendo buoni risultati per CQI e
VEQ.
Magny E, Beaudeux JL, Launay JM. Point care
testing in blood gas and electrolyte analysis: examples
of implementation and cost analysis. Ann Biol Clin
2003;61:344-51.
P023
INTEGRAZIONE DEI REFERTI OTTENUTI DA
EMOGASANALIZZATORI POCT
1
1
1
1
G. Tiraboschi , B. Saladino , C. Perani , A. Panna , L.
1
2
Auriemma , Z. Rizzi
1
Medicina di Laboratorio, Azienda Ospedaliera Bolognini
di Seriate
2
Servizio Informatico, Azienda Ospedaliera Bolognini di
Seriate
L’azienda Ospedaliera Bolognini di Seriate è composta
dai presidi di Piario, Lovere, Alzano L.do, Gazzaniga,
Seriate, distribuiti in un’area geograficamente vasta e
disomogenea.
Scopo: avviamento di una nuova modalità operativa
di integrazione dei referti di emogasanalisi ottenuti in
modalità Point of Care (POCT) che garantisca la completa
tracciabilità delle diverse fasi che portano alla produzione
del referto.
Metodologia: N. 14 emogasanalizzatori modello GEM
Premier 3000/4000 installati nei reparti dei vari Presidi,
sono stati interfacciati tramite Software gestionale GEM
web Plus al LIS aziendale (BCS) per ottimizzare tutte le
fasi del flusso di lavoro: generazione automatica delle
richieste, acquisizione delle anagrafiche e dei risultati,
trasmissione e stampa dei referti.
Si è realizzato un sistema integrato POCT/LIS dopo
un’attenta pianificazione, esecuzione prove in ambiente di
test, formazione del personale e monitoraggio dell’attività
degli emogasanalizzatori nei reparti.
Conclusioni: il sistema integrato ha permesso la completa
automazione nella produzione del flusso dati POCT/
LIS: dalla generazione della richiesta, alla produzione
e archiviazione del referto con un miglioramento nella
sicurezza del dato sia dal punto di vista dell’utilizzo
del codice di cartella/nosologico per l'identificazione del
paziente, che dall’identificazione univoca dell’operatore
oltre che nella fruibilità del dato analitico.
Di Serio F, Trenti T, Carraro P, per il Gruppo di
Studio SIBioC "Point-of-care testing". Raccomandazioni
per l'implementazione e la gestione del "point-of-care
testing" (POCT). Biochim Clin 2011;35:242-52.
P024
POINT OF CARE ANALYSIS OF ELECTROLYTES
AND CALCIUM IN CRITICALLY ILL PATIENTS:
COMPARISON WITH CENTRAL LABORATORY
INSTRUMENTS DATA
2
2
1
1
F. Marciano , M. Fumi , A. Del Rio , M. Galdiero , M.
1
Savoia
1
D.A.I. Medicina di Laboratorio, Azienda Ospedaliera
Universitaria Federico II, Napoli
2
Scuola di Specializzazione in Biochimica Clinica,
Università degli Studi di Napoli Federico II
Introduction: Last generation Point of Care Testing
(POCT) emogas-analyzers provide measurements of
2+
electrolytes and Ca . Therefore the appropriate use
of POCT systems assume a very important clinical
significance, allowing a continuous monitoring of those
parameters in critically ill patients. Verifying the alignment
of POCT results with those obtained from Central
Laboratory (CLab) instruments is essential. In this study
+
+
-
2+
we compared POCT Na , K , Cl , Ca results with those
measured with CLab instruments.
Materials and methods: Instruments: A (RapidPoint500,
Siemens), B (DxC880, BeckmanCoulter), C (Modular,
Roche) used in POCT, emergency Lab and routine Lab,
+
+
-
respectively. Methods: Na , K , Cl by direct ion-selective
electrode (ISE) method in A and by indirect ISE method in
2+
B and C; Ca by direct ISE method in A, while B and C
measured total calcium by colorimetric method, then the
2+
Ca values were calculated. Samples: 36 serum samples
were collected and analyzed by A, B and C; for the same
36 patients also heparin plasma samples were collected
and analyzed by A. Statistics: Passing-Bablok regression,
Bland-Altman, R coefficient.
+
Results of comparison studies: Na : slope=1.06, 1.07,
1.05; intercept=-9.83, -11.4, -6.18; R=0.96, 0.96, 0.93;
Syx=1.0, 1.09, 1.44 for AvsB, AvsC and CvsB respectively.
+
K : slope=1.04, 1.02, 1.0; intercept= -0.13, -0.12, 0.1;
R=0.99, 0.99, 0.99 Syx=0.045, 0.045, 0.073 for AvsB,
-
AvsC and CvsB respectively. Cl : slope=0.98, 1.0, 1.03;
intercept=1.05, 1.0, -4.87; R=0.90, 0.89, 0.93; Syx=1.28,
1.22, 1.07 for AvsB, AvsC and CvsB, respectively.
2+
Ca slope=1.09, 0.91, 1.29; intercept=-0.41, 0.37, -1.30;
R=0.75, 0.76, 0.85; Syx=0.20, 0.21, 0.13 for AvsB, AvsC
and CvsB, respectively. Plasma vs serum correlations:
+
+
-
2+
Na , K , Cl and Ca
R=0.98, 0.98, 0.93, 0.82
respectively.
Conclusion: Correlations data between A, B and C serum
+
samples showed an excellent result for K , a good result
+
-
2+
for Na and Cl and a less acceptable value for Ca . In
addition, we observed a good correlation between plasma
+
+
-
2+
and serum samples for Na , K and Cl , but less for Ca .
We consider that verifying the correlation between POCT
and CLab instruments and informing clinicians about the
observed results is essential to reduce errors and improve
quality and patient safety.
Price CP. Point of care testing. BMJ 2001;322:1285–8.
441
P025
PERFORMANCE EVALUTATION BETWEEN
DIFFERENT LABORATORIES OF NEW MONITOR
FOR PT INR TESTING
1
2
3
G. Dirienzo , N. Ciavarella , C. Di Punzio , F. Di
4
5
5
6
Serio , C.P. Ettorre , G. Malcangi , C. Mangione , L.
7
8
9
Ria , A. Santoro , R. Triggiani
1
Patologia Clinica Ospedale della Murgia, Altamura
Tavolo Tecnico Trombosi Regione Puglia
3
Patologia Clinica, Ospedale Manduria
4
Patologia Clinica, Policlinico Bari
5
Centro Emofilia , Policlinico Bari
6
Centro Trasfusionale, Galatina
7
Medicina Interna, Ospedale Gallipoli
8
Patologia Clinica, Ospedale Perrino Brindisi
9
Patologia Clinica, Ospedale di Triggiano
2
Background: The monitors are increasingly used for
to perform PT-INR test on capillary blood, to monitor
vitamin K antagonists (AVK). Several studies have shown
that the monitoring systems on capillary whole blood
are well-correlated with the values obtained using the
in vitro methods of the laboratory.The technology has
enabled in recent years to improve the performance of
these devices with systems of quality control. Methods:
A comparative study has evaluated in six centers of
Oral Anticoagulant Theraphy of Puglia in order to
value the system microINR (Instrumentation Laboratory
SpA), a portable coagulometer for the determination of
prothrombin time (PT) by means of capillary blood. PT
INR was performed on the portable monitor microINR
using human thromboplastin with ISI of 1.00. In the
six centers for PT-INR determination from venous blood
specimens a several coagulation analyzers were used
(ACL TOP System,IL–Sysmex CA&CS System,Siemens)
with two different recombinant thromboplastins (HemosIL
RecombiPlasTin 2G–Innovin). A total of 689 data were
collected, of which approximately 10% of normal patients
to improve the statistical significance.538 patients with PT
INR ranging from 2–4,5.In the same daily session venous
blood samples were collected, centrifuged and capillary
PT-INR test was performed on the monitor. Statistical
analysis was performed by linear regression and Bland
Altman method. Results: The correlation among different
systems was good showing: the Pearson coefficients
calculated for the individual centers were in a range from
0.8627 to 0.9861. The average of differences for all the
centers was -0,0592 with a DS of 0,3992. Over 95% of
data in the range of INR 2-4,5 were observed differences
less then 30% between results from monitoring system
and results from the reference measurement. In some
centers the differences in PT INR >±0.5 were observed in
less of the 5% of the total patient population. Conclusion:
The multicenter Puglia tried the good correlation of the
monitor microINR with laboratory systems, even if they
use several reagents. Of course, as already demonstrated
in other studies, comparing the coagulation instruments,
the correlations are more accurate when comparing
similar systems and in the present study has confirmed
this feature.
442
P026
SCREENING DEL PROFILO
CARDIODISMETABOLICO. VALUTAZIONE
PLURIENNALE DI UNA APPLICAZIONE POINT OF
CARE TESTING (POCT) NEL MONITORAGGIO DEL
PROFILO LIPIDICO
1
2
3
L. Rossi , G. Pellegrini , L. Della Bartola , O.
3
3
Giampietro , E. Matteucci
1
Laboratorio Patologia Clinica, Azienda Ospedaliero
Universitaria Pisana
2
Laboratorio Analisi Chimico Cliniche, Azienda
Ospedaliero Universitaria Pisana
3
Dipartimento Clinica e Medicina Sperimentale,
Università degli Studi di Pisa
La prevenzione cardiovascolare richiede un approccio
diagnostico nello screening rivolto all’identificazione
precoce dei fattori di rischio, come la dislipidemia.
Il POCT può rappresentare una integrazione alla
diagnostica tradizionale, con risultati immediati per il
processo decisionale clinico, se la qualità strumentale
è sovrapponibile al laboratorio. CardioChek PA (CCPA,
PTS, Indianapolis, USA), è un analizzatore di sangue
intero portatile per misurazione rapida di colesterolo, HDL,
trigliceridi. Obiettivo: risoluzione problemi alle prestazioni
analitiche del CCPA, nei confronti della diagnostica
standard.
Materiali e metodi: Ultimi tre anni: valutati più volte
accuratezza, precisione e discrepanze tra CCPA
(riflettanza; diversi lotti di strisce reattive, diversi
strumenti) e metodo di riferimento del laboratorio
(colorimetrico, Cobas 6000, Roche Diagnostics, Italia).
Analizzati 783 pazienti diabetici venosi a digiuno,152
pazienti sani (gruppo controllo). Precisione: 10 ripetizioni
analitiche di alcuni pazienti, sullo stesso strumento.
Risultati: All’inizio CCPA sottovalutava il colesterolo
totale (bias di 6,5%) e forniva CV intra-assay > 6%
per tutte le frazioni lipidiche. Risultati preliminari, poco
performanti, sollecitavano miglioramenti sequenziali,
attuati dal produttore. Prestazioni Cholesterol Reference
Method Laboratory Network (CRMNL) 2013: errore totale
1,3% colesterolo totale; 3,1% colesterolo HDL. Valori
capillari di colesterolo totale, colesterolo HDL, e trigliceridi
ben correlavano con risultati su sangue venoso (0,95-1,0
r, p <0.001). CV intra-assay colesterolo totale (114-276
mg/dL): 1,7 ± 0,6%; colesterolo HDL (27-90 mg/dL): 4,3 ±
1,7%; trigliceridi (65-209 mg/dL): 3,1 ± 1,5%.
Conclusioni: I POCT necessitano di supervisione e
controllo di qualità, per monitorare il processo analitico.
Una sorveglianza esterna continua (ultimi 3 anni)
ha fornito informazioni utili, con miglioramento delle
prestazioni. Risultati su diversi CCPA, con lotti di
strisce diverse, erano coerenti tra loro e col laboratorio.
Valutazione finale: nessuna differenza significativa tra
misure portatili dei lipidi e risultati tradizionali. Il dispositivo
risulta adeguato per l'uso in programmi di screening volti
al controllo metabolico e alla diagnosi precoce dei disturbi
lipidici.
P027
CAN THREE DIMENSIONAL CYTOLOGICAL
ANALYSIS HELP IN INFECTIOUS MONONUCLEOSIS
DIAGNOSIS ?
P028
IMMUNOFENOTIPIZZAZIONE LINFOCITARIA IN UNA
POPOLAZIONE LONGEVA SARDA
1
2
1
2
F. Fiorini, A. La Gioia, G. Badalassi, A. Barsotti, M.
Fastame, L. Francioni, R. Grazzini, G. Tarrini, P.
Valentini, F. Bonini
G. Rocca , A. Muredda , A. Zinellu , M. Mura , M.
3
4
1
1
Deiana , A. Marchisio , M. Pescatori , C. Carru , L.
1
Deiana
U.O. Patologia Clinica, Osp. "F. Lotti" Pontedera - Pisa
1
Infectious mononucleosis (IM) is common in adolescents
and young adults. Although the disease is often
associated with Epstein-Barr virus (EBV), several
agents can cause IM. Diagnosis is based on clinical,
hematological and serological findings. When the etiologic
agent is EBV, serological findings include heterophilic
and EBV-specific antibodies. We studied 34 cases of
EBV positive IM, compared with 13 neoplastic and 18
reactive lymphocytosis, without heterophilic and EBVspecific antibodies. All samples were examined using
the BC-6800 hematologic analyzer (Mindray, China).
This analyzer employed SF-Cube Technology (3D Cube)
that produce two three-dimensional cytograms (DIFF
and NRBC). The three dimension are the forward
scatter, the side scatter and the fluorescence for size,
complexity and, respectively, for nucleic acid content.
In the program “RUO” each cytogram can be enlarged
and rotate in every direction. This allow to study all
samples that need it. Microscopic reviews of peripheral
blood smears were performed in agreement with review
rules used in the laboratory. The microscopic counting
was performed according to Guidelines H20-A2. In all
IM cases we observed in DIFF cytogram a modified
lymphocytic cluster, looks like stretched drop. In 3D Cube,
after left-right or bottom-up rotations, we can observe
only in IM (not in others lymphocytosis) a new cluster
previously hidden. Microscopic review showed in all IM
samples variable percentage of activated lymphocytes
and, among these, many lymphocytes with sign of
cytolysis (deconstructed chromatin, vacuolization and
reduced size).The IM diagnosis can be very easy or very
difficult, depending on the severity of the clinical features
as well as on the morphologic changes of activated
lymphocytes. In some cases, its various manifestations
are often mistaken as leukemic malignancies. In addition,
the adult form of IM by EBV can be different from the
disease in children and adolescents (1). Although we
need other observation, it is reasonable to assume that
the additional cluster seen by 3D cube only in cases of
IM, can be helpful to suggest a diagnosis and guide the
microscopic observation.
1. Vetsika EK, Callan M. Infectious mononucleosis and
Epstein-Barr virus. Expert Rev Mol Med 2004;6:1-16.
2
Istituto di Malattie infettive-Università di Sassari
3
4
ASL n°1-Sassari
Durante la senescenza si verificano altera-zioni
immunologiche aventi per effetto il decadimento delle
funzioni di difesa. Non solo si assiste ad una diminuzione
del turnover dei linfociti T citotossici, ma anche di
quelli ad azione modulatrice (T helper e T suppressor). Da ciò consegue un'alterazione dell'immunità cellulomediata e delle funzioni dei linfociti B. Nel soggetto
anziano sano più che un decadimento in senso lato
si ha un rimodellamento del sistema immunitario,
con alcune funzioni immunitarie compromesse e altre,
soprattutto nei centenari, straordinariamente conservate
o addirittura attivate. Lo studio valuta il contributo del
sistema immunitario al buon invecchiamento e alla
longevità, i-dentificando le principali sottopopolazioni
linfocitarie (SPL), (linfociti B, linfociti T vergini e di
memoria e cellule NK). L’analisi delle SPL è stata
eseguita con citofluorimetria a flusso, su 9 soggetti,
età mediana 93 anni, reclutati nel progetto AKeA, e
su 5 controlli apparentemente sani età mediana 36
anni. Per l’indagine sugli stadi di differenziazione e
maturazione dei linfociti memoria, è stata utilizzata
una miscela di 8 anticorpi monoclonali direttamente
marcati. Dalla primissima osservazione è emerso che
nei soggetti anziani,senza patologie di rilievo e/o pregresse infezioni virali, l’espressione dei differenti clusters
cellulari rimane ben conservata. Infatti i CD4Naive,
mostrano una lieve diminuzione delle percentuali tra
soggetti anziani e gruppo di con-trollo del 32.4% vs 40%.
E’interessante notare come all’interno dei CD4Naive, la
stratificazione in CD4/CD25 (marker stato di attivazione
dei CD4), in CD4/CD95 (marker di apoptosi) e CD4/
CD127 (marker di vitalità/capacità di ricostituzione) ha
messo in evidenza i seguenti valori me-diani tra soggetti
anziani e controllo: CD4/CD25 1344vs1467; CD4/CD95
324vs333; CD4/CD127 2832vs2871. Questi primi dati
sembrano dimostrare una minore attivazione dei linfociti
CD4 nei pazienti anziani, ma apoptosi e vitalità/capacità di
ricostituzione sovrapponibile ai controlli, a dimo-strazione
che il contributo del sistema immunitario nella longevità
gioca un ruolo fondamentale. Lavoro supportato da
SIBioC “Progetto Adotta una tesi” e L.R. 7/2007-Regione
Autonoma della Sardegna.
Franceschi C, Monti D, Barbieri D, et al. Intern Rev
Immunol 1995;12:57-74.
443
P029
LA DETERMINAZIONE DELLA GLICOPROTEINA
SOLUBILE sCD14-ST(PRESEPSINA): SUA UTILITA'
NELLA DIAGNOSI PRECOCE DI SEPSI
1
1
1
2
F. Puggioni , A. Gigante , M. Lilliu , G. Orru' , M.
1
1
1
Pautasso , G. Melis , F. Coghe
1
Laboratorio di Chimica Clinica e Microbiologia AOU di
Cagliari
2
Laboratorio SPOKE sequenziamento AOU di Cagliari
Introduzione: La sepsi, la sepsi grave e lo shock settico
sono tra le patologie più impegnative affrontate nei
dipartimenti di emergenza. La diagnosi precoce è uno
degli obiettivi strategici per migliorare l’outcome dei
pazienti.
Uno dei biomarcatori utilizzati per la diagnosi e il
monitoraggio della sepsi è la procalcitonina (PCT), che
correla con la presenza di infezioni, ma presenta questo
limite: una specificità limitata.
Si vuole valutare l’utilità della molecola CD14 solubile,
quale marker a maggiore specificità che correla con
la presenza di numerose infezioni. La CD14 è una
glicoproteina che viene espressa sulla membrana dei
monociti e macrofagi con ruolo di recettore per i complessi
di lipopolisaccaridi e per le proteine di legame per LPS.
La CD14 attiva la cascata proinfiammatoria e durante
i processi infettivi le proteasi plasmatiche originano la
frazione solubile di CD14 (SCD14) e il suo sottotipo il
SCD14 (sCD14-ST) o PRESEPSINA.
Scopo del lavoro: valutare la maggiore significatività
della presepsina in pazienti settici piuttosto che in
pazienti con SIRS (reazione infiammatoria sistemica) VS
la popolazione sana (controllo). Evidenziare l’ efficacia
diagnostica e il ruolo prognostico in pazienti che
presentano sintomi di SIRS associato o meno a un
sospetto di sepsi grave o shock settico.
Materiali e metodi: Si sono studiati i valori di sCD14-ST
in 518 pazienti ricoverati presso i reparti di cura intensiva
dell’AOU di Cagliari, nel periodo tra Aprile 2013 e Aprile
2014. La concentrazione di presepsina è stata misurata
col metodo immunoenzimatico in chemiluminescenza
su PATHFAST PRESEPSIN COMPACT IMMUNO
ANALYZER (MITSUBISHI CHEMICAL MEDIENCE
CORPORATION LTD JAPAN). Oltre alla presepsina,
sono stati considerati altri parametri quali PCT ed
emocolture.
Risultati: Si è valutata la stretta correlazione tra la clinica
e risultati di laboratorio nella stratificazione prognostica.
Conclusioni: non esiste un test diagnostico per sepsi,
tuttavia sCD14-ST è un marker precoce di sepsi
che performa anche meglio della PCT, garantisce il
monitoraggio della terapia grazie alla sua breve emivita,
oltre a individuare infezioni che la PCT non riesce a
screenare.
444
P030
DIAGNOSTIC ACCURACY OF PRESEPSIN FOR
PREDICTION OF BACTERIAL INFECTIONS IN
CRITICAL CARE PATIENTS
1
2
3
V. Sargentini , G. Ceccarelli , M. D'Alessandro , D.
3
4
3
Collepardo , A. Morelli , A.M. Nicoletti , B.
3
5
2
1
Evangelista , A. Angeloni , M. Venditti , A. Bachetoni
1
Lab. Patologia Clinica, Dip. Medicina Sperimentale,
Sapienza Univ. di Roma
2
Dip. Salute Pubblica e Malattie Infettive, Sapienza Univ.
di Roma
3
Lab. Patologia Clinica, Dip. di Chirurgia, Sapienza Univ.
di Roma
4
Dip. Anestesia e Rianimazione, Sapienza Univ. di
Roma
5
Dip. Medicina Molecolare, Sapienza Univ. di Roma
Systemic bacterial infection carries a high risk of mortality
in critical care patients. Improvements in diagnostic
procedures are required for effective management of
sepsis. We studied presepsin, recently described as
reliable marker of bacteremia, as predictor of sepsis in
critical care patients identifying the references values able
to discriminate SIRS from bacterial infections and the
different stages of sepsis’ severity.
21 patients admitted to intensive care without clinical signs
of infection were recruited and categorized according to
their diagnosis and the severity of their illness; specimens
were collected from different clinical cases: systemic
inflammatory response syndrome (SIRS), localized
bacterial infection, sepsis and severe sepsis. The severity
and clinical diagnosis criteria were those recommended
by the ACCP/SCCM. Presepsin levels were measured
using a PATHFAST® analyzer.
The accuracy of presepsin measurements in the diagnosis
of bacterial infections were assessed with a ROC curve
analysis, comparing the infection group (sepsis+severe
sepsis+localized infection) with the non-infection group
(controls+SIRS). The AUCs calculated from ROC curve
were 0.888 (95% CI 0.683-0.904) and p <0.0001. The
best diagnostic cut-off value, to discriminate between
infection and no infection, was 600 pg/mL. Sensitivity
and specificity were 85.96% (95% CI 74.21-93.74) and
72.09% (95% CI 56.33-84.67) respectively. The mean (±
standard error) presepsin concentrations in plasma (pg/
mL) were 456±24.9 in the control group, 737±92.8 in the
SIRS group, 2145±541.7, 2286±645.2 and 3338±628.6 in
patients affected by localized bacterial infection, sepsis
and severe sepsis, respectively.
These data confirm presepsin as a reliable marker of
sepsis. References values can be set also to discriminate
different stages of the illness’ severity, in particular:
controls <500 pg/mL; SIRS 750 pg/mL; sepsis 2150 pg/
mL and severe sepsis >3000 pg/mL. This could be useful
to implement a more specific antibiotic therapy, preventing
the onset of antibiotic resistance and increasing the
success of therapeutic interventions or, on the contrary,
suspend it and thereby save on medical costs.
P031
EFFECT OF ONE YEAR B AND D VITAMINS
SUPPLEMENTATION ON TELOMERE LENGTH IN
ELDERLY
1
1
2
1
I. Pusceddu , S.H. Kirsch , C. Werner , R. Obeid , U.
1
3
1
2
Hübner , M. Herrmann , M. Bodis , U. Laufs , J.
1
1
Geisel , W. Herrmann
1
Department of Clinical Chemistry and Laboratory
Medicine, Saarland University Hospital, Germany
2
Department of Cardiology, Saarland University
Hospital, Germany
3
Department of Clinical Pathology, District Hospital
Bolzano, Italy
Background: Telomeres are essential for the maintenance
of genomic integrity. Telomere length declines with age
and telomere shortening/dysfunction has been proposed
as a biomarker for age-related diseases. B and D vitamins
are essential cofactors for numerous cellular processes
including the synthesis of purines and nucleotides,
DNA methylation, cell differentiation, proliferation and
apoptosis. B and D vitamin deficiencies are risk factors
for the development of age-related diseases. The aim of
this study was to evaluate the effects of B and D vitamin
supplementation on telomere biology in elderly people.
Methods: In a double-blind study 60 subjects (>54 years)
were randomly assigned to receive a daily combination
of vitamin D3 (1200 IU), folic acid (0.5 mg), vitamin B12
(0.5 mg), vitamin B6 (50 mg) and calcium carbonate
(456 mg) (Group A) or vitamin D3 and calcium carbonate
alone (Group B) for 1 year. Blood concentrations of
25-hydroxy-vitamin D, vitamin B12, folate forms and
several metabolites were measured. Furthermore, LINE-1
methylation and telomere length in peripheral blood were
analyzed at baseline and after 1 year of supplementation.
Results: Baseline gender- and age-adjusted telomere
length correlated with methyl-tetrahydrofolate (r=0.35),
5,10-methenyl-tetrahydrofolate (r=0.36) and total folate
(r=0.33). At the end of the study gender- and
age-adjusted telomere length showed the following
correlations: Group A: methylmalonic acid (r=-0.46)
and choline (r=0.39); Group B: 5,10-methenyltetrahydrofolate (r=-0.57), dimethyl-glycine (r=-0.39), and
LINE-1 methylation (r=-0.43).
Conclusions: The present results provide evidence for
an association between vitamin B status and telomere
length in elderly subjects. One year of B and/or D vitamin
supplementation substantially changes the pattern of
correlations observed at baseline. This suggests an
active involvement of these vitamins in telomere biology
and genomic stability. The inverse relationship between
telomere length and DNA methylation could be an
appealing explanation that links telomere length with B
vitamins.
P032
DNA-POLYMORPHISMS AND BIOCHEMICAL
PROFILING EVALUATED IN A YOUNG NATIONAL
SOCCER TEAM: PRELIMINARY DATA
G. Canu, A. Minucci, M. De Bonis, E. Fabbro, B.
Giardina, M.C. Mele, E. Capoluongo
Dep. of Diagnostic and Laboratory Medicine, CriBeNS:
Centro di Ricerca in Biochimica e Nutrizione dello Sport,
Catholic University, “A. Gemelli” Hospital, Rome, Italy
Introduction: Human athletic performance is dependent
on a highly complex phenotype considered a multifactorial polygenic trait. Muscle energy production and
metabolism, blood and tissue oxygenation, vitamins
metabolism, bone mineral density are genetically
determined, playing an essential role in determining
athletic performance. Knowledge of the status of genes
encoding factors influencing athlete capabilities, could
allow the elaboration of individualized training programs,
nutritional planning and supplementation, to achieve
optimal performance, especially in young elite players.
Environment and quality of nutrition may influence athletic
performance. The aim of this study was to evaluate some
SNPs involving endurance/sprint and vitamin metabolism:
p.R577X, I/D polymorphism, p. A222V and FokI/BsmI
polimorphisms in ACE, ACTN3, MTHFR and VDR genes,
respectively. In addition, to provide also a biochemical
profile related to athletic performance, folate and 25-OH
vitamin D were measured.
Methods: 20 players of the under 18 Lega Pro National
Soccer Team were studied during a training stage.
Genomic DNA and serum samples were obtained to
perform genetic and biochemical tests, respectively.
Molecular genotyping assays were performed as reported
in literature. Folate and 25-OH vitamin D were performed
on serum by chemiluminescence immunoassay methods.
Results: DNA profiling showed: 2 athletes with I/I
polymorphism (10%), 3 athletes with p.X577X (15%),
4 athletes with p.V222V (20%), 9 athletes with
FokI polymorphism (45%) and 7 athletes with BsmI
polimorphism for ACE, ACTN3, MTHFR and VDR genes.
For biochemical tests, 18 athletes (90%) have 25-OH
vitamin D levels under cutoff (<30 ng/mL) and 6 athletes
(30%) have serum folate under cutoff (<3 ng/mL).
Conclusion: the objective of this study was to verify if
genetic ACE and ACTN3 polymorphisms might influence
sprint and/or endurance in this elite soccer players, in
order to better modulate training and recovery strategies.
Moreover, folinic acid and vitamin D supplementation
are needed to ameliorate their individualized nutritional
programs, possibly resulting in an improvement of
athletes’ wellbeing and consequently resulting in a better
performance.
445
P033
PRESERVED CORTISOL CIRCADIAN RHYTHM IN
UNDER 18 LEGA PRO NATIONAL SOCCER TEAM
C. Carrozza, G. Canu, A. Arcuri, L. Basso, E. Fabbro, B.
Giardina, E. Capoluongo, M.C. Mele
Department of Diagnostic and Laboratory Medicine,
CriBeNS: Centro di Ricerca in Biochimica e Nutrizione
dello Sport, Catholic University, “A. Gemelli” Hospital,
Rome, Italy
Background: Due to the effects of physical training
on hormonal homeostasis, cortisol assay has gained
attention in sports because altered secretion, either
increased or decreased, might affect health, fitness
and athletic performance. Acute intense exercise
activates the Hypotalamus-Pituitary-Adrenal (HPA) axis,
while continuous intense physical training, by acting
as a chronic repeated stress, leads to a reduced
responsiveness of the HPA axis. The cortisol
measurement is frequently used to assess the risk of
overtraining syndrome in athletes. Increased secretion of
this hormone can be detrimental to physical performance
of athletes mainly due to the negative effects on protein
catabolism.
Methods: During a stage in which a double training
session per day was performed, sera were obtained from
20 males of the under 18 Lega Pro National Soccer
Team at different times (T0=basal at 8.00 am; T1=posttraining at 12 am; T2=basal at 8 am the day after) within
two consecutive days. Serum cortisol was performed
by electrochemiluminescence immunoassay (ECLIA) on
Architect 4000 (Abbott).
Results: mean serum cortisol concentration was 155
± 21 ng/mL, 79 ± 28 ng/mL, 159 ± 25 ng/mL at
different times T0, T1 and T2, respectively. No statistically
significant difference was found between basal serum
cortisol concentration at T0 and T2 (at 8 am), whereas
a statistically significant difference was found between
serum cortisol concentration at T0 (basal) and T1 (post
training) at 8 am and at 12 am.
Conclusion: The cortisol circadian rhythm was preserved,
as shown by the decrease of the cortisol concentration at
12 am, despite the stress induced by the intensive training
session. This finding was confirmed by the cortisol values
in T2 (basal at 8 am the day after) which is not different
from T0, although the double training session performed
the day before. The physical stress neither induced a
cortisol increase in post-training, nor an HPA activation by
overtraining showing a good training adaptation in a young
elite soccer team.
446
P034
EFFECT OF CITRATE-CAPPED LANTHANIDE
DOPED CaF2 NANOPARTICLES ON PLATELET
AGGREGATION
1
2
1
E. Danese , I.X. Cantarelli , G.L. Salvagno , M.
2
2
1
1
Pedroni , A. Pucci , M. Gelati , M. Benati , G. Lima1
2
1
Oliveira , A. Speghini , G.C. Guidi
1
Dip. di Scienze della Vita e della Riproduzione, Sez. di
Biochimica Clinica, Università di Verona
2
Dip. di Biotecnologie, Università di Verona e Unità di
Ricerca INSTM
Aim: The study on nanoparticles (NPs) for medical
applications, in particular for biomedical diagnostics, is
nowadays increasing rapidly. Recently, lanthanide doped
luminescent nanoparticles have attracted considerable
attention for in-vitro and in-vivo bioimaging. Among the
available types of fluoride-based hosts, citrate capped
lanthanide doped CaF2 NPs have proved to be very
promising optical and MRI contrast agents. Nevertheless,
a comprehensive evaluation of the biocompatibility of such
NPs is still under investigation. We studied the effect of
citrate capped CaF2 NPs on platelet aggregation.
Methods: Platelet aggregation in the presence and
absence of NPs was monitored using an impedance
aggregometer (Multiplate, Dynabyte) and a Light
Transmission Aggregometer (LTA; model 700, ChronoLog). NPs suspensions in saline were mixed with hirudin
(or citrate) blood and platelet-rich plasma (PRP) at a 1:10
(v/v) ratio and incubated at 37°C for 15 min under constant
stirring. Data were recorded 6 min after the addition of
agonists and expressed as arbitrary aggregation units (U)
and percentage of maximal light transmission. The results
were reported as means±SD of at least five independent
experiments.
Results: citrate capped CaF2 NPs significantly inhibited
collagene-induced platelet aggregation as determined by
impedence analysis. Mean U values in the presence
of 0.12, 0.25 and 0.5 mg/mL of NPs were 54.4±9.9,
32±9.5 and 12.6±4.9 U respectively. All values were
significantly lower than that obtained in the absence of
NPs (77.2±11.8; p<0.05 for all t-tests). Similar results
were obtained by LTA. Multiplate analysis performed
on re-calcified citrate blood showed a significant but
less marked inhibition of collagene-induced platelet
aggregation by NPs. NPs showed almost no effect on
platelet aggregation in the presence of other agonists.
Conclusion: citrate capped CaF2 NPs inhibit platelet
aggregation induced by standard concentrations of
collagen (3.2 mg/mL for impedence aggregometry and 2
mg/mL for LTA). The observed effect seems to be only
partially due to the antiplatelet agent (citric moiety), which
constitutes the nano-surface.
Dong NN, Pedroni M, Speghini A, et al. NIR-toNIR two-photon excited CaF2:Tm3+,Yb3+ nanoparticles:
multifunctional nanoprobes for highly penetrating
fluorescence bio-imaging. ACS Nano 2011;11:8665-71.
P035
DNAZYME SWITCHING PROBES FOR THE
QUANTITATIVE DETECTION OF DNA-BINDING
PROTEINS
1
1
1
P036
DETECTION OF HEMOGLOBIN FRACTIONS
IN CELLULAR LYSATES FROM ERYTHROID
CULTURES BY CAPILLARYS 2 FLEX PIERCING®
ANALYZER (SEBIA)
G. Adornetto , A. Porchetta , G. Palleschi , K.W.
2
1
Plaxco , F. Ricci
A. Aprile , G. Passerini , G. Ferrari , F. Ceriotti
1
1
In recent years, switched-based biosensors, proteins
or nucleic acids that reversibly shift between two or
more conformations in response to the binding of a
specific target ligand, have drawn great attention due
to their specific attributes. In particular, the bindingspecific conformational changes offer a robust means of
transducing a binding event into an output signal that is
not easily mimicked by non-specific effects. Furthermore,
it is possible to describe the ligand-induced biomolecular
switches via a 3-state population-shift mechanism in
which the observed affinity depends on the intrinsic affinity
of our receptor modulated by the switching constant (Ks)
[1]. It is possible to control the Ks and then tune, extend, or
narrow the dynamic range of biomolecular receptors with
different strategies, as, for example, mutational approach
outside the binding site. In this work, we present a new
class of DNAzyme switching probes for the detection of
DNA binding proteins. DNAzymes are auto-catalytic DNA
molecules able to show a signal output. In particular, we
used a DNAzyme with a peroxidase mimicking a catalytic
activity, formed by specific G-quadruplex structures in
association with the cofactor Hemin. DNA binding proteins
(Transcription Factors, TFs) play often a crucial role in
the control of gene expression. Misregulations in these
patterns are involved in different diseases, as tumors.
After the binding with a TF, the induced switch of the
probe releases a tail of the molecule able to form the
DNAzyme. After the addition of a HRP-substrate (TMB
+ H2O2), the activity of DNAzyme that is proportional
to the concentration of TF is measured. We show here
some results on the detection of different TFs, as TATAbinding protein (TBP) and Microphthalmia-associated
transcription factor (MITF).
1. Vallée-Bélisle A, Ricci F, Plaxco KW. Thermodynamic
basis for the optimization of binding-induced biomolecular
switches and structure-switching biosensors. Proc Natl
Acad Sci U S A 2009;106:13802-7.
Detection of hemoglobin (Hb) variants and thalassemias
represents an important issue for diagnosis and treatment
of hemoglobinopathies. The Capillarys 2 Flex Piercing
analyzer by Sebia is employed for routine use in our
clinical laboratories to detect Hb variants in peripheral
blood (PB). This automated method allows to separate
Hb fractions by capillary electrophoresis and to give a
spectrophotometric measure of their relative proportion,
expressed as percentage of total Hb.
The scientific research in the field of hemoglobinopathies
needs robust procedures, in order to evaluate efficacy of
experimental therapies, such as gene transfer strategies
for ß-thalassemia. Thus, we investigated for the first time
the feasibility to employ Sebia Capillarys instrument to
separation and relative quantification of Hb in cellular
lysates, derived from in vitro erythroid cultures, which
reproduce the human erythroid differentiation steps,
although with a limited output of terminally differentiated
reticulocytes or RBCs. The total Hb concentration in
hemolysates from PB ranges between 10 and 28 g/
L, whereas the concentration in erythroid cell lysates
might be as less as 1-3 g/L, depending on the culture
protocol and mature cells contribution. We analyzed
PB hemolysates at low level of Hb, thanks to the
manual mode included in the Capillarys setting, and we
compared analytical precision, sensitivity and specificity
of this procedure to the automatic method, routinely used
in diagnostics. It was estimated analytical precision of
hemolysates both within the same run (CV 0.2% for
HbA fraction) and between different series (CV 0.3% for
HbA). Imprecision is related to relative Hb concentration:
the manual mode is less robust for detection of Hb
<3%. Analytical sensitivity was evaluated at 1, 1.5, 2
and 3 g/L of Hb concentration. At Hb levels <2 g/L
irregular background in electrophoretic profile causes
higher imprecision and shift of Hb peaks. Specificity
was assessed by analyzing PB samples with a high
percentage of HbF HbA2 HbS and HbC. The results
obtained by manual and automatic mode were equivalent.
To conclude, we demonstrated that the manual method
is comparable to the automatic one. Our data showed
that Capillarys 2 Flex Piercing allows a robust analysis
of Hb fractions also at very low concentration of total Hb,
representing a useful tool in the research field.
Dip. di Scienze e Tecnologie Chimiche, Università di
Roma Tor Vergata, via della Ricerca Scientifica, 00133
Roma, Italia
2
Department of Chemistry and Biochemistry, University
of California, Santa Barbara, California 93106, United
States
1
2
1
2
San Raffaele Scientific Institute, Division of
Regenerative medicine, Stem cells and Gene therapy
- HSR-TIGET - The San Raffaele Telethon Institute for
Gene Therapy, Gene transfer into stem cells Unit
2
Servizio di Medicina di Laboratorio, Ospedale San
Raffaele, Milano, Italy
447
P037
CFTR GENE ANALYSIS BY CONVENTIONAL
REVERSE DOT BLOT KIT MAY BENEFIT OF
MASSIVE PARALLEL PYROSEQUENCING IN CASE
OF FALSE POSITIVE RESULTS
S. Palumbo, R. Molinario, S. Rocchetti, R. Rizza, A.
Minucci, E. Capoluongo
Laboratory of Clinical Molecular and Personalized
Diagnostics, Institute of Biochemistry and Clinical
Biochemistry, Catholic University, Rome, Italy
Background: To date, more than 1900 cystic fibrosis
transmembrane conductance regulator (CFTR) mutations
are reported. Currently there are different methods which
can be successfully used for molecular CF diagnosis.
Methods: A 36 years old female referred to our
laboratory for CFTR screening. Genomic DNA was
extracted using a manual method based on commercial
kit (High Pure PCR Template Preparation Kits, Roche
Diagnostics, USA). The first step of molecular analysis
was performed using two different screening programs:
1) the line probe reverse dot blot assay based-method
on for the identification of 57 CFTR mutations (INNOLiPA CFTR17+Tn, CFTR19 and CFTR Italian Regional,
Innogenetics, Belgium); 2) NanoCHIP 400 platform, using
CF70 kit. Finally, DNA sample was analyzed using CFTR
MASTR v2 assay (Multiplicom, Molecular Diagnostics) on
the pyrosequencer 454 GS Junior (Roche Diagnostics).
Results: INNO-LiPA assay showed the presence of
a missing signal for 852del22 mutation, suggesting
a heterozygous condition. To confirm this genotype,
the same DNA was analyzed by NanoCHIP CF70
platform which genotyped as wild-type our sample.
These discordant results were clarified using massive
parallel sequencing (MPS), confirming the wild-type
status. Moreover, MPS also detected the 875+11A/T, in
heterozygosis: this variant is reported as causing false
positive reaction with the probe specific for 852del22
mutation. This finding clearly explained the crossreactivity found by INNO-LiPA assay.
Conclusions: We highlight as the 852del22 mutation,
detected by INNO-LiPA, may be misinterpreted due to
the possible interference given by presence of 875+11A/
T. Using of an alternative technology, as NanoCHIP
platform, can provide a correct genotyping. In this context,
only the second level analysis on entire coding sequence
CFTR gene was able to detect the 875+11A/T variant,
explaining the cause of this interference and allowing the
final laboratory clinical reporting.
Miolo G, Crovatto M, Manno M, et al. Heterozygous
variant at nucleotide position 875+11A>T in exon 6A
cystic fibrosis transmembrane conductance regulator
gene induces 852del22 mutation false-positivity by line
probe assay. Fertil Steril 2011;95:1121.e1-4.
448
P038
EVALUATION OF A NEW METHOD FOR STEM
CELL ENUMERATION USING AN AUTOMATED
HEMATOLOGY ANALYZER (SYSMEX XN1000)
1
2
3
F. Dima , F. Benedetti , M. Montagnana , D. De
2
3
3
4
Sabata , E. Danese , G. Lima-Oliveira , G. Lippi , G.C.
3
Guidi
1
Lab. Analisi dU, AOUI Verona
U.S.O. Centro Trapianto Midollo Osseo, AOUI Verona
3
Sez. di Biochimica Clinica, Dip. Di Scienze della Vita e
della Riproduzione, Università degli Studi di Verona
4
Unità Operativa Diagnostica Ematochimica, Azienda
Ospedaliero-Universitaria di Parma
2
Background: Monitoring of peripheral blood stem cells
is critical to establish the optimal time for starting
aphaeresis. This study is aimed to assess a prototype
application for stem cells enumeration in peripheral
blood transplantation (PBSCT) patients, using a Sysmex
XN1000 equipped with the prototype Hematopoietic
Progenitor Cell (HPC) application, not yet officially
released by the company. The new method has been
compared with the reference technique for enumeration
of CD34+ cells, based on flow cytometry and monoclonal
antibodies.
Materials and methods: The HPC count is based on flow
cytometry of cells labelled with a fluorochrome targeting
nucleic acids after selective lysis of the cells according
to their maturity. The value of HPC was compared
with the count of CD34+ cells obtained with BD Stem
Cell Enumeration kit on the flow cytometer FACScalibur
(BD), by means of the protocol ISHAGE. A total number
of 22 samples of peripheral blood pre-apheresis and
13 collected by apheresis from patients undergoing
autologous PBSCT were studied. The methods were
compared with Deming fit, analysis of bias by BlandAltman plots and ROC curves.
Results: The values of HPC (median: 84.0, range:
3.0-10456.0 x10^9/L) have similar distribution to that of
CD34+ cells (median: 93.0, range: 2.6-10942.0 x 10^9/
L; p=0.09). Using regression analysis we obtain a r =
0.96 (p <0.0001). The Bland-Altman plots showed a mean
bias of -26 HPC x10^9/L (95% CI: -257 to 206 x10^9/
L) calculated over the entire series, and HPC -4 x10^9/L
(95% CI: -11 to 2 x10^9/L) in 18 samples with a CD34+ cell
count <100x10^9/L. At the cut-off of 20 x10^9/L CD34+
cells, the ROC curve displayed an AUC value of 1.00.
Conclusions: The results of this evaluation using the
prototype application for stem cells enumeration on
Sysmex XN1000 show that this method can be a reliable
approach for stem cells identification and enumeration
in patients undergoing apheresis procedures. Due to its
rapidity, ease of use and possibility of combination with the
complete blood cell count (CBC), the XN1000 represents
a reliable approach to implement flow cytometry with CBC
in this clinical setting
Tanosaki R, et al. Int J Lab Hematol 2013 Dec 27. doi:
10.1111/ijlh.12182. [Epub ahead of print]
P039
CATENE LEGGERE LIBERE SIERICHE: DUE METODI
A CONFRONTO
K. Proko, D. Ciubotaru, M. Seguso, S. Altinier, M.
Varagnolo, M. Zaninotto, M. Plebani
U.O.C. Medicina di Laboratorio, Az. Osp. -Università
degli Studi, Padova
Introduzione: La determinazione delle catene leggere
libere nel siero (FLC) viene utilizzata nel monitoraggio
e nella valutazione prognostica di soggetti affetti da
disordini linfoproliferativi (Dispenzieri A. et al., Leukemia,
2009).
Obiettivi: Confrontare i risultati dei due metodi oggi
disponibili in commercio per la valutazione delle FLC:
Freelite, Binding Site e N Latex FLC, Siemens.
Materiali e metodi: Sono stati analizzati 120 campioni
di pazienti (pz) di età compresa tra 35 e 91 anni,
pervenuti al nostro laboratorio con richiesta di FLC. Di
questi, 28 campioni appartenevano a 4 pz monitorati:
due con componente monoclonale lambda (n=19) e due
con componente monoclonale kappa (n=9). I campioni
sono stati analizzati con entrambi i metodi sul nefelometro
BNII (Siemens). Per la valutazione di ciascun metodo
è stato utilizzato un unico lotto di reagenti con controlli
dedicati forniti dalle ditte produttrici su cui è stata valutata
l’imprecisione in 12 sedute analitiche. Per la valutazione
statistica è stato utilizzato il programma Analise-it.
Risultati: -Imprecisione, controlli dedicati low e high:
Freelite κ CV 5.8%, 9.7%; Freelite λ CV 8.5%, 9.6%, N
latex κ CV 7.5%, 11.9%; N latex λ CV 3.6%, 4.8%.
-Confronto tra metodi: κ N Latex=3.67+0.72κ Freelite
(regressione di Passing Bablok, correlazione di
Pearson. r=0.97, n=116, range 1.46-4060 mg/L), λ
N Latex=0.52+1.28λ Freelite (r=0.47, n=119, range
1.33-2550 mg/L). Scostamenti maggiori si osservano per
concentrazioni elevate: bias% κ N Latex vs κ Freelite da
-85 a -39% (n=9) e per λ da -72 a +185% (n=9), di cui 8
appartenevano a pz monitorati.
Conclusioni: Le prestazioni analitiche, in termini di
imprecisione sono risultate buone e confrontabili per
entrambi i metodi. La correlazione risulta soddisfacente
per κFLC per valori <200 mg/L, ma non accettabile
per λFLC e per valori molto elevati (>200 mg/L) di
entrambe. L’evidenza che la maggior parte dei risultati
significativamente diversi appartengono a pz monitorati,
fa supporre che i diversi anticorpi utilizzati dai due metodi
riconoscano in modo diverso i diversi cloni monoclonali.
Tali risultati dimostrano che, a prescindere dalla scelta
iniziale del metodo, va assicurata una continuità di
fornitura perché è essenziale monitorare i pz sempre con
lo stesso metodo.
P040
TM
COMPARAZIONE DI N LATEX FLC E FREELITE
PER LA VALUTAZIONE DELLE CATENE LEGGERE
LIBERE NEL SIERO
1
1
1
2
L. Bani , F. Cappellini , C. Sarto , P. Brambilla
1
Servizio Universitario di Medicina di Laboratorio, A. O.
di Desio e Vimercate, Desio (MB)
2
Dip. di Scienze della Salute, Università degli Studi di
Milano – Bicocca, Monza (MB)
Introduzione: L’analisi delle catene libere leggere k e λ
sieriche (sFLC) e del loro rapporto (k/λ) è uno strumento
importante per lo screening, il monitoraggio e la prognosi
dei pazienti con disordini proliferativi plasmacellulari.
Scopo: Comparazione delle performance analitiche del
TM
metodo N Latex FLC rispetto al metodo Freelite .
Materiali e metodi: Nel periodo compreso tra Aprile e
Maggio 2014 sono state analizzate le concentrazioni di
FLC k e λ su 81 campioni di siero di soggetti con diverse
discrasie plasmacellulari.
I dosaggi sono stati effettuati con strumentazione
®
SPAPLUS (Binding Site) e sullo strumento BNII
(Siemens). E’ stata effettuata l’analisi di regressione
secondo Passing-Bablock ed è stata elaborata
una “Medical Decision Chart” confrontando bias ed
imprecisione del metodo N Latex rispetto ai traguardi
analitici di ETa basati sulla variabilità biologica intra- ed
interindividuale riportati in letteratura (1).
Risultati: La regressione di Passing-Bablock, ha indicato:
pendenza ed intercetta (con rispettivi intervalli di
confidenza al 95%) per le FLC k rispettivamente di
0,69 (0,58-0,82) e 5,02 (2,18-8,89); per le FLC λ
rispettivamente di 1,47 (1,28-1,74) e -2,67 (6,67-0,76).
Al livello decisionale di 19,4 mg/L per le FLC k il bias
TM
% di N Latex rispetto a Freelite è risultato essere di
4,68 e l’imprecisione (CV%) di 1,7; per le FLC λ (livello
decisionale di 26,3 mg/L) il bias % è stato pari a 37,05 e
l’imprecisione (CV%) pari a 1,8.
Conclusioni: Dalla regressione di Passing-Bablock i due
metodi non sono confrontabili. Per le FLC k si riscontra
un errore sistematico significativo sia di tipo proporzionale
che costante. Per le FLC λ l’errore sistematico riscontrato
è stato di tipo proporzionale. Dalla MEDx chart risulta
che ai livelli decisionali considerati, N Latex soddisfa le
specifiche di qualità per le FLC k (3 σ) ma non per le λ (σ
pari a 1).
1. Braga F, Infustino i, Dolci A, et al. Biological variation of
free light chains in serum. Clim Chim Acta 2013;415:10-1.
449
P041
ANALYTICAL EVALUATION OF A NEW LIQUID
STABLE IMMUNOTURBIDIMETRIC ASSAY FOR THE
DETERMINATION OF FERRITIN IN SERUM
R. Molinario, P.D. Daloiso, C. Autilio, K. Pocino, S. Di
Leva, C. Zuppi, M. Antenucci
U.O.C. Analysis I , Policlinico Universitario “A. Gemelli ”,
Rome
Background: Ferritin is a multifunctional protein that acts
as the soluble storage form of iron in tissue. A decrease in
the amount of stored iron is the only known cause for a low
serum ferritin result. Increased stored iron is associated
with raised serum ferritin levels (e.g. massive blood
transfusions, hemochromatosis and chronic inflammatory
disease). This study reports the evaluation of a new
immunoturbidimetric assay (Ferritin-Latex BioSystems
S.A.) on the analytical platform BA 400 LED technology for
the determination of ferritin in human serum. The results
were compared with a chemiluminescent microparticle
immunoassay on Architect c4000 (Abbott Diagnostics).
Methods:
The
principle
of
the
assay
is
immunoturbidimetric. A latex agglutination complex is
formed between ferritin and antibody coated latex
particles. Within-run imprecision (CLSI EP-15A2) was
conducted by testing control sample (Protein Control
serum level I and II, n.lot.118) at low and high
concentration levels and was expressed as CV%. The
inter-assay imprecision was evaluated by carrying out the
controls, at defined levels, supplied by the manufacturer
(Protein Control serum level I and II, n.lot.117), over
a period of 30 days. Correlation studies (samples=100)
were assessed using an immunoassay on Architect
c4000.
Results: Linearity was excellent (r =1.00). The % recovery
values ranged from 96 to 98. The within-run imprecision,
expressed as CV%, was at 2.13 (concentration level
47.0 µg/L) and 0.73 (concentration level 71.8 µg/L). The
between-run imprecision was 2.47% (concentration level
41.7 µg/L) and 4.70% (concentration level 82.9 µg/L).The
range values were from 4.0 to 1480 µg/L. Passing-Bablok
regression analysis revealed an intercept of -3.45 µg/
L (95% CI -4.880/-1.820), a slope of 0.980 (95% CI
0.960/1.010) and a regression coefficient (r) of 0.998,
suggesting that values obtained by the new method had a
very good correlation compared with matched assay. The
Bland Altman plot analysis shows very limited bias.
Conclusions: Our evaluation indicates that the
immunoturbidimetric assay exhibits high accuracy,
reproducibility and correlates favourably with other
methodology. It is applicable to a variety of automated
analyzer and represents an improvement for use in the
accurate determination of ferritin human serum.
450
P042
EVALUATION OF THE PERFORMANCE OF AN
IMMUNOTURBIDIMETRIC HBA1C REAGENT
APPLIED TO THE SIEMENS ADVIA 2400
AUTOMATIC ANALYZER
1
1
2
A. Carobene , M. Barbaro , C. Ku-Chulim , R.
3
3
1
1
Cochrane , F. Rota , G. Passerini , E. Guerra , F.
1
Ceriotti
1
Servizio di Med. di Lab., Osp. San Raffaele, Milano,
Italy
2
Hospital Centro Médico de las Américas, Mèrida,
Yucatán, México. Supported by IFCC Professional
Scientific Exchange Programme
3
Axis-Shield Laboratories, Technology Park, Dundee,
UK
Introduction: Glycated Hemoglobin (HbA1c) is recognized
as the gold standard for long-term glycemic control.
Moreover, in the last years, the use of HbA1c to screen
and diagnose diabetes mellitus has increased, leading to
the suggestion of a HbA1c level of 48 mmol/mol (6.5%)
as a diagnostic cut-off. Our aim was to evaluate a new
immunochemical reagent based on latex particles (Axis
Shield), using Siemens ADVIA 2400.
Design and Methods: Intra-assay and total imprecision,
interferences studies (bilirubin ~850 µmol/L, triglycerides
~16.9 mmol/L, total protein ~140 g/L, sodium cyanate ~50
mg/dL, ascorbic acid ~50 mg/dL, urea ~24.99 mmol/L,
glucose ~105.46 mmol/L, rheumatoid factor ~700 U/mL),
method comparison vs Sebia Capillary Electrophoresis,
lot to lot reproducibility, linearity and carry over were
conducted on Advia 2400 according to CLSI protocols.
Additionally, 40 NGSP certified samples and 24 certified
Hb variants were measured by the two methods.
Results: CVs % obtained by intra-assay imprecision,
on 3 human specimens at different concentrations (low
<48, medium between 48-64, and high >64 mmol/mol)
in 20 replicates, were <4%.CVs% by total imprecision,
performed in 20 days with 4 calibrations on 5 materials
[control low 41 mmol/mol, high 85 mmol/mol 3 human
samples (<48; 48-64, >65 mmol/mol HbA1c], resulted
<4%. Interferences were studied on two human samples
(42-53, >64 mmol/mol) without obtaining significant
biases (<10%). Methods comparison, performed on 120
samples ranging 23–137 mmol/mol, obtaining r=0.9809
as regression coefficient and a mean bias at decisional
level (48 mmol/mol) <2.0%. The results obtained with the
40 NGSP samples has allowed the certification of the new
reagent. The biases on 24 NGSP certified Hb variants
measured were <10% for A2, AC and F variants.
Conclusions: The availability fully automated, economical
high throughput analysis, for the determination of HbA1c
will not be only desirable but will become an important
clinical need. The ADVIA 2400 is able to perform the
analysis in 10 minutes for each sample. Furthermore,
this method showed good performance in our evaluation,
robustness with respect to endogenous interference, and
a good correlation when compared with routinely used CE
especially against NGSP certified materials.
P043
AN ULPC MS/MS METHOD COUPLED WITH
AUTOMATED ON-LINE SOLID PHASE EXTRACTION
FOR QUANTIFICATION OF TACROLIMUS IN PBMC
SAMPLES
1
1
2
2
D. Pensi , A. De Nicolò , M. Pinon , P.L. Calvo , G. Di
1
1
Perri , A. D'Avolio
1
Lab. di Farmacologia Clinica e Farmacogenetica, Osp.
Amedeo di Savoia, Dip. di Scienze Mediche, C.U. di
Malattie Infettive, Uni. degli Studi di Torino, Torino
2
S.C. di Gastroenterologia ed Epatologia Pediatrica,
Osp. Regina Margherita "Città della Salute e della
Scienza", Uni. degli studi di Torino, Torino
Background and Aims: Tacrolimus (TAC) is used to treat
pediatric patients undergoing liver transplant. Therapeutic
drug monitoring of TAC in whole blood by ultra or
high performance liquid chromatography (U-HPLC) with
tandem mass spectrometry (MS/MS) is the new gold
standard (1), but it does not necessarily reflect its
concentration at the active site. Our aim was to develop
and validate a new method for TAC quantification into the
target cells (peripheral blood mononuclear cells, PBMCs),
and apply this to patients samples.
Methods: PBMCs were collected using CPT tubes;
cells count and the mean cellular volume (MCV)
were evaluated with a coulter counter. TAC was
quantified, after cell lyses, using UPLC-MS/MS in positive
ion mode, coupled with the new automated on-line
solid phase extraction (OSM®, Waters) technology;
XBridge® C8 10µm(1x10mm) OSM cartridges were used.
Chromatographic run was performed on an Acquity
UPLC® BEH C18 1.7µm(2,1x50mm) column heated at
45°C for 5 min at 0.5 mL/min, with a gradient of H2O and
methanol (both with 2mL/L ammonium acetate and 1mL/L
formic acid). These phases were used also to elute OSM
cartridges. 6,7-Dimethyl-2,3-di(2-pyridyl)quinoxaline was
used as internal standard (IS).
Results: Full validation following FDA guidelines was
performed: the method have high sensitivity (LOQ
of 0.039 ng/mL) and specificity. Intra- and inter-day
imprecision and inaccuracy (RSD) are lower than 15%.
Moreover, absence of matrix effect was observed, with
a good recovery for TAC and IS (both>80%). This
fast method was applied to more than 100 PBMCs
samples from 40 pediatric patients. All concentrations
resulted within calibration range (0.039-10 ng/mL, mean
r2=0.998). Concentrations from each patient were
standardized using their real MCV: the observed intraPBMCs concentration was meanly 12.7 times higher than
the blood one.
Conclusions: Using UPLC-MS/MS coupled with the new
OSM, we developed a simple, specific, sensitive, precise,
rapid and accurate method according to FDA guidelines. It
might be useful in the clinical routine for TAC quantification
in PBMCs samples to help clinicians to improve therapy
on the basis of data obtained from the target cells.
1. Taylor PJ, et al. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed
Life Sci 2011;883-884:108-12.
P044
CONTEGGIO CELLULARE AUTOMATICO NEI
LIQUIDI BIOLOGICI: ANALISI COMPARATIVA XN
9000 VS XE 5000
M.T. Comberlato, G. Mezzena, A. Bedin, S.
Consolaro, G. Ruggero, L. Scarparo, A. Rauli, S.
Indico, D. Giavarina
Lab. di Biochimica Clinica, Osp. S.Bortolo, Vicenza
Lo scopo di questo lavoro e stata la valutazione delle
prestazioni analitiche (imprecisione, linearità, carry-over)
e le sue prestazioni di accuratezza relative a conteggio
e differenziazione leucocitaria del nuovo modulo del
sistema Sysmex serie XN dedicato all’analisi dei liquidi
biologici, rispetto al precedente contaglobuli XE-5000.
Imprecisione: sono stati esaminati 6 campioni di liquido
diversi (peritoneale, PRT, pleurico PLR, cerebrospinale,
LCR, broncolavaggio alveolare, BAL, da drenaggio
cerebrale, NCH, pleurico diluito, PLRdil), in 10 replicati
consecutivi per ciascun campione. Entrambi i sistemi
hanno mostrato CV < 20% per bianchi totali, WBC,
fino a 12 x10^6/L, mononucleati MN# fino a 7 x10^6/L,
polimorfonucleati, PMN# e linfociti, LY#, fino a 4 x10^6/
L, monociti fino a 9 x10^6/L. Maggiore imprecisione per
gli eosinofili. Nessuna differenza significativa tra i due
strumenti.
Linearità: sono state esaminate sette diluizioni scalari 1:2
di un campione con 500 x10^6/L WBC. La regressione è
risultata R^2 >0.95 per WBC, MN#, PMN# per XN, mentre
XE-5000 accusa una R^2 = 0,85 per i mononucleati
(conteggio di partenza molto basso, di 18 x10^6/L ).
Carry over: analisi in triplicato un campione ad elevata
cellularità (WBC >500/µL) High1, High2, High3, seguito
da un triplicato a bassa cellularità (WBC < 20/µL), Low1,
Low2, Low3. Calcolo della K di Broughton: Carryover
%= (Low1-Low3)/(High3-Low3)*100. WBC, MN#, PMN#,
LY#, MO#, NEUT#, hanno mostrato tutti un Carryover <
1% su entrambi gli strumenti. XE-5000 spesso non è in
grado di misurare correttamente gli eosinofili.
Confronto dei metodi: Confronto tra XN-9000, XE-5000
e analisi morfologica su cytospin su 50 campioni
consecutivi. L’analisi di Bland-Altman e la Regressione di
Passing Bablok hanno dimostrato limiti di concordanza e
correlazioni ottimali, con bias di 0 per WBC, MN#, PMN#
e MO#. Maggiore discordanza per i linfociti e limiti analiti
per gli eosinofili su XE-5000.
Lo strumento XN-9000 nella citometria dei liquidi
biologici ha buone performance rispetto al gol-standard
microscopia ottica. La nuova serie XN, grazie alla
possibilità di lavorare con tappo chiuso, permette inoltre
all’operatore di effettuare le determinazioni in completa
sicurezza, riducendo notevolmente il rischio biologico.
451
P045
VALUTAZIONE DELLA PROVETTA KIMA 13X100MM
LITIO EPARINA+GEL SU ESAMI IMMUNOMETRICI
P046
ANALYTICAL PERFORMANCE OF THE NEW
AUTOMATED ISYS CTX-I® (CROSSLAPS)
F. Fortuna, D. Urbani, L. Urbani, F. Fabbi, G.
Rossettini, D. Giavarina
G.L. Salvagno, M. Meneghello, L. Stefani, M. Voi, G.
Brocco, G.C. Guidi
Lab. di Biochimica Clinica, Osp. S. Bortolo, Vicenza
Sezione di Biochimica Clinica, Dipartimento di Scienze
della Vita e della Riproduzione, Università di Verona,
Italy
Introduzione: Il nostro ospedale sta attualmente
utilizzando la provetta Vacuette, Greiner Bio-One, cod.
454046, su strumentazione Dimension Vista (Siemens),
oltreché per gli esami di chimica clinica, anche per
alcuni esami immunometrici: Alfa feto Proteina (AFP),
Peptide Natriuretico Ventricolare, frammento NT (NTBNP), Marcatori tumorali mucinici (CEA, CA19-9, CA125,
CA15-3), Ferritina (FERRI), Ormoni tiroidei (fT3, fT4),
ormone tireotropo (TSH), Troponina I (cTnI), Mioglobina
(MIOG), Prolattina (PRL). In previsione di un cambio
di provetta per diversa fornitura regionale, sono state
valutate le nuove provette per questi costituenti, al fine di
validare l’uso di plasma e del separatore gel di diverso
produttore.
Materiali e metodi: campioni appaiati, raccolti su provetta
Vacuette, Greiner Bio-One, cod. 454046, 5mL, 3 provetta
KIMA 13x100 mm litio eparina + gel, cod. 12570, sono
stati raccolti da 15 volontari. I campioni sono stati
centrifugati contemporaneamente oltre 90 minuti dalla
raccolta ed analizzati sullo stesso strumento Dimension
Vista, per gli esami elencati in introduzione. Per ogni
parametro sono stati calcolati Bias (differenza tra le
medie dei 15 campioni, Greiner – KIMA, in % sulla
media Greiner), differenza media ±DS, differenza minima
e massima, nonché coefficiente di correlazione (R),
pendenza (p) ed intercetta (i).
Risultati: bias%; differenza media, minima e massima; R,
p sono risultati rispettivamente: AFP(0.0%; 0.02, -0.1 e 0.3
µg/mL; 1.0,1.04,-0.13); NT-BNP (-0.26%; -0.40,-6 e 7 pg/
mL; 1.00,0.99,0.89); CA125 (2.53%; 0.07, -1.10 e 1.00 U/
mL; 1.0, 0.96, 0.43); CA15-3 (1.35%; 0,23, -1.2 e 2.7 U/
mL; 0.99, 0.98, 0.56); CA19-9 (0.35%; -0.03, -0.6 e 0.3
U/mL; 1.00, 0.98, 0.08); CEA (0.42%; 0.02, 0.0 e 0.1 U/
mL; 1.00, 1.00, 0.01); FERRI (-0.12%; -0.18, -21.4 e 9.0
ng/mL; 1.00, 0.98, 1.68); fT3 (-0.37%; 0.01, -0.3 e 0.19
pg/mL; 0.88, 0.98, 0.07); fT4(1.32%; 0.01, -0.1 e 0.1 ng/
dL; 0.98, 1.08, -0.07); MIOG (-0.29%; -0.13, -2.0 e 2.0 ng/
mL; 1.00, 0.98, 0.90); PRL (1.45%; 0.23, -0.2 e 1.1 ng/mL;
1.00, 1.04, 0.20); TSH (-1.12%; 0.12, -2.0 e 0.06 mUI/L;
1.00, 0.99, 0.03).
Conclusioni: La provetta KIMA 13x100 mm litio eparina
+ gel non determina variazioni significative rispetto alla
provetta Vacuette, Greiner Bio-One, cod. 454046 per
la determinazioni degli esami immunometrici eseguiti in
automazione qui considerati.
452
Background: Serum biochemical bone turnover markers
have shown considerable promise for prediction of the
risk of osteoporosis and accurate assessment of the
clinical progression of the disease. The measurement of
C-telopeptide cross-link of type 1 collagen (sCTX) is a
highly sensitive indicator of bone turnover and become the
reference markers of bone resorption.
The aim of this study was to compare the
analytical performances of new iSYS CTX-I® automated
immunoassay assayed on iSYS (Immunodiagnostic
Systems, Boldon, UK) according to the manufacturer's
specifications with the first automated version of the
CTX performed on the Roche/Hitachi COBAS 6000
System ROCHE E170 immunoassay analysers (Roche
Diagnostics, Penzberg, Germany). The iSYS CTX-I®
assay uses two monoclonal antibodies against the amino
acid sequence EKAHD-b-GGR from the a1 chain of
human collagen type I.
Methods: Two serum aliquots were assayed
simultaneously with the current reference ROCHE
COBAS E 170 assay and the novel new iSYS CTX-I®
automated immunoassay.
Results: The within run coefficients of variations of
iSYS CTX-I® concentrations at low (0.242 ng/mL),
medium (0.769 ng/mL) and high (2.312 ng/mL) were:
4.82%, 3.85% and 3.53%, respectively. The assay was
proven linear in a range of iSYS CTX-I® concentrations
comprised between 0.266 ng/mL and 2.458 ng/mL, as
confirmed by the linear regression analysis (y = 1.01x
+ 0.06) and the relative correlation coefficient (r=0.997,
p <0.001). Results of Serum samples (n=88) were
compared with those of the reference commercial ROCHE
CTX assay. The median values (2.5-97.5 percentiles)
of the samples were: 0.406 ng/mL (0.067-1.337 ng/
mL) for iSYS CTX-I® and 0.365 ng/mL (0.089-1.296
ng/mL) for ROCHE CTX. The nonparametric regression
according to the method of Passing & Bablok and
the relative Spearman’s correlation coefficient showed
excellent performance for iSYS CTX-I® (iSYS CTX-I® =
1.46 x ROCHE CTX – 0.11; r= 0.960, p <0.001).
Conclusion: We conclude that the analytical performance
and the technical features of new iSYS CTX-I® make it a
suitable assay for the rapid quantification of sCTX.
P047
MOLECULAR DIAGNOSIS OF CYSTIC FIBROSIS
(CF): COMPARISON OF THREE DIFFERENT
TECHNOLOGIES ROUTINELY USED FOR THE FIRST
LEVEL SCREENING
P048
NUOVE OPPORTUNITÀ STRUMENTALI NELLA
DIAGNOSTICA TIROIDEA: AIA-2000
R. Molinario, S. Palumbo, S. Rocchetti, R. Rizza, E.
Capoluongo
U.O.C. Medicina di Laboratorio, Azienda Ospedaliera Università, Padova
Laboratory of Clinical Molecular and Personalized
Diagnostics, Institute of Biochemistry and Clinical
Biochemistry, Catholic University, Rome, Italy
Scopo dello studio: Valutazione delle caratteristiche
di
praticabilità,
robustezza
meccanica
dello
strumento AIA-2000(Tosoh Bioscience-Italia),strumento
immunoenzimatico in fluorescenza, con attenzione ai
marcatori biochimici per la valutazione delle patologie
della tiroide: Tireoglobulina (Tg), anticorpi antiperossidasi
tiroidea (anti-TPOAb) e anticorpi antitireoglobulina (antiTgAb). Materiali e metodi: Le determinazioni sono state
eseguite su 100 campioni di siero di pazienti inviati
presso il nostro laboratorio. Le prestazioni analitiche in
termini di imprecisione sono state valutate utilizzando
campioni di controllo a tre livelli di concentrazione
(Biorad Lyphochek Immunoassay Plus Control) e pool
di sieri a concentrazioni adeguate per ambiti specifici
di applicazioni cliniche. Per tutti gli analiti sono stati
eseguiti test di linearità per verificare limiti di sensibilità
analitica e funzionale. I risultati sono stati confrontati
con quelli ottenuti sugli strumenti utilizzati di routine:
DXI800(Beckman Coulter) per la Tg e LIASON (Diasorin)
per AbTg e AbTPO. Risultati: Imprecisione: Tg-CV% tra
serie: 10,2-4,7 (pool 0,26-0,79 ng/mL rispettivamente;
2.5-3.2%, intervallo di concentrazioni 13.70-189.98 ng/
mL. Anti-TPOAb -CV% tra serie: 9.46-3.60, intervallo
di concentrazioni: 2.05-6.99 UI/mL. Anti-TgAb - CV
% tra serie: 10.21-4.11, intervallo di concentrazioni:
59.19-334.10. Test di Linearità: Tg: R2 =1,00 range:
da 59,09 a 0,233 ng/ml; Anti–TPOAb: R2 da 0,873 a
0,999 range: da 965 a 0,94 UI/mL; Anti – TgAb: R2 da
0,889 a 0,9991; range: da 6592 a 6,74 UI/mL. Per il
metodo di misura della Tg, sono stati calcolati il limite
del bianco(LOB) ed il limite di rilevabilità (LOD) che sono
risultati rispettivamente 0,105 e 0.207 ng/mL. Confronto
tra metodi (media, range; Bland-Altman, Passing-Bablok):
Tg: 10.25 ng/mL [0.1-236.8]; [+ 3.739 (- 1.13 – +8.61)],
y=1.71x-0.06; Anti–TPOAb: 168.95 UI/mL [5.63-1049.3];
[- 50.208 (- 84,511 – +15,905)], y= 0.83x -3.95; Anti–
TgAb: 221.08 UI/mL [6.23-1204.13]; [-174.879 (- 256.223
– 93,535)], y= 0.57x-1.92. Conclusioni: La stabilità delle
calibrazioni, la praticabilità di utilizzo, oltre alle buone
prestazioni analitiche, l’adeguata sensibilità per test critici,
quali la Tg, oltre alla confrontabilità dei risultati con
metodologie diffuse, dimostrano la validità di questa
nuova proposta tecnologica.
Background: CF is one of the most common lifethreatening autosomal recessive disorders among
Caucasians. The large number of different mutations
found within populations reflects their genetic
heterogeneity. To provide a cost-effective CF test and
optimize the CF detection rate, the selection of a mutation
panel should be considered for covering the population
disease risk. The simplest and rapid laboratory approach
for mutational screening generally involves using of a
panel of mutations.
The aim of this study was to evaluate and to compare
the performance of three different analytical CF molecular
assays: 1) INNO-LiPA kit (Innogenetics), 2) NanoCHIP
CF70 Kit (Savyon Diagnostic) and xTAG Cystic Fibrosis
kit (Luminex Molecular Diagnostics). All three mutation
panels showed a good detection rate regarding our
geographical area.
Methods: We analyzed 100 DNA samples with INNOLiPA kit (57 CFTR mutation) and NanoCHIP CF70; 50
of these samples were also analyzed with xTAG 91 EU
Luminex (Panel A, B and C). All tests included most
frequent CF mutations and Poly-T screening. To clarify
the discordant results, some samples were submitted to
CFTR massive parallel sequencing (MPS) with MASTR
v2 assay (Multiplicom, Molecular Diagnostics) run on 454
GS Junior (Roche).
Results: INNO-LiPA and NanoCHIP were concordant for
99/100 samples. Only 1 out of 100 (0.01%, 852del22
mutation) resulted as discordant: MPS confirmed the
wild-type genotype previously obtained on NanoCHIP.
Contrastingly, in a sample genotyped by INNO-LiPA
and MPS as compound heterozygote (3272-26 A/G;
621+3 A/G), the NanoCHIP only detected the 3272-26
A/G mutation. Finally, 47/50 samples were correctly
genotyped by INNO-LiPA and Luminex. The latter does
not include three mutations (3272-26 A/G; 621+3 A/G and
852del22). For Tn polymorphic tract, concordant results
were obtained using the three different platforms. INNOLiPA and Luminex had full concordance for Poly-t (50/50).
Conclusions: The choice of a molecular diagnostics
technology should take into account different factors,
including the coverage of the specific risk population and
the possibility to automate the complete workflow. In our
laboratory, Nanochip platform meets all these criteria, due
to the good mean CFTR mutation detection rate (84%)
for Italian Regions, and being the complete workflow
automated and traceable.
C. Cosma, D. Faggian, M. Zaninotto, M. Plebani
453
P049
HOW MORPHOLOGICAL ANALYSIS IMPROVES
DIAGNOSTIC SIGNIFICANCE OF URINARY STONES
ANALYSIS?
1
1
2
A. Primiano , S. Persichilli , G. Gambaro , P.M.
2
1
1
1
Ferraro , A. Cocci , A. Schiattarella , C. Zuppi , J.
1
Gervasoni
1
Dipartimento di Diagnostica e medicina di laboratorio,
Pol. A. Gemelli, Roma
2
Dipartimento di Scienze Mediche, Divisione di
Nefrologia Complesso Integrato Columbus, Pol. A.
Gemelli, Roma
Background: Nephrolithiasis is a common condition, with
the prevalence varying by age and sex. Associations
between nephrolithiasis and systemic diseases have
been recognized, including subclinical atherosclerosis,
hypertension, diabetes, metabolic syndrome and
cardiovascular disease. The study of the chemical
composition of urinary stones is important for
understanding their etiology. The clinical guidelines
recommend to analyze the calculi with infrared
spectrometry (IR) and X-ray diffraction that are considered
the gold standard techniques. FT-IR technology is
routinely used in our clinical laboratory since february
2013.
Aim of this study was to compare the results obtained
with KBr-FT-IR with those obtained using stereoscopic
microscopy for morphological analysis and to evaluate
the improvement of this approach in the urinary stones
management.
Method: We analyzed 18 calculi with Perkin Elmer
Spectrum One FT-IR Spectrometer for KBr-FT-IR analysis
and morphological analysis with Wild M3z Heerbrug
Stereo Microscope in accordance with the protocol
published by Daudon et al. All KBr-FT-IR spectra of kidney
stones were then computer matched against a library of
spectra (NICODOM IR Library) to generate a report of the
various components.
Results: The results obtained with both methods showed a
good concordance between KBr-FT-IR and morphological
analyses.
Discussion: The knowledge of the origin of the stone
and the factors involved in the lithogenic process is
helpful to prescribe a diet or therapy for reducing the
risk of recurrence. Moreover morphological analysis offers
additional information and permits a stone classification.
Both methods can be combined for a better understanding
of the mechanisms involved in lithogenesis and provide
more information to our clinicians.
454
P050
CARDIAC TROPONIN T (CTNT) AND CARDIAC
TROPONIN I (CTNI) LEVELS IN PATIENTS
AFFECTED BY MYOTONIC DISTROPHY TYPE 1
(DM1) AND TYPE 2 (DM2)
1
1
2
B. Rampoldi , R. Panella , R. Valaperta , F.
2
3
4
1
Lombardi , R. Cardani , B. Fossati , R. Rigolini , P.
1
4
4
1
Gaia , S. Gallo Cassarino , G. Meola , E. Costa
1
Service of Laboratory Medicine, IRCCS Policlinico San
Donato, San Donato Milanese (MI)
2
Research Laboratories-Molecular Biology, IRCCS
Policlinico San Donato, San Donato Milanese (MI)
3
Lab. of Muscle Histopathology and Molecular Biology,
IRCCS Policlinico San Donato, San Donato Milanese
(MI)
4
Dept. of Neurology, IRCCS Policlinico San Donato,
Univ. of Milan, San Donato Milanese (MI)
Introduction: Myotonic dystrophy (DM) is the most
common adult muscular dystrophy, characterized by
autosomal dominant progressive myopathy, myotonia
and multiorgan involvement. Two distinct forms caused
by similar mutations have been identified: DM1 and
DM2. Conduction disturbances and tachyarythmias occur
commonly in these patients. Cardiac Troponins I (cTnI)
and T (cTnT) represent the biomarkers for the diagnosis of
myocardic injury. While cTnT and cTnI are both absent in
healthy adult skeletal muscle, cTnT but not cTnI is present
in fetal skeletal muscle.
Objectives: To evaluate cTnT and cTnI serum levels in
patients affected by DM.
Methods: A cohort of 58 patients (35 M and 23 F;
age 45.9±14.8) attending the Neuromuscolar Unit were
subjected to the molecular analysis for DM detection
(48 DM1, 10 DM2) in a previous time. Most of them
underwent cardiac investigations. cTnT and cTnI were
measured by high-sensitivity assays (Roche Diagnostics
and Abbott Diagnostics, respectively). N-terminal pro Btype natriuretic peptide (NT-proBNP) (Roche Diagnostics)
were performed in only 26 patients.
Results: DM patients were characterized by persistent
elevation of circulating cTnT (44.74±70.06 pg/mL) not
accompanied by cTnI (7.87±17.7 pg/mL) increase and
in the absence of clinical evidence of myocardial injury.
Hs-cTnT was elevated (>14 pg/mL) in 91.4% (53/58)
of the patients, while hs-cTnI was elevated (>26.2 pg/
mL) in only 3.4% (3/58) of the patients. 11.5% (3/26) of
the patients had NT-proBNP abnormal levels (>300 pg/
mL). One quarter of our patients had abnormal ECGs
(PR intervals >200 msec; QRS >120 msec) however not
related to an increase of cTnT.
Conclusions: The obtained data show that DM patients
have elevated cTnT serum levels in the absence of
increases in cTnI. No evidence was found between the
increased levels of cTnT and clinical cardiology. This
increase could be attributed to the re-expression of cTnT
in skeletal muscle of patients with DM as previously
observed in patients with other neuromuscular diseases.
Other studies will be needed to clarify whether the causes
of elevated serum cTnT may be correlated to cardiac
fibrosis.
P051
PERFORMANCE NEL RICONOSCIMENTO DI
CELLULE ATIPICHE NELL'ESAME URINE MEDIANTE
SISTEMA DI LETTURA A CATTURA DI IMMAGINE:
IMPATTO CLINICO DEL REFERTO COMMENTATO
P052
UN CASO DI INTERFERENZA NELLA
DETERMINAZIONE DI FARMACI
IMMUNOSOPPRESSORI ELIMINATA DAL
PRETRATTAMENTO
R. Anderlini , F. Torricelli , F. Zambelli , L.
1
1
1
1
Giampaolo , D. Guerri , G. Patelli , M. Varani , T.
1
3
2
2
Trenti , P. Morandi , C. Lucchi , G. Manieri
C. Lo Cascio, L. Perobelli
1
Scopo del lavoro: Il lavoro riporta il caso di una
interferenza multipla nella determinazione di farmaci
immunosoppressori con un metodo immunometrico che
non richiede pretrattamento manuale del campione
Materiali e metodi: Soggetto: adulto trapiantato di fegato
in terapia con tacrolimus.
Reattivi TACR, SIRO, CSA (Siemens) applicati su
Dimension ExL (Siemens), determinazione con metodica
ACMIA in cui il campione di sangue intero viene caricato
come tale sullo strumento. Come controllo di qualità
interno viene utilizzato MORE
Risultati: Le determinazioni di tacrolimus sui campioni
di sangue intero del soggetto in studio davano risultati
persistentemente elevati (28 ug/L) senza modificazioni
della terapia in atto, mentre successivamente alla
sospensione della somministrazione di tacrolimus, la
sua concentrazione con metodo ACMIA risulta di 18
ug/L. Verifiche con metodo LC-MS/MS hanno riportato
concentrazioni indosabili.
La stessa sovrastima si osservava nella determinazione
di ciclosporina (61 ug/L) e di sirolimus (8,8 ug/L), entrambi
non somministrati e risultati indosabili con LC-MS/MS.
Alla ripresa della terapia con everolimus prima e
tacrolimus poi, sono state effettuate determinazioni
di everolimus con un metodo immunometrico con
pretrattamento (CDx-90) e di tacrolimus con un metodo
immunometrico con pretrattamento (ECLIA Roche), che
risultavano allineate con LC/MS-MS.
Discussione e conclusioni: nel caso in esame si è
verificato come il pretrattamento del campione per la
lisi e la estrazione del farmaco porti a risolvere alcune
interferenze che si riscontravano in tutte le determinazioni
effettuate con un metodo diretto, potendo quindi il metodo
con estrazione essere utilizzato alla pari della LC-MS/MS.
1
1
1
Dip.Interaziendale ad attività integrata di Medicina di
CoreLab AUSL Modena
2
U.O Patologia clinica e Citopatologia Osp.Mirandola
AUSL Modena
3
Dip.Interaziendale integrato di Lab.e Anat. Pat. AOU
Policlinico di Modena
Premessa: Nel nostro Laboratorio l’esame urine si effettua
su Menarini AUTION MAX 4030 (analisi chimica) e la
valutazione morfologica con IRIS iQ200 Beckman. Il
volume annuale di test analitici urinari è di circa 450.000.
La microscopia automatizzata a cattura d’immagine
consente di recuperare nella categoria Non Squamous
Epithelial (NSE) elementi dell’urotelio, a fronte di
una personalizzazione delle regole di validazione. In
quest’ambito l’operatore esperto può riconoscere atipie
a carico delle cellule uroteliali, pertanto si è ritenuto
opportuno inserire un commento al referto come di seguito
riportato: “ATIP: presenza di cellule transizionali con note
di atipia. Si consiglia approfondimento diagnostico con
citologia urinaria”.
Scopo del lavoro: Verificare l’appropriatezza e l’efficacia
clinica della nota “ATIP” attraverso una revisione critica
retrospettiva della casistica.
Materiali e metodi: Studio condotto su 70 pazienti (età
50-85 aa, 63 m-7 f) attraverso una selezione retrospettiva
di campioni con nota “ATIP”. In collaborazione con le
U.O. di Anatomia Patologica e Citopatologia è stato
verificato l’avvenuto approfondimento citopatologico e la
concordanza con il sospetto diagnostico iniziale.
Risultati: 17 utenti non hanno eseguito l’approfondimento;
10 hanno eseguito citologia urinaria con esito negativo;
33 utenti sono risultati positivi alla citologia urinaria e/
o esame istologico da biopsia; 10 sono risultati con
anamnesi positiva per K vescicale (al momento della
segnalazione).
Discussione: La percentuale di veri positivi (81%), pur
nella limitata casistica, rafforza l’efficacia clinica delle
indicazioni contenute nel commento “ATIP”; i falsi positivi
(19%), derivando da indagine citologica di minore (non
ottimale) sensibilità per forme a basso grado di malignità,
non escludono in via definitiva la possibilità di una
patologia misconosciuta.
La valutazione dei risultati ottenuti in un Laboratorio ad
elevato numero di esami ci induce a implementare le
performance di riconoscimento di elementi atipici.
Il grado elevato di concordanza con i risultati degli
approfondimenti indotti conferma da un lato l’impatto
clinico del commento in ragione dell’adesione del curante
alle indicazioni suggerite e dall’altro l’outcome positivo di
anticipazione diagnostica.
Laboratorio di Analisi dO, Azienda Ospedaliera
Universitaria Integrata, Verona
455
P053
CONFRONTO TRA METODI TURBIDIMETRICO "Full
Range C-Reactive Protein" E NEFELOMETRICO
"CardioPhase hs-CRP" PER IL DOSAGGIO AD ALTA
SENSIBILITA' DELLA PROTEINA C REATTIVA
1
1
1
2
F. Cappellini , L. Bani , C. Sarto , P. Brambilla
1
Servizio Univ. di Medicina di Laboratorio, A.O. di Desio
e Vimercate, Desio (MB)
2
Dipartimento di Scienze della Salute, Università degli
Studi di Milano - Bicocca, Monza (MB)
Introduzione: La Proteina C Reattiva (PCR) è il marcatore
d’elezione per la valutazione di stati infiammatori, in
particolar modo acuti, e riveste un ruolo chiave nello
sviluppo di patologie cardiovascolari rappresentando un
importante fattore prognostico e di stratificazione del
rischio. In quest’ultimo caso il dosaggio della proteina con
metodi ad alta sensibilità analitica è di grande utilità poiché
consente di rilevare concentrazioni della proteina inferiori
a 0,3 mg/L.
Materiali e metodi: E’ stato effettuato il confronto
del metodo turbidimetrico “Full Range C-Reactive
Protein®” (Binding Site, strumentazione SPAPLUS)
con il metodo nefelometrico “CardioPhase® hsCRP” (Siemens, strumentazione BNII) in uso presso il
Laboratorio Analisi dell’Ospedale di Desio per il dosaggio
della PCR ad alta sensibilità. Seguendo il protocollo di
comparazione di metodi (versione preliminare) elaborato
dal Gruppo di Studio Sibioc “Statistica per il Laboratorio”
sono stati analizzati in 2 sedute analitiche 53 campioni
con concentrazioni di PCR tra 0 e 10 mg/L. Sono
state effettuate la regressione Passing-Bablock e l’analisi
Bland-Altman per verificare la confrontabilità dei due
metodi. Successivamente è stata eseguita la valutazione
del bias e dell’ imprecisione ottenute con “Full Range
C-Reactive Protein®” rispetto ai traguardi analitici
desiderabili per PCR (ETa=66%) mediante creazione di
una Medical Decision Chart.
Risultati: La regressione Passing-Bablock ha evidenziato
un’intercetta di 0,01 (95% CI -0,13-0,03), non
significativamente diversa da “0” ed un coefficiente
angolare di 1,06 (95% CI 1,01-1,11), statisticamente
diverso da 1. L’analisi Bland-Altman ha indicato un BIAS
% medio di 2,33 (95% CI -1,34-6,01) e il 95% delle
differenze % tra i 2 metodi (BIAS medio±1,96 DS) si è
attestato tra -23,80 (95% CI -30,12-(-)17,48) e 28,46 (95%
CI 22,14-34,78).
La valutazione Medical Decision Chart ha riportato un
valore “σ” relativo al metodo in prova superiore a 6.
Conclusioni: La regressione Passing-Bablock, l’analisi
Bland-Altman e la Medical Decision Chart hanno fornito
indicazioni omogenee riguardo all’ottima comparabilità
dei risultati forniti da “Full Range C-Reactive Protein®”
di Binding Site rispetto a “CardioPhase® hs-CRP” di
Siemens per il dosaggio ad alta sensibilità della PCR.
456
P054
OPTISCANNER™ 5000 SYSTEM: EVALUATION OF
THE ANALYTICAL PERFORMANCES
1
2
1
A. Barassi , M. Umbrello , C.A.L. Damele , F.
1
1
1
2
Ghilardi , R. Stefanelli , A. Flaminio , G. Iapichino , G.V.
1
Melzi d'Eril
1
Laboratorio di Analisi, Ospedale San Paolo,
Studi di Milano, Milano, Italy
2
UO Anestesia e Rianimazione, Polo Universitario
San Paolo e Dipartimento di Fisiopatologia MedicoChirurgica e dei Trapianti, Università degli Studi di
Milano, Milano, Italy
Background: Mid-infrared spectral technology has shown
a high degree of promise in detecting glucose in plasma.
OptiScan Biomedical has developed a glucose monitor
based on mid-infrared spectroscopy that withdraws blood
samples and measures plasma glucose. Objectives: The
objective of this study was to evaluate the accuracy
and performance of the OptiScanner™ 5000 system on
different pools of blood.
Methods: The OptiScanner™ 5000 system consists
of a cuvette and onboard spectrometer that uses 25
wavelengths to estimate glucose. Specifically, 11 of the
filters are between 7 and 8 µm, 6 of the filters are
between 8 and 9 µm and 8 of the filters are between
9 and 10 µm. The device is intended to connect to an
existing blood access port of the patient, requiring no
additional cannula insertion. A small sample of venous
blood is withdrawn, the plasma is separated using a
centrifuge within the system, and a glucose reading
is produced every 15 min. This study was performed
to validate the blood glucose measurements obtained
with the OptiScanner™ 5000 by comparing them to
Central Laboratory glucose measurements (VITROS®
5600 Integrated System) across a broad range of
glucose values over a three day period to obtain 80-90
paired measurements. The comparison between Central
Laboratory glucose determinations was performed with
simple linear regression and Bland Altman analysis. A
Clarke Error Grid (CEG) was built to quantify the clinical
accuracy of blood glucose determinations generated
by the OptiscannerTM 5000 as compared to Central
Laboratory measurements.
Results: A total of 81 paired measurements, distributed
between 33 and 320 mg/100 mL of glucose, were
performed. The aggregate data points were within
International Organization for Standardization standards,
with 100% of the glucose values within ±20%.
Conclusions: The current study suggests that a midIR fixed-wavelength (OptiScanner) can measure glucose
accurately across a wide range of glucose values,
particularly, in plasma of Intensive Care Unit patients.
P055
PROTEINURIA DI BENCE-JONES: SCREENING CON
ANTISIERO BIVALENTE KAPPA E LAMBDA FREE
BIOCI E ANTISIERO PENTAVALENTE SEBIA
1
2
2
1
E. De Santis , G. Illuminati , M. Attanasio , F. Gulli , E.
3
3
1
2
Longhi , A. Vernocchi , U. Basile , L. Conti , G.
2
Cigliana
1
Dip. Medicina di Laboratorio Policlinico Universitario “A.
Gemelli”, Roma
2
U.O. Patologia Clinica, Istituto Nazionale Tumori
“Regina Elena” IRCCS, Roma
3
Servizio di Medicina di Laboratorio IRCCS,
Multimedica, Milano
Per la ricerca delle componenti monoclonali nelle
urine (Proteinuria di Bence Jones) risulterebbe molto
utile utilizzare un metodo di screening che consenta
di individuare accuratamente i campioni negativi e
di processare solamente quelli dubbi o positivi con
la metodica di riferimento IFE. Lo scopo di questo
studio è stato quello di confrontare due protocolli di
screening per la ricerca della proteinuria di Bence-Jones
con l’immunoelettroforesi urinaria: uno con antisiero
pentavalente IgG, IgA, IgM, k e λ totali della Sebia (IFEPenta) e l’altro con l’antisiero bivalente k e λ free della
Bioci. Entrambe le metodiche sono state applicate sullo
strumento Hydrasys della Sebia (Hydragel 2/4 BJ-UP MS/
MD). Per il confronto delle metodiche, 240 campioni di
urine delle 24 ore sono stati testati con entrambi i protocolli
di screening. Per la valutazione della sensibilità degli
antisieri e della necessità di concentrare o meno le urine
delle 24 ore, sono stati utilizzati degli standard da 5-10-20
mg/L di catene leggere libere sia k che λ. In base alla
sensibilità osservata il protocollo di screening IFE Penta
della Sebia è stato effettuato su urine concentrate tra 10 e
25x con concentratori Viva-Spin 6 (Sartorius), il fissativo
e l’antisiero pentavalente con un totale di 12 campioni
per ogni seduta mentre il protocollo di screening Bioci
è stato effettuato su urine non concentrate, utilizzando
solo l’antisiero bivalente per un totale di 24 campioni a
seduta. I risultati ottenuti hanno evidenziato che circa il
47% dei campioni negativi con entrambi gli screening
sono stati confermati tali con la metodica di riferimento IFE
(ELP, GAM, k-tot, λ-tot, k-free, λ-free) mentre per circa il
restante 53% dei campioni dubbi/positivi è stata osservata
con il protocollo Bioci una riduzione del 5% dei campioni
da mandare in conferma con il metodo di riferimento.
In conclusione il protocollo di screening con l’antisiero
Bioci, essendo a maggiore avidità e diretto verso le catene
leggere libere, risulta utile ad una maggiore ottimizzazione
dei tempi e dei costi evitando la concentrazione delle
urine, permettendo l’analisi di 24 campioni su un unico
gel e riducendo il numero dei campioni da mandare in
conferma con il metodo di riferimento.
P056
SVILUPPO E VALIDAZIONE DI UN METODO PER LA
QUANTIZZAZIONE DELLE ACILGLICINE SU SPOT DI
SANGUE PERIFERICO
1
2
1
M.G. di Girolamo , E. Scolamiero , M. Ruoppolo
1
Dip. di Medicina Molecolare e Biotecnologie Mediche,
Università degli Studi di Napoli "Federico II”, Napoli
2
CEINGE Biotecnologie Avanzate scarl, Napoli
La diagnosi precoce di acidemie organiche e deficit
di β-ossidazione degli acidi grassi, è resa possibile
tramite il profilo di acilcarnitine su spot di sangue
periferico essiccato (Dried Blood Spot, DBS) e su
1
siero . Tuttavia tali analiti possono essere alterati in più
difetti metabolici o come conseguenza di una terapia
farmacologica e/o nutrizionale. Pertanto, sono necessari
test di approndimento, quali il dosaggio degli acidi organici
ed aciglicine nelle urine, per una diagnosi differenziale
corretta. Recentemente presso il nostro laboratorio è
stato messo a punto un metodo per la determinazione
delle aciglicine nelle urine usando la cromatografia liquida
2
accoppiata alla spettrometria di massa (LC-MS/MS) .
Obiettivo di questo lavoro è stato quello di applicare
questo metodo per DBS al fine di sviluppare un test di
secondo livello utile sia per il programma di screening
neonatale sia per la corretta interpretazione del profilo di
acilcarnitine richiesto per un sospetto clinico. Due DBS di
3,2 millimetri sono stati estratti con 200 µL di metanolo
per 15 minuti dopo l'aggiunta di standard interni deuterati.
L'estratto è stato essiccato sotto flusso di azoto a 45
°C per 8 minuti e, infine,ricostituito con 100 µL di acqua
distillata. La curva di calibrazione è stata usata per la
quantificazione di ciascun acilglicina.I valori di riferimento
sono stati determinati su DBS raccolti tra le 48 e 72 ore
di vita di 120 neonati potenzialmente sani. Il metodo è
stato validato processando una serie di campioni che in
precedenza avevano mostrato un profilo di acilcarnitine
negativo o alterato.
Il metodo per DBS ha mostrato un elevata sensibilità
e specificità. DBS è la matrice di elezione per il
dosaggio di un numero crescente di metaboliti e presenta
diversi vantaggi quali semplicità di raccolta, spedizione
e il piccolo volume di sangue che richiede. L'aspetto
innovativo dello studio presentato è che l'individuazione
di questi marcatori può essere eseguita sul cartoncino
di screening raccolto nei primi giorni di vita dei neonati
fornendo quindi un grande contributo alla diagnosi
presintomatica di malattie potenzialmente mortali.
1. Catanzano F, et al. J Inherit metab Dis 2010;
DOI10.1007/s10545-009-3.
2. Ombrone D, et al. Anal Biochem 2011;417:122-8.
457
P057
STATISTICAL APPROACHES FOR MALDI-TOF/
MS DATA ANALYSIS AND PROSTATE CANCER
BIOMARKERS IDENTIFICATION IN URINE
1
1
1
A. Padoan , M. La Malfa , D. Basso , T. Prayer2
3
3
4
Galetti , A. Di Chiara , G. Pavanello , R. Bellocco , F.
2
1
Zattoni , M. Plebani
1
Department of Medicine (DIMED), University of
Padova, Padova, Italy
2
Department of Surgical, Oncological and
Gastroenterological Sciences (DISCOG), University of
Padova, Padova, Italy
3
SIPRES, Gruppo Pavanello, Padova, Italy
4
Department of Statistics and Quantitative Methods,
University of Milano-Bicocca, Milan, Italy
Background: MALDI-TOF/MS can be a valuable
technology for urine biomarkers identification. We studied
the urinary MALDI-TOF/MS peptidome reproducibility,
and we proposed strategies for dealing with measurement
errors (ME) and signal limit of detection (sLOD). We also
evaluated urine collected after digital rectal examination
of patients that underwent to prostate biopsy, to identify
prostate cancer (PCa) biomarkers.
Methods: Intra- and inter-assay MALDI-TOF/MS features
reproducibility was evaluated by pooled urine, spiked
with an internal standard peptide (IS). Features variability
was estimated by coefficient of variations (CVs). After
estimating features sLOD, we adjusted data to reduce
variability, also by 6 normalization methods (mean,
median, IS, relative intensity, total ion current and linear
rescaling). Alternatively, a feedback signal detection
approach was used. ME was estimated from an external
dataset. Urine from 106 References and 72 PCa patients
were analysed to identify features associated with
PCa. Intra-class correlation coefficient (ICC), Regression
Calibration (RCAL) and SIMEX were used to estimate
unbiased regression coefficients. Monte Carlo was used
to verify biases in ICC estimations.
Results: Intra- and inter-assay pooled features CVs were
elevated (above 100%), also after data normalizations.
IS normalization CVs were the worst (132% and 212%,
respectively). After sLOD adjustment, CVs were reduced,
especially by median normalization (CVs: 50%, 63% for
intra- and inter-assay). By optimizing the peaks signal,
the overall variability further decreased and median
normalization, after sLOD adjustment, remained the
advisable (CVs: 20%, 23% for intra- and inter-assay).
Evaluating the ME, we found that urine has a high intrasubject variability. By using substitution of below sLOD
values by sLOD/2, simulations showed that ICCs were
poorly affected by sLOD. Comparing results from naïve
logistic regression, RCAL and SIMEX, the latter seemed
to correct for a smaller amount of bias than RCAL. Overall,
we found eight MALDI-TOF/MS features associated with
positive biopsy results.
Conclusions: sLOD adjustment and median normalization
of MALDI-TOF/MS features aids in increasing data
reproducibility. RCAL appeared a valuable approach to
adjust ME.
458
P058
A SIMPLE AND RAPID HPLC METHOD FOR
SIMULTANEOUS DETERMINATION OF PLASMA 7DEHYDROCHOLESTEROL
A. Cocci, A. Schiattarella, S. Persichilli, A. Primiano, C.
Zuppi, J. Gervasoni
Background: Smitz–Lemli–Opitz syndrome (SLOS), is an
autosomal recessive disorder of cholesterol biosynthesis
characterized by multiple congenital malformations and
mental retardation. Patients show a characteristic
plasma neutral sterol pattern with low cholesterol levels
combined with elevation of its precursors 7- and 8dehydrocholesterol. The diagnosis is performed by
quantification of 7-dehydrocholesterol in plasma.
We describe a HPLC-PDA method for 7-DHC
determination in plasma samples.
Methods: Human blood samples were collected in EDTA
tubes. An aliquot of 200 µl of plasma was transferred in
to a glass tube and 200 µl of ethanol was added then
extracted with 1.5 ml of hexane containing 12.5 mg/l of
butylhydroxytoluene. The organic phase was collected,
and evaporated. The dry residue was solubilized with 200
µl of methanol and 25 µl were injected into the HPLC
apparatus.For chromatographic separation, a reversed
phase BetaBasic-18 column (150×2.1; 5 µm) delivered at
o
a flow rate of 300 µl/min at 30 C and conditioned with
60/40 methanol/ethanol was used. PDA wavelengths was
282 nm for 7-DHC. Total chromatographic run was 8
minutes.
Calibration curves were prepared by adding different
concentrations of 7-DHC standard to a negative plasma,
covering the range 0.125 to 50 µg/mL. A positive plasma
pool was prepared by enriching the negative plasma pool
with 7-DHC to obtain a final concentration of 50 µg/
mL. The method was fully validated according to EMA
international Guidelines.
Results: The method was linear from 0.125 mg/L to 20 mg/
L. Total imprecision was lower than 10%. Recovery was
higher than 90% for the three level tested.
Discussion: Our HPLC method represents a reliable
alternative to the commonly used GC–MS technique
allowing the determination of 7-DHC in a short time. The
recovery, precision and the linearity were satisfactory for
the clinical pourpose.
P059
TRANSFERRINA CARBOIDRATO CARENTE NEL
MISUSO ALCOLICO: CONFRONTO TRA METODICHE
ALTERNATIVE DI DOSAGGIO E RIVALUTAZIONE
DEGLI INTERVALLI DI RIFERIMENTO
1
2
5
G. Ferraguti , C. Codazzo , M. Santonicola , F.
1
2
2
3
Ceci , M. Ceccanti , G. Battagliese , P. Spanedda , R.
6
4
1
Pascone , A. Angeloni , M. Lucarelli
1
"Sapienza" Univ. di Roma, Dip. Biotecnologie Cellulari
ed Ematologia
2
"Sapienza" Univ. di Roma, Policlinico Umberto I, Centro
di Riferimento Alcologico Regione Lazio
3
"Sapienza" Univ. di Roma, Dip. Medicina Sperimentale
4
"Sapienza" Univ. di Roma, Dip. Medicina Molecolare
5
"Sapienza" Univ. di Roma, Policlinico Umberto I, UOC
Immunoematologia e Medicina Trasfusionale
6
"Sapienza" Univ. di Roma, Dip. Pediatria e
Neuropsichiatria infantile
La diagnosi oggettiva di abuso alcolico è di grande
importanza in medicina clinica e legale. Sono di uso
comune, attualmente, diversi metodi analitici per la misura
della transferrina carboidrato carente (CDT). Oggetto
del nostro studio è quello di rivalutare gli intervalli di
riferimento per il dosaggio della CDT con metodica NLatex (N-Latex – SIEMENS, su analizzatore BN Pro
Spec®) ed in elettroforesi capillare (EC) (Capillarys,
Sebia) in una popolazione di 130 donatori, afferenti al
Centro Trasfusionale del Policlinico Umberto I, astemi o
moderati bevitori (1 Unità Alcolica/die per la donna e 2
per l’uomo). Si vogliono inoltre confrontare i due differenti
metodi analitici su 100 campioni, selezionati in base al
loro valore di CDT in EC (negativo: ≤1,3%, n=41; incerto:
>1,3% e ≤1,6%, n=25; positivo: >1,6%, n=34) da soggetti
alcolisti afferenti al Centro di Riferimento Alcologico
della Regione Lazio (Roma, Policlinico Umberto I).
Si intende infine considerare l’influenza del dosaggio
della transferrina totale sul risultato della determinazione
percentuale della CDT nel test N-Latex, sostituendo la
misura della transferrina totale eseguita in nefelometria
con quelle eseguite con metodo immunoturbidimetrico
Siemens (TNRF, Flex® reagent cartridge, Dimension) e
Roche/Hitachi (TRSF2, Tina-quant Transferrin, Cobas C).
Gli intervalli di riferimento ottenuti come 95% unilaterale
sinistro della distribuzione vanno per il metodo N-Latex
dall’1,08% all’1,68%; per il metodo in EC dallo 0,3%
all’1,0%. Utilizzando l’intervallo di riferimento Siemens
(1,19%-2,47%), l’85,3% dei pazienti selezionati con CDT
in EC >1,6% ha un valore N-Latex > 2,47% ed il 34,3% dei
soggetti negativi ha valori di CDT in EC >1,3% e ≤1,6%.
Utilizzando i nostri intervalli di riferimento, tutti i pazienti
selezionati con CDT in EC >1,6% hanno un valore NLatex >1,69% ed il 34,3% dei pazienti positivi ha valori
di CDT in EC >1,3% e ≤1,6%. Per il metodo N-Latex
suggeriamo di riconsiderare l’intervallo di riferimento e
di introdurre una fascia di risultati non conclusivi. Dai
nostri dati i livelli di concordanza tra metodo SEBIA ed NLatex non cambiano utilizzando dosaggi alternativi della
transferrina totale.
P060
CREATININE COMPARATIVE EVALUATION OF TWO
POINT-OF-CARE ANALYZERS
A. Schiattarella, A. Primiano, L. Colacicco, C. Zuppi, D.
Scribano
Policlinico A. Gemelli, Roma
Background: Measurement of creatinine levels is a
key indicator of kidney function. We compared two
whole blood creatinine methods (point-of-care blood
gas analyzers-POCT BGAs) with one plasma reference
method (Roche). The BGAs were the pHOx Ultra (NOVA
Biomedical) and ABL 837 FLEX (Radiometer Medical).
The central laboratory analyzer was Roche Cobas 8000.
Methods: 100 whole blood samples collected with dry
heparin precoated syringes from critically ill patients, were
measured alternately on the two POCT BGAs. After
their centrifugation, creatinine was measured in plasma
samples on Cobas 8000. In order to assess the method
differences in creatinine values, we compared the POCT
BGAs results with those obtained on Cobas 8000, within
the following relevant clinical ranges: ≤0.7 mg/dL, ≤0.7-1.3
mg/dL, ≥1.3 mg/dL. The statistical analysis of results was
performed using linear regression analysis and BlandAltman plots.
Results: Both POCT BGAs showed a CV<5%. By the
2
comparison with Cobas 8000 we observed R = 0.974 for
2
ABL creatinine results and R = 0.911 for those of pHOx
Ultra. However, the pHOx Ultra whole blood creatinine
values were lower than those of the Roche analyzer, with
a mean difference approximately of -0.12 mg/dL, more
evident for creatinine levels ≤0.7 mg/dL and ≥1.3 mg/dL.
Conclusions: The Radiometer device, respect to NOVA,
demonstrated the best overall correlation to plasma
creatinine level and best clinical concordance for
creatinine values. Instead 19 of 26 samples that would
have been classified as over range by central laboratory
(plasma) analysis, would have been classified as
intermediate range by NOVA device (whole blood). This
could be particularly problematic if the first measurement
was performed on a point-of-care platform and a followup measurement successively performed in the central
laboratory. In conclusion with the prevalence of Chronic
Kidney Disease (CKD) increasing across the world, a
good screening need for identifying CKD risk is more
and more becoming important and it is mandatory for
POCT devices good analytical performance specifications
to correctly categorise CKD risk.
459
P061
DEVELOPMENT OF A TURBOFLOW-LC-MS/
MS METHOD FOR THE SIMULTANEOUS
QUANTIFICATION OF A STEROID HORMONES
PANEL IN HUMAN SERUM
A. Schiattarella, S. Persichilli, A. Cocci, A. Primiano, C.
Zuppi, J. Gervasoni
Policlinico A. Gemelli, Roma
Background: The simultaneous quantification of a
steroid hormones panel provides more valuable
clinical information than single steroid assay,
to clarify physiological and pathological hormone
status. Traditionally, steroids have been quantified
with immunoassays, however these methods are
characterized by high rate of positive results. The aim
of this work, was to develop a TurboFlow-LC-MS/MS
method for the simultaneous quantification of four steroids
(17-hydroxyprogesterone, androstenedione, cortisol and
testosterone) in human serum.
Methods: To 100 µL of serum sample, 100 µL of
internal standards were added in order to displace the
binding protein. After centrifugation of 5 minutes at
14000 rpm the supernatant was directly injected in the
TurboFlow™ system (Thermo Scientific), equipped with
Cyclone TurboFlow column, for further purification. The
chromatographic separation was obtained with a Kynetex
C-18 column equilibrated with water and methanol
containing 0.05% formic acid. Hormone steroids were
determined by LC-MS/MS using a TSQ Vantage triple
quadrupole tandem mass spectrometry operating with an
atmospheric pressure chemical ionization (APCI) source
in the positive mode.
Calibration curves were prepared in water:methanol
50:50.
Linearity, imprecision, limit of detection (LOD) and limit
of quantification (LOQ) were evaluated. Moreover, the
comparison among our method and immunoassays
(RIA and ECLIA), currently used in our laboratory, are
in progress. In addition, for monitoring the analytical
procedure we have analyzed the quality controls
purchased from PerkinElmer (CHSTM MSMS steroids kit)
and from BIOCRATES (AbsoluteIDQ stero17 Kit).
Results: Linearity, imprecision, limit of detection (LOD)
and limit of quantification (LOQ) are adequate for the
proposed method.
For all the quality controls analyzed we have obtained
values within the range provided by the manufacturers.
Conclusions: TurboFlow analysis provides a simple and
effective clean-up procedure minimizing the interference
of the matrix. The presented method, selective, precise,
and sensitive, is suitable in a clinical laboratory for
quantification of steroids in whole range of physiopathological values and may offer a new approach for
solving the shortcomings of immunoassays.
460
P062
CISTINURIA AL FOSFOTUNGSTATO: NUOVO
DOSAGGIO FOTOMETRICO A TRE REAGENTI
1
1
1
G. Cangiano , C. Paradisone , E. Di Maina , G.
1
1
1
1
Buccino , A. Errico , P. Improta , A. Silvestro , M.M.
1
1
2
1
D'Ambrosio , M. Iappelli , M. D'Amora , A. Sarappa
1
Lab. Patologia Clinica, Osp. dei Pellegrini, ASL Napoli 1
Centro
2
Direzione Generale, ASL Napoli 3 Sud
La determinazione fotometrica della cistina praticata
nel nostro Laboratorio viene richiesta dalle Nefrologie
Aziendali, dall’Utenza esterna e dalle Aziende Pediatriche
viciniore. Col nostro lavoro si propone un dosaggio a
tre reagenti adattabile su Viva E della ditta Siemens
ed utilizzante reattivi praticamente stabili nel tempo.
L’analizzatore miscela 30 µL di urina con 220 µL di
primo reattivo (5 parti tampone acetato 2M e 3,5
parti di acqua). Dopo un’attesa di circa 3 minuti lo
stesso preleva 30 µL di secondo reattivo (solfito di
sodio 0,1 M) e successivamente, dopo quasi 2 minuti,
aggiunge 120 µL di terzo reattivo (acido fosfotungstico
al 30%). La lettura a 660 nm (formazione di blu di
tungsteno) di una reazione a termine si effettua dopo
ulteriori 7 minuti. La calibrazione (spine cubico modificata)
necessita di sette punti, da 0 a 60 mg/dL di cistina. La
metodica “bianco” si effettua semplicemente utilizzando
l’opzione strumentale “riesegui” sugli stessi campione
precedentemente testati e cambiando il primo reattivo con
un reagente preparato al momento (3 mL di primo reattivo
e 50 µL di cloruro mercurico 0,1 M). La concentrazione
di cistina si ottiene per differenza tra i valori ottenuti
prima e dopo la riesecuzione dei campioni urinari. La
LOD e la LOQ hanno valori rispettivamente di 1,60
e 2,96 mg/dL. Il profilo di precisione mostra dei CV
compresi tra 0,79 e 6,74% nel range tra 0,77 e 55,07
mg/dL di cistinuria. Le prove di recupero evidenziano
valori compresi tra il 91,6 ed il 108,6% (recupero medio
del 101,6%). Le prove di precisione (n=21) nella e
tra le serie evidenziano valori di CV inferiori al 5% .
Buona è la correlazione con il metodo fotometrico a
due reagenti (y = 0,9753.x + 0,3105; r = 0,9949)
precedentemente comparato con quello cromatografico.
La delicata preparativa e la celerità di esecuzione
caratterizzanti la vecchia determinazione fotometrica
della cistinuria vengono ben risolte proponendo il
dosaggio a 3 reagenti sull’analizzatore Viva E. Il test
è facilmente eseguibile, estremamente rapido (dopo 20
minuti il primo risultato) ed ampiamente affidabile proprio
per l’utilizzo di reagenti stabili da noi costruiti.
P063
DIAGNOSTIC AND PROGNOSTIC ROLE
OF PRESEPSIN AND GALECTIN-3 IN THE
MANAGEMENT OF SEPSIS IN THE EMERGENCY
DEPARTMENT
1
1
2
2
M. Lucchiari , S. Raso , C. Galluzzo , E. Pizzolato , M.
1
2
2
1
Rende , M. Ulla , S. Battista , G. Mengozzi
1
Clinical Biochemistry, Città della Salute e della Scienza
Hospital of Turin
2
Emergency department, Città della Salute e della
Scienza Hospital of Turin
Introduction: Sepsis (S), Severe sepsis and Septic Shock
(SS) are among the most common conditions handled in
the Emergency Department (ED) and their early diagnosis
is one of the keys to improve survival. Procalcitonin (PCT)
is one of the diagnostic marker of sepsis but it has limited
specificity. Recent studies identified new biomarkers like
Presepsin, the soluble fraction of CD14-L and Galectin-3,
a lectin that takes part to the inflammatory response and
fibrosis process. The aim of this study is to investigate the
diagnostic and prognostic role of presepsin and galectin-3
in comparison with PCT in patients with SIRS (Systemic
Inflammatory Response Syndrome) presenting to the ED
of the “Molinette” Hospital of Turin.
Materials and method: 108 patients were enrolled from
June 2013 to December 2013: 37 with S, 39 with SS
and 32 with secondary SIRS. All the samples were
analyzed using the Pathfast® Presepsin assay for sCD14,
Elecsys® Brahms PCT (Roche Diagnostics) and Vidas®
Galectin-3 assay (bioMèrieux).
Results: Higher concentrations of presepsin at
presentation were observed in patient with S,SS
compared to controls (p=0.036); the same trend was
observed for mean values of PCT. Higher levels
of Galectin-3 were observed in patients affected by
SS compared to S group. In patients with severe
prognosis Galectin-3 values are higher (p=0,0238) than
S population. ROC curve result significant for all three
biomarkers.Best values of sensitivity and specificity were
observed for Presepsin values = 600 pg/mL (sens
=78,9% and spec=55,8%) and for Galectin-3 >20.7 ng/
mL (sens=73.7% and spec=55.6%). The best prognostic
predictive value was obtained with a combination of levels
of Galectin-3 >20.7 ng/mL and Presepsin >1000 pg/mL
(p=0.0185).
Conclusion: The results demonstrate that Presepsin is
a promising biomarker to discriminate septic patients in
a population affected by SIRS. Furthermore Galectine-3
may have a prognostic role to identify severe cases of
sepsis associated with Multiple Organ Failure.
1. Bone RC, Balk RA, Cerra FB, et al. Definitions for sepsis
and organ failure and guidelines for the use of innovative
therapies in sepsis. The ACCP/SCCM Consensus
Conference Committee. Chest 1992;101:1644-55.
P064
ALBUMINA URINARIA: VALUTAZIONE DI DUE
METODI ANALITICI
K. Pocino, R. Molinario, P.D. Daloiso, A. Giannace, C.
Zuppi, M. Antenucci
U.O.C. Analisi 1, Policlinico Universitario "A. Gemelli",
Roma
Introduzione: Il dosaggio quantitativo della albumina
urinaria è un fattore predittivo indipendente di
danno renale, nefropatia diabetica e insufficienza
cardiovascolare. Negli ultimi anni sono stati proposti
diversi metodi per l'analisi dell’albumina urinaria non
essendoci una procedura di riferimento. Scopo del
lavoro è valutare la performance analitica di un metodo
immunoturbidimetrico sulla piattaforma Cobas 8000
(Roche Diagnostics) e correlare i risultati con quelli
ottenuti con il metodo nefelometrico implementato sullo
strumento Siemens Dade Behring BN II Nephelometer.
Materiali e metodi: Sono stati raccolti 100 campioni di
urina random e conservati in provette di polipropilene
a -80 °C. Successivamente sono stati scongelati,
centrifugati a 650xg per 10 minuti e dosati utilizzando il
reattivo Tina-quant Albumin Gen.2 (Roche). La linearità,
le prove di recupero, l’imprecisione, l’accuratezza e la
correlazione sono stati valutati utilizzando i protocolli
CLSI.
Risultati: La linearità è eccellente (r=1.00). Il LOD (2 mg/L)
e il LOQ (3 mg/L) coincidono con quelli dichiarati dalla ditta
produttrice. La percentuale media di recupero è risultata
ottimale (98%). L’imprecisione intra-serie (protocollo 3x5,
CLSI EP15-A2), effettuata con i controlli a due livelli
(UrichemGol I e II, BioDev) ha mostrato un CV% di 0.87
e di 0.61 rispettivamente ad una concentrazione di 29.9
e 174.2 mg/L. Il CV% inter-serie è di 2.7 ad un livello di
concentrazione di 33 mg/L e di 2.6 ad una concentrazione
di 185 mg/L, raggiungendo i goals analitici ottimali basati
sulla variabiltà biologica.
2
Il coefficiente di regressione lineare di Pearson (R =0.99),
su un range di valori tra 2.0 e 207.5 mg/L, è soddisfacente.
Questi risultati sono stati confermati dall’analisi di
regressione lineare di Passing–Bablok: intercetta -1.873
(C.I. -2.76 -1.32) slope 1.091 (C.I. 1.06-1.12). Inoltre il plot
di Bland-Altman mostra un bias di 0.98 (C.I. 0.14-1.82).
Conclusioni: I nostri risultati dimostrano un totale
raggiungimento della qualità del metodo analitico
testato. Il metodo turbidimetrico risulta essere un’ottima
alternativa a quello nefelometrico e di facile
implementazione su una piattaforma analitica di un
laboratorio clinico centralizzato, facilitando così la
misurazione dell’ACR (rapporto albumina/creatinina) nei
campioni di urine.
461
P065
CONTRIBUTO ALLA VALUTAZIONE DI UN METODO
NON RADIOIMMUNOLOGICO PER IL DOSAGGIO
DELL'ALDOSTERONE PLASMATICO
G. Barbina, U. Qualizza, A. Colatutto, R. Ganzini, D.E.
Fontana , B. Marcon, M. Orzan, S. Mazzolini , P. Sala
Scopo del lavoro: L’aldosterone, ormone steroideo
secreto dalla corticale del surrene, è attivo principalmente
sul tubulo renale distale aumentandone la capacità
di riassorbimento di sodio e l’escrezione di potassio.
Il suo dosaggio risulta fondamentale nella valutazione
dell'omeostasi idro-salina e pressoria dell’intero
organismo. Scopo del presente lavoro è il confronto tra
una metodica interamente manuale radioimmunologica
(RIA) ed una metodica interamente automatizzata
immunochemiluminescente (CLIA).
Materiali e metodi: Sono stati raccolti e congelati a –
20C fino all’analisi 54 campioni di plasma di pazienti.
Tali campioni sono stati analizzati in duplicato sia con la
metodica radioimmunologica (ALDO-CTK DiaSorin s.p.a.
Saluggia VC Italy) che con quella chemiluminescente
(LIAISON Aldosterone DiaSorin s.p.a. Saluggia VC Italy).
Risultati: L’analisi dei dati mostra un intervallo di
concentrazione da 1.0 a 61 ng/mL per la metodica RIA
e da 3.0 a 39.5 per la metodica CLIA, le medie rispettive
2
erano 15.92 ng/mL e 12.0 ng/mL con correlazione R =
0.8138. Assumendo come cut-off di positività i rispettivi
range consigliati dalle ditte produttrici è stata rilevata una
concordanza nel 87% dei dati. La precisione analitica
totale ha evidenziato un CV di 6.2% per il metodo RIA e
4.4% per l’immunochemiluminescenza.
Discussione e conclusioni: La comparazione tra le due
metodiche, pur con caratteristiche analitiche diverse,
risulta accettabile sia in termini statistici che clinici,
infatti i bassi CV riscontrati indicano che i prodotti
offrono garanzia di efficacia analitica. La nostra
esperienza suggerisce una superiorità della metodica
chemiluminescente in quanto, grazie alla eliminazione
della fase manuale, aumenta la velocità di analisi in
completa automazione ed infine, utilizzando reagenti non
radioattivi, è accessibile anche a laboratori non attrezzati
in tal senso.
Williams GH. Aldosterone biosynthesis, regulation,
and classical mechanism of action. Heart Fail Rev
2005;10:7-13.
1
1
1
1
E. De Santis , F. Gulli , U. Basile , M.T. Dell' Abate , E.
1
1
2
2
2
Torti , C. Zuppi , G. Illuminati , L. Conti , G. Cigliana
1
Dipartimento di Diagnostica di Laboratorio, Azienda
Ospedaliero-Universitaria Santa Maria della
Misericordia, Udine.
462
P066
QUANTIFICATION OF SERUM-FREE LIGHT CHAIN
ANALYSIS: BINDING SITE VERSUS SIEMENS
Dep. of Laboratory Medicine and Diagnostics,
Policlinico Universitario A. Gemelli, Rome
2
Clinical Pathology, Regine Elena National Cancer
Institute, IFO, Rome
Immunoglobulin Free Light Chains (FLC) κ and λ are
normally produced by B-Cells and can be found in the
serum of healthy subjects. In patients with Monoclonal
Gammopathies, FLC are overproduced by the neoplastic
Plasma cell clone, and the International Myeloma Working
Group (IMWG) recommend FLC measurement with
Freelite™ (Human Kappa and Lambda Free Kits, The
Binding Site, polyclonal antibody based assay) for the
diagnosis, prognosis and monitoring of patients.
Recently, another test was introduced for FLC
measurement: N Latex (monoclonal antibody based
assay, Siemens)
Data available in the literature report major differences in
their analytical performance and their clinical accuracy,
and advise the use of the same method especially for
patient monitoring.
Our aim is to analyse the differences between the two
methods, by comparing serum samples from 301 Multiple
Myeloma patients. Samples were collected and stocked
at -80 °C until analysis. Each sample was tested with both
Freelite™ (The Binding Site) and N Latex FLC (Siemens
Healthcare Diagnostics Ltd) assays, according to the
manufacturers’ instructions. Each test was performed on
the producer’s platform (BNTMII - Siemens and SPAplus
- The Binding Site) in order to minimize discrepancies
and to evaluate specificity and sensitivity separately. FLC
κ/λ ratios were evaluated and compared as well. Inter
and Intra batch variation analysis was performed in order
to assess reproducibility. Controls were interchanged
between analyzing platforms to test for differences in
analyzing systems, the results were analyzed by BlandAltman curves, in order to evaluate comparability of the
two techniques.
As expected, MM samples results were discrepant
and significant differences were observed among
methods, confirming that the two tests are not clinically
equivalent and should not be used interchangeably.
When control samples were interchanged among the two
platforms, the results were significantly diffrent, confirming
discrepancies between both systems, and unreliable
interchangeability among controls.
Dispenzieri A, Kyle R, Merlini G, et al. International
Myeloma Working Group guidelines for serum-free light
chain analysis in multiple myeloma e related disorders.
Leukemia 2009;23:215-24.
P067
ARE COMMERCIAL EXTRACTION DEVICES
IN FAECAL CALPROTECTIN DETECTION
INTERCHANGEABLE?
R. Rizza, F. Corrente, C. Morlacchi, C. Zuppi, T. De
Michele
Laboratorio Analisi I, Policlinico Universitario A. Gemelli,
Roma
Background: The analysis of faecal calprotectin
(FC) presents several problems related to the preanalytical phase. Since the different operators, extraction
procedures, consistency of stools and their heterogeneity,
we compared two commercial devices: Smart Prep Device
(Roche) and EliA Calprotectin Extraction Device (Thermo
Fisher).
Methods: 100 routine samples for FC detection, were
assessed by both devices according to the manufacturer’s
instructions and detected by fluorescence enzyme
immunoassay (FEIA) on Phadia 250 (Thermo Fisher
Scientific). Using the recommended cut-off (50 mg/kg),
the comparison of both devices was performed for the
whole (0-3000 mg/kg), the negative (<50 mg/kg) and the
positive (>50 mg/kg) ranges. For method comparison,
Passing-Bablok regression analysis, Bland-Altman plots
and Spearman’s correlation were performed.
Results: Regression analysis for the whole range resulted
in a proportional difference between both devices: slope
1.51 (95% CI from 1.19 to 1.91); intercept -7.71 (95%
2
CI from -13.7 to 2.86); R 0.89. For the negative range,
there is no a linear relationship. However, a Spearman’s
2
correlation showed a R of 0.73. Regression results for the
positive range confirmed a small proportional difference
between the two devices: slope 1.50 (95% CI from 1.01 to
1.98); intercept of -35.46 (95% CI from -85.73 to 21.80),
2
with a R 0.88. Bland-Altman analysis for EliA vs Roche
devices in the whole range showed a mean difference of
37.36 mg/kg (95% CI from -260.1 to 334.8 mg/kg). The
mean difference in the negative range was 15.11 mg/kg
(95% CI from -49.99 to 79.72 mg/kg), whereas the mean
difference in the positive range was 75.06 mg/kg (95%
CI from -400.9 to 551 mg/kg). Extraction of FC samples
with EliA device in comparison with Roche device resulted
in a qualitative discordance of 15% (15/100). 2/100 (2%)
samples were positive with Roche and negative with EliA
devices, whereas 13/100 (13%) samples were negative
with Roche and positive with EliA devices.
Conclusions: Since we observed differences between the
two devices, in our laboratory we routinely use Roche
device that assures a better standardization of extraction
procedure. However, we need to correlate our data to
clinical findings to evaluate each extraction method.
P068
VALUTAZIONE DELLE PRESTAZIONI ANALITICHE
DELL’ANALIZZATORE HELENA BIOSCIENCES'
V8® NELLA DETERMINAZIONE DI TRANSFERRINA
CARBOIDRATO-CARENTE
1
1
1
2
S. Baggio , M. Marinova , C. Artusi , G. Antonelli , L.
1
1
2
Brugnolo , M. Zaninotto , M. Plebani
1
UOC Medicina di Laboratorio, Azienda OspedalieraUniversità degli Studi, Padova
2
Dipartimento di Medicina, Università degli Studi di
Padova
Introduzione: La determinazione di transferrina
carboidrato-carente (CDT) svolge un ruolo fondamentale
nella valutazione della glicosilazione della Transferrina
(Tf). Le glicoforme CDT correlate (disialo- e asialo-Tf)
aumentano in percentuale nel siero umano in seguito
ad un inefficiente processo di glicosilazione causato da
un consumo eccessivo e continuativo di alcool etilico.
Attualmente, la CDT è il parametro cardine nella gestione
dei disordini legati all’abuso alcolico cronico, sia per
finalità cliniche, sia medico-legali. Recentemente è stato
introdotto in commercio, Helena Biosciences' V8 E-class,
un sistema automatico di elettroforesi multi-capillare per
la separazione e la quantificazione della CDT.
Obiettivi: Valutare le prestazioni analitiche dello strumento
Helena Biosciences' V8 E-class nella determinazione
della CDT e confrontare i risultati con quelli ottenuti dal
metodo attualmente in uso nella routine .
Materiali e metodi: Per la valutazione dell’imprecisione
sono stati utilizzati quattro materiali di CQI disponibili in
commercio e due pool di sieri a differenti concentrazioni
di CDT (1.2% - 3.7%). Il confronto fra i metodi è stato
eseguito analizzando contemporaneamente con Helena
Biosciences' V8 E-class e con HPLC Bio-Rad Ready-Prep
CDT, campioni di siero da 133 soggetti scelti casualmente
di età compresa tra 18-68 anni I risultati sono stati
elaborati statisticamente con Analyse-it Software (Ltd,
Leeds, UK).
Risultati: I risultati ottenuti dalle prove di imprecisione
tra le serie secondo il protocollo CLSI EP5-A2 ridotto
(n=10), mostrano un CV max < 11.2%. I due metodi, messi
a confronto attraverso la regressione lineare e l’analisi
di Bland-Altman, presentano un’ottima correlazione
(r=0.970), CDT [V8 capillary electrophoresis]= 0.84 x CDT
[HPLC] + 0.03 e un bias di -0.03 mmol/mol (-0.4 a-0.22,
95% CI), statisticamente significativo. L’accuratezza
valutata mediante la partecipazione alla VEQ è tra -5.8%
e +1.2% in confronto al gruppo omogeneo.
Conclusioni: Le prestazioni analitiche, sia in termini di
imprecisione che correlazione con il metodo di riferimento,
sono risultate molto soddisfacenti. La facilità d’uso, la
robustezza e la produttività oraria attestano la possibile
applicazione nella diagnostica clinica di laboratorio.
463
P069
QUANTIFICAZIONE DEGLI AMMINOACIDI
AROMATICI FENILALANINA, TRIPTOFANO E
TIROSINA IN PLASMA MEDIANTE ELETTROFORESI
CAPILLARE UV DETECTION
1
1
1
M. Forteschi , S. Assaretti , D. Cambedda , M.A.
1
1
1
3
1
Pinna , D. Caddeo , S. Ena , F. Sanciu , A. Zinellu , C.
1
Carru
1
Dipartimento di Scienze Biomediche, Università di
Sassari
2
Servizio Controllo di Qualità, Azienda Ospedaliero
Universitaria di Sassari
3
Laboratorio di Immunometria, Azienda Ospedaliero
La fenilalanina (PHE), il triptofano (TRP) e la tirosina
(TYR) sono amminoacidi aromatici (AAA) con importanti
funzioni fisiologiche. Alterazioni nelle concentrazioni
plasmatiche degli AAA possono essere riscontrate in
diverse patologie. Pazienti nefropatici, ad esempio,
possono mostrare livelli ridotti di TYR con valori normali
o leggermente aumentati di PHE, con conseguente
riduzione del rapporto TYR/PHE. In generale la
misurazione degli AAA è considerato uno strumento
valido per lo studio delle patologie legate al sistema renale
ed epatico.
Lo scopo del presente lavoro è stato quello di sviluppare
un metodo per la quantificazione simultanea PHE TYR e
TRP nel plasma mediante elettroforesi capillare (EC) UV
detection.
L’analisi veniva condotta in un capillare uncoated di silice
fusa (50 µm I.D. x 85 cm di lunghezza) in presenza di TRIS
fosfato 80 mmol/L a pH 1.4 come BGE, ad un voltaggio di
30 KV e ad una temperatura di 25°C
La fase preanalitica prevedeva la diluizione di 50 µl di
plasma con 50 µl di H2O, la successiva aggiunta di 20
µl metiltriptofano (200µmol/L) come standard interno, e
quindi la deproteinizzazione con 25µl di SSA (15% ).
Dopo la centrifugazione il surnatante veniva direttamente
caricato in EC. L’applicabilità del metodo è stata testata
misurando il livello degli AAA in 30 pazienti con CKD
sia a livello basale sia dopo trattamento con simvastatin/
ezetimibe.
Sono state rilevate differenze significative nei livelli di
TRP plasmatico, ed un trend positivo del rapporto TYR/
PHE durante il trattamento con ipolipidemizzante con
simvastatin/ezetimibe.
In conclusione il metodo sviluppato offre caratteristiche
di sensibilità e riproducibilità tali da renderlo indicato
all’applicazione su larga scala sia in ambito clinico che di
ricerca biomedica.
464
P070
QUANTIFICAZIONE DI KYNURENINA E TRIPTOFANO
IN PLASMA MEDIANTE ELETTROFORESI
CAPILLARE
1
1
1
1
D. Arru , B. Scanu , E. Pisanu , M. Sanna , F.
1
1
3
1
2
Chiscuzzu , G. Pira , L. Puddu , A. Zinellu , C. Carru
1
Dipartimento di Scienze Biomediche, Università di
Sassari
2
Servizio Controllo di Qualità, Azienda Ospedaliero
3
Laboratorio di Chimica Clinica, Azienda Ospedaliero
Scopo del lavoro: Il Triptofano (Trp) è un aminoacido
essenziale importante per la sintesi delle proteine e come
precursore di diverse sostanze biologicamente attive quali
la serotonina. La degradazione del Trp avviene nel fegato,
nei reni e nel cervello attraverso tre vie cataboliche: via
della chinurenina (Kyn), via della triptamina e via della
5-idrossitriptamina. Tra queste la via della Kyn è quella
maggiormente attiva. Una diminuzione dei livelli sierici
di Trp, con concomitante aumento dei livelli di Kyn è
correlato a diverse patologie associate all’attivazione della
risposta immunitaria cellulo-mediata. In questo lavoro
abbiamo sviluppato la prima metodica in elettroforesi
capillare (CE) per la misurazione simultanea di Kyn e Trp
in campioni di plasma.
Materiali e metodi: I campioni di sangue sono stati
prelevati in provette con EDTA e immediatamente
centrifugati. A 100 µL di plasma venivano aggiunti 50
µL di metiltriptofano (mTrp) come standard interno e
1 mL di acetonitrile per eliminare le proteine. Dopo
centrifugazione 1 mL di surnatante veniva essiccato ed il
residuo veniva risospeso in 100 µL di acqua ed iniettato
in CE.
Risultati: La separazione di Kyn, Trp e mTrp può essere
effettuata in tampone sodio fosfato a pH 10 in cui i
due analiti risultano carichi negativamente. Tuttavia nel
plasma esistono contaminanti che, in queste condizioni,
si sovrappongono alla Kyn. Per questo motivo si è deciso
di provare la separazione degli analiti a valori di pH acidi
nei quali gli analiti si mostrano carichi positivamente.
Al fine di ottimizzare la separazione elettroforetica sono
stati eseguiti degli esperimenti preliminari sul tipo, sulla
concentrazione e sul pH del tampone di corsa. In ultima
analisi le condizioni ideali per la separazione prevedono
l’utilizzo di un capillare “uncoated” di silce fusa (75 µm ID
e 30 cm di lunghezza) e l’impiego di un tampone bis-trispropano fosfato 100 mmol/L a pH 2,15, un voltaggio di 12
kV ed una temperatura di 20°C. In queste condizioni gli
analiti venivano separati alla base in meno di 9 minuti.
Conclusioni: I tempi ridotti, sia della fase preanalitica che
analitica, la buona sensibilità e i bassi costi rendono
questo metodo particolarmente adatto per l’applicazione
su larga scala sia in ambito clinico che di ricerca
biomedica.
P071
VALUTAZIONE DI SENSIBILITA' E SPECIFICITA'
DELLE METODICHE 'FILMARRAY' E RT-PCR
MEDIANTE IMPIEGO DI CEPPI DI RIFERIMENTO
NTCP E ATCC
Z. Napoli, M. Donati, A. Cafissi , C. Sebastiani, M.
Niccolai, R. Lari , L. Bianchi
Lab. Analisi Chimico-Cliniche e Microbiologiche, Osp. S.
Jacopo, Pistoia
Introduzione: Nel management della meningite batterica
la metodica Real-Time (RT) PCR aumenta l'efficacia
diagnostica rispetto ad esami batteriologici quali
batterioscopico Gram (BG), colturale (EC), emocoltura
(EM) ed estrazione degli antigeni solubiliEA).
Obiettivi: Scopo di questo studio è stato valutare: 1) la
sensibilità della tecnologia FilmArray (TFA) verso la RTPCR, il loro valori predittivi positivo (VPP) e negativo
(VPN) e l’efficacia nella gestione della meningite in
urgenza. Metodi: La sensibilità della TFA (Biofire, DID) e
della RT-PCR (EusepScreen, Eurospital) è stata valutata
con l'impiego di ceppi di riferimento quantitativi (NTCP)
e qualitativi (ATCC) ed espressa come copie/µl o ciclo
soglia (Ct). I liquor risultati positivi (LP) in RT-PCR
(22/210) sono stati ritestati con la TFA.
Risultati: Per L.monocytogenes (LM), E.coli (EC),
N.meningitidis (NM), S.pneumoniae (SP), H.influenzae
(HI) e S.agalactiae (SA) la sensibilità rilevata è stata di
0.5-5copie/µl (range Ct: 36-39) e 50-500copie/µl (range
Ct: 30-33) per RT-PCR e TFA rispettivamente. Tutti i
liquor negativi alla RT-PCR sono risultati negativi a BG,
EA, esame colturale(EC) ed emocoltura(EM). Per RTPCR il VPN rilevato è del 100% per i patogeni rilevati.
Gli LP presentavano glucorrachia <45 mg/dL e globuli
bianchi (WBC) >100/µl (neutrofili >60%). EA e BG sono
risultati positivi rispettivamente nel 33% (5/15) e 55%
(12/22) dei casi. Il 67% (6/9), 57% (4/7), 67% (2/3) e
33% (1/3) dei LP rispettivamente per SP, LM, EC e HI
sono stati riconfermati con la tecnologia FilmArray con
una sensibilità del 60% rispetto alla RT-PCR. I liquor
discordanti (40%) presentavano un Ct>31 ed EA, BG, EC
ed EM erano negativi nel 78% (7/9)dei casi.
Conclusioni: 1) la glucorrachia e la differenziazione fra
elementi mono o polinucleati hanno alto VPP di infezione
batterica; 2) La RT-PCR è la metodica più sensibile per
la gestione delle meningiti batteriche ma ha il limite del
ridotto numero di patogeni rilevati; 3) la metodica TFA
mostra una buona concordanza con la RT-PCR anche se
quest'ultima ha sensibilità e VPN più elevati; 4) la TFA ha
sensibilità più elevata rispetto a BG ed ES e la facilità di
allestimento del test (2 min tempo operatore) e il suo TAT
di 1 h la rendono una tecnica efficace nella gestione del
liquor in urgenza.
P072
ALBUMINA SIERICA E URINARIA: CONFRONTO TRA
DUE METODI
M. Lorubbio, S. Rapi , B. Salvadori , F. Morandini , V.
Sbolci , D. Borgi , G. Salerno, F. Daniele , F.
Angiolini , G. Marrani , A. Ognibene
Laboratorio Generale, Azienda Ospedaliero-Universitaria
Careggi, Firenze
Introduzione: Le attuali evidenze scientifiche disponibili
attribuiscono alla misura dell’albumina sierica e urinaria
un ruolo clinico importantissimo per la valutazione
prognostica di molteplici patologie. La presenza
dell’albumina nelle urine è utilizzata non solo per
monitorare la perdita della funzionalità renale, ma anche
come potenziale marker di rischio cardiovascolare e di
disfunzione endoteliale. Di seguito riportiamo il confronto
di 2 metodiche strumentali attraverso il dosaggio
dell’albumina sierica e urinaria.
Materiali e metodi: I dosaggi dell'albumina sierica in
112 pazienti (71F - 41 M) e dell'albumina urinaria in
224 pazienti (102 F-122 M) sono stati eseguiti con
metodi nefelometrici su Immage 800 (Beckman Coulter)
e su Dimension Vista® (Siemens). E’ stata dosata
anche la creatinina urinaria per il calcolo dell’ACR
(Albumin Creatinine Ratio) rapporto albumina urinaria
(mg/L) e creatinina urinaria (g/L). Le differenze sono state
analizzate utilizzando il metodo di Bland Altman e la
regressione lineare di Passing e Bablok.
Risultati: La regressione lineare mostra una correlazione
di r=0,99 e r=0,98 per l'albumina sierica quella urinaria
rispettivamente. Le analisi statistiche di confronto per
l’albumina urinaria sono state eseguite su 167/222
campioni i rimanenti 55/222 sono risultati sotto la soglia
di sensibilità dei metodi. All’analisi Bland Altman è stata
dimostrata una costante sovrastima dei risultati ottenuti
su Dimension Vista® di circa il 20%. Dei 55 campioni
sotto la linearità dei metodi 21/55 erano concordanti 34/55
discordanti.
Conclusioni: Per l’albumina sierica i metodi studiati
mostrano una buona performance anailitica. Per la
determinazione dell’albumina urinaria la discordanza in
circa il 15% dei casi dimostra, al di là dell’estrema
variabilità biologica dell’analita e del campione biologico ai
quali si aggiunge la diversa sensibilità dei metodi, quanto
sia necessario un programma di standardizzazione di
questo dosaggio.
465
P073
IL CONTEGGIO DEI GLOBULI BIANCHI NEL LIQUIDO
CEFALORACHIDIANO IN UN LABORATORIO
D'URGENZA: CONFRONTO TRA CONTA
AUTOMATICA SU SYSMEX XE-2100 E ANALISI
MICROSCOPICA
1
1
1
2
M.G. Alessio , L. Paterna , V. Rizza , B. Trezzi , F.
1
Lavarda
1
Lab. di Chimica Clinica e di Ematologia A.O.Osp.San
Carlo Borromeo, Milano
2
U.O. di Nefrologia e Dialisi A.O.Osp.San Carlo
Borromeo, Milano
Introduzione e scopo: Nei pazienti con disordini
neurologici infiammatori acuti è richiesta tra le misure
urgenti la conta dei globuli bianchi (WBC) nel liquor
(LCR). Il conteggio al microscopio ottico (MO) possiede
scarse performance metodologiche in quanto soggetto
a variabilità analitica e richiede esperienza da parte
dell’operatore. Scopo del nostro lavoro è stato valutare le
caratteristiche del sistema Sysmex XE-2100 in alternativa
all’analisi microscopica.
Metodi: Su 72 campioni di LCR è stato eseguito il
conteggio dei WBC in automazione su Sysmex XE-2100
e al MO in camera di Nageotte. L’analisi statistica è stata
eseguita con il programma MedCalc.
Risultati: La mediana dei valori ottenuti al MO è 5 WBC/µL
(5 percentile: 0; 95 percentile: 1910). Il conteggio WBCDiff è stato confrontato con il metodo MO e, considerando
il cut-off di 5 WBC/µL, ha evidenziato 7 falsi positivi (17%),
viceversa prendendo come riferimento lo strumento
usando lo stesso cut-off il conteggio al M.O. non ha
evidenziato nessun falso negativo. La retta di regressione
secondo Passing-Bablok di 54 campioni con valori inferiori
a 50 WBC/µL è la seguente: MO=0+0.78XE-2100. Il test di
Wilcoxon per dati appaiati ha evidenziato una p=0.0054.
Conclusioni: Come atteso i due metodi di conteggio
dei globuli bianchi nel liquor presentano delle differenze
statisticamente significative come evidenziato dal test di
Wilcoxon. La retta di regressione rileva una sovrastima
del 22% da parte del sistema XE-2100. L’analisi della
concordanza per un valore strumentale di 5 WBC/µL
ha dimostrato che non ci sono falsi negativi. Dai dati
raccolti è verosimile affermare che l’utilizzo del conteggio
strumentale dei globuli bianchi del liquor è praticabile con
valori strumentali ≤ a 5 WBC/µL, al di sopra di tali valori
è opportuno il controllo microscopico. Dobbiamo però
aggiungere che XE-2100 possiede una buona affidabilità
metodologica, minor impegno di risorse e soprattutto validi
suggerimenti strumentali per l’analisi morfologica. Infatti
in campioni con WBC>20/µL abbiamo trovato una perfetta
concordanza nella differenziazione degli elementi. E’
tuttavia sempre necessaria una valutazione microscopica
per casi con scattergram anomali e/o allarmi strumentali.
Seehusen DA, Reeves MM, Fomin DA. Cerebrospinal
fluid analysis. Am Fam Physician 2003;68:1103-8.
466
P074
DOSAGGIO DELLA PROCALCITONINA:
CONFRONTO TRA METODI
R. Panella, B. Rampoldi, E. Perfetti, S. Mazza, A.
Pettinato, P. Giubbilini, R. Rigolini, E. Costa
Servizio di Medicina di Laboratorio, I.R.C.C.S. Policlinico
San Donato, San Donato Milanese (MI)
Introduzione e scopo: La procalcitonina (PCT) è una
proteina costituita da 116 aminoacidi (14kDa) generata
mediante proteolisi intracellulare di un precursore
peptidico, la pre-procalcitonina. È prodotta selettivamente
in presenza di infezioni batteriche sistemiche, di sepsi e di
shock settico; non compare in presenza di infezioni virali,
di infezioni batteriche localizzate, di patologie autoimmuni
e disordini allergici. La PCT può essere usata per la
diagnosi differenziale di sepsi e per il monitoraggio di
pazienti in terapia antimicrobica (1).
Scopo di questo lavoro è confrontare i dosaggi di PCT
effettuati con il test Elecsys BRAHMS PCT su Cobas e601
Roche Diagnostics e con il test Vidas BRAMHS PCT su
Vidas Biomérieux.
Materiali e metodi: Sono stati arruolati 71 soggetti
con sospetta sepsi ricoverati in vari reparti dell’IRCCS
Policlinico San Donato ai quali è stato effettuato
il dosaggio della PCT con strumentazione Roche e
Biomérieux. Il test eseguito su Cobas è un saggio in
elettrochemiluminescenza(ECLIA) mentre il test eseguito
su Vidas usa la tecnica ELFA (Enzyme Linked
Fluorescent Assay). L’analisi statistica è stata effettuata
mediante il test di Wilcoxon-Mann-Whitney che valuta
la differenza tra le medie, il calcolo del coefficiente di
correlazione di Pearson ed il test di Bland-Altman.
Risultati. La differenza tra le medie dei due gruppi
(media±errore standard) (3,29 ng/mL ± 1,42 per PCT
Vidas vs 2,5 ng/mL±1,04 per PCT Cobas; p=0,73)
non è statisticamente significativa. Il coefficiente di
correlazione è risultato di 0,998 (IC95%=0,996-0,998 e
p <0,0001) e mostra un’ottima correlazione tra i due
metodi considerati. L’analisi di Bland-Altman evidenzia
una buona correlazione con un bias di 0,79 (IC 95% da
-5,65 a 7,23). L’imprecisione nella serie, valutata su un
pool di sieri dosato sia con Vidas che con Cobas, ha
mostrato sempre un CV <10%.
Conclusioni: L’analisi statistica mostra un’ottima
correlazione tra le due metodiche. La scelta tra i
saggi può basarsi sul modello organizzativo di ciascun
laboratorio; in particolare la metodica su Cobas consente
l’utilizzo di un volume inferiore di siero, caratteristica non
trascurabile vista l’importanza del dosaggio della PCT in
età pediatrica.
1. Pezzati P, Balboni F, Piazzini T, et al. Biochim Clin
2013;37:15-22.
P075
COMPARISON OF FULLY AUTOMATED
CAPILLARYS WITH AGAROSE GEL
ELECTROPHORESIS FOR THE IDENTIFICATION
AND CHARACTERIZATION OF MONOCLONAL
IMMUNOGLOBULINS
1
2
3
V. Sargentini , M. Berretti , M. D'Alessandro , A.
4
1
Angeloni , A. Bachetoni
1
Lab. di Patologia Clinica, Dip. di Medicina
Sperimentale, Sapienza Università di Roma
2
Interlab srl, Roma
3
Lab. di Patologia Clinica, Dip. di Chirurgia, Sapienza
Università di Roma
4
Dip. di Medicina Molecolare, Sapienza Università di
Roma
Introduction: In clinical chemistry laboratories, serum
protein electrophoresis is usually performed using the
“gold standard” agarose gel as a migration support (AGE).
Within the last decade, capillary electrophoresis (CE)
has been adapted for use in clinical laboratories for
its advantages like rapid separation and automation.
Recently a fully automated AGE technique has been
developed and the real innovation is the availability of
immunofixation electrophoresis (IFE) kits designed for use
with the automated instruments. This study compare interindividual interpretations of the CE with the new AGE with
respect to sensitivity and specificity, also considering ease
of use, rapidity and costs.
Methods: Patients admitted to the Surgical Units of
Policlinico Umberto I were recruited independently from
their history of multiple myeloma. 196 serum specimens
sent to the laboratory for the routine serum protein
electrophoresis has been analyzed. All the sera were
analyzed on the CE Capillarys 2® (Sebia, France) and,
consequently, on the Agarose Gel Easy Interlab G26
electrophoresis (Interlab, Italy). The biologist interpreting
AGE results had no knowledge of the CE data, and when
observed a monoclonal immunoglobulin, went on with
IFE analysis, on the same fully automated platform to
confirm the monoclonal band and to identify the type of
paraprotein.
Results: The performance characteristics of AGE
and CE were determined by comparing each with
IFE. The sensitivity of AGE in detecting monoclonal
immunoglobulins was 100%, higher than that for CE
(60%). In particular it has been observed that half of the
40% false negative specimens, resulted from CE, were
post gamma proteins (25%) or IgM paraproteins (25%).
The specificity of the two methods was comparable: 100%
and 98% for AGE and CE respectively.
Conclusion: This study is the first evaluation of two
systems that combine the advantages of full automation
quickness, easy to use, bar code traceability and costs
with high analytical performances. Our data confirm the
fully automated AGE technique as a suitable routine
alternative to CE for serum protein analysis in clinical
practice, also considering the usefulness of the automated
IFE availability.
McCudden CR, et al. Am J Clin Pathol 2008.
P076
MEASUREMENT OF 25-HYDROXYVITAMIN D BY A
NOVEL SANDWICH IMMUNOASSAY METHOD
C. Autilio, G. Canu, C. Zuppi, C. Carrozza
Department of Diagnostic and Laboratory Medicine,
“A.Gemelli” Hospital, Catholic University, School of
Medicine, Rome, Italy
Introduction: Vitamin D plays an important role in bone
metabolism and its insufficiency has been associated
with increased risk and progression of several diseases,
including rickets in children, osteomalacia, cancer and
diabetes. There are two basic methods for measuring
serum vitamin D: immunoassays and chromotography.
In our study we compared a new chemiluminescence
sandwich immunoassay (FUJIREBIO 25-OH vitamin D
kit on LUMIPULSE® G1200) with DiaSorin 25-OHD
competitive immunoassay on Liaison® XL.
Materials and methods: We selected 240 serum samples
from outpatients (age 18 to 79 years old) sent to the
laboratory for routine 25-OHD testing on Liaison® XL
instrument. Serum samples represented a range of 25OHD levels (deficient, insufficient, sufficient and potential
toxicity levels), as defined by Endocrine Society Clinical
Pratice Guidelines: <19.9 ng/mL (24 samples), 20-29.9
ng/mL (130 samples), 30-100 ng/mL (84 samples), >100
ng/mL (2 samples). For statistical analysis we combined
values of deficient and insufficient levels in a single group
(154 samples). All samples were tested in one week using
a single lot of 25-OHD reagents. Controls were run at the
beginning of each analytical run.
Results: The statistical analysis showed a good
correlation between the two methods. Regression
coefficient (R) was 0.849 for samples ≤29.9 ng/mL and
0.819 for the range between 30-100 ng/mL.
Passing Bablok equation [y= (bias slope)x + bias
intercept] and means [Mean ± SD Liaison/ Mean ± SD
Lumipulse] are shown below:
-(≤29.9 ng/mL): y = 1.17(95% CI, from 1.085 to 1.280)x
-1.85(95% CI, from -4.24 to -0.02); mean 22.8 ± 5.4/ 24.5
± 6.13.
-(30-100 ng/mL): y = 1.29(95% CI, from 1.06 to 1.56)x
-9.02(95% CI, from -18.67 to -1.11); mean 37.1 ± 8.7/37.9
± 9.8.
The concordance of the two methods (percentage of data
which belong to the same reference range) was 87% in
the insufficient range and 92% in the normal range. The
two toxicity samples were also concordant.
Conclusions: In all ranges evaluated methods comparison
shows a good correlation between the two immunoassay
methods and a reliable clinical performance.
467
P077
VALUTAZIONE DELL'AFFIDABILITÀ DELLE
DILUIZIONI NEL DOSAGGIO DELLA TROPONINA I
CARDIACA ACCUTNI+3 BECKMAN COULTER CON
VALORI SUPERIORI AL VALORE PIU’ ALTO DELLA
CURVA DI CALIBRAZIONE
S. Storti, M.S. Parri, S. Cau, D. Chicchi , E.
Battipaglia, A. Baroni, N. Botto, S. Vittorini, M.G.
Colombo, A. Clerico
1
1
2
Sclavo Diagnostics International SRL, Sovicille (SI)
Dasit Group, Cornaredo (MI)
3
Lab. Clinica ed Ematologia, Osp. San Bortolo ULSS6,
Vicenza
2
Il dosaggio immunometrico della troponina I cardiaca
(cTnI) AccuTnI+3 Beckman Coulter è un sistema
“sandwich” in chemiluminescenza che utilizza come
fase legante particelle paramagnetiche. La ditta
commercializza due differenti kit dedicati alle piattaforme
DXI800 e Access2, raccomandando di non diluire
campioni con valori di cTnI maggiori di 80 ng/mL
per il sistema DXI800 e 100 ng/mL per Access2,
che rappresentano i valori più alti della calibrazione,
ma di refertare i valori come maggiori del cut-off
indicato (80 o 100 ng/mL a seconda del sistema).
Tale raccomandazione di fatto impedisce uno studio
cinetico completo dei valori di cTnI dopo infarto acuto
del miocardio (IMA) STEMI, dopo angioplastica per IMA
NO-STEMI o dopo interventi di bybass aortocoronarico,
settings clinici in cui è importante valutare il picco
massimo della cTnI che è correlato con l’area di necrosi,
a sua volta importante predittore di rischio di mortalità a
breve-medio termine e di scompenso cardiaco.
Scopo del nostro studio è stato verificare se le diluizioni
di campioni con valori al di sopra del cut-off indicato dalla
ditta forniscano un’affidabile valutazione della cinetica
della cTnI.
Materiali e metodi: Diluizioni seriali fino a 1:256 con
soluzione fisiologica di 2 campioni con valori di cTnI fra
300 e 400 ng/mL e di 3 campioni tra 5 e 10 ng/mL sono
state analizzate in parallelo su strumentazione Access 2
e DXI800. Per campioni a concentrazione alta di cTnI è
stato ottenuto un CV medio di 7.9% su DXI800 e 7.0%
su Access2, mentre per i campioni con concentrazioni
inferiori d cTnI il CV medio è stato del 5.8% per DXI800
e 6.3% per Access2. E’ stata sempre ottenuta un’ottima
risposta al test di diluizione su entrambe le piattaforme,
2
con R compreso fra 0.997 e 0.999. Un campione con
alta concentrazione di cTnI (circa 350 ng/mL) è stato
serialmente diluito con un siero a concentrazione di cTnI
2
< 0.02 ng/mL, ottenendo una eccellente correlazione (R =
0.999), con CV% di 9.9 per DXI800 e 8.8 per Access2.
Conclusioni: I nostri dati indicano che la diluizione di
campioni con concentrazione di cTnI>76 ng/mL per
DXI800 e >104 ng/mL per Access2, che rappresentano
per di due sistemi i valori più alti della curva di calibrazione
usata nelle nostre prove, fornisce una stima affidabile
della concentrazione di cTnI.
1
A. Calabrò , B. Daviddi , T. Maggi , C. Ottomano , D.
3
1
Giavarina , C. Musitelli
1
Fondazione Toscana G. Monasterio, Massa, Pisa, Italia
468
P078
GLI INDICI DI SIERO DA AUSILIO OPERATIVO
A CRITERIO DISCRIMINANTE PER I MODERNI
ANALIZZATORI
Scopo di questo progetto è l'implementazione e
la validazione della procedura automatica per il
monitoraggio degli Indici di Siero sull'analizzatore DIRUI
CS1200, prodotto dalla DIRUI Industrial Co.,Lt e
distribuito in Italia dalla DASIT SPA. Nel corso del
lavoro abbiamo misurato gli Indici di Siero in modo
quantitativo in Unità Arbitrarie e, considerandoli come
normali substrati, abbiamo applicato gli stessi protocolli
internazionali impiegati normalmente.
Abbiamo misurato la sensibilità analitica, la precisione e
correlato i tre indici con le concentrazioni della Bilirubina,
della Emoglobina e dei Trigliceridi dei campioni.
Gli Indici DIRUI si sono dimostrati pratici, funzionali,
sensibili (LOD (UA) Icte=0.09, Heme=3.3, Lipe=1.2) e
precisi (CV(%) Icte=1.7, Heme=2.0, Lipe=3.3).
Abbiamo verificato l'assenza di interferenze reciproche.
Le correlazioni con la Bilirubina (n=117, r=0.99,
y=0.944x-0.509) e con l'Emoglobina (n=115, r=0.90,
y=2.57x-6.77) hanno palesato un’ottima corrispondenza.
Critica invece, come ci aspettavamo, quella con i
Trigliceridi (n=120, r=0.54, y=0.32x+7.24).
La mancanza di una scala di un riferimento per
l'indice Lipe rende difficile verificarne l'attendibilità.
Ma l'affidabilità della tecnica impiegata, turbidimetria,
e l'ottima corrispondenza trovata con l'esame visuale
dimostrano la validità della soluzione proposta.
Il confronto DIRUI/Vista, condotto utilizzando una scala
semiquantitativa, ha evidenziato una buona concordanza
per gli indici Icte(3 discordanze su 63 campioni) e Heme(3
su 63). Il successivo dosaggio della BLT e dell'Hb ha
confermato i risultati DIRUI.
L'indice Lipe ha mostrato un numero maggiore di
discordanze (14 su 63), 11 in classe 1L e tre campioni
positivi al Vista (2 e 3L) ma negativi al DIRUI e limpidi
all'esame visuale. Il problema è imputabile all'utilizzo
dell'acqua come diluente da parte del Vista invece della
fisiologica utilizzata dagli altri sistemi. La forza ionica di
quest'ultima inibisce infatti i fenomeni di precipitazione di
natura proteica
Il confronto DIRUI/ESAME VISUALE su 120 campioni,
nonostante la forte soggettività di questa ultima
procedura, ha mostrato una buona concordanza per tutti
gli indici.
Lippi G, Giavarina D, Gelati M, et al. Clin Chim Acta
2014;429:143-6.
P079
VALUTAZIONE DI UNO STRUMENTO POCT PER LA
DETERMINAZIONE DELL’EMOGLOBINA GLICATA IN
PRESENZA DI VARIANTE EMOGLOBINICA DI TIPO S
1
1
1
2
C. Artusi , M. Marinova , L. Brugnolo , G. Antonelli , M.
1
2
Zaninotto , M. Plebani
1
UOC Medicina di Laboratorio, Azienda OspedalieraUniversità degli Studi di Padova
2
Padova
Introduzione: la misura dell’emoglobina glicata, parametro
biochimico d’elezione per il monitoraggio dello stato
glicemico a lungo termine nei pazienti diabetici, è stata
recentemente raccomandata come ulteriore strumento
per la diagnosi di diabete. Pertanto, è necessario
garantire che la precisione e l'accuratezza dei metodi
di misurazione siano adeguati . L’analizzatore B-analyst
è uno strumento POCT basato sulla tecnologia µ-TAS
(Micro Total Analysis System) in grado di analizzare
l’emoglobina glicata. Il campione di sangue intero
viene inserito in un chip ed analizzato con metodo
immunoturbidimetrico mediante agglutinazione al lattice
con anticorpi monoclonali. Il tempo di misurazione per
campione è di 7’30”. È noto come la presenza di varianti
emoglobiniche possa interferire nella determinazione
dell’emoglobina glicata. L’emoglobina S rappresenta
l’emoglobina principale negli individui affetti da anemia
falciforme, ed è la variante più diffusa nella popolazione
afferente al nostro servizio.
Scopo dello studio: valutare le prestazioni analitiche
dell’analizzatore
B-analyst
per
la
misurazione
dell’emoglobina glicata in presenza della variante
emoglobinica di tipo S.
Materiali e metodi: sono stati raccolti 45 campioni
di sangue di pazienti afferenti all’UOC Medicina di
Laboratorio con richiesta di HbA1c che presentavano
una variante emoglobinica di tipo S (confermata con il
test di sickling). I campioni sono stati analizzati con Banalyst S1 (A. Menarini Diagnostics) e confrontati con
Adams HA8160 (A. Menarini Diagnostics), strumento
HPLC utilizzato nella routine.
Risultati: i due sistemi diagnostici sono stati messi
a confronto attraverso la correlazione di Pearson, la
regressione di Passing Bablok e l’analisi di BlandAltman. Essi presentano un’ottima correlazione (y=1.00x,
r=0.994) e un bias non significativo (bias: 0.0; 95%IC: -0.6
a 0.6).
Conclusioni: la correlazione con il metodo HPLC di
confronto è risultata ottima. La semplicità d’uso, la
robustezza e l’elevata accuratezza attestano la possibile
applicazione come strumento POCT nel monitoraggio
del paziente diabetico anche in presenza di varianti
emoglobiniche di tipo S.
P080
VALUTAZIONE DEL DOSAGGIO DEL 5FLUOROURACILE: L'INFLUENZA DELLA FASE PREANALITICA
V. Pecoraro, R.M. Russo, S. Granata
Lab Analisi Chimico Cliniche e Microbiologia – S.S. di
Biochimica Clinica, A.O. Niguarda Ca’Granda, Milano
Background: Il 5-fluorouracile(5FU) è un farmaco
antitumorale utilizzato per il trattamento di tumori solidi
tra cui quelli del tratto gastro-intestinale. La disponibilità
del 5FU nelle cellule dipende dal suo catabolismo ad
opera dell’enzima diidropiridina deidrogenasi. Il 5FU viene
somministrato come bolo endovenoso, la sua emivita nel
plasma è di 10 minuti. Molti studi hanno indagato la
concentrazione del 5FU nel monitoraggio terapeutico di
1
pazienti oncologici.
Obiettivo:Implementare una nuova metodica di
immunodosaggio per la determinazione plasmatica del
5FU e valutare l’influenza della raccolta del campione.
Metodi: Il protocollo sperimentale prevede il dosaggio
con metodo immunochimico (Saldax) su Cobas 8000
(Roche). Sono stati raccolti campioni di plasma in EDTA,
ed è stata definita una rigorosa procedura di raccolta e
conservazione dei campioni, nonché di raccolta dati. È
stata valutata la precisione del metodo e calcolato il valore
di AUC.
Risultati: Sono stati arruolati 10 pazienti con tumore del
colon retto, sottoposti a protocollo chemioterapico Folfox
o De Gramat. Entrambi prevedono 3 cicli di infusioni
continue, ogni ciclo di 44 ore di infusione del farmaco. In
7 pazienti (80%) si è riscontrato un aumento dei livelli di
5FU ad ogni ciclo ai quali corrisponde anche un aumento
dei livelli di AUC. Quando non è stata rispettata la corretta
procedura di raccolta, si sono rilevati livelli di 5FU e di AUC
non valutabili (3 pazienti). La concentrazione media del
5FU è di 206,3 mg/L (SD=57,6). La variabilità biologica
intra-individuale è di 30%, mentre il CV inter-individuale
è di 27%. CV intra-individuale è maggiore tra la prima
e la seconda infusione. I valori di AUC vanno da 4,2
della prima infusione a 16,1 nella terza infusione. Nessun
paziente ha riportato gravi segni di tossicità (p <0.001).
Conclusioni: Il dosaggio immunometrico è un metodo
veloce e preciso per la determinazione plasmatica del
5FU. La fase critica è quella pre-analitica, infatti il risultato
è influenzato dalla modalità di raccolta del campione. I
valori di AUC <30 mg/Lxh sono associati ad una minore
tossicità, questo consente di poter adottare un miglior
regime chemioterapico specifico per il paziente.
1. Sorrentino MF, Kim J, Foderaro AE, et al. 5-fluorouracil
induced cardiotoxicity: Review of the literature. Cardiol J
2012;19:453-8.
469
P081
VALUTAZIONE DELL’ATTENDIBILITÀ DEGLI
INDICI LIQUORALI IN CASI DI DUBBIA
INTERPRETAZIONE DI BANDE OLIGOCLONALI IN
ISOELETTROFOCUSING
M.T. Dell'Abate, A. Giannace, C. Zuppi, T. De Michele
Laboratorio Analisi I, Policlinico Universitario A. Gemelli,
Roma
Introduzione: Molte malattie del sistema nervoso centrale
sono associate ad un aumento della concentrazione delle
proteine nel liquor. La diagnostica liquorale prevede il
dosaggio nefelometrico, nel liquor e nel siero, di albumina
ed immunoglobuline IgG per la valutazione dello stato
della barriera emato-liquorale, ed il calcolo di indici
che rappresentano l’espressione quantitativa di sintesi
intratecale di IgG. Solo l’isoelettrofocusing permette di
avere un’espressione qualitativa di sintesi intratecale di
IgG con una sensibilità del 95%. Scopo del lavoro è di
valutare, in casi di dubbia interpretazione del tracciato
ottenuto in isoelettrofocusing, i dati di sintesi intratecale
calcolati con gli indici al fine di ottimizzare la metodica.
Materiali e metodi: Lo studio ha riguardato 100 pazienti
positivi per bande oligoclonali analizzate con sistema
isoelettrofocusing (HYDRASYS Focusing, SEBIA) e
confermate da reperti radiodiagnostici. Di questi è stata
effettuata una selezione di 74/100 pazienti con danno
di barriera negativo e, per ciascun caso, sono stati,
poi, calcolati gli indici liquorali con sistema Protis rev
1.0.0 previo dosaggio delle proteine mediante strumento
Siemens BN II. Sono stati, analogamente, studiati, 22
soggetti con “alterazioni borderline” nei tracciati.
Risultati: Dai dati è emerso che nei casi di dubbia
interpretazione dei tracciati, gli indici non forniscono
informazioni utili per una migliore interpretazione dei
risultati ottenuti in isoelettrofocusing. Inoltre, in 23/74 casi
di pazienti con un pattern positivo per bande oligoclonali,
gli indici liquorali risultano negativi.
Conclusioni: Questa discussione vuole essere solo un
lavoro preliminare ad un’analisi più ampia di casi con
il fine di operare una ulteriore sintesi critica circa
l’interpretazione e la correlazione dei dati disponibili nella
diagnostica liquorale.
Deisenhammer F, Bartos A, Egg R, et al. Guidelines on
routine cerebrospinal fluid analysis. Report from an EFNS
task force. Eur J Neurol 2006;13:913-22.
470
P082
DOSAGGIO PROCALCITONINA: CONFRONTO TRA
DUE METODI AUTOMATIZZATI
M. Brugia, V. Viola, F. Balducci, M. Piaggesi, M.
Tocchini
Lab. di Biochimica Clinica e Microbiologia, Azienda
Ospedali Riuniti Ancona
Premesse e scopo dello studio: La diagnosi precoce
e l’adeguata terapia della sepsi costituiscono una sfida
quotidiana per i reparti di pronto soccorso e per le
unità di terapia intensiva (1). Evidenze scientifiche
hanno dimostrato che la procalcitonina (PCT ) è un
marker molto utile oltre che nelle sepsi anche nella
diagnosi differenziale tra infezioni fungine e batteriche,
nel prevedere le complicanze dopo intervento chirurgico
di bypass aorto-coronarico e nelle infezioni pediatriche e
neonatali (3-4).
Lo scopo dello studio è di valutare le performance
analitiche di due dosaggi automatizzati di PCT in
chemiluminescenza e confrontare i valori ottenuti in
relazione alle condizioni cliniche dei pazienti studiati.
Materiali e metodi: Nel periodo 01/11/2013 al 01/12/2013
sono stati analizzati rettrospettivamente 96 campioni di
sangue, mantenuti congelati a -20 °C, di 75 pazienti
ricoverati presso le varie Unità Operative dell’Azienda
Ospedaliera con sospette infezioni o sepsi.
La procalcitonina è stata dosata mediante il metodo
Vidas- Biomerieux (ELFA) e Thermo Fisher Modular E170
Roche (ECLIA).
Risultati e conclusioni: Il confronto tra i due metodi
mostra una buona correlazione con coefficiente R2
=0,9931 soprattutto a concentrazioni >10 ng/mL. Dei 75
pazienti studiati 46 avevano PCT <0,5 ng/mL e non
presentavano infezioni, 18 avevano valori PCT >2 ng/mL
e identificazione microbiologica dell’infezione, 11 pazienti
erano stati sottoposti ad interventi di cardio-chirurgia.
Nello studio si evidenzia che la PCT è un indicatore
affidabile di infiammazione o infezione in pazienti critici
e la sua misura nel tempo, in aggiunta ai criteri
clinici, può essere utilizzata per adattare la durata della
terapia antibiotica e per verificare un eventuale fallimento
terapeutico.
P083
VALUTAZIONE ANALITICA DEL POCT HORIBA
MEDICAL MICROSEMI CRP: CONFRONTO CON GLI
ANALIZZATORI UTILIZZATI IN ROUTINE
G. Bourlot, V. Granero, E. Zanotto, M.R. Cavallo
S.C. Lab. Analisi di Pinerolo ASL TO3
Scopo del lavoro: Il dosaggio della Proteina C reattiva
(CRP), associato con la valutazione del numero dei globuli
bianchi, riveste un’essenziale importanza per stabilire la
presenza e l’entità di un processo infiammatorio acuto,
nonché per monitorare la sua progressione e l’efficacia
della terapia. Utilizzare un POCT in grado di determinare
la CRP e l’esame emocromocitometrico può rivelarsi
di grande efficacia, quando sia inevitabile l’utilizzo di
ridotti volumi ematici, usuali per i prelievi dei pazienti di
Neonatologia e di Pediatria. Il nostro lavoro ha lo scopo
di valutare l’accuratezza dello strumento Microsemi CRP
Horiba, con l’analisi combinata dell’emocromo e della
CRP, a confronto con i sistemi analitici utilizzati in routine.
Materiali e metodi:
A. Qualità analitica dei due metodi: Confronto eseguito
utilizzando “Protocollo Rapido 3*5”: tre livelli di
concentrazione, ripetuti in triplicato quotidianamente, per
5 giorni.
B. Analisi di regressione: Analisi statistica con programma
Med Calc grafici di Box & Wisker, analisi di Bland &
Altman, correlazione di Passing e Bablok eseguita su 99
campioni scelti casualmente dalla routine.
Risultati:
• CV combinato: Livello:
1°: PCR: 8,8; WBC: 4,94; RBC: 2,27; Hb: 2,22; Hct: 2,71;
PLT: 5,95.
2°: PCR: 8,2; WBC: 4,96; RBC: 1.63; Hb: 2,08; Hct: 2,58;
PLT: 8,10.
3°: PCR: 6,3; WBC: 4,31; RBC: 2,71; Hb: 2,18; Hct: 2,75;
PLT: 3,75.
• Passing & Bablok: Intercept (IN); Slope (SL)
PCR: Y=-0,0100+1,0000X [95%CI: IN da -0,0106 a
0,0004; SL da 0,9962 a 1,0055].
WBC: Y=0,0686+0,9929X [95%CI: IN da 0,0000 a 0,2175;
SL da 0,9750 a 1,0000].
Hct: Y=-0,1948+1,0174X [95%CI: IN da -1,8171 a 1,1898;
SL da 0,9774 a 1,0610].
RBC: Y=-0,1015+1,032X [95%CI: IN da -0,2609 a 0,0350;
SL da 1,0000 a 1,0698].
Hb: Y=0,0000+1,0000X [95%CI: IN da -0,2018 a 0,0000;
SL da 1,0000 a 1,0182].
PLT: Y=2,7873+0,9902X [95%CI: IN da 0,0000 a 6,7711;
SL da 0,9759 a 1,0000].
Conclusioni: Buona correlazione, in quanto i dati sono
inferiori al livello massimo d’errore accettabile, prefissato
nei coefficienti di variabilità biologica intra-individuali.
Innovativo POCT, ideale per i reparti di neonatologia
poichè le caratteristiche dei pazienti rendono critica la
raccolta dei campioni.
Bibliografia: Protocollo operativo comparazione GdS
SIBioC «Statistica per il Laboratorio».
P084
BENCE-JONES NEPHELOMETRIC EVALUATION: A
STEP FORWARD IN QUANTITATIVE ASSESSMENT?
A. De Stefano, F. De Gregorio, M. Pieri, V. Dinallo, F.
Duranti, R. Zenobi, S. Bernardini, M. Dessì
Department of Experimental Medicine and Surgery, "Tor
Vergata" University Hospital, Rome (Italy)
Bence Jones (BJ) protein is an important marker
for identifying and managing patients with monoclonal
plasmaproliferative disorders. Free light chains (FLCs)
are produced in excess by plasmacells and their
production must increase many times before urine
contains significant amount of FLCs. Despite FLCs
are more frequently abnormal in serum than in urine
because of renal metabolism, urine FLCs analysis
can probably still be useful as supportive evidence
for minimal tumor burden in patients with Multiple
Myeloma, AL Amyloidosis and related disorders. To date,
immunoelectrophoresis (IFE) is the gold standard method
to determine BJ, whereas immunochemical methods such
as nephelometry are less recommended due to lack of
International standardization.
Quantitative analysis today can be made by
nephelometric/turbidimetric immunometric assay or by
computing densitometry of the IFE’s BJ band. The
densitometric quantization can be made difficult by the
different affinity of monoclonal free light chains for the
dyes used, by the coincident migration of other proteins
and also is operator dependent. Moreover it could be
useful to perform BJ protein quantitative evaluation,
during the follow-up in order to evaluate therapy response.
The aim of our study was to correlate the BJ presence
evaluated by an automated nephelometric assay and by
IFE agarose gel.
We used a nephelometric assay on BN ProSpec®
System (Siemens Healthcare Diagnostics) based on a
mixture of monoclonal antibodies (N Latex FLC kit) (1)
and the electrophoresis Hydrasis system (Sebia Italy)
as reference method for the best detection of urinary
monoclonal FLCs.
FLCs urine determination was performed on 211 patients
presented to the Tor Vergata University Hospital of
Rome. Our data show a significant correlation (r> 0.9, p
<0.001) between the two methods. We conclude that both
methods were highly comparable for BJ determination,
but nephelometric assay is quantitative, rapid and
not operator depending. Furthermore nephelometric
assay could be useful in monitoring patients’ therapy
response during the follow-up, considering the difficulty in
densitometry measurement of BJ band.
1. Hoedemakers RM, Pruijt JF, Hol S, et al. Clin Chem Lab
Med 2011;50:489-95.
471
P085
LA MISURA DEL TESTOSTERONE TOTALE:
CONFRONTO TRA UN METODO RIA E UN METODO
IMMUNOMETRICO AUTOMATIZZATO
P086
EFFETTO DEL TEMPO DI CONTATTO TRA SIERO
E COAGULO SU 57 METABOLITI IDENTIFICATI
MEDIANTE SPETTROMETRIA DI MASSA
C. Guiotto, D. Marranca, L. Erroi, M. Di Grazia, R.
Cerruti, E. Cocciardi, M. Vizzini, M. Migliardi
A. Angiolillo, A. Cristofano , N. Sapere, A. Di Costanzo
Lab. di Ormonologia, S.C. Laboratorio Analisi, A.O.
Ordine Mauriziano di Torino
Obiettivi: La misura del testosterone totale (T) viene
effettuata per lo studio della pubertà precoce, della
sindrome virilizzante nelle donne e dell’infertilità maschile.
In molte di queste situazioni la concentrazione del T può
essere molto bassa e i metodi immunometrici sovente
non presentano livelli di esattezza e precisione pari a
quelli ottenibili nel caso della misura del T nei maschi
adulti. Scopo del lavoro è il confronto dei livelli di T
ottenuti con un metodo RIA estrattivo triziato sviluppato
in laboratorio, e un metodo immunometrico automatizzato
su strumentazione Architect i2000. Obiettivo ulteriore è
la valutazione delle misure del T effettuate su Architect
i2000, precedute o meno da un processo di estrazione
dell’analita.
Materiali e metodi: Sono state confrontate le misure di T
ottenute con i due metodi su campioni di plasma di 100
pazienti (50 femmine e 50 maschi). Sono stati presi in
considerazione successivamente 31 campioni di plasma
di donne con concentrazioni comprese tra 0.14 ng/mL e
0.91 ng/mL; ogni campione è stato dosato con Architect
i2000 previa estrazione con etere dietilico effettuata in
fase solida su colonne Extrelut® NT 1 (VWR). I risultati
ottenuti sono stati confrontati con il metodo diretto.
Risultati: La retta di regressione di P&B mette in luce
una sottostima del metodo automatizzato (y) rispetto al
metodo RIA (x) (y=0.821x-0.19); la correlazione tra i due
metodi è ottima (r di Pearson 0.98, p <0.0001). Per quanto
riguarda il confronto tra i risultati ottenuti su Architect
i2000 senza (x) e con estrazione (y) si osserva una lieve
sottostima del metodo estrattivo (y=0.853x-0.02), mentre
l’associazione tra le due misure è molto buona (r di
Pearson 0.93, p <0.0001.
Conclusioni: I metodi studiati non mostrano significative
differenze nelle prestazioni analitiche. Il metodo RIA
estrattivo richiede tempo, doti di manualità ed è quindi
applicabile a un numero limitato di campioni. Il metodo
automatizzato su Architect i2000 è rapido, semplice,
eseguibile su ampie serie di campioni e di conseguenza
è di più semplice utilizzo in laboratorio.
472
Dip. di Medicina e Scienze della Salute, Università del
Molise
La variabilità dei valori degli analiti presenti nel siero può
essere dovuta a fattori preanalitici, analitici o biologici.
Grazie ai notevoli progressi tecnologici degli ultimi anni,
la variabilità analitica è stata ridotta a livelli tali da
non influenzare l’interpretazione clinica dei risultati. Il
contributo della variabilità preanalitica è, oggi, il problema
principale per l'affidabilità dell'intero processo analitico:
la raccolta e il trattamento dei campioni, nonché il
loro trasporto e stoccaggio, possono avere un effetto
sul risultato dei test. Per identificare i reali risultati
fisiopatologici nei pazienti, gli artefatti dovrebbero essere,
quindi, ridotti al minimo.
Cambiamenti nei valori biochimici sierici in funzione del
tempo di contatto tra siero e coagulo sono già stati
studiati per diversi analiti comunemente usati negli esami
di routine.
La metabolomica viene sempre più utilizzata in una
varietà di applicazioni inerenti la salute, tra cui
test farmaceutici, screening tossicologico, monitoraggio
dei trapianti, screening neonatale. Questo approccio
consente di quantificare in maniera specifica piccoli
metaboliti endogeni a basso peso molecolare, fornendo
una "impronta metabolica" degli individui.
In questo studio sono state indagate le variazioni nel siero
di 57 metaboliti, utilizzando la spettrometria di massa. Il
sangue venoso è stato prelevato da quattordici soggetti
sani, impiegando il sistema vacutainer, e centrifugato a
tempi diversi. I campioni di siero sono stati deposti su
carta da filtro dopo centrifugazione del sangue a 0h, 2h
e 6h. I metaboliti (36 acilcarnitine e 21 aminoacidi) sono
stati misurati mediante spettrometria di massa utilizzando
un'API 4000 AB Sciex. Le concentrazioni degli analiti sono
state calcolate con il software Chemoview.
I risultati ottenuti hanno mostrato che la concentrazione
di alcuni metaboliti, principalmente degli amminoacidi,
è alterata da un contatto prolungato con il coagulo.
In particolare aspartato, glutammato, fenilalanina,
metionina, glicina e ornitina hanno mostrato un
incremento lineare di concentrazione con il tempo.
I risultati suggeriscono che sarebbe auspicabile far
intercorrere un lasso di tempo di un massimo di due ore
dalla raccolta alla separazione.
Tuck MK, Chan DW, Chia D, et al. J Proteome Res
2009;8:113-7.
P087
E’ POSSIBILE ESEGUIRE L’ELETTROFORESI DELLE
PROTEINE URINARIE IN TECNICA CAPILLARE?
1
1
1
1
M. Falcone , S. Petti , M. Angiolilli , M.G. Bonfitto , A.
1
1
1
2
Prencipe , A. Natale , F. Simone , M. Codonesu , D.
2
2
1
Giodice , F. Tosello , L. Lavilla
1
Azienda Ospedaliero Universitaria OO. RR. di Foggia,
1° Laboratorio Analisi Cliniche, Foggia
2
Medical Systems, Genova
L’elettroforesi delle proteine urinarie (EPU) ha un
posto preponderante nella diagnostica delle nefropatie.
Una proteinuria oltre i 150 mg/urine 24h necessità di
approfondimenti clinici. Lo scopo del presente lavoro è
tentare di eseguire anche con la tecnica in capillare
(Capillare Elettroforesi CE) l’EPU. Le motivazioni che
spingono a tentare ciò, sono le stesse delle proteine
sieriche, la misura delle bande non sarebbe vincolata
alla affinità per un colorante, ma una misura diretta
delle proteine presenti nelle urine. Attualmente non si
esegue l’EPU in CE perché, il tracciato si presenta
con picchi aspecifici che lo rendono non interpretabile.
Materiali e metodi: Presso il 1° Laboratorio di Analisi
sono installati sia il sistema in Gel d’Agarisio (AGE)
SAS, che il sistema in capillare V8 della Ditta Helena
Biosciences Europe (in Italia Medical Systems, Genova).
Mentre per l’EPU in AGE non è previsto alcun trattamento
del campione; per l’EPU in CE si attua un trattamento
di purificazione: a 1 ml di urina si aggiungono 50 ul di
“SPE buffer” (tampone a forte pH alcalino del sistema
CE V8), da questo si prelevano 0,5 ml di urina e si
dispensano in provetta eppendorf con tappo, contente
circa 90 mg di “carbone attivo granulare”, breve agitazione
per 5 minuti, centrifugazione a 5000 rpm per 5 minuti
e inserimento dell’eppendorf, stappata, sui rack del V8.
Si selezionare su V8 la modalità “SPE urine”, in questo
modo, la macchina esegue esami per liquidi con basso
contenuto proteico, come urine e liquido cefalorachidiano.
Risultati: Sono stati esaminati in EPU n. 19 campioni di
urine, provenienti da raccolte di 24 ore e 1 siero diluito
1/61 (controllo), con valori da 29 a 500 mg/dl, sia in CE
che in AGE, durante agosto settembre 2013. Entrambe
le tecniche hanno quantizzato le frazioni proteiche
in modo coincidente e classificato le 19 proteinurie
secondo questa tipologia: Proteinuria glomerulare non
selettiva:8. Proteinuria glomerulare selettiva: 3. Rilevante
CM proteinuria da overflow: 5. Proteinuria glomerulare
selettiva e CM: 3. 1 Siero diluito 1/61 (controllo). Il metodo
attuato in questo lavoro vuole porsi come prototipo per
l’Elettroforesi delle proteine urinarie in capillare.
P088
VALUTAZIONE DI UNA NUOVA STRUMENTAZIONE
NEFELOMETRICA PER IL DOSAGGIO DI PROTEINE
SIERICHE E URINARIE
1
2
1
2
T. Lupo , G. Salerno , M. Calcagno , M. Fumi
1
DAI di Medicina di Laboratorio, Azienda Ospedaliera
2
Scuola di Specializzazione in Biochimica Clinica,
Università degli Studi di Napoli Federico II
Scopo del lavoro: Dopo la valutazione preliminare
del nefelometro EasyNeph(Sclavo) con reagenti
dedicati(luglio-settembre 2013), è stata pianificata una
rivalutazione della strumentazione e delle metodiche
secondo i criteri Clinical and Laboratory Standard Institute
(CLSI), in funzione delle migliorie apportate al software di
gestione e ai reagenti in uso.
Metodi: Sono state rivalutate le metodiche: transferrina
sierica, microalbumina e catene leggere κ/λ urinarie.
In accordo alle linee guida CLSI–EP è stata
verificata: precisione intra e inter-serie(EP05-A;EP15-A2);
linearità(EP06-A) e carry-over da campione(EP10-A2). La
correlazione tra metodi (EP09-A2) è stata effettuata con il
nefelometro BNProspec(SIEMENS), in uso presso il DAIMed Lab, su 50 campioni in duplicato.
Risultati: Per i 3 pool in studio la ripetibilità intraserie ha
mostrato un CV% tra 1.44-4.50 per le proteine urinarie
e tra 2.20-3.25 per la transferrina; per la ripetibilità
interserie un CV% tra 1.0 e 5.0 per le proteine urinarie
e tra 3.5-3.6 per la transferrina. La linearità è stata
verificata tra 9.3-169.7 mg/L per la microalbuminuria; tra
11.0 e 227.6 mg/L per le C.L.κ; tra 18-135 mg/L per
le C.L.λ e tra 1.73-7.88g/L per la transferrina. Tutte le
determinazioni analitiche sono esenti da carry-over da
campione. Nel confronto strumentale la microalbumina ha
mostrato uno slope di 0.74 e R^2:0.97; le C.L.κ uno slope
0.76 e R^2:0.98; le C.L.λ uno slope 1.38 e R^2:0.96; la
transferrina uno slope 1.21 e R^2:0.97.
Conclusioni: L’imprecisione intra e inter-serie sono
risultate soddisfacenti; la linearità per la microalbuminuria
e le C.L.κ e λ è risultata accettabile, anche se lievemente
inferiore al limite dichiarato; per la transferrina non è
stato possibile testare il range dichiarato per mancanza
di campioni ad elevata concentrazione, tuttavia il range
valutato e clinicamente utile, risulta soddisfacente. Nel
confronto con il BNProspec si osserva una leggera e
costante sottostima per C.L.κ e microalbuminuria e una
lieve e costante sovrastima per C.L.λ e transferrina
che comunque non influisce sull’outcome clinico del
paziente. In conclusione il nuovo sistema analitico
EasyNeph(Sclavo) fornisce dati precisi ed accurati
consentendo un corretto follow-up dei pazienti per gli
analiti valutati.
Bibl:NCCLS
473
P089
ANALYTICAL EVALUATION AND CLINICAL UTILITY
OF PIVKA II IN PATIENTS WITH CHOLANGIO OR
HEPATOCELLULAR CARCINOMA: A PRELIMINARY
STUDY
1
1
1
P090
COMPONENTI MONOCLONALI IGAλ TIPIZZATE CON
LA IMMUNOSOTTRAZIONE IN ELETTROFORESI
CAPILLARE DOVE LA IMMUNOFISSAZIONE
FALLISCE
G.L. Salvagno , O. Ruzzenente , E. Danese , A.
2
2
1
Ruzzenente , S. Pachera , M. Gelati , A.
2
1
Guglielmi , G.C. Guidi
A. Pocognoli, A. Frezzotti, M. Galeazzi, R. Mazzoni, G.
Pennesi, M. Tocchini
1
Introduzione: L’elettroforesi rileva la presenza di una
componente monoclonale (CM) che viene poi tipizzata
con la immunofissazione (IFE), che è il metodo di
riferimento, o con la immunosottrazione in elettroforesi
capillare (ISE).
Materiali e metodi: Vengono descritti due casi in cui
l'elettroforesi con metodo capillare (CE) (CapillarysSebia) ha evidenziato un picco anomalo a cui ha fatto
seguito la tipizzazione con IFE (Hydrasys-Sebia) e ISE
(Capillarys-Sebia).
Risultati:
Paziente
1:
CE
evidenzia
ipergammaglobulinemia e una lieve anomalia in zona
beta; IFE rileva una banda costituita da catene pesanti α
non associata a catene leggere; ISE rileva una CM, IgAλ.
La diagnosi clinica è di mieloma allo stadio iniziale. Dopo
un anno CE evidenzia un picco ben definito in zona beta e
IFE identifica una CM, IgAλ. Paziente 2: CE evidenzia un
picco in zona beta; IFE rileva una CM, IgAλ. La diagnosi
clinica è di mieloma. Dopo chemioterapia CE evidenzia
ipogammaglobulinemia e una lieve anomalia in zona beta,
IFE rileva una banda costituita da catene pesanti α non
associata a catene leggere; ISE evidenzia una CM, IgAλ.
Conclusioni: Le nostre osservazioni indicano che
l’antisiero anti-catene leggere λ, usato nella IFE, non è
in grado di rilevare le catene leggere λ quando la CM è
di modesta entità; si può supporre che gli anticorpi anticatene leggere λ, impiegati da IFE, abbiano una bassa
sensibilità o avidità o che gli epitopi verso cui sono diretti
siano in parte alterati; solo quando la CM è presente
in più elevata concentrazione l’antisiero è in grado di
legare gli epitopi delle catene leggere λ e quindi evidenzia
la immunoglobulina completa. IFE, identificando solo
le catene pesanti α senza catene leggere associate,
suggerisce erroneamente una diagnosi di malattia da
catene pesanti. Considerando che le immunoglobuline
monoclonali IgAλ si osservano nel 20-25% dei mielomi
e che la dimensione del picco non esclude un mieloma
è bene procedere alla identificazione della CM con ISE
quando IFE evidenzia solo le catene pesanti per orientare
verso una corretta diagnosi.
Sezione di Biochimica Clinica, Dipartimento di Scienze
della Vita e della Riproduzione, Università di Verona,
Italy
2
Divisione di Chirurgia Generale A, Dipartimento di
Scienze Chirurgiche, Università di Verona, Italy
Background: Cholangiocarcinoma (CCA), is typically
suspected in the presence of signs of biliary obstruction,
with ultrasonography compatible with bile stricture or
mass. Ultrasonography and Computed tomography (CT)
are the first examinations, whereas the significance
of serum tumor markers remains controversial. Protein
induced by vitamin K absence or antagonist-II(PIVKA-II) is
an abnormal prothrombin protein that is found in the serum
of patients with Hepatocellular carcinoma (HCC). PIVKAII is an abnormal protein and some reports have indicated
the improved specificity of PIVKA-II in the diagnosis of
HCC. Few reports investigated the role of PIVKA II in the
management of CCA. Aim of this study was to evaluate the
performance of PIVKA-II in patients with CCA and HCC
undergoing radical tumour ablation.
Methods: The expression of PIVKA-II in serum samples
from 35 patients (mean age 70 y) with histologically
confirmed CCA, 14 patients (mean age 65 y) with
histologically confirmed HCC and 20 patients (mean
age 58 y) with choledocholithiasis (i.e., controls) were
assessed using the commercial PIVKA-II on Lumipulse
G1200 (Fujirebio, Japan) All sample were collected 1
week before tumor ablation.
Results: The within run coefficients of variations of PIVKAII at different concentrations (a=30 AU/L, b=46 AU/L,
c=201 AU/L, d=807 AU/L, e=7496 AU/L), were: 3.51%,
1.78%, 1.75%, 1.45%, 1.26% respectively. The assay
was proven linear in a range of PIVKA-II concentrations
comprised between 5 and 600 AU/L, as confirmed by
the linear regression analysis (y = 1.01x -7.2) and the
relative correlation coefficient (r=0.9998, p <0.001). The
geometric mean ± standard error of the mean (SEM)
of PIVKA-II concentrations measured in CCA, HCC and
controls patients were 64±206 AU/L, 1011±1883, 52±48
AU/L respectively. When compared to healthy controls,
PIVKA concentration appeared significantly increased in
HCC patients (p<0.01). No significant differences were
observed between CCA patients and controls (p=0.20)
Conclusion. The PIVKA-II test is simple to perform,
reproducible, and could be a promise tool in the
management of HCC patients and probably helpful for
detecting cholangiocarcinoma only in a selected high-risk
group patients.
474
Lab. Analisi, Ospedali Riuniti, Ancona
P091
PANCREATIC DISEASES AND VITAMIN D
DEFICIENCY
1
1
1
A. Barassi , C.A.L. Damele , R. Stefanelli , A.
1
2
1
Flaminio , R. Pezzilli , G.V. Melzi d'Eril
1
Central Laboratory, Department of Health Sciences,
San Paolo Hospital, University of Milan, Milan, Italy
2
Pancreas Unit, Department of Digestive Diseases
and Internal Medicine Sant’Orsola-Malpighi Hospital,
University of Bologna, Bologna, Italy
Background: There are no extensive data on the
comparative evaluation of 25-hydroxyvitamin D (VIT D)
serum levels in patients with chronic benign and malignant
pancreatic diseases. We evaluated serum VIT D levels
in patients with chronic pancreatitis (CP), pancreatic
adenocarcinoma (PA) and in healthy subjects (HS).
Methods. Sixty-nine consecutive subjects were studied:
20 patients with a firm diagnosis of CP (12 M, 8 F;
mean age 56.0 yrs, range 25-74; 14 were alcohol drinkers
and 12 were smokers; 12 had calcifications and 5
diabetes mellitus; 6 were studied during a flare of CP), 20
histologically confirmed PA (11 M, 9 F; age 63.5 yrs, range
47-80; 5 patients were alcohol drinkers, 3 were smokers
11 had diabetes; all patients had pancreatic pain); 29 HS
(13 M, 16 F; mean age 59.5 yrs, range 44-75). Serum
VIT D levels were measured using chemiluminescence
assay (CLIA)(DiaSorin, Italy). VIT D levels were normally
distributed and ANOVA test was applied to analyse
the data. In addition, fecal pancreatic elastase-1 (FE),
as marker of exocrine pancreatic insufficiency (ScheBo
Biotech AG, Germany), was also measured in patients
with pancreatic diseases. Results. The 3 groups of
subjects were comparable for sex (P=0.554) and age
(P=0.107); exocrine pancreatic insufficiency (FE <200
µg/g) was present in 14 patients with CP and in 1
patient with PA (P <0.001). Serum VIT D was significantly
different among the 3 groups of patients studied (mean
±SD; 10.9±8.1 ng/mL in CP patients, 12.5±5.6 ng/mL
in PA patients and 23.6±8.3 ng/mL in HS; P <0.001).
CP and PA patients had similar VIT D serum levels
(P=0.258) and these levels were significantly lower than
those of HS (P <0.001). Taking into consideration clinical
parameters such as the disease (CP, PA, HS), sex,
exocrine pancreatic insufficiency, alcohol, smoking habit,
pancreatic calcifications, pain and diabetes mellitus, only
the type of the disease (i.e. CP or PA) at univariate
analysis was significantly associated with low VIT D levels
(P=0.036). Conclusions. Low VIT D levels are associated
with chronic diseases of the pancreas, but the mechanism
should be elucidated because these low levels are not
associated with sex, exocrine pancreatic insufficiency,
alcohol and smoking habit, pancreatic calcifications, pain
and diabetes mellitus.
P092
SMAD-4 RELATED AND UNRELATED SOLUBLE
FACTORS AND EXOSOMES CO-OPERATE IN
DETERMINING PDAC IMMUNOEVASION
1
1
1
1
E. Gnatta , A. Aita , P. Fogar , A. Padoan , G.
1
1
1
1
Pantano , D. Bozzato , S. Moz , F. Navaglia , E.
1
1
2
1
Greco , C. Zambon , S. Pedrazzoli , M. Plebani , D.
1
Basso
1
Department of Medicine – DIMED, University of
Padova, Italy
2
Associazione Wirsung Onlus, Padova, Italy
Context: Genetic aberrations, including Smad4
inactivation,
and
tumor-piloted
immunoevasion,
characterized by myeloid derived suppressive cells
(MDSCs) expansion and dendritic cells (DCs) inhibition,
concur in worsening PDAC prognosis.
Objective: To verify whether PDAC affects immune cells in
a Smad4-dependent manner and whether tumor-derived
exosomes (Ex) play a part.
Methods: Two pancreatic cancer cell lines were
used: BxPC3 (Smad4 Homozygous Deletion, HD) and
Smad4-transfected BxPC3 (BxPC3-Smad4+). 1%FCSConditioned media (CM) were obtained from these
cell lines. Peripheral blood mononuclear cells from
10 blood donors were cultured (4 days) in
unfractioned control medium, BxPC3/CM and BxPC3Smad4+/CM, and in Ex-enriched (pellet), or Ex-free
(supernatant) media (ultracentrifugation at 100000 g
for 1h). CD4+,CD8+,CD4+CD25+ T-cells, DCs (CD11b
+CD14+DR-) and two MDSCs subsetes (CD11b+CD14DR+=mMDSCs; CD11b+CD14-DR-=gMDSCs) were
FACS analysed. Exosomes enrichement and deprivation
were confirmed by western blot (Alix and tsg 101).
Results: BxPC3/CM and BxPC3-Smad4+/CM decreased
CD8+ with respect to control (p <0.05) and BxPC3/CM
(p <0.05). Ex-enriched BxPC3-Smad4+/CM replicated the
inhibitory effects on CD4+ cells (p <0.05). With respect to
control, BxPC3-Smad4+/CM reduced mMDSCs (p <0.05)
and expanded gMDSCs (p <0.05). The effect on mMDSCs
was not reproduced by Ex-free or Ex-enriched media. By
contrast, the whole media stimulatory effect on gMDSCs
was reproduced by Ex-enriched (p <0.05), not by Exfree media (p:ns). Ex-enriched BxPC3/CM also expanded
gMDSC (p <0.05), while Ex-free BxPC3/CM reduced the
same cellular population (p <0.05). Whole BxPC3/CM was
ineffective on gMDSC (p:ns). DCs were unaffected by
both BxPC3 and BxPC3-Smad4+ entire and fractionated
CM.
Conclusions: Smad4-associated exosomes modulate
PDAC effects on immune cells. PDAC inhibition of CD4+
T-cells is Smad4-dependent and Ex-mediated. Exosomes
transfer also PDAC-associated signals leading to gMDSC
expansion, which is counteracted by soluble mediators
released by cells with Smad4 HD.
475
P093
AUTOMATED ANALYSIS OF DNA DOUBLE STRAND
BREAKS IN HUMAN LYMPHOCYTES BY INDIRECT
IMMUNOFLUORESCENCE: A NEW EVALUATION OF
DNA DAMAGING CANCER THERAPY
1
2
2
3
C. Bonaguri , A. Melegari , T. Trenti , S. Buti , M.
3
4
1
1
Bersanelli , D. Campioli , A. Russo , R. Buonocore , A.
1
1
2
1
Picanza , R. Perini , B. Venturelli , G. Lippi
1
Diagnostic Lab. Dep., Parma Hospital, Parma, Italy
Diagnostic Lab. Dep., NOCSAE Hospital, Modena, Italy
3
Oncology Dep., Parma Hospital, Parma, Italy
4
Diagnostic Lab. Dep., Policlinico Hospital, Modena, Italy
2
Background: The analysis of γ-H2AX foci is a technique
that allows to reliably identify DNA double-strand breaks
(DSBs). The indirect immunofluorescent analysis of γH2AX foci in cell nuclei is available as a complete manual
procedure, but is time consuming and poorly reproducible.
Aim: We aimed to assess the γ-H2AX foci in a pilot study
for identifying patients with DSB repair deficiencies, which
may be oversensitive to DNA invasive chemotherapy.
Methods: The evaluation included 11 patients with
solid tumour compared with 11 age-matched controls.
DSBs were assessed by counting γ-H2AX foci in
blood lymphocytes, after optimisation of isolation
method. The measurement of γ-H2AX foci was
performed on AKLIDES platform using a proprietary
software, specifically developed for automated analysis
of cell-based immunofluorescence assays. Quantitative
parameters that characterized the degree of cell damage
included the average number of foci per cell and
the percentage of cells with foci. The following drugs
cancer therapies were studied: carboplatin (n=4), sunitinib
(n=4) and irinotecan (n=3) in association with 5FU and
cetuximab or bevucizumab. We also tested etoposide
“ex vivo”, aiming to standardize the AKLIDES assay and
hence confirming the “in vivo “effect as dose and time–
dependent in foci formation.
Results: As formerly described in “in vitro”studies, we
observed no significant influence of “in vivo” treatment
with carboplatin or sunitinib and the average number
of DSBs in cancer patients compared to age-matched
controls . Conversely, we detected a significant increase
in foci formation after treatment with irinotecan. It is
noteworthy that in sequential treatment the number of
damaged cells increases remarkably after administration
of the second cycle of chemotherapy, thus making it
difficult to precisely identify the number of DSBs. This
phenomenon is similar to that observed in “ex vivo” studies
based on administration of increasing doses of etoposide.
Conclusions: These findings pave the way for application
of γ-H2AX focus assay to estimate individual drug
sensitivity in patients undergoing chemotherapy. We also
confirmed the need for standardization and automation of
γ-H2AX foci analysis, thus making it possible to translate
laboratory data into clinics.
476
P094
VALIDATION OF PROSTATE CANCER BIOMARKERS
AND INFLAMMATION: A PROTEOMICS STUDY
1
1
1
S. Bergamini , E. Bellei , A. Cuoghi , L. Reggiani2
4
4
4
Bonetti , F. Borelli , M.C. Sighinolfi , G. Bianchi , T.
3
1
Ozben , A. Tomasi
1
Department of Diagnostic Medicine, Clinic and Public
Health, (Proteomics) Univ. of Modena e Reggio Emilia
2
Department of Diagnostic Medicine, Clinic and Public
Health, (Pathology), Univ. of Modena e Reggio Emilia
3
Dep. of Biochemistry, Medical Faculty, Akdeniz Univ.,
Antalya, Turkey
4
Division of Urology, Univ. Hospital of Modena and
Reggio Emilia
Background: In this study serum protein profiles were
analyzed in order to investigate possible confounding
parameters in the discrimination between prostate cancer
(PCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH).
Methods: Patients with clinical suspect of PCa and
candidates for trans-rectal ultrasound guided prostate
biopsy (TRUS) were enrolled. Histological specimens
were examined in order to identify PCa, BPH and
detect inflammation. Surface Enhanced Laser Desorption/
Ionization-Time of Flight-Mass Spectrometry (SELDIToF-MS) and two-dimensional gel electrophoresis (2DE) coupled with Liquid Chromatography-MS/MS (LCMS/MS) were used to analyze immuno-depleted serum
samples from patients with PCa and BPH.
Results: The comparison between PCa (in the presence
or absence of inflammation) and BPH (also in the
presence or absence of inflammation) serum samples
performed by SELDI-ToF-MS analysis, did not show
differences in protein profiles. Differences became evident
when the presence of inflammation was taken into
consideration. When samples with histological sign of
inflammation were excluded, 20 significantly different
protein peaks were detected. Subsequent comparisons
(PCa with inflammation vs PCa without inflammation,
and BPH with inflammation vs BPH without inflammation)
showed that 16 proteins appeared to be differently
expressed in the presence of inflammation, while 4 protein
peaks were not modified. With 2-DE analysis, comparing
PCa without inflammation vs PCa with inflammation,
and BPH without inflammation vs the same condition
in the presence of inflammation, were identified 29 and
25 differentially expressed protein spots, respectively.
Excluding samples with inflammation the comparison
between PCa vs BPH showed 9 unique PCa proteins, 4
of which overlapped with those previously identified in the
presence of inflammation, while other 2 were proteins, not
identified in the previous comparisons.
Conclusions: This study indicates that inflammation
might be a confounding parameter during the search
of candidate proteomic biomarkers of PCa. The results
indicate that inflammation represents a significant
confounding factor, hence, only a well-selected protein
pattern should be considered as a potential biomarker of
PCa.
P095
AN ACCURATE DIAGNOSIS BY CALCITONIN
MEASUREMENT IN ASPIRATION NEEDLE
WASHOUT
1
1
2
M. Monari , R. Assandri , L. Cozzaglio , M.
2
3
1
Gusmeroli , L. Di Tommaso , A. Montanelli
1
Clinical Investigation Laboratory, Humanitas Clinical
and Research Center, Rozzano (MI)
2
Division of Surgical Oncology, Humanitas Clinical and
Research Center, Rozzano (MI)
3
Department of Medical Biotecnologies and
Translational Medicine, University of Milan School of
Medicine and U.O. Anatomia Patologica, Clinical and
Research Center, Rozzano (MI)
Objective: Serum Calcitonin (CT) is a highly sensitive
marker for medullary thyroid carcinoma (MTC), but for
value <100 pg/mL, this accuracy decreases. Furthermore
fine needle aspiration (FNA) for cytology has a poor
sensitivity in detecting MTC, ranging from 45 to 63%.
Aim of this case presentation is to show the role of
Calcitonin measurement in aspiration needle washout
(FNA-CT) in special clinical setting when serum Calcitonin
and cytology give a doubt of MTC in a multi nodular goiter.
Material and methods: We report the story a 73 years
old female with an accidental diagnosis of thyroid goiter.
Ultrasonography showed of the right lobe 3 centimeter
isoechoic, solid nodule, with microcalcifications, IIIb
pattern of vascularization; the left lobe was interested
by multiple hypoechoic nodules, the largest being 8
millimeters. The biochemical test showed: normal thyroid
function, negative antibodies against thyroid antigens,
persistent elevated level of basal CT (154 and 169 pg/
mL). Serum calcitonin (CT) and FNA-CT were performed
by CMIA assay (Calcitonin II-Generation Diasorin®,
Saluggia, Torino, Italy).
Results: FNA showed ephitelial cells with abundant
cytoplasm, hyperchromatic nuclei, arranged in clusters.
After aspiration, needle and syringe were washed in 1
ml of normal saline solution, and the resulting samples
were employed for CT measurement: it was 7.62 pg/mL
suggesting the probably presence of MTC.
Patient underwent total thyroidectomy and lymph node
central neck dissection. The pathological specimen
demonstrated a follicular carcinoma of the right lobe (pT2)
and a medullary carcinoma of the left lobe (pT1). During
the thyroidectomy a new FNA-CT of the nodule at the
right lobe was performed and the level of CT was again
elevated: 4.68 pg/mL.
Conclusions: Our case shows that FNA-CT is an useful
tool in differential diagnosis of MTC in presence of
multinodular goiter when serum CT and cytology are not
fully exhaustive. Furthermore intraoperative FNA-CT can
be performed in order to obtain a rapid interpretation about
the nature of suspected nodules.
Trimboli P, Cremonini N, Ceriani L, et al. Calcitonin
measurement in aspiration needle washout fluids has
higher sensitivity than cytology in detecting medullary
thyroid cancer: a retrospective multicentre study. Clin
Endocrinol (Oxf) 2014;80:135-40.
P096
DETECTION OF BRAFP.V600E AND P.V600K
MUTATIONS IN MALIGNANT MELANOMA:
DO MUTATIONS LEAD TO DISTINCT
IMMUNOHISTOCHEMICAL AND CLINICAL
FEATURES?
1
3
3
3
G. Ponti , G. Pellacani , M. Maccaferri , L. Benassi , A.
2
2
1
Maiorana , A. Cesinaro , A. Tomasi
1
Dept. of Diagnostic Medicine, Clinic and Public Health,
University Hospital of Modena, University of Modena and
Reggio Emilia
2
Div. of Pathology, University Hospital of Modena,
University of Modena and Reggio Emilia
3
Div. of Dermatology, University Hospital of Modena,
University of Modena and Reggio Emilia
BRAF mutations have been detected in about 60%
malignant melanomas. The most common mutations
are BRAFV600E (80%) and BRAFV600K (10-30%).
The assessment of BRAF pV600 mutational status has
become necessary for evaluating molecular targeted
treatment options of patients with advanced malignant
melanoma using BRAF/MEK inhibitors. BRAF mutational
status is usually determined by direct sequencing.
Although the detection of Vp600E mutation by
immunohistochemistry (IHC) was clearly described in
melanoma and other tumor types, discordant evidences
were reported for the detection of V600K and V600R
BRAF mutations.
The aim of the study was to evaluate the efficacy
of BRAFp.V600E, V600K and V600R detection by
immunohistochemistry in melanoma. Moreover, we tried
to investigate the distinctive clinical features of those more
common mutations.
IHC with VE1 antibody was performed on tissue samples
taken from 18 patients with metastatic melanomas
with known BRAF mutational status: p.V600E (n.6),
p.V600K (n.7), p.V600R (1), and wt (n.4). Sanger
sequencing analyses was performed on all samples to
determine the BRAF mutational status. Two independent
pathologists, blinded to all biomolecular data, evaluated
all immunostained slides. In this cohort, the concordance
rate between IHC analyses was 100% (5/5) for V600E
mutation. The only BRAF V600R mutated melanoma was
reported as positive. Differently, the 7 BRAF p.V600K
mutated melanomas were scored as VE1 negative by both
observers. Regarding immunohistochemistry, all cases
had a very high inter-observer reproducibility. From the
clinical point of view, V600K mutated melanomas were
significantly associated with older age, male sex and worst
clinical outcome.
Our findings suggest that immunohistochemistry could be
proficiently adopted as a first step for the detection of
BRAFV600E and V600R mutation in the initial selection
of patients with advanced melanomas as candidates for
BRAF inhibitors. This should be followed by molecular
biology techniques in V600E negative melanomas, for
the specific search of potential V600K and other nonV600E BRAF mutations. Immunohistochemistry allows a
quick and cost-effective screening for BRAF mutations,
compared to molecular sequencing.
477
P097
PROFILO SIEROPROTEOMICO E VALUTAZIONE
SIERICA DELLA GALECTINA 3 IN PAZIENTI CON
PATOLOGIA NODULARE TIROIDEA TIR 3
P098
STUDIO DEI LIVELLI DI MARCATORI TUMORALI
NEL LIQUIDO PLEURICO
1
1
2
3
V.M. Garrisi , G. Achille , S. Russo , V. Cafagna , A.
1
1
2
1
Atlante , M.D. Carbonara , L. Grammatica , I. Abbate
A. De Stefano , S. Elia , U. Morandi , A. Vetrani , S.
4
1
2
1
Griffo , R. Massoud , A. Stefani , C. Cortese , P.
1
1
Casalino , G. Petrella
1
1
1
2
2
1
U.O.S.D. Patologia Clinica e Sperimentale, IRCCS
Istituto Tumori "Giovanni Paolo II", Bari
2
U.O.C. Otorino Laringoiatria e Chirurgia Cervico-Maxillo
Facciale, IRCCS Istituto Tumori "Giovanni Paolo II", Bari
L’agoaspirato (FNA) eco-guidato per lo studio citologico
è la metodica diagnostica più accurata nella definizione
della patologia nodulare tiroidea. Il referto del citoaspirato
è determinante per decisioni sul trattamento chirurgico.
Circa il 70% delle FNA sono classificate come benigne
(Tir 2), il 5% maligne (Tir 5) o sospette (Tir 4), il 10%
indeterminate (Tir 3) ed il 10-20% come non diagnostiche
(Tir 1). Si definiscono “indeterminati” i preparati citologici
che non consentono di distinguere in modo netto la
natura benigna o maligna della lesione. Il 20% circa dei
TIR3 si rivela di natura maligna all’esame istologico. La
ripetizione della FNA non è raccomandata perché può
creare confusione e non fornisce informazioni ulteriori utili
alla gestione clinica.
La proteomica studia la componente proteica
dell’organismo umano con particolare attenzione alla
frazione peptidica a basso PM. Tra queste piccole
molecole o prodotti di degradazione di proteine originate
dalla neoplasia o dal microambiente peritumorale
potrebbero celarsi potenziali biomarcatori tumorali. A
questo scopo, abbiamo studiato, con tecnologia SELDI
TOF - Mass Spectrometry, il profilo proteomico nel range
0-30 KDa su 96 campioni di cui 28 pazienti TIR 1-3, 48 TIR
2 e 20 TIR 5. Per questi stessi campioni abbiamo valutato
con tecnica ELFA (BIOMERIEUX) anche la Galectina 3
una glicoproteina derivata dai macrofagi, il cui ruolo in
immunositochimica delle patologie tiroidee è stato già
ampiamente descritto.
Il profilo proteomico di tutti i 96 campioni analizzati
in doppio, ha rivelato la presenza di 8 picchi
differenzialmente espressi in maniera statisticamente
significativa. Di questi, il picco proteico con PM 17068 Da
aveva la ROC - AUC migliore (P-value <0,05; AUC=0,64).
Sulla base del cut-off di espressione (0,228 µA) di
tale peptide, 7 su 8 pazienti TIR1-3 confermati poi
come neoplastici dall’esame istologico, avevano un valore
superiore (88%).
L’espressione sierica di Galectina–3 negli stessi
campioni non è sembrata correlata significativamente (Pvalue=0,09) nè con le dimensioni del nodulo, nè con
l’interessamento linfonodale.
Ulteriori studi di purificazione e caratterizzazione del picco
con PM 17068 Da permetteranno di chiarirne identità e
ruolo nella patologia nodulare tiroidea.
Garrisi VM, et al. Expert Rev Proteomics 2008;5:779-85.
478
Dip.di Medicina Sperimentale e Chirurgia, Università
Tor Vergata di Roma
2
Dip. di Scienze Mediche e Chirurgiche, Università di
Modena e Reggio Emilia
3
Dip. di Scienze Biomorfologiche, Università Federico II
di Napoli
4
Dip. di Scienze Chirurgiche, AnestesiologicheRianimatorie e dell'Emergenza, Università Federico II di
Napoli
I Versamenti pleurici maligni rappresentano una causa
importante di mortalità e morbilità associata al cancro del
polmone. Una diagnosi precoce mediante procedure miniinvasive rappresenta un punto essenziale nella gestione
evolutiva della malattia. L’applicazione di un pannello
di marcatori tumorali è stata proposta come alternativa
meno invasiva per la caratterizzazione dei versamenti
pleurici (1). Lo scopo di questo studio multicentrico è di
individuare cut-off diagnostici mediante determinazione di
biomarcatori neoplastici nel liquido pleurico e nel siero per
identificare i pazienti con cancro del polmone. Applicando
criteri di esclusione i campioni di liquido pleurico e di
plasma erano ottenuti da 112 pazienti consecutivi (46 con
neoplasia maligna e 66 con patologia benigna) ricoverati
in tre ospedali universitari italiani sono stati analizzati
per la determinazione dei livelli di Ca 125, Cyfra 21.1,
NSE, CEA, M2PK. La diagnosi di versamento maligno
o non maligno è stata effettuata mediante citologia,
biopsia pleurica, toracoscopia e chirurgia toracica videoassistita (VATS). Lo studio di curve ROC è stato utilizzato
per individuare cut-off analitici, sensibilità e specificità
per ciascun marcatore. Dai dati ottenuti risulta che
I livelli dei marcatori tumorali presi in considerazione
sono significativamente più elevati nei versamenti maligni
rispetto ai versamenti non maligni. Il valore delle aree
sotto la curva (AUC) dei campioni di liquido pleurico è
superiore all’ AUC nel plasma per tutti i casi maligni.
Il marcatori con la miglior perfomance diagnostica in
entrambe le matrici biologiche sono risultati il Cyfra 21.1
(0,91 vs 0,695) e il CEA (0,836 vs 0,681). Lo studio
suggerisce che il dosaggio di un pannello di marcatori
tumorali nel liquido pleurico per le neoplasie del polmone
potrebbe completare l’iter diagnostico insieme all’esame
citologico, evitando di sottoporre i pazienti con sospetta
neoplasia a procedure invasive. Inoltre una corretta
applicazione di questi indicatori potrebbe essere utilizzata
come indice prognostico nel follow up di pazienti con
nota malignità già sottoposti a chirurgia e/o a chemioradioterapia.
1. Elia S, Massoud R, Guggino G, et al. Eur J Cardiothorac
Surg 2008;33:723-7.
P099
EVALUATION OF URINARY NICOTINAMIDE
N-METHYLTRANSFERASE: A NON-INVASIVE
DIAGNOSTIC TEST FOR BLADDER CANCER
P100
INTERFERENZA DA IOPAMIRO NELLA
IMMUNOSOTTRAZIONE IN ELETTROFORESI
CAPILLARE
G. Di Ruscio, G. Muzzonigro , V. Pozzi, D. Sartini , A.
Vici, P. Fulvi, G. Milanese, M. Emanuelli
V. Viola, M. Galeazzi, A. Frezzotti, P. Caprini, S.
Galeazzi
Dip. di Scienze Cliniche Specialistiche e
Odontostomatologiche, Università Politecnica delle
Marche, Ancona
Lab. Analisi, Ospedali Riuniti, Ancona
Urothelial carcinoma (UC) of the bladder represents the
most common malignant neoplasm of the urinary tract
and is a major cause of cancer-related death. Currently,
cystoscopy and urine cytology are the “gold standard”
for monitoring bladder UC. However, both procedures
have drawbacks and limitations. Conventional cystoscopy
is highly sensitive for most tumors but has high costs
and may lead to patient discomfort. Although urine
cytology has high specificity, its sensitivity is relatively low,
especially for low-grade tumors. Therefore, the search for
new and reliable biomarkers that could be used for early
and non-invasive detection of bladder UC are urgently
needed.
Nicotinamide N-methyltransferase (NNMT) is a cytosolic
enzyme that catalyzes the N-methylation of nicotinamide,
pyridines and other structural analogs, and has been
found to be overexpressed in several neoplasms. We
recently demonstrated NNMT upregulation in tumor tissue
samples and in a small cohort of urine specimens obtained
1
from patients with bladder UC .
In the present study, we evaluated NNMT expression
level in urinary exfoliated cells obtained from 55 patients
with bladder UC and 107 healthy donors, using RealTime PCR. The correlation between NNMT expression
levels and clinicopathological characteristics of patients
were determined using the Kruskal–Wallis and the Mann–
Whitney U test. Receiver operating characteristic (ROC)
curves and the area under the curves (AUC) were used
to identify the best cut-off value to discriminate bladder
UC patients from healthy subjects, and to evaluate the
diagnostic accuracy of the urine-based NNMT test.
Results obtained demonstrated that urinary NNMT
expression levels were significantly (p <0.05) higher
in patients with bladder UC compared with controls.
Moreover, a statistically significant (p <0.05) inverse
correlation was found between NNMT expression and the
histological grading. The ROC analysis showed that a ∆Ct
of 13.3 is the best cut-off value for NNMT, associated with
the highest combination of sensitivity (84%) and specificity
(84%). The AUC value was 0.913 (p <0.05), indicating the
excellent diagnostic accuracy of the urine-based NNMT
test.
Our data indicate that NNMT may represent a useful
biomarker for the early and non-invasive detection of
bladder cancer.
1. Sartini D, et al. Cell Biochem Biophys 2013;65:473-83.
Introduzione: L'elettroforesi capillare (CE) separa le
frazioni proteiche, sotto influenza di in un campo
elettrico, con assorbanza a 200nm. I mezzi di contrasto,
utilizzati in alcune indagini strumentali che assorbono alla
stessa lunghezza d’onda, possono interferire causando
la presenza di un picco anomalo. L'immunosottrazione
in elettroforesi capillare (ISE) viene spesso utilizzata per
escludere in questi casi la presenza di una componente
monoclonale (CM).
Materiali e metodi: In due pazienti sottoposti a indagine
strumentale con mezzo di contrasto iodato, iopamiro 300
(iopamidolo), la CE (Capillarys Sebia) evidenzia un picco
anomalo; la caratterizzazione del picco viene eseguita
con ISE (Capillarys Sebia) e con immunofissazione (IFE)
(Hydrasys Sebia).
Risultati: Paziente sottoposto a coronarografia: dopo circa
un giorno CE evidenzia un picco anomalo in zona gamma;
ISE rileva due CM, IgAk e IgMk. IFE identifica una CM,
IgMk. Dopo due giorni CE evidenzia lo stesso picco
anomalo e sia ISE che IFE rilevano una CM, IgMk.
Paziente sottoposto ad arteriografia: dopo circa un giorno
CE evidenzia un picco anomalo in zona beta; ISE rileva
due CM, IgAk e IgMk. IFE non evidenzia nessuna CM.
Dopo tre giorni CE non evidenzia nessun picco anomalo
e sia ISE che IFE risultano negative.
Conclusioni: I picchi evidenziati da CE in zona gamma
e beta sono da attribuire alla permanenza in circolo di
iopamiro e alla coincidenza del tempo di eluizione e
dello spettro di assorbanza con la frazione proteica; i
risultati prodotti da ISE che identificano due CM, non sono
stati confermati da IFE che ha escluso la presenza di
una CM, IgAk, nel primo caso e non ne ha evidenziata
nessuna nel secondo. Si può supporre che il mezzo
iodato ha ritardato il tempo di eluizione dei complessi
con anticorpo anti-catene pesanti α e µ e con anticorpo
anti-catene leggere k. La interferenza da iopamiro può
essere confusa con una immunoglobulina monoclonale
se a CE fa seguito solo ISE. Considerando che Il tempo
di dimezzamento dello iopamiro è di 90-120 min con
eliminazione per via renale del 90% in circa 24 ore, è bene
fornire istruzioni precise che indichino di non prelevare
campioni di sangue per elettroforesi almeno nel giorno
successivo ad esami strumentali che utilizzano iopamiro
come mezzo di contrasto.
479
P101
NEUTROPHIL/LYMPHOCYTE RATIO AS PREDICTOR
OF NEW-ONSET ATRIAL FIBRILLATION IN
MYOCARDIAL INFARCTION WITH ST ELEVATION
PATIENTS
1
2
2
N. Botto , A. Mazzone , U. Paradossi , M.
2
1
1
2
Francini , M.S. Parri , S. Storti , F. Marchi , C.
2
2
2
1
Palmieri , S. Maffei , S. Berti , A. Clerico
1
U.O.C. Medicina di Laboratorio, Fondazione G.
Monasterio CNR-Regione Toscana, Osp. del Cuore,
Massa
2
U.O.C. Cardiologia Adulti, Fondazione G. Monasterio
CNR-Regione Toscana, Osp. del Cuore, Massa
Background: The Neutrophil/Lymphocyte ratio (N/L)
stands for the balance between neutrophil and
lymphocyte counts in the body and can be utilized as
an index for systemic inflammatory status. Recently, the
inflammatory status has been associated with new-onset
atrial fibrillation (NOAF) in acute myocardial infarction with
ST Elevation (STEMI).
Purpose. We evaluated the relation between admission
metabolic, inflammatory, ischemic biomarkers and newonset AF in a large STEMI population.
Methods: We retrospectively examined clinical and
laboratory data of 1071 consecutive STEMI patients
(ranging from 21 to 99 years) admitted to our Cardiology
Care for primary PCI from 2006 to 2011. The NOAF
was defined as AF that occurred during the index
hospitalization.
Results: New-onset AF was documented in 89 patients
with STEMI (8.3%; mean age 73.9±9.9 years; 67%
men). The NOAF group was older (p <0.0001) and
presented higher frequency of hypertension (p=0.009),
higher levels of troponin-I (p=0.02) and BNP (p <0.0001).
Regarding inflammatory markers, ESR (p=0.001),
fibrinogen (p=0.001), CRP (p <0.0001) and the N/L ratio (p
<0.0001) resulted significantly higher in the NOAF group.
After adjustment of confounding factors, the independent
predictors of NOAF were higher N/L ratio (OR=3.9,
p=0.01) and old age (OR=3.4, p=0.02).
Conclusions: Our results suggest that acute inflammatory
status and, in particular, admission elevated N/L ratio is
a strong predictor of new-onset AF in STEMI. The use
of this simple routine biomarker of systemic inflammation
may have potential therapeutic implication in preventing
the atrial arrhytmia and improving prognosis in STEMI
revascularized patients.
Parashar S, Kella D, Reid KJ, et al. New-onset atrial
fibrillation after acute myocardial infarction and its relation
to admission biomarkers (from the TRIUMPH registry).
Am J Cardiol 2013;112:1390-5.
480
P102
EVALUATION OF VITAMIN D IN PATIENTS WTH
ERECTILE DYSFUNCTION
1
2
1
G.V. Melzi d'Eril , p. Raffaele , C.A.L. Damele , R.
3
1
4
Stefanelli , G.M. Colpi , M. Corsi Romanelli , A.
1
Barassi
1
Lab. di Analisi, Osp. San Paolo, Dip. di Scienze della
Salute, Università degli Studi di Milano, Milano, Italy
2
Dip. di Malattie dell’Apparato Digerente e Medicina
Interna, Osp. Sant'Orsola-Malpighi, Alma Mater
Studiorum, Univ. degli Studi di Bologna, Bologna, Italy
3
ISES – Istituto per la Sterilità e la Sessualità, Milano,
Italy
4
U.O. Medicina di Laboratorio -1 Patologia Clinica,
IRCCS Policlinico San Donato, San Donato Milanese,
Milano, e Dip. di Scienze Biomediche per la Salute,
Università degli Studi di Milano, Milano, Italy
Introduction: Endothelial dysfunction has been
demonstrated to play an important role in pathogenesis
of erectile dysfunction (ED) and vitamin D deficiency is
deemed to promote endothelial dysfunctions. Objectives.
We aimed to evaluate the status of serum vitamin D in a
group of patients with ED.
Methods: Diagnosis and severity of ED was based
on the International Index of Erectile Function Score
(IIEF-5) and its aetiology was classified as arteriogenic
(A-ED), nonarteriogenic (NA-ED) and borderline (BLED) with penile echo-colour Doppler in basal condition
and after intracaversous injection of prostaglandin
E1. Serum vitamin D levels were measured using
by radioimmunoassay (RIA) double antibody assay
(DiaSorin, Italy) and serum PTH levels were measured
using 1-84 PTH chemiluminescence immunoassay
(DiaSorin, Italy).
Results: Fifty patients were classified as A-ED, 65 as NAED and 28 as ED-BL, for a total of 143 cases. Mean
vitamin D level was 21.3 ng/mL; vitamin D deficiency (<20
ng/mL) was present in 45.9% and only 20.2% had optimal
vitamin D levels. Patients with severe/complete ED had
vitamin D level significantly lower (p=0.02) than those with
mild ED. Vitamin level was negatively correlated with PTH
and the correlation was more marked in subjects with
vitamin D deficiency. Vitamin D deficiency in A-ED was
significantly lower (p=0.01) than in NA-ED patients. Penile
echo-colour-Doppler revealed that A-ED (PSV ≤25 cm/
sec) was more frequent in those with vitamin D deficiency
as compared to those with vitamin > 20 ng/dL (45% vs
24%; p <0.05) and in the same population median PSV
values were lower (26 vs 38; p <0.001) in vitamin D
subjects.
Conclusion: Our study shows that a significant proportion
of ED patients has a vitamin D deficiency and that
this condition is more frequent in patients with the
arteriogenic etiology. Low levels of vitamin D might
increase the ED risk by promoting endothelial dysfunction.
Men with ED should be analyzed for vitamin D levels and
particularly to A-ED patients with a low level a vitamin D
supplementation is suggested.
P103
ROLE OF SERUM GALECTIN-3 TO RENAL
FUNCTION IN PATIENTS WITH HEART FAILURE:
PRELIMINARY DATA
1
2
2
2
F. Di Serio , M. Iacoviello , V. Paradies , M. Leone , V.
2
2
2
2
Antoncecchi , F. Monitillo , A. Doronzo , G. Citarelli , R.
3
4
5
6
Valle , P. Caldarola , L. Gesualdo , N. Aspromonte
1
Clinical Pathology Unit, University-Hospital of Bari, Italy
2
Cardiology Unit, Department of Emergency and Organ
Transplantation, University-Hospital of Bari, Bari, Italy
3
Cardiology Unit, Chioggia Hospital, Chioggia, Italy
4
Cardiology Unit, “San Paolo” Hospital, Bari, Italy
5
Nephrology Unit, Department of Emergency and Organ
Transplantation, University-Hospital of Bari, Bari, Italy
6
Cardiology Unit, “San Filippo Neri” Hospital, Rome, Italy
Galectin-3 (Gal-3) is a novel biomarker which has been
demonstrated to be related to inflammation status, fibrosis
and worse prognosis in patients affected by chronic
heart failure (CHF). Moreover, it has been shown an
independent relationship between Gal-3 and glomerular
filtration rate (GFR). In order to better clarify define
the role of Gal-3 in renal impairment, we sought to
evaluate its relationship with microalbuminuria in a
®
group of CHF outpatients. Biomerieux VIDAS serum
Galectin-3 (Enzyme-Linked Fluorescent Assay/ELFA)
method, was used. We enrolled outpatients with CHF,
in stable clinical conditions and in conventional therapy.
All patients underwent a clinical evaluation, a routine
chemistry and an echocardiogram. Normalbuminuria,
microalbuminuria and macroalbuminuria were defined as
the urinary Albumin/Creatinine Ratio (UACR) of <30,
30 to 299, and ≥300 mg/g. Out of seventy patients,
6 (9%) were excluded because of the presence of
macroalbuminuria (UACR >300 mg/g). The remaining 64
patients (91% males, 64±13 years, NYHA class 2.4±0.7,
LVEF 32±9%) were enrolled. Forty-four percent among
these were affected by ischemic cardiomiopathy, 28%
by diabetes mellitus, 59% by arterial hypertension and
19% by atrial fibrillation. Mean estimated glomerular
filtration rate (eGFR, CKD-EPI Creatinine Equation) was
73 ± 26 mL/min/1,73 m2, mean NT proBNP value
1876±2397 pg/mL and mean Gal-3 level 16,7±7,7 ng/
mL. Patients with microalbuminuria, when compared
to patients with normoalbuminuria, showed significantly
higher levels of Gal-3 serum levels (21.9±10.3 vs
14.1±4.1 ng/mL; p <0.001). Moreover, at multivariate Cox
regression analysis only log-Gal-3 (OR 1.51, 95% CI:
1.11-2.08; p: 0.009) remained significantly associated to
microalbuminuria but not the other univariate predictors
(i.e. ischemic cardiomyopathy, left ventricular ejection
fraction, GRF and NTproBNP).
Our findings suggest that Gal-3 serum levels
are significantly and independently correlated to
microalbuminuria in CHF outpatients, thus providing new
data useful to better clarify the association between Gal-3
and chronic kidney disease in these patients.
Van Kimmenade RRJ, Januzzi JL. Emerging biomarkers
in heart failure. Clin Chem 2012;58:127-38.
P104
ASSESSING THE ROLE OF BNP IN THE RISK
PREDICTION IN PEDIATRIC CARDIAC SURGERY
1
1
1
1
S. Storti , M. Cantinotti , M.S. Parri , A. Andrenelli , V.
1
1
1
1
Zanetti , R. Lombardi , B. Murzi , R. Moschetti , S.
2
2
Molinaro , A. Clerico
1
Fondazione Toscana G. Monasterio, Massa, Italy
Scuola Superiore Sant’Anna, Pisa, Italy
2
Background: Brain natriuretic peptide (BNP) use in
pediatrics is still controversial. Aim: to test whether BNP
may improve risk prediction in pediatric cardiac surgery.
Methods: BNP was measured in 587 pediatric
patients (318 males, 269 females, median age 6.3
months, 1.2-35.9 months), BNP preoperatively, every
postoperative day in ICU and before discharge. Primary
outcome: major complications and ventilator assistance
>15 days. A base risk prediction model was fitted using
Cox proportional hazards model with age, Aristotle-score
and body surface area (BSA) as continuous predictors.
A second model was build adding to the base model
cardiopulmonary-bypass time and arterial lactate at the
end of operation. At both the models was then added peak
post-operative log-BNP. Analysis to test discrimination,
calibration, and reclassification has been performed.
Results: Expressing age into two categories, neonates
(aged 0-30 days) and children (aged 1 month-18 years),
two patterns of BNP kinetics were observed: in neonates
BNP significantly dropped after surgery (p <0.001)
remaining below baseline values (p <0.001); in older
children BNP increased post-surgery peaking at 60h
(p <0.001) decreasing thereafter and remaining still
higher than baseline level (p <0.001). In the overall
population, both preoperative and postoperative BNP
values were significantly correlated with BSA, Aristotle
score, and with outcome parameters, including intubation
and inotropic time, duration of ICU stay. Furthermore,
a significant association between BNP value before and
after surgery (at 12 hours) was found (rho=0.69, p
<0.001). Hazard ratios (HR) for peak-BNP were highly
significant (base-model HR=1.40, p=0.006, second model
HR=1.44, p=0.008), log-likelihood improved with the
addition of BNP at 12 hours (p=0.006; p=0.009). The
adjunction of peak-BNP also significantly improved the
area under the ROC curve (base-model and secondmodel: p <0.001). The adjunction of peak-BNP also
resulted a net gain in reclassification proportion (base
model NRI=0.089, p <0.001; second model NRI=0.139,
p=0.003).
Conclusions: BNP may improve the risk prediction in
pediatric cardiac surgery and help the development of new
guidelines supporting the routine use of BNP in pediatric
cardiac surgery.
481
P105
VALUTAZIONE DELL’INTERFERENZA
DELL’EMOLISI SUL NUOVO DOSAGGIO DI
TROPONINA I AccuTnI+3 (BECKMAN-COULTER)
P106
NEUROHORMONAL BIOMARKERS AND
GALECTIN-3 IN NON-ISCHEMIC DILATED
CARDIOMYOPATHY
R. Dittadi, M. Gion
A. Del Franco , G. Vergaro , S. Cardile , S. Masotti , M.
2
1
2
1
Franzini , C. Prontera , A. Clerico , M. Emdin
Lab. Analisi, Osp. dell'Angelo, Mestre - Venezia
L’arrivo in laboratorio di campioni emolizzati è un evento
che si presenta con relativa frequenza. Il dosaggio della
Troponina è generalmente considerato moderatamente
sensibile a questo tipo di problematica analitica, ma con
effetti fortemente metodo-dipendenti (1).
Scopo dello studio è stato quello di valutare il grado di
influenza dell’emolisi sulla nuova release del dosaggio
della Troponina I (AccuTnI+3) recentemente messo in
commercio da Beckman Coulter.
Sono stati utilizzati 13 campioni in plasma eparinato con
un range di Troponina I da 0.02 a 5.01 ng/L. Aliquote con
diversi gradi di emolisi per ciascun campione (da 0.2 a 11
g/L di emoglobina) sono state preparate per aggiunta di
emolisato, ottenuto mediante un ciclo di congelamentoscongelamento e successiva centrifugazione di sangue
intero autologo dove è stata misurata la concentrazione
di emoglobina (Hb).
Per ogni campione i risultati sono stati confrontati con
il dato del campione non emolizzato (valore base),
e le differenze sono state considerate significative se
superavano la variazione "analitica" (valore base ± 2ds)
calcolata sulla base dell’imprecisione attesa secondo
il profilo di imprecisione del metodo, e/o la variazione
"biologica" valutata come bias desiderabile sulla base
della variabilità biologica su campioni di plasma (2).
A qualsiasi grado di emolisi i risultati rientrano all’interno
della variazione biologica. L’intervallo di variazione è
stato +12% / -16%, tranne in due casi (nelle aliquote
con Hb >4 g/L). A livelli di Hb >1g/L, 4 casi mostrano
una diminuzione significativa sulla base del criterio più
restrittivo della variazione analitica. Sono 4 dei 6 casi con
valori di Troponina I maggiori di 0.7 ng/L.
In conclusione sembra che il metodo AccuTnI+3
sia particolarmente robusto all’interferenza da emolisi.
Nessuno dei campioni valutati ha superato il bias
desiderabile, e solo in caso di campioni con forte
emolisi può essere opportuno consigliare la ripetizione del
campione per avere la sicurezza di rientrare nell’ambito
della imprecisione analitica.
1. Lippi G, Caputo M, Banfi G, et al. Raccomandazioni di
consenso SIBioC-SIMeL per la rilevazione e gestione dei
campioni emolisati e utilizzo dell’indice di emolisi. Biochim
Clin 2011;35:481-90.
2. http://www.westgard.com/biodatabase1.htm (ultimo
accesso: 10 giugno 2014).
482
1
2
1
2
1
Fondazione Toscana G. Monasterio, Pisa
Scuola Superiore Sant'Anna, Pisa
2
Background: Galectin-3, a β-galactoside binding lectin,
is involved in the mechanisms of cardiac fibrosis and
remodelling. In recent years, galectin-3 has shown to
be a useful prognostic marker in chronic heart failure
(HF) patients, but clear data are currently lacking
on the relation between galectin-3 and neurohormonal
profile in patients with systolic HF. Our aim was to
test the association between galectin-3 and a panel of
neurohormonal biomarkers in a cohort of patients with
non-ischemic dilated cardiomyopathy (DCM).
Materials and methods: One hundred-fifty consecutive
patients with non-ischemic DCM (age 58±14 years;
males 73%, NYHA class I-II: 83%, LVEF 35±13%)
were enrolled. Subjects with malignancies, systemic
inflammatory diseases, autoimmune disorders and severe
renal failure were excluded. All patients were on guideline
recommended medical treatment and underwent a
comprehensive clinical and biohumoral assessment,
including the assay of galectin-3 (Architect, Abbott), NTproBNP (Roche Diagnostics), C-reactive protein high
sensitive (CRPH) (Beckman Coulter), plasma renin
activity (PRA) (Diasorin), aldosterone (Diasorin) and
troponin I (Beckman Coulter).
Results: Median galectin-3 value was 14.4 ng/mL (IQR
11.70-19.05). At linear regression analysis high galectin-3
levels were associated with increased CRPH (R 0.35,
p <0.001), troponin I (R 0.25, p=0.012), aldosterone
(R 0.20, p=0.038) and NT-proBNP (R 0.28, p=0.001)
plasma levels; composing a multivariable setting, only
CRPH (p=0.001) and NT-proBNP (p=0.027) maintained
their predictive value for increased galectin-3 levels.
Discerning the whole population for the median value of
left ventricular ejection fraction (LVEF: 35%), galectin-3
remained associated with CRPH (p=0.040) and NTproBNP (p=0.047) in patients with LVEF <35%, but with
CRPH (p=0.001) and PRA (p=0.037) in the other subset.
Conclusions: Galectin-3 value was correlated with NTproBNP level in non-ischemic DCM patients. Moreover,
in the subset with LVEF >35% a correlation between
galectin-3 and a marker of the renin-angiotensinaldosterone system, such as PRA, was observed.
De Boer RA, Voors AA, Muntendam P, et al. Galectin-3:
a novel mediator of heart failure development and
progression. Eur J Heart Fail 2009;11:811-7.
P107
RELATIONSHIP BETWEEN CYTOCROME P 450
EICOSANOIDS AND HYPERTENSION IN OBESE
CHILDREN
1
1
1
M. Montagnana , E. Danese , M. Benati , S.
2
3
3
Bonafini , A. Tagetti , M.V. Benetti , F. Dalle
2
3
2
4
Vedove , F. Antoniazzi , P. Minuz , M. Rothe , W.
5
1
2
Schunck , G.C. Guidi , C. Fava
1
Dep. of Life and Reproduction Sciences, Clinical
Biochemistry Section, University of Verona, Verona
2
Dep. of Medicine, Internal Medicine Section C,
University of Verona, Verona
3
Dep. of Life and Reproduction Sciences, Pediatry
Section, University of Verona, Verona
4
Lipidomix GmbH, Berlin, Germany
5
Max Delbrueck Center for Molecular Medicine, Berlin,
Germany
Aim: Obesity and hypertension are widespread
health problems involving also children and young
adolescents. Epoxyeicosatrienoic acids (EETs) and 20hydroxyeicosatetraenoic acid (20-HETE), derived from
arachidonic acid (AA) via cytocrome P 450 (CYP450),
are vasoactive and natriuretic compounds involved in
blood pressure (BP) control and vascular function. EETs
are further metabolized to dihydroxyeicosatrienoic acids
(DHETs). Omega-3 fatty acids (n-3 FA) may compete with
AA, an Omega-6 fattv acid (n-6 FA), for the metabolism
via CYP450, thus modulating eicosanoids production.
The aim of our study was to investigate the role of
AA metabolites via CYP450 in BP control and vascular
function.
Methods: 46 obese children (BMI≥95° percentile for
sex and age) without comorbidities were enrolled.
Vascular function was measured by ultrasound (flowmediated dilation, FMD; carotid distendibility, DC) and
digital photoplethysmography (Stiffness Index, SI). In a
subsample of 26 subjects, plasma and urinary EETs, 20HETE and DHETs were measured by LC-MS/MS, as well
as eicosapentaenoic (EPA) and docosahexaenoic acid
(DHA), the main n-3 FA, in red blood cell membranes.
Results: About one third of subjects resulted hypertensive.
Hypertensive obese children had a higher urinary
excretion of DHETs compared to normotensive
(1684±766 vs 1051±426 ng/24 h; p=0.03), without
significant differences in the four regioisomers. Plasma
EETS, DHETs, 20-HETE and urinary 20-HETE did not
show any difference between the two groups, as well as
Omega-3 Index. We did not find any significant correlation
between CYP450 eicosanoids and BP levels. SI showed
an inverse correlation with Omega-3 Index (r=-0.39, p
<0.05). Only in males, a correlation between FMD and
plasma EETs was found (r=0.52, p <0.05).
Conclusions: These preliminary data suggest an effect of
AA metabolites via CYP450 on haemodynamic control in
obese children and a possible influence of n-3 FA levels
on elastic properties of vessels.
Capdevila JH, Falck JR, Imig JD. Roles of the cytochrome
P450 arachidonic acid monooxygenases in the control of
systemic blood pressure and experimental hypertension.
Kidney Int 2007;72:683-9.
P108
ADMISSION LEVELS OF GALECTIN-3 AND RISK
OF DEATH IN ELDERLY PATIENS AFTER ACUTE
NON ST ELEVATION MYOCARDIAL INFARCTION
(IMANSTEMI)
1
2
1
1
S. Suppressa , M. Brugia , F. Olivieri , A. Procopio , M.
2
Tocchini
1
Dipartimento di Scienze Cliniche e Molecolari di
Ancona
2
Laboratorio analisi, Osp. Ancona
Galectin-3 (Gal-3) has been the most widely-studied
member of the galectin protein family and the major effects
is its role in the promotion of fibrosis. The determination
of Gal-3 is useful as a predictor of prognosis in patient
with acute or chronic heart failure(CHF). Only few studies
have highlighted the potentiality of this test in patient with
IMANSTEMI.
The galectin-3 levels were categorized according to the
following three risk categories as previously defined for
the BGM Galectin-3 microplate assay (BG Medicine): low
risk = Gal-3≤ 17.8 ng/mL; intermediate risk = Gal-3> 17.8
and ≤ 25.9 ng/mL; high risk = Gal-3> 25.9 ng/mL.
The purpose of the present study was to determinate the
association between Gal-3 level and risk stratification of
death in elderly patient after NSTEMI.
All consecutive 108 elderely patients (>63 years, mean
80.74 years) who presented to the Coronary Care Unit
(CCU) of the Italian National Research Center on Aging
(INRCA) Hospital in Ancona, Italy, from January 2009
to January 2010 with a diagnosis of NSTEMI were
examined by the same medical team and enrolled in the
study. Gal-3 concentrations were measured using the
ELFA (Enzyme-Linked Fluorescent Assay) technique in
baseline banked plasma (EDTA) samples on the VIDAS
automated immunoassay instrument (Biomerioux).
In our IMA cohort, the mean and median plasma Gal-3
level were 19.1 and 14.3 ng/mL, respectively. Higher
Gal-3 levels (36.4%), identified by adding the moderate
to severe risk, were associated with lower age (79.87 vs
81.25 years), lower BMI (25.09 vs 26.14) and higher TnI
level (1.14 vs 0.57 ng/mL).
After 1 years of follow-up period of our chronic IMA cohort,
the previous higher Gal-3 levels were associated with
higher all-cause mortality age adjusted (p=0.049); also
the survival function of this cohort classified in the three
previous risk categories instead of the two ones, the
Gal-3 levels were correlated to better long-term survival
(p=0.022).
Despite the numerical limitation of the samples analyzed,
our data suggest that Gal-3 provides additional and
complementary risk information in the prognosis of elderly
patient IMANSTEMI affected; in particular, elevated
admission Gal-3 levels result the best independent
predictor of long term mortality (1 year) age adjusted.
Widera C, Pencina MJ, Bobadilla M, et al. Clin Chem
2013;59:1497-505.
483
P109
DIAGNOSTIC UTILITY OF COPEPTIN IN ADDITION
TO HIGH-SENSITIVITY CARDIAC TROPONIN FOR
THE EARLY DIAGNOSIS OF NON ST-ELEVATION
ACUTE CORONARY SYNDROMES
1
1
1
1
I. Cataldo , I. Griffo , F. Paolini , S. Martinotti , F.
2
2
Ricci , R. De Caterina
1
Patol. Clin. Osped. Clin. SS. Annunziata, Chieti
2
Insit. of Cardiology University of Chieti
Rapid and reliable exclusion of NSTEMI during an
Emergency Department (ED) triage is a major unmet
clinical need. We aimed at verifying the non inferiority
of a single sampling strategy of high sensitivity cardiac
troponinI (hscTnI) and copeptin compared with the dual
hscTnI sampling for the early diagnosis of NSTEMI versus
Non Coronary Chest Pain.
Methods: Copeptin (CP) hscTnI, CK-MB and myoglobin
levels were measured in 196 consecutive patients
admitted to the ED for non traumatic chest pain with onset
within the previous 6 hours and without ST elevation.
The diagnostic accuracy and the predictive value were
assessed using both ROC curve and Net Reclassification
Improvement analysis (NRI). A margin to define non-inferiority the ROC curves (AUC) was set at <0,05.
Result: The adjudicated final diagnosis of NSTEMI was
done in 29 patients(14.8%).At the time of admission/
first blood sampling analysis,a CP level <14 pmol/L in
combination with a hscTnI <0.045 ng/mL safely ruled
out NSTEMI with both a sensitivity and a negative
predictive value of 100%. The combination of hscTnI
and CP generated an AUC of 0,91 (95%CI:0.88-0.94),
which was non-inferior with respect to the 3 hours
interval hscTnI serial sampling when compared with
the 0.89 (95%CI:0.81-0.97) for hscTnI alone, 0,86
(95%CI: 0.77-0.92) for hscTnI/CK-MB, 0.83 MB, (95%CI:
0.73-0.90) for hscTnI/myoglobin. When compared with
hscTnI alone, the combination of hscTnI and CP yielded
a significant positive NRI of 0,459 (P=0,043).
Conclusions: The combined single sampling use of CP
and hscTnI is non-inferior to dual hs-cTnI sampling to
allow a rapid and reliable ruling-out of NSTEMI in patients
within 6 hours from chest pain onset, the diagnostic
utility of single sampling CP/hscTnI may result in a
substantial cost-saving benefit compared with dual hscTnI
sampling by reducing the total treatment cost of chest pain
management in the ED.
Keller T, Tzikas S, Zeller T, et al. Copeptin improves early
diagnosis of acute myocardial infarction. J Am Coll Card
2010;55:2096-106.
484
P110
RUOLO PROGNOSTICO DELL'ALDOSTERONE
NELLE SINDROMI CORONARICHE ACUTE:
FOLLOW-UP A BREVE E MEDIO TERMINE
A. Mignano, E. Corrado, G. Novo, G. Coppola, S. Novo
U.O. di Cardiologia, A.U.O.P. Paolo Giaccone, Palermo
Background: Elevati livelli di aldosterone in pazienti
con infarto miocardico acuto, sia con persistente
sopraslivellamento del segmento ST (STEMI) che senza
sopraslivellamento del segmento ST (N-STEMI) sono
associati a una peggiore prognosi a breve termine e
medio termine. Tuttavia, rimane ancora incerto il ruolo
dell’aldosterone come fattore prognostico a lungo termine.
Materiali e metodi: Sono stati determinati i livelli di
aldosterone, all’ingresso, in un totale di 101 pazienti
arruolati consecutivamente con la diagnosi di STEMI
(75 pazienti) ed N-STEMI (26 pazienti). Sono state
registrate le eventuali complicanze intraospedaliere
(aritmie maggiori, insufficienza cardiaca, morte per
cause cardiovascolari e per tutte le cause) ed è stato
eseguito un follow-up della durata di due anni con
raccolta di informazioni attraverso intervista telefonica,
riguardanti il verificarsi di eventuali eventi avversi
(mortalità cardiovascolare e per tutte le cause, reospedalizzazione).
Risultati: La popolazione globale è stata divisa in tre
gruppi di pazienti, in accordo con i terzili dei livelli
di aldosterone plasmatico (≤22,0, da 23,0 a 85,9, ≥86
pg/mL). Livelli più elevati di aldosterone sono risultati
positivamente correlati con l’insorgenza di complicanze
intraospedaliere (131,7 ± 116,5 vs 66,1 ± 87,3 pg/mL, p
<0,0001) e con l’insorgenza di eventi durante il followup (140±15 vs 56±68; p=0,0002). Inoltre, 20 pazienti
sono stati trattati con antialdosteronici in aggiunta al
trattamento standard; in questo gruppo di pazienti è stata
dimostrata una minore incidenza di eventi avversi.
Conclusioni: I risultati dello studio mostrano la presenza
di un’associazione statisticamente significativa tra livelli
plasmatici di aldosterone in acuto e l’insorgenza di eventi
avversi, fatali e non fatali in pazienti con STEMI ed NSTEMI. Sulla base di tali evidenze, il trattamento con
antialdosteronici, somministrati acutamente ai pazienti
con infarto che presentano un aumento dei livelli
dell’ormone, potrebbe influenzare favorevolmente la
prognosi a breve e medio termine.
P111
EVALUATION OF HIGH SENSITIVE TROPONIN IN
PATIENTS WITH ERECTILE DYSFUNCTION
P112
ACIDO URICO ED OUTCOME IN PAZIENTI CON
INFARTO MIOCARDICO ACUTO
G.V. Melzi d'Eril , R. Pezzilli , C.A.L. Damele , R.
1
1
3
Stefanelli , A. Flaminio , G.M. Colpi , M.M. Corsi
4
1
Romanelli , A. Barassi
A. Mignano, O.F. Triolo, E. Corrado, G. Novo, G.
Coppola, S. Novo
1
Obiettivi: Lo studio si propone di valutare se l’acido
urico può avere un ruolo nella valutazione dell’outcome
dei pazienti con infarto del miocardio. Pertanto è stata
valutata l’associazione tra livelli plasmatici di acido urico
e l’incidenza di scompenso cardiaco congestizio, aritmie,
shock, re-infarto e morte.
Metodi: E’ stato dosato l’acido urico in 81 pazienti
ricoverati presso la nostra cardiologia con diagnosi di
infarto acuto del miocardio. Sono state registrate le
complicanze intraospedaliere manifestatesi (insufficienza
cardiaca, aritmie e morte per cause cardiovascolari) ed è
stato eseguito un follow-up della durata di un anno con
raccolta di informazioni su re-infarti, re-ospedalizzazioni,
insorgenza di scompenso cardiaco congestizio e morte.
Risultati: Tra le variabili analizzate, livelli più elevati di
acido urico sono risultati correlati in maniera significativa
con l’insorgenza di fibrillazione o tachicardia ventricolare
durante la degenza ospedaliera (4,94±1,99 vs 7,24±1,31
pg/ml, p=0,0035). All’analisi multivariata la significatività
è stata mantenuta dopo correzione per i tradizionali
fattori di rischio cardiovascolare (età, sesso, fumo,
ipertensione, familiarità per malattie cardiovascolari,
diabete mellito, dislipidemia ed obesità) (OR=3,03; CI
1,11-8,28; p=0,031). Per le altre variabili analizzate
(scompenso cardiaco congestizio, fibrillazione atriale,
shock, re-infarto e morte per cause cardiovascolari e non)
non sono state riscontrate correlazioni statisticamente
significative. Un trend positivo è stato riscontrato con
l’insorgenza di scompenso cardiaco post-ischemico.
Conclusioni: I risultati dello studio mostrano la presenza
di un’associazione statisticamente significativa tra livelli
di acido urico e l’insorgenza di aritmie maggiori quali
fibrillazione ventricolare e tachicardia ventricolare. Inoltre,
sebbene non sia stata raggiunta la significatività statistica,
probabilmente a causa del ridotto numero del nostro
campione e del follow-up di breve durata, all’analisi
univariata è stato riscontrato un trend tra livelli di acido
urico ed incidenza di scompenso cardiaco. Riteniamo
quindi che il dosaggio dell’acido urico possa dare
importanti informazioni sulla prognosi dei pazienti con
infarto miocardico acuto.
1
2
1
Lab. di Analisi, Ospedale San Paolo, Dip. di Scienze
della Salute, Univ. degli Studi di Milano, Milano, Italy
2
Dip. di Malattie dell’Apparato Digerente e Medicina
Interna, Ospedale Sant'Orsola-Malpighi, Alma Mater
Studiorum, Univ. degli Studi di Bologna, Bologna, Italy
3
ISES – Istituto per la Sterilità e la Sessualità, Milano,
Italy
4
Dip. di Scienze Biomediche per la Salute, Univ. degli
Studi di Milano, Milano, Italy e Unità Operativa Medicina
di Laboratorio -1 Patologia Clinica, IRCCS Policlinico
San Donato, San Donato Milanese, Milano, Italy
Introduction: Evidence is accumulating in favour of a
link between erectile dysfunction and coronary artery
diseases. Cardiac troponin with a new high-sensitivity (hsTn) assay has a strong association with coronary artery
diseases, mortality, and heart failure. Objectives: The aim
of the study was to investigate the presence of cardiac
injury in patients who have had arteriogenic and non
arteriogenic erectile dysfunction for less than one year
using the hs-Tn levels.
Methods: The diagnosis of erectile dysfunction was
based on the International Index of Erectile Function 5questionnaire and patients were classified as arteriogenic
(no. 40), non arteriogenic (no. 48), and borderline (no.
32) patients in relation to the results of echo-color-doppler
examination of cavernous arteries in basal conditions and
after an intracavernous injection of 10 #g prostaglandin
E1. Hs-TnT and hs-TnI levels were measured in 120
men with a history of erectile dysfunction of less than
one year with no clinical evidence of cardiac ischemic
disease. Serum concentration of hs-TnT (Troponin T
immunoassay; Roche Diagnostics, Switzerland) and of
hs-TnI (Troponin I immunoassay; Johnson & Johnson,
Italy) were measured according to the manufacturer’s
recommendations. The 99th percentile value for our
normal reference population was 18.3 pg/mL for hs-TnT
and 37 pg/mL for hs-TnI measured with a CV <10%.
Results: The levels of both hs-TnT and hs-TnI were
all within the reference range and there was no
significant (P<0.05) difference between patients of the
three groups. The hs-CRP values were higher in A-ED
men compared with NA-ED (P=0.048), but not compared
with BL-ED (P=0.136), and negatively correlated with
International Index of Erectile Function questionnaire
(r=-0.480; P=0.031).
Conclusion: This study shows that the measurement of
hs-TnT or hs-TnI levels allows us to exclude the presence
of cardiovascular disease in patients with ED. The reason
is probably the short history of ED, which was of less
than one year. Longitudinal study is currently in progress
to follow the level of hs-Tn (I and T) in this selected
group of men, particularly in A-ED, in order to recognize
when the heart begins to be affected by the process of
atherosclerosis, before clinical symptoms.
U.O. di Cardiologia, A.U.O.P. Paolo Giaccone, Palermo
485
P113
VALORE PROGNOSTICO DOPO SFORZO DELLA
TROPONINA T AD ALTA SENSIBILITA’ (hs-cTNT) IN
PAZIENTI CON CARDIOPATIA ISCHEMICA
1
2
2
2
C. Autilio , D. Del Prete , L. Capaldi , D. Marsiliani , F.
2
1
2
1
Franceschi , R. Morelli , G. Zuccalà , C. Zuppi , S.
1
Baroni
1
Roma
2
Dipartimento di Emergenza e Accettazione, Università
Cattolica del Sacro Cuore, Policlinico Gemelli, Roma
Introduzione: I dosaggi delle troponine di ultima
generazione hanno migliorato la performance analitica
e diagnostica, evidenziando anche piccoli danni
miocardici, ma inevitabilmente hanno determinato
positività biochimiche non sempre riferibili a danno
ischemico. La maggiore sensibilità analitica potrebbe,
infatti, evidenziare sofferenze subcliniche del miocardio e
fornire nel paziente con cardiopatia ischemica indicazioni
prognostiche di stratificazione del rischio. Abbiamo
valutato in pazienti con dolore toracico acuto, risultati
positivi a test ergometrico, il valore predittivo della
hs-cTnT, dosata 6 ore dopo lo sforzo, sulle recidive
ischemiche a tre mesi.
Metodi: Sono stati selezionati 53 pazienti (50-87 anni)
giunti al Pronto Soccorso del nostro Policlinico per
dolore toracico acuto, con hs-cTnT <0.014 ng/mL e che,
sottoposti a test ergometrico secondo Bruce, risultavano
positivi per cardiopatia ischemica; 6 ore dopo lo sforzo
è stato effettuato un secondo dosaggio della troponina
e successivamente un esame coronarografico. I dosaggi
della hs-cTnT sono stati eseguiti su Cobas Roche. A
3 mesi dalla dimissione sono stati ricontattati i pazienti/
familiari e registrati gli episodi di dolore toracico acuto o
l’exitus; in base a tali dati i soggetti sono stati suddivisi in
2 gruppi: A(n=28):no eventi, B(n=25):sì eventi.
Risultati: I valori della hs-cTnT a 6 ore dallo sforzo
rimanevano inferiori al cut-off di normalità nel gruppo A
(mediana=0.012 ng/mL), mentre nel gruppo B (p <0.05)
erano maggiori di 0.014 ng/mL (mediana=0.022 ng/
mL). Nei pazienti del gruppo B, inoltre, la troponina a
6 ore aumentava significativamente (p <0.033) rispetto
al basale ed in 6/25 pazienti il delta di variazione
era superiore al 50% (57-320%). Dall’analisi statistica
delle hs-cTnT a 6 ore dallo sforzo è risultato 0.058
ng/mL il valore predittivo di eventi a 3 mesi con una
specificità di 89,3% ed una sensibilità di 40%. Tale valore
è interessante e promettente se si considera l’esiguo
numero di pazienti.
Conclusioni: Lo studio, anche se preliminare, suggerisce
un nuovo utilizzo della hs-cTnT come marker
indipendente di rischio cardiovascolare ed in particolare
evidenzia il suo ruolo prognostico dopo test da sforzo nel
predire recidive a breve termine in pazienti con cardiopatia
ischemica.
486
P114
PLASMA LEVELS OF GALECTIN-3 AND
NT-PROBNP: CORRELATION WITH LATE
GADOLINIUM ENHANCEMENT IN HYPERTROPHIC
CARDIOMYOPATHY AND RELATIONSHIP OF
GALECTIN-3 TO RENAL FUNCTION
1
1
2
2
L. Erroi , D. Cosseddu , K. De Rosa , T. Forni , S.
2
2
1
1
Bongioanni , B. Mabritto , I. Rodolico , S. Musolino , R.
1
2
1
Ronchi , M.R. Conte , M. Migliardi
1
Clinical Laboratory Dept, Umberto I Mauriziano
Hospital, Torino
2
Cardiology Dept, Umberto I Mauriziano Hospital, Torino
Background: Galectin-3 (Gal-3) is a recently discovered
marker for myocardial fibrosis. Cardiac magnetic
resonance (CMR) with Late Gadolinium Enhancement
(LGE) can identify the presence of fibrosis areas in
patients with hypertrophic cardiomyopathy (HCM). Aim of
our study was to correlate Gal-3 and N-terminal pro-Brain
Natriuretic Peptide (NT-proBNP) plasma levels with LGE
in CMR results obtained in a cohort of patients affected
by HCM.
Materials and methods: The study was approved by
Ethic Committee and all patients gave written informed
consent. Patients were carefully enrolled by Cardiology
Department’s physicians. Lithium heparin plasma tubes
were used for the collection of samples. Gal-3 and
NT-proBNP were measured using commercial assays
(VIDAS Biomérieux, France). Plasma creatinine (Roche
Diagnostics, Germany) and estimated glomerular filtration
rate (eGFR CKD-EPI) were measured for all patients.
Gal-3, NT-proBNP and eGFR were measured also in
healthy subjects (HS) and in renal failure (RF) patients
(3-5 stage).
Results: 55 patients with HCM (65.5% males; mean
age 50 years) were enrolled: 25 patients (45.5%) were
asymptomatic (NYHA class I); 28 patients (50.9%) were
NYHA class II and two (3.6%) were NYHA class III.
Gal-3 median concentration in HCM patients was 9.8
ng/mL (range 4.5-22.0); two patient with medium/high
Gal-3 (16.2 and 22 ng/mL) showed a creatinine of 1.8
and 1.4 mg/dL, respectively. NT-proBNP and creatinine
median levels in HCM patients were respectively 562 pg/
mL (range 25-5532) and 0.9 mg/dL (range 0.6-1.8). Gal-3
levels were not significantly different between NYHA II
and asymptomatic patients. On the contrary, a significant
difference was observed between NT-proBNP of two
groups of patients (Mann-Whitney test U=197, Z=2.726,
p <0.007).
No significant correlation was observed between Gal-3
and LGE results and also between NT-proBNP and LGE.
We observed a significant nonlinear regression between
Gal-3 and eGFR in HS and RF patients p<0.0001. The
same significant relationship was found in HCM patients
p <0.0001.
Conclusions: In HCM patients of NYHA classes I and II,
no correlation was found between Gal-3/Nt-proBNP and
LGE. In our patients medium/high Gal-3 values could be
motivated by a mild renal failure.
P115
COMPARISON BETWEEN A HIGH SENSITIVE AND A
CONTEMPORARY SENSITIVE ASSAY FOR CARDIAC
TROPONIN I
1
1
2
3
C. Barranco , C. Volpi , G. Bartesaghi , C. Galli
1
Laboratorio, Ospedale "Moriggia Pelascini", Gravedona
(CO)
2
Cardiologia, Ospedale "Moriggia Pelascini", Gravedona
(CO)
3
Scientific Affairs, Abbott Diagnostici, Roma
Background: Cardiac troponin is the primary biomarker
for the diagnosis of acute myocardial infarction (AMI).
High sensitive assays for troponin I (hsTnI) guarantee
an increased diagnostic sensitivity, especially in females,
and a shorter interval for ruling in and out AMI. We
aimed to evaluate a hsTnI assay in comparison with a
contemporary sensitive method.
Methods: Consecutive, unselected routine samples sent
for the determination of TnI have been assayed in
parallel with the current ARCHITECT TnI and the
new ARCHITECT hsTnI assays (Abbott Laboratories,
Wiesbaden, Germany). The correlation of the two assays
and the percentage of samples in which TnI levels could
be measured were evaluated along with the rate of results
exceeding the 99th percentile by the hs method.
Results: A total of 72 patients have been examined (33
males, 39 females). On the 96 available plasma samples,
the correlation between TnI and hsTnI was very high
(Pearson; r2= 0.991) and the Bland-Altman difference plot
indicated that the hs assay gave lower values on samples
with TnI levels <40 pg/mL, i.e. the diagnostic threshold
of the contemporary assay. Overall, 80,2% and 99% of
samples had detectable levels of TnI by the current and
the hs assay, respectively, with non-significant genderspecific differences (86.7% vs. 100% in males, 74.5% vs.
98% in females). Levels exceeding the 99th percentile
with the hs assay were detected in 75.6% of males,
in 62.7% of females and in 68.8% overall. On the 16
patients (22.2%) with multiple determinations, the patterns
of percentage increase/decrease with the two assays
were almost identical at all levels. Repeat testing on 25
specimens with TnI levels ranging from 2.2 to 32,753 pg/
mL indicated a very good reproducibility of the hs assay,
with CVs <10% at TnI concentrations higher than 5 pg/mL.
Conclusions: Though only a limited number of patients/
specimens could be evaluated so far, our data confirm the
increased detection of cardiac troponin by a hs method,
that showed a very good precision also at low values.
The analytical performances of the new assay will enable
to shorten from 6 to 3 hours the time for a second draw
in order to rule in/out AMI, as suggested by the recent
recommendations1.
1. Casagranda I, Cavazza M, Clerico A, et al. Clin Chem
Lab Med 2013;51:1727-37.
P116
COMPARISON OF BRAIN NATRIURETIC PEPTIDE
(BNP) AND AMINO-TERMINAL PROBNP (NTPROBNP) IMMUNOASSAYS : A STATISTICAL
ANALYSIS IN DIFFERENT GROUPS OF PATIENTS
1
2
3
M.P. D'Errico , E. Gianicolo , M.F. Petruzzelli , R.
1
3
Placella , M. Portaluri
1
Department of Laboratory Medicine “A. Perrino”
Hospital, Brindisi, Italy
2
Clinical Physiology Institute–National Research Council
(IFC-CNR), Pisa-Lecce, Italy
3
Department of Radiation Oncology “A. Perrino”
Hospital, Brindisi, Italy
Background:
Radiotherapy
(RT)
could
induce
cardiotoxicity,
but
often
these
patients
are
asymptomatic,with normal electrocardiogram and left
ventricular ejection fraction. Biochemical markers, such
as BNP and NTproBNP,may be sensitive markers for the
detection of early signs of cardiovascular disease.
Our aim was to study the relationship between the two
variables in groups of patients differing in terms of levels
of both biomarker concentrations.
Methods and Materials: Immunoassays “ECLIA” Roche
for NTproBNP, Triage BIOSITE for BNP were used in 79
left-sided breast cancer patients (RT group; mean age 58
years, range 40-76) asymptomatic after comprehensive
transthoracic echocardiography examinations at rest, and
in a group of 46 patient- admitted to the Cardiologic
Intensive Therapy Department with cardiac failure
diagnosis (UTIC group; mean age 60 years, range 35-75)
Statistical analysis was performed using SAS statistical
software,versions 8.2 per Microsoft Windows.
Results: A close positive correlation was found between
the results of ECLIA Roche and Triage Biosite methods
(correlation coefficient: all patients: 0.93; RT group: 0.86;
UTIC group: 0.86); analytic concordance was 86%. The
molar ratio NTproBNP/BNP ranged from 0.52 to 72.04,RT
group: mean 2.49(0.52-5.38); UTIC group: mean
8.33(1.87-72.03). After log-transformation,considering
logNTproBNP as dependent variable and logBNP as
independent, a significant linear regression was found (All
patients R2=0.87, RT group R2=0.75, UTIC group R2
=0.73). The significant difference of the slopes represents
a faster increase of logNTproBNP in UTIC subgroup
rather than in RT subgroup.
Discussion: Despite deriving from a proteolytic cleaveage
of the same precursor,an increase in natriuretic
peptide concentrations always matches the increase in
NTproBNP/BNP ratio,up to 10-20-fold in patients with
cardiomyopathy. Moreover recent studies suggest that
other biochemical mechanisms,different from those able
to induce the release from cardiomyocytes,could affect
the circulating levels of NTproBNP, which may be relevant
in some clinical settings (Jensen 2011). Which natriuretic
peptide forms are circulating physiologically is still a
not completely clear issue that certainly require further
studies.
Jensen J, Ma LP, Fu ML, et al. Clin Res Cardiol
2010;7:445-52.
487
P117
NTproBNP IDENTIFIES PATIENTS AT HIGH RISK OF
POSTOPERATIVE ATRIAL FIBRILLATION SUITABLE
OF PREVENTIVE THERAPY
1
2
1
3
M. Salvatici , D. Cardinale , G. Facchi , A. Colombo , L.
4
1
Spaggiari , M.T. Sandri
1
Div. di Medicina di Laboratorio, Istituto Europeo di
Oncologia, Milano
2
U. di Cardioncologia, Istituto Europeo di Oncologia,
Milano
3
U. di Cardiologia, Istituto Europeo di Oncologia, Milano
4
Div. di Chirurgia Toracica, Istituto Europeo di
Oncologia, Milano
Background: Postoperative atrial fibrillation (AF) is one of
the most frequent complications of thoracic surgery for
lung cancer, with an incidence ranging from 8 to 42%. In
some studies, postoperative AF has been found to be a
benign and self-limiting complication, whereas, in others,
it has been related to significantly increased morbidity
and mortality. The development of postoperative AF is
associated with a prolonged length of hospitalization and
high related costs. The identification of patients at high risk
that could benefit from preventive strategies, represents
a clear need. Several risk indexes have been evaluated,
and recently the N-terminal pro-BNP (NT-proBNP) has
emerged as an early marker predictive of post-operative
AF in different surgical settings. This study was aimed at
the evaluation of the efficacy of treatment with a betablocker or angiotensin receptor blocker, in patients with
elevated perioperative values of Nt-proBNP at higher risk
for AF.
Methods: We conducted a prospective randomized
controlled study in patients undergoing elective thoracic
surgery for lung cancer. Patients with elevated
perioperative values of NT-proBNP were randomized
to receive a cardio protective therapy (Metoprolol
or Losartan) or no therapy (control subjects). The
primary end point was a decrease of the incidence of
postoperative AF.
Results: Of the 1116 cancer patients undergoing thoracic
surgery enrolled from April 2008 to June 2013, 315
showed a perioperative NT-proBNP increase and were
randomized to receive Metoprolol n=104 or Losartan
n=101, while 110 represented the control group. All
patients remained under continuous ECG monitoring
until discharge. Sixty-three patients (20%) develop a
postoperative AF. A significant reduction of postoperative
AF events was observed in treated patients: 7% (=7
patients) and 11% (=12 patients) in the groups receiving
metoprolol or losartan respectively, compared to 40%
(n=44) in the control group (P <0.001).
Conclusions: In patients undergoing elective thoracic
surgery for lung cancer, a perioperative increased value
of Nt-proBNP could represent an early marker useful
to candidate patients to receive a therapy with betablocker or angiotensin to prevent the development of a
postoperative AF.
Rodseth RN, Biccard BM, Le Manach Y, et al. J Am Coll
Cardiol 2014;63:170-80.
488
P118
SOSPETTO IMA: QUALI GLI ESAMI APPROPRIATI?
1
1
1
2
M. Vitiritti , M. Monica , B. Mancuso , F. Crocco , E.
1
1
1
Filicetti , B. Modello , S. Vaccarella
1
U.O.C. Laboratorio Analisi Cliniche, Biomolecolari e
Genetica*
2
U.O.C. Pronto Soccorso**
Abbiamo voluto valutare l’appropriatezza delle richieste
di determinazione dei Marcatori di Danno Miocardico
(troponina, mioglobina e CK-MB) nei pazienti che
giungono al Pronto Soccorso con sintomi da sospetto
Infarto Miocardico Acuto (IMA). La determinazione dei
marcatori MDM per sospetto IMA è stata richiesta in
1.511 su 7.750 (19.50%) accessi al P.S. dell’Ospedale
dell’Annunziata di Cosenza nel periodo compreso tra
il 07/01/14 e il 07/02/14. Per 357 pazienti era stata
richiesta soltanto la determinazione della troponina (TnI),
per gli altri 1136 pazienti era stata richiesta, invece,
la determinazione di TnI, Mioglobina (Mb) e CK-MB.
Tra questi ultimi pazienti solo 37 (3,26%) sono risultati
affetti da IMA. Abbiamo, quindi, valutato la sensibilità
e la specificità di ogni singolo marcatore, ottenendo
per la Mb una sensibilità del 35,13% e una specificità
dell’ 87,80%, per il CK-MB una sensibilità del 51,35%
e specificità del 91,90% e per la TnI una sensibilità del
91,98% e una specificità dell’ 89,90%. Solo 3 dei 37
pazienti affetti da IMA sono risultati TnI negativi, e solo
1 di questi presentava CK-MB e Mb positiva. In questi
3 casi la diagnosi di IMA è stata effettuata mediante
ECG. In conclusione, l’elevata sensibilità diagnostica della
troponina (91,98%) determinata con metodi di ultima
generazione rispetto a quella del CK-MB e della Mb e
l’elevato VPN del test (99,70%), non solo rende ragione
del cospicuo numero di richieste di TnI in emergenza in
Pronto Soccorso rispetto ad un numero esiguo di malati
di IMA (VPP= 23,45%) in quanto marcatore precoce
di esclusione di ischemia miocardica, ma rende anche
inappropriata la richiesta concomitante di altri marcatori
MDM.
Parsonage WA, Greenslade JH, Hammett CJ, et al.
Validation of an accelerated high-sensitivity troponin T
assay protocol in an Australian cohort with chest pain.
Med J Aust 2014;200:161-5.
P119
NGAL URINARIO PER VALUTARE IL POSSIBILE
DANNO RENALE INDOTTO DALLA LITOTRISSIA
(SWL)
1
2
1
1
S. Baroni , M. Vittori , M. Nicosia , A. Primiano , P.F.
2
1
2
Bassi , C. Zuppi , A. D'Addessi
1
Università Cattolica del Sacro Cuore, Policlinico
A.Gemelli, Roma
2
Clinica Urologica, Università Cattolica del Sacro Cuore,
Policlinico A.Gemelli, Roma
Introduzione: La shock wave lithotripsy(SWL) è una
procedura efficace e non invasiva, abitualmente utilizzata
nel trattare le urolitiasi, ma non è del tutto esente
da effetti collaterali e complicanze soprattutto di tipo
vascolare. Sebbene vari studi non abbiano evidenziato
dopo litotrissia variazioni del GFR, non è del tutto chiaro
se tale procedura sia comunque in grado di provocare
lesioni renali, non evidenziabili dai valori di creatininemia.
L’NGAL (Neutrophil Gelatinase-Associated Lypocalin) è il
più promettente marker biochimico renale, più specifico
e precoce della creatinina; aumenta nelle urine già dopo
2-4 ore dal danno ed avrebbe proprietà diagnostiche e
predittive non solo nel danno renale acuto, ma anche nella
sofferenza tubulare subclinica. Pertanto in questo studio
abbiamo misurato l’NGAL in pazienti sottoposti a SWL
extracorporea, per ricercare e monitorare una eventuale
sofferenza renale, in fase precoce e tardiva, provocata dal
trattamento.
Metodi: Sono stati arruolati 21 pazienti, con singola
calcolosi radiopaca in situ, pielica o caliceale, di
dimensioni ≤15mm. La SWL era effettuata con litotritore
Siemens Lithoskop:3500 shock waves, frequenza 90 SW/
min, potenza 60 Joules. Sono stati dosati: creatinina
siero e urine (kit enzimatico Roche su Cobas 8000) e
NGAL urine (kit Abbott su Architect2000i), prima della
SWL, dopo 3 e 24 ore e dopo 30 giorni. NGAL è
stato espresso come NGAL/crea, per meglio confrontare
i dati longitudinali e correggere le variazioni da diversa
osmolarità urinaria.
Risultati: I valori basali di creatininemia e di NGAL/crea
erano nei limiti di riferimento e considerando tutti i pazienti,
non variavano significativamente prima e dopo SWL. Solo
in 7/21 pazienti è stato trovato a 3 ore un aumento
intraindividuale (p <0.05) di NGAL/crea (mediana:50.05
vs 25.60 ng/mg), con ritorno ai valori basali già a 24 ore
(19.6 ng/mg), riconfermato a 30 giorni.
Conclusioni: I nostri dati sebbene preliminari, hanno
evidenziato che la SWL può causare in alcuni soggetti,
un delta di incremento di NGAL a 3 ore, come indice di
sofferenza tubulare precoce, ma in ogni caso transitoria.
Un singolo trattamento di SWL non sembra indurre danno
renale significativo, ma il dosaggio di NGAL potrebbe
fornire nuovi approcci clinici e terapeutici.
P120
IDENTIFICATION OF REVERSIBLE RENAL DAMAGE
AND EARLY MARKERS OF RESPONSE TO
CHEMOTHERAPY IN AL AMYLOIDOSIS: A STUDY
ON 732 PATIENTS
1
1
2
2
P. Milani , G. Palladini , U. Hegenbart , C. Kimmich , A.
1
2
1
3
Foli , A.D. Ho , M. Vidus Rosin , R. Albertini , R.
4
1
2
Moratti , G. Merlini , S. Schönland
1
Centro per lo Studio e la Cura delle Amiloidosi
Sistemiche, Dip. di Medicina Molecolare, Univ. di Pavia,
Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo, Pavia, Italia
2
Amyloidosis Center, Department of Internal Medicine
V, Division of Hematology / Oncology / Rheumatology,
Univ. of Heidelberg, Heidelberg, Germany
3
Analisi Chimico Cliniche, Fondazione IRCCS Policlinico
San Matteo, Pavia, Italia
4
Direzione Scientifica, Fondazione IRCCS Policlinico
The kidney is involved in 70% of patients with AL
amyloidosis, but little is known on factors affecting
progression and potential reversibility of renal damage,
and the criteria for renal response have never been
validated. We systematically searched the databases
of the Pavia and Heidelberg amyloidosis canters for
previously untreated patients with renal AL amyloidosis
diagnosed between 2004 and 2012. Italian patients
(n=461) were used as testing cohort and Germans
(n=271) as validation cohort. All the patients gave written
informed consent. The study endpoint was time from
diagnosis to dialysis initiation (renal survival). Patients
who died off-dialysis were censored. Seventy-one (15%)
patients required dialysis in the Italian group and 84
(31%) in the German series after a median time of 85
and 69 months, respectively. Baseline proteinuria >5 g/24
hours and estimated glomerular filtration rate (eGFR)
<50 mL/min per 1·73 m2 were associated with poorer
renal survival. Patients with proteinuria below and eGFR
above the thresholds were at low-risk of dialysis (0 and
4% at three years in the testing and validation cohorts,
respectively), whereas subjects with both high proteinuria
and low eGFR were at high-risk (60% at three years in
the Italian and 85% in the German series). Patients with
either proteinuria above the cutoff or eGFR below the
threshold were at intermediate-risk of progression (18%
and 31% at three years in the testing and validation
cohorts, respectively). The difference in renal survival
between the three stages was significant (P<0.001 in
both groups). Response and progression were assessed
at three and six months. A decrease in eGFR by ≥25%
was associated with poor renal survival in both cohorts
and was adopted as the criterion for renal progression.
A decrease in proteinuria by ≥30% or below 0.5 g/24
hours in the absence of renal progression was the criterion
for renal response, being associated with longer renal
survival in both series. Hematologic very good partial or
complete remission improved renal outcome.
We identified and validated a staging system for renal
involvement and criteria for early assessment of renal
response and progression in AL amyloidosis which should
be used in routine clinical practice and clinical trial design.
489
P121
MODALITA' DI REFERTAZIONE DELLA STIMA
DEL FILTRATO GLOMERULARE (eGFR) NEI
LABORATORI ITALIANI
1
1
2
2
S. Secchiero , L. Sciacovelli , M. Zaninotto , M. Plebani
1
Centro di Ricerca Biomedica, Azienda OspedalieraUniversità, Padova
2
Dip. di Medicina di Laboratorio, Azienda OspedalieraUniversità, Padova
2
Laboratorio Analisi IFCA Firenze
U.O. Nefrologia e Dialisi IFCA Firenze
3
Geriatria per la Complessità Assistenziale - AOU
Careggi Firenze
2
2
e nel 10% solo per valori <90 mL/min/1,73m . Nel 71%
dei casi il valore di eGFR è accompagnato da Intervalli di
Riferimento e nel 49% anche da un commento.
f) I laboratori trovano interessante (36%), utile (49%)
indispensabile (9%) la partecipazione ad un programma
VEQ che includa l’eGFR.
Conclusioni: Il CRB già dal 2013 ha incluso nel
Programma di VEQ per Biochimica Clinica la creatinina
con valore target e l’eGFR.
490
2
1
Introduzione: Nel 2013 il Centro di Ricerca Biomedica
(CRB) ha condotto un’indagine tra i laboratori italiani volta
a conoscere le modalità di refertazione dell’eGFR.
Metodi: Il questionario, disponibile sul sito web del CRB,
includeva 7 domande sui seguenti aspetti: a) provenienza
delle richieste, b) metodo utilizzato per la determinazione
della creatinina, c) utilizzo o meno di formule per il calcolo
dell'eGFR, d) modalità di espressione dei risultati e f)
interesse a partecipare ad un Programma VEQ. E' stata
spedita una mail a 1080 professionisti inclusi nella mailing
list dei 652 laboratori partecipanti ai programmi VEQ del
CRB.
Risultati: La percentuale di risposte è stata del 32,2 per
un totale di 210 laboratori (62,4% pubblici, 10,5% Case di
Cura, 6,2% IRCCS e 20,9% privati) provenienti da 18 delle
20 Regioni, con prevalenza di risposte dal Veneto (49),
Lombardia (35), Lazio (22), Piemonte e Friuli Venezia
Giulia (20).
a) Le richieste di esami provengono principalmente da:
medici di medicina generale per il 52%, medici dei reparti
di cura per il 37%, medici specialisti per il 11%.
b) I metodi per la determinazione della creatinina sono:
Enzimatico = 25%, IDMS tracciabile = 17%, IDMS
tracciabile con compensazione = 16%, Jaffè = 37%,
chimica secca = 5%.
c) Il 74% dei laboratori esegue il calcolo dell'eGFR
mediante l'applicazione di una formula e lo riporta nel
referto mentre il 26% non lo referta.
d) Le formule utilizzate per il calcolo dell'eGFR sono:
MDRD = 69%, CKD-EPI = 15%, Cockcroft & Gault = 7%,
Schwartz = 1%, altro = 8%.
e) Il 55% dei laboratori referta l'eGFR solo quando
richiesto, il 43% sempre quando è richiesta la creatinina,
il 2% ai pazienti ricoverati con profilo d'ingresso.
Nel 75% dei laboratori l’eGFR viene riportato
indipendentemente dal valore ottenuto, nel 16% il dato
2
2
F. Balboni , M. Gallo , S. Bandini , G. Monzani , D.
2
1
1
3
3
Sacchi , B. Morrocchi , D. Veggi , B. Salani , A. Marsilii
1
numerico è riportato solo per valori <60 mL/min/1,73m
P122
FOLATO SIERICO VS FOLATO
INTRAERITROCITARIO: QUALE PARAMETRO È PIÙ
SENSIBILE NELLA VALUTAZIONE DELLO STATO
DEI FOLATI NEL PAZIENTE IN EMODIALISI?
Scopo del lavoro e materiali e metodi: L’anemia
iporigenerativa è tipica nell’insufficienza renale cronica
e la carenza di acido folico può essere una
delle determinanti. Per individuare quali pazienti
necessitassero della supplementazione di acido folico
abbiamo determinato i folati intraeritrocitari (FIE), i folati
sierici (FS), la vitamina B12 (B12) e l’omocisteina (HCY)
in 29 pazienti emodializzati, a 12 e 24 mesi (T12 e T24)
dall’interruzione della supplementazione settimanale con
Calcio Levofolinato e Cianocobalamina.
La determinazione dei folati sierici, eritrocitari e vitamina
B12 è stata effettuata con il sistema Access Beckman
con metodica CLIA; quella dell’HCY con metodica
immunoturbidimetrica Axis-Shield su AU480 Olympus
Beckman.
Il valore di folato intraeritrocitario è stato calcolato
correggendolo per il valore dell'ematocrito.
Risultati: I livelli di B12 al T24 si sono ridotti del 97%
pur mantenendosi tutti al di sopra dei limiti di normalità.
Analogamente si è evidenziata una riduzione significativa
del FIE, con una riduzione netta del 94%, (t di Student
per dati accoppiati p <0.001) del FS con una riduzione
netta del 84% (p <0.001), associata ad un incremento
dell’HCY dell'84% (p <0.001). A fine follow up solo il 7%
dei pazienti al T12 e il 28% al T24 presentavano valori di
FIE al di sotto del range di normalità (>237 ng/mL) mentre
l’83% dei pazienti al T12 e al T24 mostravano valori di FS
inferiori ai limiti della norma (>5,21 ng/mL).
Come descritto in letteratura il FS sembra essere più
sensibile, rispetto al FIE, nell’evidenziare deficit di folati
in soggetti non sottoposti a supplementazione e risulta
facilmente correlabile all’omocisteina. Per contro, i folati
intraeritrocitari più tardivamente rilevano l’instaurarsi di
un deficit, oltre ad essere soggetti a maggiori variabili
preanalitiche dovute al trattamento del campione.
Conclusioni: In accordo con i dati della letteratura, pur
nell’esiguità del campione, ma dopo un follow-up di 24
mesi, il folato sierico potrebbe rappresentare un marker
più precoce e predittivo, rispetto al FIE, del reale deficit di
folati nel paziente uremico in emodialisi.
Farrell CJ, Kirsch SH, Herrmann M. Red cell or serum
folate: what to do in clinical practice?. Clin Chem Lab Med
2013;51:555-69.
P123
CYSTATIN C BASED ESTIMATION OF
GLOMERULAR FILTRATION RATE IN AL
AMYLOIDOSIS
1
1
2
2
P. Milani , A. Foli , T. Bosoni , L. Pirolini , M. Vidus
1
2
1
1
Rosin , R. Albertini , V. Valentini , M. Basset , G.
1
1
Palladini , G. Merlini
1
Sistemiche, Dip. di Medicina Molecolare, Università di
Pavia, Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo, Pavia,
Italia
2
Analisi Chimico Cliniche, Fondazione IRCCS Policlinico
Cystatin C-based eGFR (eGFR-cy) has been proven
superior to creatinine based eGFR (eGFR-cr) in predicting
death and progression to end stage renal disease in
general populations and in patients with chronic kidney
disease. The kidney is involved in approximately 70%
of patients with AL amyloidosis, and is responsible
for significant morbidity and treatment limitations. We
compared eGFR-cr, eGFR-cy, and the estimation based
on both creatinine and cystatin C (eGFR-cr/cy) in 362
consecutive newly-diagnosed (between 2004 and 2012)
patients with renal AL amyloidosis. Serum creatinine was
measured with an enzimathic method and cystatyin C with
a commercial assay. All the patients gave written informed
consent. Sixty-five percent had also cardiac involvement
(cardiac stage III in 30%). Patients who died off-dialysis
were censored for the analysis of renal survival. Median
(interquartile range) creatinine was 1.11 mg/dL (0.65-1.62
mg/dL) and cystatin C 1.2 mg/L (1.0-1.8 mg/L). Fortynine percent of patients died and 15% initiated dialysis.
Median survival was 43 months. There was no difference
between the equations in predicting progression to
dialysis. However, Cystatin C-based estimations were
predicors of patients’ survival, while eGFR-cr had no
impact on survival. Subjects with eGFR-cy <90 mL/min
had shorter survival (median 28 months vs. not reached,
P <0.001). Comparing patients (n=33) with eGFR-cr but
not eGFR-cy <90 mL/min with patients (n=39) with eGFRcy but not eGFR-cr <90 mL/min there was no difference
in progression to dialysis, while the latter had shorter
survival (P <0.001). At multivariate analysis cardiac stage
III (HR 3.34, P <0.001) and eGFR-cy (but not eGFRcr) <90 mL/min (HR 2.51, P=0.001) were independent
prognostic determinants. The different eGFR formulas
perform similarly in assessing risk of progression to
dialysis. However, eGFR-cy is an independent marker of
patients’ survival.
P124
REFERENCE CHANGE VALUE FOR SERUM
CREATININE: THE NEW LIFE OF OLD MARKER
1
1
2
1
1
F.B. Ronchi , G. Demuro , G. Serra , M. Meli , S. Caria
1
Clinical Pathology Service, Dept. of Services, P. O. San
Gavino M.le, ASL Sanluri (CA), Italy
2
Dept. Biomedical Sciences, Clinical Pathology,
University of Cagliari, Italy
Background: Healthy renal function is essential to
homeostasis. Despite several proposals of new markers
and the widespread professional misconception, serum
creatinine remains the most used biomarker to assess
glomerular filtration rate (GFR). Normal creatinine levels
can be observed in patients with early compromise GFR.
Changes in serial individual results are not accuracy
monitored with conventional reference interval (RI). An
alternative way is the use of the reference change value
(RCV) for creatinine thanks to its marked biological
individuality (index of individuality <0.6). The aim of this
study was to assess if RCV is more sensitive than
estimated GFR (eGFR) to identify early kidney injury.
Methods: We derived the RCV using our analytical
imprecision (CVA) and current Ricos’s database
on biological variation (CVB). We performed daily
measurement of creatinine with human serum based
quality control (QC) (Bio-Rad Laboratories) by a modified
Jaffe method with Architect i2000SR (Abbott) traceable
to IDMS. We calculated monthly CVA and kept continued
vigilance for quality outcomes by a QC program (UNITY
Interlaboratory Program, Bio-Rad) during one year. We
compared CVA with analytical goals (AG) derived from
CVB and calculated by Fraser’s formula. We evaluated 62
patients (36 M; 26 F) that showed at the beginning at least
2 consecutive creatinine values within the RI and above
the upper reference limit in serial results. We compared
RCV with MDRD and CKD-EPI eGFR in all cases.
Results: The mean concentration of QC creatinine and its
annual average CVA were respectively 0.59 mg/dL and
1.5% (optimal AG: 1.5%). RCV of creatinine was 17.2%
(z=1.96 for bidirectional changes; p <0.05). The RCV
calculated for all results of creatinine showed a significant
change (>17.2 %) in 34 patients (55 % of cases) even
when their creatinine levels were inside the RI and eGFR
2
>60 mL/min/1.73m .
Conclusions: Our results shows that the application of
RCV for creatinine was more sensitive than MDRD and
CKD-EPI eGFR to predict early changes in renal function
even with normal creatinine levels. RCV of creatinine
is a useful tool in personalized medicine, thus it should
be calculated by laboratories and used in their reporting
systems in addition at the RI and eGFR.
491
P125
COULD REFERENCE CHANGE VALUE FOR SERUM
CREATININE BE A USEFUL TOOL IN SPECIAL
CLINICAL CONDITIONS WHEN eGFR IS NOT
APPROPRIATE?
1
2
1
1
F.B. Ronchi , G. Serra , G. Demuro , S. Caria , E.
2
Laconi
1
Clinical Pathology Service, Dept. of Services, P.O. San
Gavino Monreale, ASL Sanluri (CA), Italy
2
Dept. Biomedical Sciences, Clinical Pathology,
University of Cagliari, Italy
Background: The NKDEP guideline and SIBioC
recommendation suggest reporting estimated glomerular
filtration rate (eGFR) associated to serum creatinine
results. However there are clinical conditions in which
eGFR is not appropriate: age over 70 years, pregnancy,
patients with comorbidities, persons with extreme body
size, different nutritional status. The aim of our study was
to evaluate the correlation between RCV for creatinine
and eGFR in early detection of kidney disease and as well
as the use of RCV as appropriate tool in patients over 70
years in place of eGFR.
Methods: We defined the RCV using biological variation
(CVB) from Ricos’s database and we calculated our
analytical imprecision (CVA). Daily measurements of
creatinine in human serum based quality control (QC),
Bio-Rad Laboratories, has been collected from a modified
Jaffe method by Architect i2000SR (Abbott) traceable
to IDMS. During one year we calculated monthly CVA
and kept continued vigilance on quality outcomes by a
QC program (UNITY Interlaboratory Program, Bio-Rad).
We compared CVA with analytical goals (AG) derived
from CVB and calculated through Fraser’s formula. We
assessed 60 adult patients, 16 below 70 years and 44 over
70 years that started at least with 2 serial creatinine values
within the RI and then increased over the upper reference
limit. We derived RCV and applied MDRD and CKD-EPI
eGFR to all cases.
Results: The mean concentration of QC creatinine and
its annual average CVA were respectively 0.59 mg/dL
and 1.5% (optimal AG: 1.5%). RCV of creatinine was
17.2% (z=1.96 indentifies a probability level of 95 %
for bidirectional changes). RCV correlated with MDRD
and CKD-EPI eGFR in all cases. The application of the
RCV showed a significant change in 50% of all 60 cases
(median creatinine = 1.10 mg/dL) (8 patients <70 years,
22 patients >70 years) when their creatinine was within
2
the RI and eGFR was >60 mL/min/1.73m .
Conclusions: From the present findings, we conclude that:
1) RCV correlates with eGFR in patients below 70 years
when eGFR is appropriate 2) RCV provides an opportunity
for monitoring patients also over 70 years when eGFR is
inappropriate. 3) RCV should be used in reporting system
in addition to serum creatinine value for patients over 70
years old as well.
492
P126
PUO' L'ANALISI AUTOMATIZZATA DELLE URINE
RIDURRE LE RICHIESTE NON NECESSARIE DI
UROCOLTURA?
1
1
2
M.F. Borghi , I. Frambolli , T. Trenti
1
Lab. Patologia Clinica, Osp. B.Ramazzini, Carpi (MO)
Dip. Patologia Clinica SC Patologia Clinica Tossicologia
Diagnostica Avanzata, Nuovo Osp. S. Agostino Estense,
Modena
2
Le infezioni delle vie urinarie (UTI) rappresentano una
delle prime cause di infezione nosocomiale. La tecnologia
adottata da IRIS iQ200 (CA,USA) prevede l’analisi
automatizzata in microscopia a flusso.La combinazione
di iQ200 e l’analisi chimica (Aution Max AX-4280 MN
USA) si può paragonare a una iQ200 Workstation.
Abbiamo voluto comparare i risultati ottenuti con iQ200
e Aution Max con i risultati dell’esame colturale eseguito
dal Lab. di microbiologia dell’H.NOCSAE di Modena.
Questo studio vuole esaminare il potere discriminante
della combinazione dell’analisi chimica e la lettura
automatizzata del sedimento nella individuazione di UTI
ed identificare la combinazione di parametri capaci di
massimizzare la sensibilità e nello stesso tempo limitare la
perdita di specificità.Lo studio viene condotto nel Lab. Pat.
Clin. H. Ramazzini Carpi (MO). Noi abbiamo analizzato
in maniera retrospettiva i dati di 4333 pazienti (41%M
59% F) consecutivi (età 64.7±19.5) nel periodo GiugnoDicembre 2013. Il 50% di questi pazienti aveva 61-80
anni. Il 15% dei paz. era esterno e l’85% interno.L’analisi
chimica comprendeva esterasi leucocitaria e nitriti e quella
microscopica WBC, ASP (piccole particelle) e batteri. Le
urine che presentavano una flora mista da inquinamento
(n°51) sono state escluse dallo studio. Un singolo
patogeno era trovato in 258 (92.5%) colture, 2 patogeni in
21 (7.5%). I microrganismi isolati:E.coli 56%,Enterococco
5.7%, Klebsiella 11.1%. Totale campioni esaminati 4333
Totale richieste urocolture 615 (14.2%) Totale urocolture
positive 279 (≥10³ CFU/mL) 45.3% Totale urocolture
negative 336 54.6%. VP e VN sono determinati in
confronto con“reference standard”urocoltura. Per l’analisi
statistica si è usato Stata (StataCorp, Release 11.0;TX).Sensibilità = 89.8%- Specificità = 59.4% - NPV = 98.2%
Lo strumento può, quindi, inserirsi adeguatamente
in una strategia diagnostica che combini la striscia
reattiva e il sedimento automatizzato, con revisione dei
patologici e/o discrepanti. Ottimo NPV come screening di
UTI. Dall’analisi statistica emerge come possa risultare
discriminante la massima sensibilità e NPV in quanto
l’errore analitico che sfocia in un FN è drammatico la
Sensibilità è da prediligere alla specificità tipica della
urocoltura.
Parta M, Hudson BY, Le TP, et al. Diagn Microbiol Infect
Dis 2013;75:5-8.
P127
DETERMINAZIONE DELLA CISTATINA C
FINALIZZATA ALLA DIAGNOSI PRECOCE DI IRA
1
1
1
2
M. Lilliu , F. Puggioni , A. Gigante , G. Orru' , M.
1
1
1
Pautasso , P. Ferraguti , F. Coghe
1
Cagliari
2
Introduzione: il progressivo, generalizzato e irreversibile
declino della funzione renale determina l’insufficienza
renale che, se non diagnosticata tempestivamente, porta
alla dialisi, al trapianto renale e, nei casi più gravi,
alla morte del paziente. L’individuazione in fase precoce
dell’insufficienza renale consente l’adozione di interventi
terapeutici e non volti a impedirne o ritardarne la
progressione. La GFR, intesa come somma della capacità
filtrante di ogni glomerulo funzionante, è stata fino ad
oggi il migliore e più utilizzato indice di valutazione della
funzionalità renale. Il dosaggio della creatinina è stato
l’esame più utilizzato per studiare la funzione renale;
tuttavia, a causa delle numerose variabili che possono
interferire su di esso, non può essere considerato
un marcatore ideale soprattutto nelle fasi iniziali di
compromissione reanale.
Recentemente è stato standardizzato il dosaggio della
cistatina C, una proteina a basso P.M., prodotta dalle
cellule nucleate dell’organismo a ritmo costante e non
influenzata da massa muscolare, età e sesso, che viene
eliminata attraverso il filtrato glomerulare.
Scopo del lavoro: valutare l’utilità della cistatina C vs
Creatininemia come marcatore precoce di insufficienza
renale sulla popolazione sarda studiata nel nostro
Laboratorio.
Materiali e metodi: su tutti i campioni è stata dosata la
creatinina con metodo colorimetrico (reazione di Jaffè)
su Olympus AU640 –Beckman – con valori di riferimento
per la nostra popolazione sana compresi tra 0.7 e 1.2
mg/dL. La concentrazione della cistatina è stata ottenuta
con metodo nefelometrico su BN PROSPEC SIEMENS
e valori di riferimento per la popolazione sana studiata
compresi tra 0.53-0.95 mg/L.
Risultati: dall’elaborazione dei dati emerge l’esistenza di
una correlazione positiva tra cistatina C e insufficienza
renale acuta e risulta essere un marker più sensibile
rispetto alla creatinina.
Conclusioni: la cistatina C rappresenta un importante
biomarcatore precoce di danno renale acuto in grado di
favorire una diagnosi rapida e finalizzata all’adozione di
misure terapeutiche tempestive e adeguate.
P128
GAMMOPATIA MONOCLONALE DI INCERTO
SIGNIFICATO (MGUS) DOPO TRAPIANTO DI RENE
2
1
2
V. Sargentini , M. D'Alessandro , M.T. Piccolo , R.
1
1
1
1
Pretagostini , F. Nudo , B. Evangelista , P. Berloco , A.
2
2
Angeloni , A. Bachetoni
1
Dip. Chirurgia Generale "P.Stefanini", Sapienza
Università di Roma
2
Dip. Medicina Diagnostica, Sapienza Università di
Roma
Introduzione: Il riscontro di MGUS nella popolazione
è un evento frequente con prevalenza legata all’età
e bassa tendenza di progressione. La MGUS è
aumentata nei trapiantati di rene come conseguenza
dell’immunosoppressione e del maggior rischio di
infezioni.(1) Scopo di questo studio è stato analizzare
il significato clinico delle alterazioni elettroforetiche
nella fase post-trapianto definendone la prevalenza e
l‘evoluzione.
Metodi: Dei 138 pazienti trapiantati di rene dal 2010
al 2013 presso l’Unità Trapianti del Dipartimento
“P.Stefanini” del Policlinico Umberto I, 75, (età media
56 anni, terapia immunosoppressiva in prevalenza
Tacrolimus.), con un follow-up di almeno 6 mesi e
la presenza del tracciato elettroforetico, sono stati
inclusi nello studio. L’elettroforesi è stata eseguita con
metodologia capillare. Su 21 campioni è stata eseguita
immunofissazione su gel di agarosio.
Risultati: 38 pazienti (età media 50 anni) hanno
evidenziato una condizione di sospetta MGUS, con una
prevalenza pari al 50,6%, superiore (p <0,05) sia rispetto
alla popolazione di pazienti con malattia renale cronica
(12%) sia rispetto alla popolazione di età superiore ai
50 anni (3.3%). Non è stata evidenziata correlazione
tra MGUS ed infezioni da EBV e/o CMV; le infezioni
batteriche sono risultate significativamente più frequenti. Il
picco monoclonale sospetto di MGUS “de novo” compare
a circa 5 mesi dal trapianto. Il 27.8% dei pazienti presenta
una MGUS transitoria. L'immunofissazione ha evidenziato
che dei 21 pazienti 7 sono risultati negativi; la distribuzione
degli isotipi nei 15 pazienti positivi è risultata: IgG/K:
28,6%, IgG/L: 28,6%, IgM/K: 14,3%, IgM/L: 14,3%, IgG/L
+ IgA/L: 7,1%, Lambda free: 7,1%.
Conclusioni: I risultati confermano l'alta incidenza di
MGUS “de novo” dopo trapianto di rene. Si rileva
una associazione tra presenza di MGUS ed infezioni
batteriche. La tipizzazione evidenzia una distribuzione
eterogenea degli isotipi: IgG/K e IgG/L rappresentano il
57.2%, IgM/K e IgM/L rappresentano il 28.6%. E’ presente
un caso di gammopatia biclonale (IgG/L,IgA/L) e un caso
di lambda free. I risultati ribadiscono la necessità del
controllo a lungo termine.
1. Naina HV, Harris S, Dispenzieri A, et al. Am J Nephrol
2012;35:365-71.
493
P129
INSUFFICIENZA RENALE CRONICA: L’INTERVALLO
DI RIFERIMENTO PER LE FREE LIGHT CHAIN
1
1
1
1
P130
IPOTIROIDISMO IN PAZIENTI IN EMODIALISI IN
TERAPIA CON SEVELAMER O CARBONATO DI
LANTANIO
C. Salemi , C. Sarto , C. Siracusa , E. Reginella , P.
2
Brambilla
A. Perfetti , D. Capone , G. Palmiero
1
1
S.C. Analisi Chimico Cliniche Desio/Carate/Giussano –
AO di Desio e Vimercate (MB)
2
Studi di Milano – Bicocca, Monza (MB)
Introduzione: Si definisce malattia renale cronica
(IRC) ogni condizione patologica che interessi il
rene e che possa provocare perdita progressiva
e completa della funzionalità renale o complicanze
derivanti da esse; questo si riflette sul metabolismo
delle catene leggere libere monoclonali (FLC). Infatti
la loro concentrazione sierica dipende dall’equilibrio
fra produzione plasmacellulare ed eliminazione renale,
compromessa nei pazienti con IRC.
Scopo: Indagare se per i pazienti affetti da IRC seguiti
all’Ospedale di Desio deve essere modificato il range di
normalità per il dosaggio delle FLC nel siero da 0.26-1.65
a 0.37-3.10 come suggerito da Hutchison [1].
Materiali e metodi: In 22 pazienti seguiti per 3 anni, affetti
da IRC (Stadio IV e V), con picco monoclonale visibile nel
tracciato elettroforetico, un alterato ratio delle FLC, e una
immunofissazione su siero negativa.
Risultati e conclusioni: Tutti i 22 pazienti che mostravano
un ratio k/l alterato nell’intervallo 0.26-1.65, con l’intervallo
di riferimento nefrologico sono risultati normali.
In conclusione l’intervallo k/l 0.37-3.10 per i pazienti con
IRC permette di discriminare tra un incremento policlonale
delle FLC, rispetto ad un incremento monoclonale dovuto
ad una discrasia plasmacellulare.
1. Hutchison CA, Harding S, Hewins P, et al. Quantitative
assessment of serum and urinary polyclonal free light
chains in patients with chronic kidney disease. Clin J Am
Soc Nephrol 2008;3:1684-90.
494
2
1
3
Dip. di Farmacologia Universita' Federico II,Napoli
Ceinge-Biotecnologie avanzate, Napoli
3
Nefrocenter Blue e Rosso, Napoli
2
Introduzione: Scopo dello studio è stato quello di valutare
l’effetto di due chelanti del fosforo, sevelamer (S) e
carbonato di lantanio (CL), sui livelli sierici degli ormoni
tiroidei in pazienti in emodialisi affetti da ipotiroidismo
in trattamento con L-tiroxina (LT). Per concomitante
presenza di iperfosforemia e/o aumentato prodotto CaxP,
i pazienti necessitavano dell’aggiunta di un chelante del
fosforo.
Materiali e metodi: Nello studio sono stati arruolati 40
pazienti, 20 sono stati trattati con S alla dose di 2400 mg/
die somministrata alle ore (h)8, alle h14 ed alle h20 mentre
altri 20 sono stati trattati con CL alla dose di 2000 mg/die
suddivisa in due dosi somministrate alle h14 ed alle h20.
Tutti i valori sono stati espressi come media±deviazioni
standard e comparati rispetto al valore basale usando il
test t di Student per dati appaiati.
Risultati: Dopo due mesi di trattamento con S si è
registrato un incremento dei livelli sierici di TSH ed una
corrispondente diminuzione dei livelli sierici di FT4 per
diminuito assorbimento della LT somministrata per os. A
questo punto si è provveduto ad una modifica dei tempi
di somministrazione del farmaco (1600 mg alle ore 14
e 800 mg alle ore 20) e ciò ha consentito un ritorno ai
valori basali dei livelli sierici di TSH e FT4 confermando la
nostra ipotesi di un’interferenza del S1 sull’assorbimento
di LT. Al contrario il CL non determinava modificazioni dei
livelli sierici di TSH e FT4. La fosforemia rientrava sempre
nei valori di riferimento con entrambi i chelanti per l’intera
durata dello studio.
Conclusioni: IL CL non interferisce con la
somministrazione contemporanea di LT, mentre per il S
è necessaria una modifica dei tempi di somministrazione,
al fine di evitare l’insorgenza di una sua possibile
interferenza sull’assorbimento della LT.
1. John-Kalarickal J, Pearlman G, Carlson HE. New
medications which decrease levothyroxine absorption.
Thyroid 2007;17:763-5.
P131
CAN 24-HOUR URINE COLLECTION BE
REPLACED BY AN EARLY MORNING SAMPLE
FOR BENCE JONES PROTEIN DETECTION AND
QUANTIFICATION?
1
1
4
1
P. Milani , G. Palladini , C. Klersy , V. Valentini , F.
1
1
2
3
Lavatelli , M. Nuvolone , L. Zanolla , G. Righetti , V.
5
3
1
Meneghini , M.S. Graziani , G. Merlini
1
Sistemiche, Dip. di Medicina Molecolare, Univ. di Pavia,
Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo, Pavia, Italia
2
Dip. di Cardiologia, Osp. Civile Maggiore, Az.
Ospedaliera Universitaria Integrata, Verona, Italia
3
Lab. Analisi Chimico Cliniche, Osp. Civile Maggiore, Az.
4
Direzione Scientifica, Fondazione IRCCS Policlinico
5
Dip. di Ematologia, Osp. Civile Maggiore, Az.
Background: Detection and quantification of Bence Jones
protein (BJP) is necessary in multiple myeloma, AL
amyloidosis, and other monoclonal gammopathies. For
BJP quantification a 24h urine collection is required;
however, this can be inconvenient and subject to
errors, particularly in the outpatient setting. Total protein
excretion can be measured in an early morning void
(EMV) and expressed as protein-to-creatinine ratio.
Methods: In the present study we tested if an EMV
sample could be used to detect and quantify BJP in 337
outpatients from two hematology Clinics. Two-hundred
four had AL amyloidosis, 56 MGUS, 51 MM, 17 SMM,
9 WM. All the patients gave written informed consent.
Patients were asked to provide the 24h urine collection
and the early morning void (EMV) obtained at the end
of the collection. The BJP was detected by agarose gel
immunofixation. The BJP quantification was performed by
densitometric scanning of the electrophoretic monoclonal
peak.
Results: In 132 patients BJP was detected in both
samples, in 13 only in the EMV, and in 1 only in the
24h sample (agreement 96%, Kappa-statistic 0.91 in
the overall population). When the BJP was visible at
electrophoresis (68 pairs of samples) it was quantified
and expressed in mg/24h or mg/g-creatinine. There was
very good agreement between BJP expressed as mg/24h
and mg/g-creatinine in the 24h samples (Lin’s correlation
coefficient [cc] 0.95), mg/g-creatinine in the 24h and EMV
samples (cc 0.95), and mg/24h in the 24h sample and
mg/g-creatinine in the EMV (cc 0.91). In 25 patients with
#2 measurements, agreement between changes in BJP
expressed in mg/24h in the 24h sample and in mg/gcreatinine in the EMV was suboptimal (cc 0.72). However,
agreement between BJP changes expressed in mg/gcreatinine in the 24h sample and in the EMV was better
(cc 0.85).
Conclusions: An EMV can be used for BJP detection
and measurement. The better agreement in BJP changes
between the 24h and EMV samples when BJP is
expressed in mg/g-creatinine probably reflects patients’
errors in timed urine collection.
P132
MINDRAY BC-6800 HEMATOLOGIC ANALYZER.
CAN THREE-DIMENSIONAL CYTOGRAMS
IMPROVE CLINICAL INFORMATION PROVIDED BY
LABORATORY?
F. Fiorini, a. La Gioia, G. Badalassi, A. Barsotti, M.
Cytograms are the graphical representation of the
interaction between circulating peripheral blood cells and
the methodology used by each analyzer to recognize
those. Because all analyzers use different counting
methodology, as well as different methodology mix,
all cytograms are so different each other, that each
binding instrument-cytogram is easily and unequivocally
recognizable.
The Mindray BC 6800 analyzer use to perform Leukocyte
Differential Count (LDC) as well as Nucleated Red Blood
Cells (NRBC) counting the SF Cube Technology (3D
Cube) (1).
The three dimension are the forward scatter for cellular
size, the side scatter for cellular complexity and the
fluorescence for nucleic acid content. The instrumental
results is represented by two cytograms: DIFF for LDC
and NRBC for erythroblasts.
From November 2013 to April, 2014 we used the
BC-6800 Analyzer in our laboratory to evaluate 3D Cube
performances in different hematological neoplastic or
reactive diseases. We studied 1642 normal samples and
64 abnormal samples. In most of studied samples, 3D
Cube allow us to acquire additional information to improve
the microscopic review quality. Particularly:
• In three samples with granulocytic dysplasia, the
neuthrophils cluster in DIFF cytogram and upper cluster
in NRBC cytogram were splitted in two sub-cluster
corresponding to double granulocytic population;
• In 34 cases of infectious mononucleosis (IM) we
observed after left-right rotation an additional lymphocytic
cluster hidden behind the “usual” lymphocytic/monocytic
clusters. None of 31 reactive or neoplastic lymphocytosis
was characterized by additional clusters in any 3D Cube
position, except for
• Five cases of circulating plasma cells with an additional
cluster in High Fluorescence Cells (HFC) zone, very far
and very different on shape from IM additional cluster.
In addition, we observed interesting three dimensional
cytograms changes in two cases of acute myeloid
leukemia and in three cases of chronic myeloid
leukemia. These last cases, compared with neoplastic/
non neoplastic lymphocytosis, allow us to distinguish true
basophilia from pseudobasophilia.
1. Lippi G, Cattabiani C, Bonomini S, et al. Preliminary
evaluation of complete blood cell count on Mindray
BC-6800. Clin Chem Lab Med 2013;51:65-7.
495
P133
CONTENUTO EMOGLOBINICO RETICOLOCITARIO
(CHr): UN UTILE INDICATORE DELL’EFFICACIA
DELLA TERAPIA MARZIALE NELL’ANEMIA
SIDEROPENICA
1
1
1
1
F.B. Ronchi , P.P. Porcu , G. Demuro , S. Caria , G.
2
Serra
1
Servizio di Patologia Clinica, Dip. dei Servizi, P.O. San
Gavino M.le, ASL Sanluri (CA), Italia
2
Dip. Scienze Biomediche, Patologia Clinica, Università
di Cagliari, Italia
Introduzione: Il Contenuto Emoglobinico reticolocitario
(CHr) è considerato un efficace biomarker di
deficit funzionale marziale. A differenza dei più
classici parametri (es. sideremia, ferritina) esprime la
capacità dell’emopoiesi di sintetizzare l’emoglobina (Hb)
reticolocitaria utilizzando il ferro in modo efficace.
Considerando che i reticolociti sono le prime cellule della
serie rossa rilasciate nel sangue con un’emivita di 24 h,
la misura del CHr rappresenta un precoce e puntuale
indicatore di efficacia della terapia marziale e di ripresa
della normale emopoiesi (CHr > 28 pg). L’obiettivo dello
studio è quello di monitorare il CHr per valutare l’efficacia
della terapia marziale in due casi clinici.
Metodi: Donna di 74 (paziente A) e di 45 anni (paziente
B). Gli esami di laboratorio sono stati eseguiti con gli
strumenti Advia 2120i Siemens e Architect 8200i Abbott.
Risultati: Le pazienti (pz) ricoverate per astenia marcata e
segni di anemia hanno presentato, all’esordio, un quadro
di laboratorio indicativo di anemia sideropenica severa (Pz
A: Hb 6.2 g/dL, MCV 70 fL, sideremia 10 µg/dL, ferritina
< 1 ng/mL, CHr 21.2 pg; Pz B: Hb 5.1 g/dL, MCV 60 fL,
sideremia < 5 µg/dL, ferritina < 1 ng/mL; CHr 14.5 pg).
Le pz hanno praticato terapia marziale (150 mg/die) sino
al ripristino delle riserve di ferro. Il monitoraggio è stato
effettuato in diverse giornate (gg) evidenziando i valori
seguenti. Pz A: gg II, VI, X, XIII, XXX, LX rispettivamente
per Hb (g/dL) di 6.4, 7.9, 8.1, 8.5, 10.7, 12.8 e per CHr
(pg) di 25.5, 27.6, 28.7, 29.9, 29.1, 28.1. Pz.B: gg II, IV,
VI, VIII, XXX per Hb (g/dL) di 5.1, 5.3, 6.7, 7.9, 9.5, 11.8
e per CHr (pg) di 18.2, 24.7, 27.1, 29.7, 32.0.
Conclusioni: Il CHr rappresenta un parametro puntuale,
precoce e predittivo di efficacia della terapia marziale per
la risoluzione dell’anemia sideropenica. Nel pz A, il CHr
ha raggiunto il valore di normalità in X giornata mentre
la Hb è risalita a livelli accettabili dal giorno LX. Nel pz
B, il CHr è normale in VIII giornata con Hb accettabile
in giorno XXX. La determinazione del CHr ha permesso
di evitare la terapia emotrasfusionale per la precocità nel
valutare l’efficacia della terapia marziale (aumentato già
in II giornata) e la conseguente predittività indicativa di
risoluzione dell’anemia.
496
P134
VALUTAZIONE DEL TEST Hevylite® NELLA
QUANTIFICAZIONE DELLE COMPONENTI
MONOCLONALI IgA
1
2
1
2
M. Berardi , C. Nozzoli , A. Terreni , M. Staderini , T.
1
1
2
1
Biagioli , M. Brogi , A. Bosi , A. Caldini
1
Laboratorio Generale, Azienda Ospedaliero
Universitaria Careggi, Firenze
2
Ematologia, Azienda Ospedaliero Universitaria Careggi,
Firenze
Nei pazienti affetti da gammopatia monoclonale (GM)
la quantificazione della componente monoclonale (CM)
è utile nella diagnosi differenziale, nella stratificazione
del rischio e nella valutazione della risposta alla terapia.
L’elettroforesi delle sieroproteine (SPE) è la tecnica
d’elezione per la rilevazione e la misura della CM, tramite
proporzione diretta del picco monoclonale. Qualora la
CM non sia quantificabile tramite SPE si ricorre alla
misura immunochimica della catena pesante coinvolta,
metodica però non priva di limiti: influenza del background
policlonale, mancato parallelismo e possibile mancato
riconoscimento dell’antigene. Il test immunochimico
Hevylite® (HLC, Binding Site,UK) permette la misura di
Ig intere discriminando sia l'isotipo che la catena leggera
associata, fornendo così un indice di clonalità tramite il
rapporto Ig’κ/Ig’λ. Scopo del nostro lavoro è stato quello di
valutare l’utilizzo del test HLC nella quantificazione delle
CM IgA in pazienti affetti da GM.
Sono state effettuate 132 determinazioni in 122 pazienti,
selezionati in base a immunofissazione (IFE) positiva
per CM IgA. In 119 casi i valori ottenuti dalla somma
delle componenti IgAκ e IgAλ sono stati confrontati con
la misura nefelometrica delle IgA totali. Nei casi in cui
è stato possibile misurare densitometricamente la CM
(26%), questo dato è stato confrontato con il risultato del
test HLC relativo alla catena leggera coinvolta.
I risultati ottenuti hanno mostrato una buona
corrispondenza tra la misura nefelometrica delle IgA totali
e la somma delle componenti IgAκ e IgAλ quantificate
2
tramite test HLC (y= -0.482+1.070x; R =0.95; p <0.0001).
Anche la correlazione tra la misura densitometrica
della CM e il risultato del test HLC è risultata
2
soddisfacente (n=34; y=-0.519+1.162x; R = 0.98; p
<0.0001). In entrambi i casi l’analisi di Bland-Altman non
ha evidenziato differenze significative.
Va però osservato che in 26 casi (20%) con IFE positiva,
caratterizzati da CM di lieve entità, non è stata trovata
alcuna alterazione del rapporto IgAκ/IgAλ.
I risultati ottenuti in questo studio preliminare
suggeriscono che il test HLC può essere un valido ausilio
per la misura di CM IgA non quantificabili tramite SPE.
Ludwig H, Milosavljevic D, Zojer N, et al. Leukemia
2013;27:213-9.
P135
DIAGNOSI DI MALATTIA DEPRANOCITICA
IN PAZIENTE DI ETA’ PEDIATRICA:
EMOGLOBINOPATIA S-C
1
1
2
P136
TROMBOCITOSI SECONDARIA AD ANEMIA
SIDEROPENICA. UN CASO CLINICO
1
3
V. Letizia , V. Panetta , S. Costanzo , A. Castaldo , M.
1
1
1
1
Di Lorenzo , E. Esposito , D. Vitelli , M. Schioppa
1
UOC Patologia clinica, Osp. "S'anna e San sebastiano"
di Caserta
2
Scuola di Spec. Patologia clinica, Univ. Federico II,
Napoli
3
V anno Medicina e chirurgia, Univ. SUN di Napoli
La malattia drepanocitica (SCD) é la più frequente
emoglobinopatia presente in Italia. Essa è presente sia
nella forma omozigote (SS) che nella forma di eterozigosi
composta (S-βth), interazione del gene dell'Hb S e il gene
β talassemico e, in una minoranza di casi, come Hb S e
altra emoglobina (HbC, HbLepore, Hb D).
Si descrive il caso di un paziente di età pediatrica
(m, 6 anni), di origine africana, con segni clinici di
anemia, malessere diffuso e splenomegalia. Gli esami
ematochimici mostrano un’anemia di grado medio,
microcitemia, neutrofilia, indici infiammatori aumentati
e studio del metabolismo del ferro nella norma. Il
sospetto clinico di emoglobinopatia è stato confermato
dall’analisi di I livello, eseguita in HPLC, dell’assetto
emoglobinico che ha mostrato la compresenza di due
varianti emoglobine β, di tipo S (44%) e di tipo C (42%),
HbF (5%) e con valori aumentati di HbA2 (4%) che
sono una caratteristica costante nei portatori di HbS.
L’osservazione microscopica dello strisco di sangue ha
rilevato una significativa presenza di cellule a bersaglio;
rare emazie falciformi. La falcizzazione è stata dimostrata
con l’esecuzione dello “sickling test”.
La diagnosi di Emoglobinopatia S-C è stata
successivamente confermata con tecniche di Biologia
molecolare che hanno caratterizzato le due varianti
emoglobiniche ed escluso la presenza di beta-talassemia.
Le analisi di I e II livello, sono state allargate ai genitori del
paziente (e ai fratelli) dimostrando che la variante betaemoglobinica tipo S è stata ereditata dalla madre, mentre
quella di tipo C dal padre, con un probabilità, quindi,
del 25% di generare un doppio eterozigote S-C (12,5 se
consideriamo anche il sesso).
In conclusione, poiché le varianti emoglobiniche accertate
a tutt’oggi sono oltre 800, esiste la possibilità che
diverse emoglobine possano condividere lo stesso
tempo di ritenzione. Pertanto non è sufficiente il
dosaggio quali-quantitativo fornito dalla HPLC, ma è
necessario combinare più tecniche per raggiungere una
identificazione certa. Ciononostante, per l’identificazione
di varianti diffuse, quali la HbS e la HbC, può essere
sufficiente la sola combinazione di diversi test meno
costosi rispetto a quelli di tipo molecolare, demandando
al II livello solo i quadri più complessi.
1
1
1
F.B. Ronchi , P.P. Porcu , G. Demuro , S. Caria , G.
2
Serra
1
Servizio di Patologia Clinica, Dip. dei Servizi, P.O. San
Gavino M.le, ASL Sanluri (CA), Italia
2
di Cagliari, Italia
Introduzione: L’anemia sideropenica è una delle cause
di trombocitosi secondaria. I pazienti affetti da anemia
ferro carenziale mostrano nella maggioranza dei casi
valori di piastrine (PLT) normali, piastrinopenia in una
piccola percentuale dei casi e trombocitosi (PLT > 500
3
x10 /µL) nel 10% dei casi. Quest’ultima raramente supera
3
la soglia di 700 x10 /µL PLT. I meccanismi fisiopatologici
che stanno alla base della trombocitosi reattiva alla
carenza di ferro non sono ancora chiari. La similitudine
strutturale tra l’eritropoietina (aumentata nell’anemia ferro
carenziale) e la trombopoietina sembra giocare un ruolo
determinante. In questo studio abbiamo valutato una
donna con anemia sideropenica e trombocitosi severa
3
(PLT >1.000 x10 /µL), valore decisamente superiore a
quelli mediamente descritti in letteratura.
Metodi: Donna di 45 anni. Gli esami ematochimici sono
stati eseguiti con gli strumenti Advia 2120 Siemens e
Architect 8200i Abbott.
Risultati: La paziente (pz), ricoverata per astenia marcata,
ha presentato all’esordio un quadro di laboratorio
indicativo di anemia sideropenia e trombocitosi: Hb 5.1
3
mg/dL; PLT 1.600 x 10 /µL; sideremia <5 µg/dL; ferritina
<1 ng/mL; PCR 0.02 mg/dL. Per la severa anemia
sideropenica la pz ha praticato terapia marziale e.v. (150
mg/die) per una settimana, proseguita per o.s. allo stesso
dosaggio sino al ripristino delle riserve di ferro (giorno
30). La pz è stata monitorata nei giorni 1, 2, 4, 6, 8 e 30
riportando i seguenti risultati: Hb (g/dL) 5.1, 5.3, 6.7, 7.9,
3
9.5, 11.8 e PLT (10 /µL) 1.600, 1.300, 800, 400, 350, 300
rispettivamente.
Conclusioni: Il caso clinico mostra una correlazione del
livello di gravità tra anemia sideropenica e trombocitosi
sia all’esordio che durante la terapia marziale, con la
risoluzione della trombocitosi più repentina rispetto a
quella dell’anemia (giorno 6 e 8). Tuttavia la risoluzione
della trombocitosi severa con la sola terapia marziale
conferma la sua natura reattiva esplicata attraverso il
coinvolgimento dei meccanismi biologici e di compenso
che stanno alla base della stessa anemia sideropenica.
497
P137
VALUTAZIONE DEL CONTEGGIO DEI GRANULOCITI
IMMATURI OTTENUTO CON GLI ANALIZZATORI
EMATOLOGICI MINDRAY BC6800, SYSMEX XN1000,
XE5000 e XE2100
F. Spolaore, E. Piva, M. Plebani
UOC di Medicina di Laboratorio, Azienda OspedalieraUniversità, Padova
Scopo: Clinicamente utili nelle condizioni flogistiche, sepsi
compresa, e nelle patologie ematologiche, normalmente
non presenti nel sangue periferico, il conteggio
automatizzato dei granulociti immaturi (IGs, comprensivo
di metamielociti, mielociti e promielociti) rappresenta il
prototipo dell’applicazione in ematologia automatizzata
del conteggio differenziale esteso.
Metodi: Campioni della routine anticoagulati con EDTA,
prelevati da 156 pazienti presentanti IGs tra 0,1 e 29%,
sono stati analizzati con tre sistemi Sysmex della serie X,
XE2100, XE5000 ed XN1000, e con il Mindray BC6800.
Sommariamente, con le varie tecnologie i granulociti
immaturi sono individuati e quantificati in una specifica
area del citogramma mediante analisi simultanea delle
caratteristiche bidimensionali (forward and side scatter)
e di fluorescenza rilevate nel canale DIFF con software
dedicati. XN 1000 dispone di un nuovo canale, progettato
per un miglior riconoscimento di IGs. I valori sono
espressi in percentuale e in numero assoluto. Per la
comparazione l’analisi statistica è stata effettuata con
la regressione lineare di Passing-Bablock (MedCalc®,
versione 11.0.1.0).
Risultati: I valori della media±DS per i conteggi IGs
in percentuale sono stati i seguenti: BC6800 Mindray:
3,63±4,71; XN: 4,33±3,99; XE2100: 3,34±2,35; XE5000:
2,84±3,30. I valori della media±DS per i conteggi IGs
9
in valore assoluto (10 /L) sono stati i seguenti: BC6800
Mindray: 0,46±0,93; XN: 0,48±0,55; XE2100: 0,59±1,30;
XE5000: 0,32±0,44. Relativamente ai parametri della
retta, sono riportati il valore dell’intercetta a e del
coefficiente angolare b, entrambi con il loro intervallo di
confidenza al 95%. Il confronto tra BC6800 ed XN100 ha
quindi dimostrato: a= -0,24 (IC al 95% da -0,39 a -0,08), b
= 0,79 (IC al 95% da 0,72 a 0,85); tra BC6800 e XE2100:
a= 0,04 (IC al 95% da -0,14 a 0,10), b = 1,06 (IC al 95%
da 1,0 a 1,14); tra BC6800 e XE5000: a= 0,07 (IC al 95%
da -0,04 a 0,18), b = 1,13 (IC al 95% da 1,08 a 1,2).
Conclusioni: Sebbene preliminare e senza confronto con
il metodo microscopico di riferimento, la valutazione
di queste tecnologie ha dimostrato una concordanza
statisticamente ottimale tra i conteggi ottenuti con
BC6800, XE2100 e XE5000, e di una lieve sovrastima di
XN1000.
498
P138
HEMORHEOLOGICAL PROFILE OF HEALTHY
AND DISEASED RED BLOOD CELLS UNDER
CONTROLLED FLOW CONDITIONS
P. Caprari, S. Panicale, E. Bakalli, L. Diana, D. Di Silvio
Department of Hematology, Oncology and Molecular
Medicine, Istituto Superiore di Sanità, Rome
The red blood cells (RBCs) are the most prominent
haematological factor influencing hemoreology. Diseases
characterized by alterations in RBC are generally
associated with hemorheological abnormalities. The
contribution of RBCs to flow behaviour of blood is linked
to cell deformability and aggregation. RBCs survive in
the hemodynamic environment of the circulation in vivo
because of their deformability, which plays an essential
role in the delivery of oxygen to the tissues. In response
to fluid shear forces RBCs deform from the resting
biconcave into ellipsoid shapes and align themselves to
the fluid stream. Cytoplasmic viscosity, high surface area/
cell volume ratio, and membrane viscoelasticity are the
main features that allow RBCs to be flexible. In certain
pathological conditions where membrane stability and
cellular deformability are compromised, the lifespan of the
RBCs can be drastically reduced or their function severely
compromised.
Physiological RBC aggregation is characterised by
the formation of multi-cell structures, initially rouleaux,
followed by clustering and branching of rouleaux. RBC
aggregation is mainly determined by plasma protein
composition and surface properties of RBCs. However
cellular shape and deformability also affect the extent
of aggregation so that any change from the normal
biconcave shape and normal deformability may interfere
with physiological rouleaux aggregate formation. Clinical
studies fail to demonstrate a correlation between
RBC deformability changes and altered aggregation
and further studies are needed to clarify the basic
differences in the characteristics of physiological and
pathological RBC aggregation. The flow behaviour of
RBCs affected by different genetic disorders (e.g.
thalassemia, hereditary spherocytosis and hereditary
elliptocytosis) has been analysed by a Rheo-Microscope
system that simultaneously allows erythrocyte rheological
characterization and direct imaging. Rheological profiles
of diseased RBCs have been related to the images
showing different aggregation-disaggregation patterns in
the congenital erythrocyte disorders.
P139
STUDIO IN VITRO DELLE INTERFERENZE DA
FARMACI ANTINEOPLASTICI NELLE TECNICHE
ELETTROFORETICHE E IMMUNOFISSATIVE
1
2
1
G. Illuminati , E. De Santis , M. Attanasio , A. La
3
4
4
1
1
Malfa , E. Longhi , A. Vernocchi , L. Conti , G. Cigliana
1
U.O. Patologia Clinica, Istituto Nazionale Tumori
2
Dip. Medicina di Laboratorio, Policlinico Universitario
“A. Gemelli”, Roma
3
U.O. Farmacia Ospedaliera IFO, IRCCS, Roma
4
Servizio di Medicina di Laboratorio, IRCCS
Multimedica, Milano
Lo studio della letteratura sulla discordanza tra i
dati ottenuti con l’elettroforesi sierica e quelli ottenuti
con l’immunofisazione ha messo le basi per uno
studio retrospettivo dei tracciati elettroforetici ottenuti
con metodica capillare presso l’ospedale oncologico
IRCCS Regina Elena di Roma. Dall’analisi di 4692
tracciati elettroforetici (circa il 20% annui) è stato
osservato che delle 856 sospette componenti monoclonali
riscontrate in elettroforesi capillare 612 sono state
confermate in immunofissazione mentre le restanti
244 non confermavano la sospetta componente
monoclonale. Analizzando la provenienza dei pazienti
abbiamo osservato, inoltre, che i falsi positivi erano
per lo più pazienti interni provenienti dalle divisioni
oncologiche. Suddividendo i pazienti in due gruppi:
pazienti interni oncologici e pazienti esterni afferenti
alla sala prelievi abbiamo osservato che, nel gruppo
dei pazienti esterni, le sospette componenti non
confermate all’immunofissazione erano il 20,2%; mentre
quelle dei pazienti oncologici rappresentavano, all’interno
del gruppo, il 59.3%. Abbiamo quindi ipotizzato che
un aumento così marcato delle false componenti
monoclonali e delle alterazioni sul tracciato potesse
essere attribuibile ad una interferenza causata dalle
chemioterapie alle quali questi pazienti sono normalmente
sottoposti. Dei ventisei farmaci testati in vitro nove
antineoplastici (Paclitaxel, Irinotecan, Gemcitabina,
Docetaxel, Vinorelbina, Etoposide, Bevacizumab,
Cetuximab e Trastuzumab) hanno dato una netta
interferenza, mimando perfettamente una componente
monoclonale. Dei nove farmaci risultati positivi in
metodica capillare solo i farmaci biologici hanno dato
una chiara componente monoclonale in elettroforesi
su gel di agarosio. Questi stessi farmaci sono stati
testati attraverso immunofissazione per tipizzare il tipo
di componente e tutti e tre hanno dato una componente
monoclonale IgG Kappa, come da formulazione. I dati
emersi dallo studio in vitro sono alla base dello studio
in vivo, attualmente in corso di ultimazione condotto in
collaborazione con il centro MULTIMEDICA di Milano,
che ha come obiettivo quello di osservare le eventuali
interferenze dei farmaci antineoplastici considerandone
anche gli aspetti di farmacocinetica.
P140
A CASE OF MYELODISPLASTIC SYNDROME IN A
YOUNG BLACK FEMALE
1
2
2
2
P. Piccioni , F. Sorà , L. Laurenti , S. Sica , M.L.
1
Gozzo
1
Laboratorio di Patologia generale, Ospedale MG
Vannini, Roma
2
UOC Ematologia, Policlino A. Gemelli, Roma
Myelodysplastic syndromes (MDS) are heterogeneous
bone marrow diseases of acquired clonal stem cell
disorders that cause ineffective and dysplastic production
of blood cells and can transform in acute myeloid
leukemia. Cytomorphological alterations in peripheral
blood films as well as bone marrow aspirates remain valid
key elements for setting the diagnosis of MDS. Whereas
diagnosis can be made quite easily in advanced MDS this
is much more difficult in early MDS, especially in cases
with cytopenias or dysplasias of uncertain significance
(ICUS and IDUS). MDS are extremely rare in adults under
60 years old. We reported a case of a black female 21
years old affected by acute myeloid leukemia NPM 1
exon 12: positive, FLT3 negative. Clinical history started
4 years early with sideropenic anemia and neutropenia
(Hb 7.1 gr/dl, MCV 62.5 fl, N 570 /mmc, sideremia 15
(mcg/dl), ferritina 5(ng/ml) in woman with metrorrhagia for
uterine fibromatosis. Moreover, she was eterozigosis for
C hemoglobinopathy. She was submitted to oral marzial
therapy with discrete benefit. (Hb 11.8 g/dl, MCV 77.7 fl),
but not resolving neutropenia. She was monitored with
follow up for persistent isolated neutropenia of III grade
(N 840/mmc). With progressive worsening of neutropenia
(130 /mmc) in association of the onset of suddenly severe
thrombocytopenia (35000/mmc) it was decided to perform
a bone marrow aspirate wich documented presence of
dysplasia and increase of blasts’ count. At peripheral
blood film no increase of blats’s count was seen but on
the morphological study of bone marrow was documented
30% myeloid blasts with CD117, CD33 positivity, CD34
and MPO low expression. As diagnosis, management
and therapy of MDS evolving significantly in recent years,
primar care physicians play an important role to refer
patients to hematologists for a correct early diagnosis.
Also in absence of increase blast’s peripheral count, a
bone marrow aspirate was perform for correct counting
and identification of medullar blasts and define features
of dysplastic morphological alterations in all three cell
lineages. That’s allowing an early MDS diagnosis and
specialistic follow-up and adapted risk stratification for a
targeted therapy, especially in low risk groups.
Samiev D, Bhatt VR, Armitage JD, et al. A primary care
approach to myelodisplastic syndromes. Korean J Fam
Med 2014;35:111-8.
499
P141
IMAGING ECOGRAFICO NELLA DIAGNOSI DI
AMILOIDOSI INTESTINALE
P142
IMAGING ECOGRAFICO NELLA DIAGNOSI DI
AMILOIDOSI EPATICA
V. Russo
v. Russo
Dipartimento di Ematologia, A.O.U. Federico II, Napoli
Introduzione: L’amiloidosi primitiva da catene leggere
lambda (AL) è una patologia rara nella popolazione
generale, con un incidenza attorno al 5,1-12,8 milioni di
persone/anno.
I disturbi dell’apparato gastroenterico sono dovuti
all’infiltrazione di sostanza amiloide nella parete
intestinale .
L’esame ecografico dell’addome nell’AL a localizzazione
intestinale consente di visualizzare rapidamente
l’ispessimento delle anse intestinali.
Descriviamo il caso di un uomo con inappetenza , diarrea
e scadente stato nutrizionale.
Presentazione del caso: Riportiamo il caso di un uomo
di 53 anni, con peso corporeo di 61 Kg (IMC=16,9 Kg/
m2), inappetente, con decremento ponderale di circa 7 Kg
avvenuto negli ultimi mesi, che si ricovera per una colica
addominale.
Gli esami bioumorali risultavano nella norma tranne per
bilirubina totale 4,15 mg/dL, ALT 66 U/L, γGT 89 U/L.
L’elettroforesi capillare del siero mostrava proteine totali
6,6 g/dL,albumina 4,3 g/dL, γglobuline 0,6 g/dL; e l’
immunofissazione del siero mostrava la presenza di una
componente monoclonale IgG lambda pari a 1,16 g/dL.
L’ecografia dell’addome visualizzava anse intestinali con
parete di spessore aumentato e prive di vascolarizzazione
al color-doppler. Nello stesso periodo è insorta diarrea.
Fu eseguito un’ecocardiografia che documentava SIV 14
mm, PP 14 mm ed FE 50% , una successiva RMN
cardiaca mostrava un quadro sospetto per amiloidosi.
Un aspirato ed in seguito una biopsia del grasso periombelicale risultava positiva per la ricerca di sostanza
amiloide.
L’agoaspirato midollare documentava un infiltrato
plasmacellulare in media del 22%. I dati ottenuti
permettevano di porre diagnosi di amiloidosi AL (catene
leggere libere lambda).
Discussione: L’AL a localizzazione intestinale come
l’amiloidosi AL comportano un malassorbimento primitivo
causato da sostanza amiloide che infiltra i tessuti,
causando una perdita cospicua con le feci di acqua ed
elettroliti.
Nell’AL, l’ecografia del tratto intestinale mostra anse
intestinali con parete di spessore aumentato, prive di
vascolarizzazione al color-doppler.
Introduzione: L’amiloidosi primitiva da catene leggere
lambda (AL) è una patologia rara nella popolazione
generale, con un incidenza attorno al 5,1-12,8 milioni di
persone/anno.
L’AL a localizzazione epatica è dovuta a infiltrazione di
sostanza amiloide che imbottisce i tessuti.
L’esame ecografico dell’addome nell’AL a localizzazione
epatica mostra lesioni iperecogene con aree prive di
vascolarizzazione al color doppler.
Discutiamo il caso di un uomo con inappetenza, con
scadente stato nutrizionale.
di 65 anni inappetente, con peso corporeo di 55 Kg
(IMC= 19,5 Kg/m2), decremento ponderale di circa 10 Kg
avvenuto negli ultimi 6 mesi.
Gli esami bioumorali erano nella norma tranne per
bilirubina totale 4,15 mg/dL (V.N. <1,1 mg/dL), bilirubina
diretta 4,36 mg/dL (V.N. <0,25 mg/dL), ALT 144 U/L (V.N.
<40 U/L), AST 180 U/L (V.N. <137 U/L), γGT 3158 U/L
(V.N. <50).
L’elettroforesi capillare del siero mostrava proteine totali
6,5 g/dL,albumina 3,6 g/dL, γglobuline 0,7 g/dL; e l’
immunofissazione del siero mostrava la presenza di una
componente monoclonale IgG lambda pari a 1,73 g/dL.
L’ecografia dell’addome evidenziava aree iperecogene,
prive di vascolarizzazione al color doppler. Una RMN
dell’addome ha riscontrato fegato aumentato di volume
con segnale fibro-nodulare del IV, VI segmento.
Un ecocardiografia documentava SIV 16,1 mm, PP 12,7
mm ed FE 61%, riscontrando un quadro di amiloidosi
cardiaca.
Un’aspirato ed una biopsia del grasso periombelicale
hanno dato positività alla colorazione rosso Congo per la
ricerca di sostanza amiloide.
L’aspirato midollare ha documentato un infiltrato
plasmacellulare del 10%. I dati ottenuti permettevano di
porre diagnosi di amiloidosi AL (catene leggere libere λ).
Discussione: Il caso clinico evidenzia come l’ecografia
pur non rappresentando l’esame d scelta nell’AL epatica,
sia stata la prima indagine a sospettare malattia e
successivamente a permettere una completa stadiazione.
500
P143
HEMATOLOGIC RESPONSE TO LENALIDOMIDE
IN JAK2 V617F-POSITIVE ESSENTIAL
THROMBOCYTEMIA (TE) ASSOCIATED TO DEL(5q)
MYELODYSPLASTIC SYNDROME: A CASE REPORT
P144
STUDIO IN VIVO DELLE INTERFERENZE DA
FARMACI ANTINEOPLASTICI BIOLOGICI
NELLE TECNICHE ELETTROFORETICHE E
IMMUNOFISSATIVE
V. Russo
G. Illuminati , E. De Santis , M. Attanasio , F.
3
4
5
5
Pisani , C. Garufi , E. Longhi , A. Vernocchi , L.
1
1
Conti , G. Cigliana
Introduction: The JAK2 V617F somatic mutation is
the molecular marker most frequently detected in the
BCR/ABL negative myeloproliferative neoplasms (MPN).
Deletion of long arm of chromosome 5 (del5q) is
one of the most common cytogenetic abnormalities in
Myelodysplastic Syndromes (MDS). Here we describe
simultaneous occurrence of JAK2 V617F mutation and
del(5q) in a case of MDS successfully treated with
lenalidomide.
Methods: A 62-year-old woman had been treated with
hydroxyurea for 5 years because of a diagnosis of
Essential Thrombocytemia (ET) before admission to
our hospital for normocytic anemia (Hb 9,5 g/dL)
thrombocytosis (PLT 853x109/L) and mild leucopenia
(WBC 2,9x109/L). Bone marrow aspirate showed
increased number of megakaryocytes with dysplastic
features, dyserythropoiesis and dysgranulopoiesis, no
ringed sideroblast was observed; polymerase chain
reaction (PCR) was positive for JAK2 V617F mutation.
Results: Treatment with lenalidomide (10 mg/day on days
1 through 21 of repeated 28 days cycles) was started after
red blood cell transfusions.
Conclusions: Several authors have already reported the
presence of del(5q) in MPN as well as MDS with JAK2
V617F somatic mutation, furthermore some cases of ET
with concurrent presence of del(5q) and JAK2 mutation
have been referred and finally Ingram and coll. have
described six cases of MDS arboring del(5q) and JAK2
alteration. There is not yet an univocal evaluation of
the prognostic significance concerning the association of
JAK2 mutation and del(5q) in MDS or in MPN, in future
probably new entities will be identified with the more
extensive application of molecular investigation.
1
2
1
1
U.O. Patologia Clinica Istituto Nazionale Tumori
2
Dip. Medicina di Laboratorio Policlinico Universitario “A.
Gemelli”, Roma
3
U.O. Ematologia e Trapianti, Istituto Nazionale Tumori
4
U.O. Oncologia Medica A, Istituto Nazionale Tumori
5
Servizio di Medicina di Laboratorio IRCCS Multimedica,
Milano
Viste le interferenze da antineoplastici dallo studio
in vitro, è stato ideato e approvato dai rispettivi
Comitati Etici un protocollo di studio multicentrico in
vivo nel quale sono stati testati quattro farmaci biologici,
frequentemente utilizzati nei protocolli terapeutici
(Bevacizumab, Cetuximab, Trastuzumab e Rituximab)
allo scopo di evidenziare le loro interferenze nelle
metodiche di elettroforesi e di immunofissazione sierica.
Le tecniche utilizzate per il nostro studio sono l’EF zonale
su supporto solido, costituito da gel di agarosio (AGE),
l’EF zonale in fase liquida, rappresentata dalla EF zonale
capillare (CZE) e l’immuonofissazione (IF).
Sulla base dell’emivita dei quattro farmaci sono stati
definiti diversi tempi di prelievo. Per Cetuximab e
Rituximab, a più breve emivita, sono stati eseguiti un
primo prelievo prima della somministrazione, un secondo
al termine della somministrazione, un terzo dopo 1 giorno
ed un quarto dopo 3 giorni. Per il Bevacizumab e il
Trastuzumab, a emivita più lunga, sono stati eseguiti un
primo prelievo prima della somministrazione, un secondo
al termine della somministrazione, un terzo dopo 7 giorni
ed un quarto dopo 15 giorni.
I farmaci a più breve emivita, testati dall’istituto Nazionale
Tumori Regina Elena di Roma, hanno dato solo una
lieve interferenza in vivo, la quale scompariva del tutto
dopo 72 ore dall’infusione; al contrario, i dati ottenuti
con Bevcizumab e Trastuzumab, testati dall’istituto
MULTIMEDICA di Milano, dimostrano la chiara presenza
di un componente monoclonale, tipizzata IgG Kappa,
rilevabile in elettroforesi e dipendente dal dosaggio
somministrato. I dati emersi dal nostro studio dimostrano
come la segnalazione di una “falsa” e confondente
componente monoclonale o di un’alterazione del tracciato
possa interferire con il processo diagnostico terapeutico
assistenziale del paziente esaminato, aumentando i costi
relativi alla diagnostica di laboratorio e per immagini,
sottolineando l’importanza dell’appropriatezza prescrittiva
e interpretativa delle analisi elettroforetiche nonché la
necessità di fornire ai medici di laboratorio notizie cliniche
relative ai trattamenti in atto nei pazienti esaminati.
501
P145
THREE DIMENSIONAL CYTOLOGICAL ANALYSIS: A
NEW OPPORTUNITY IN HEMATOLOGIC DIAGNOSIS.
FIVE CASES OF CIRCULATING PLASMA CELLS
F. Fiorini, A. La Gioia, G. Badalassi, A. Barsotti, M.
In hematological diagnosis, the advent of analyzers
capable to count Red Blood Cells, White Blood Cells
and Platelets, measuring Hemoglobin level, performing
Leukocyte Differential Count and, sometimes the morphofunctional analysis of the various cellular populations, has
strongly impacted the quality of diagnostic information.
Automated hematology analyzer BC 6800 (Mindray,
China) is characterized by use of the SF Cube technology
(3D Cube) in analysis of circulating blood cells. Circulating
leukocytes and Erythroblasts, evaluated by laser scatter
and fluorescence, are plotted in two three-dimensional
cytograms (DIFF and NRBC) that can be rotate to
observe complexity, size and nucleic acids content. We
studied three-dimensional DIFF scattergram in five cases
of circulating plasma cells to evaluate if the 3D cube
rotation can help to improve microscopic quality review.
All samples present in two-dimensional DIFF scattergram
(fluorescence on X axis, forward scatter on Y axis) a
unique cluster extending from lymphocytic zone to the
high fluorescence cell (HFC) zone. On the contrary, threedimensional cytogram, after left-right rotation result very
different because the an HFC cluster is clearly shifted long
the cellular size axis, well separated from the monocytes/
lymphocytes cluster.
The additional clusters differ each other only by extension
and density but they have the same shape. The
microscopic review demonstrated in all cases circulating
plasma cells between 11% and 1%. The dislocation of
circulating plasma cells into three-dimensional cytogram
it look compatible with their important nucleic acid content
due to nuclear DNA and to cytoplasmic RNA as well
as with their variable cellular size. Although we cannot
exclude a reactive cause, circulating plasma cells are
a sign that should be evaluated with attention. In fact,
circulating plasma cells can report a previously unknown
plasma cells dyscrasia or, in cases of know plasma cells
disease, they can mark a progression of the disease and
its transformation in Plasma Cells leukemia. The threedimensional evaluation of 3D cytogram can we help to
improve microscopic review quality.
1. McKenna RW, Kyle RA, Kuehl W-M, et al. Plasma cell
neoplasm In: Swerdlow SH, Campo E, Lee Harris N. et
al WHO classification of tumours of haematopoietic and
lymphoid tissues. Lyon: IARC, 2008:200-2013
502
P146
STANDARDIZATION AND OPTIMIZATION OF
HEMOGLOBINOPATHY SCREENING IN THE
GREATER ROMAGNA AREA: AUDIT OF 2011-2013
ACTIVITY
1
1
2
1
M. Rosetti , G. Poletti , N. Tommasini , L. Baldrati , M.
1
1
4
5
Rondoni , M.S. Filippone , A. Mondaini , V. Polli , L.
1
3
1
Morotti , A. Sensi , R.M. Dorizzi
1
U.O Corelab, AUSL della Romagna, Lab. Unico di Area
Vasta Romagna, Pievesestina (FC)
2
U.O. Gestione Amministrativa Servizi Territoriali e
Ospedalieri, Settore Statisitco, AUSL della Romagna,
Lab. Unico di Area Vasta Romagna, Pievesestina (FC)
3
U.O. Genetica Medica, AUSL della Romagna, Lab.
Unico di Area Vasta Romagna, Pievesestina (FC)
4
Corso di Laurea in Scienze Biologiche, Univ. degli Studi
di Bologna
5
Scuola di Specializzazione in Biochimica Clinica, Univ.
degli studi di Siena
The Central Laboratory of Greater Romagna Area (AVR)
is a “Shared Resource Laboratory” (SRL) that since
2009 provides diagnostic activity for more than one
million inhabitants. The hemoglobinopathy screening,
previously carried out by four local laboratories, has been
consolidated and laboratory supervisors standardize and
optimize the results validation using a dedicated software
(DNLab, Noemalife, Bologna). Thirty (median) HbA2 and
HbF assays/day were carried in the haematology area
that integrates standard and specialized haematology
tests (including flow cytometry and coagulation) and
collaborates with the Medical Genetics Unit. The analytical
results obtained with HPLC analyzer (Tosoh HLC723G8, Tosoh Corporation, Tokyo, Japan) were firstly
assessed for the presence of any Hemoglobin (Hb)
variant and the suspected presence of a new case
of HbS was confirmed by sickle test. The results
obtained in the years 2011-2013 have been downloaded
from the LIS (DNLab) for verifying the HbA2 and HbF
intervals. 7700 results have been selected in subjects
with MCV>80<91fl and MCH>28<32pg, HbA2>1.3% and
HbF<4% to exclude most of thalassemia and HPFH
defects. We obtained the following reference limits
respectively for HbA2 (2.5-97.5 percentiles): 1.9-3.2%
and HbF (97.5 percentile): <1.7%. Moreover in the
years 2012-2013, adopting an algorithm including HbA2,
HbF, Red Blood Cell parameters and Iron status, we
detected 6.2% (962 cases) of thalassemia (4.3% of ß
and 1.6% suspected α or δ) and 2.5% (390 cases) of
Hb-variants (1.5% of HbS, 0.4% of suspected HbC). The
integration of HPLC graphs, hematological parameters
and Iron status adoption appropriate reference limits
can optimize the hemoglobinopathy screening. In the
SRL of AVR this aim has been obtained using a
software capable to display in a single PC screen all
these information including several notes to the report.
Furthermore, the hemoglobinopathy diagnostic service
consolidation improved the standardization of laboratory
procedures, and the collection of a large amount of data
is a very useful condition for professional training and
statistical data analysis.
P147
IMMATURE PLATELET FRACTION (IPF)
PARAMETRO UTILE NEL MONITORAGGIO
NEI SOGGETTI IN TERAPIA INTENSIVA? DATI
PRELIMINARI
1
2
1
S. Apassiti Esposito , P. Gabriele , L. Cerutti , G.
1
1
3
2
Azzarà , T. Mecca , C. Ottomano , G. Marchesi , A.
1
1
Crippa , S. Buoro
1
USC Laboratorio Analisi Chimico Cliniche A. O. Papa
Giovanni XXIII, Bergamo
2
USC Terapia Intensiva III A. O. Papa Giovanni XXIII,
Bergamo
3
UO Diagnostica Ematochimica Azienda Ospedaliera
Universitaria di Parma, Parma
Scopo: Il valore della frazione di piastrine immature
(IPF) può essere utile per valutare lo stato settico dei
pazienti critici (1). L’obiettivo è seguire l’andamento di
IPF % nei pazienti in Terapia Intensiva (UTI), durante
il ricovero e l’eventuale sviluppo di sepsi, e valutare la
correlazione con l’indice SOFA (Sequential Organ Failure
Assessment).
Materiali e metodi: Sono stati indagati 63 soggetti tra
21 e 90 anni senza malattie ematologiche di cui 18 con
epatopatia, ricoverati per più di 48 ore in UTI. Il conteggio
di IPF è stato eseguito su 566 campioni, utilizzando
SYSMEX XN (Sysmex, Kobe, Japan). I dati sono stati
elaborati con software Analyse-it 2.30.
Risultati: Il valore mediano di IPF % nei pazienti non
settici (n=41) è risultato pari al 4.1%. Nei pazienti settici
l’andamento dei valori mediani di IPF% è risultato: nei
giorni (gg) prima dello sviluppo di sepsi 4.0% a -3 gg, 4.4%
a -2 gg, 5.4% a -1 gg e 5.4% il giorno della diagnosi. I valori
mediani di IPF% nei giorni successivi alla diagnosi sono
risultati 5.9% a + 1 gg, 6,0% a + 2 gg, 6.9% a +3 gg e 6.7
a +4 gg senza tuttavia significatività. Se dall’elaborazioni
escludiamo i soggetti epatopatici, i valori mediani di IPF%
sono rispettivamente 4.1% a -3 gg, 4.5% a -2 gg, 5.3% a
-1 gg e 5.3% il giorno della diagnosi, mentre nello stesso
gruppo di soggetti i giorni successivi alla diagnosi i valori
mediani di IPF% sono 5.8% a + 1 gg, 6.0% a +2 gg, 6.9%
a +3 gg e 4.4% a +4gg. Nonostante si confermi il trend in
crescita non sono state rilevate differenze significative. Si
evidenzia invece un’elevata significatività fra indice SOFA
e IPF% (p <0.0001). Il valore mediano di IPF% varia nei
soggetti con SOFA <5, fra 6 e 10, tra 11 e 15 e >15 e
risulta rispettivamente pari a 3.9%, 5.9%, 7.8% e 13.2%.
Conclusioni: I valori di IPF % sono più elevati nei
pazienti settici rispetto ai non settici. Nei pazienti settici si
osserva un incremento progressivo di IPF%, l’assenza di
differenze significative può essere dovuta alla numerosità
del campione. L’elevata correlazione tra IPF% e SOFA
indica che questo parametro potrebbe essere utilizzato
come fattore prognostico sfavorevole nei pazienti critici.
1. De Blasi RA, Cardelli P, Costante A, et al. Immature
platelet fraction in predicting sepsis in critically ill patients.
Intensive Care Med 2013;39:636-43.
P148
SYSMEX XN: INTERVALLI DI RIFERIMENTO DEI
RETICOLOCITI NELLA POPOLAZIONE DELLA
PROVINCIA DI BERGAMO
G. Azzarà, S. Apassiti Esposito, T. Mecca, E. Lochis, P.
Dominoni, A. Crippa, S. Buoro
USC Laboratorio Analisi Chimico Cliniche A.O. Papa
Giovanni XXIII, Bergamo
Scopo: L’esame emocitometrico corredato dal conteggio
dei Reticolociti totali (RET) con indici maturativi (LFR,
MFR, HFR, IRF), dal contenuto medio di emoglobina
dei RET (RET-He) e dalla differenza tra il contenuto
emoglobinico dei reticolociti e quello degli eritrociti
(Delta-He) concorre all’inquadramento e al monitoraggio
dell’anemia. Per contestualizzare i risultati è necessario
disporre dei relativi intervalli di riferimento (IR). Questo
studio si propone di valutare gli IR per RET, le frazioni
LFR, MFR, HFR, RET-He e Delta-He nella popolazione
locale.
Materiali e metodi: La determinazione di tutti i parametri
è stata eseguita utilizzando l’analizzatore SYSMEX XN
(Sysmex, Kobe, Japan) con App RET, secondo le
specifiche del costruttore. 110 soggetti non consecutivi
(53 donne e 57 uomini), di età compresa tra i 19 e i
61 anni (media 42), sono stati reclutati con il criterio di
selezione a priori per assenza di malattie conclamate,
valori di emocromo e formula, creatinina, AST, ALT, LDH,
glucosio, proteina C reattiva e ferritina nella norma. I dati
sono stati elaborati mediante software Analyse-it vers.
2.3.
Risultati: Dall’analisi dei dati si è ottenuto un valore
mediano di RET (%) pari a 1,09 con IR 0,6-1,9; per
gli indici maturativi sono stati ottenuti rispettivamente
un valore mediano per IRF% di 6,75 con IR 3,5-12,7,
per LFR% di 93,5 con IR 87,2-96,5, per MFR% di
6.20 con IR 3.4-11.1. Per tutti gli altri parametri sono
state osservate differenze statisticamente significative (p
<0.05) fra i gruppi “femmine” e “maschi”, rispettivamente
9
con i seguenti valori mediani: RET (#) 49,0*10 /L vs 58,0;
RET-He 32,9 pg vs 33,8; Delta-He 2,6 pg vs 3,0; HFR%
0,5% vs 0,8.
Discussione e conclusioni: I risultati della determinazione
dell’emoglobina e dei principali parametri derivati
dell’emocromo correlano con i dati della letteratura, così
come il valore di RET% e delle frazioni immature. Le
differenze statisticamente significative tra generi per il
conteggio RET#, per la frazione HFR%, per RET-He e
per Delta-He (p<0.05) sono attese e spiegabili proprio
nella diversa fisiologia di genere. I dati sono comunque
preliminari e sarà necessario ampliare la casistica per
confermare i risultati ottenuti e i rispettivi IR.
Piva E, et al. Clin Chem Lab Med 2010.
503
P149
INFLUENZA DELL’EMOLISI IN VITRO SUL
CONTEGGIO DELLE PIASTRINE IN QUATTRO
ANALIZZATORI EMATOLOGICI
P150
SYSMEX XN: CONFERMA INTERVALLI DI
RIFERIMENTO PIASTRINE (PLT) E IMMATURE
PLATELET FRACTION (IPF) NEI SOGGETTI ADULTI
E. Grimaldi, P. Carandente Giarrusso, E. D'Addio, M.
Amalfitano , A. Pirone
E. Apassiti , G. Azzarà, T. Mecca, P. Dominoni, P.
Gherardi, A. Crippa, S. Buoro
D.A.I. di Medicina di Laboratorio, Azienda Ospedaliera
USC Laboratorio Analisi Chimico Cliniche A.O. Papa
Giovanni XXIII Bergamo
Il riscontro di campioni emolizzati ha una prevalenza
vicina al 3% di tutti i campioni ricevuti in laboratorio e,in
quest’ambito,l’emolisi in vitro è la principale causa di
non idoneità. Mentre per i campioni di siero o plasma
l’emolisi è evidenziabile visivamente,per i campioni di
sangue intero destinati all’esame emocromocitometrico
ciò non è possibile e quindi poco si conosce degli
effetti dell’emolisi su questo esame.Scopo del nostro
studio è stato quello di valutare l’influenza dell’emolisi
in vitro sul conteggio delle piastrine eseguito da quattro
analizzatori ematologici: Siemens ADVIA2120,Horiba
PENTRA DX120,Beckman-Coulter LH750 e Abbott CD
SAPPHIRE. Sono stati prelevati 20 campioni di sangue,
ognuno diviso in diverse aliquote;è stato effettuato un
esame emocromocitometrico su ciascuno dei campioni
e successivamente è stata misurata l’emoglobina
plasmatica. Le diverse aliquote sono state sottoposte ad
emolisi meccanica secondo il metodo descritto da Dimeski
(2004) mediante un numero crescente di passaggi
attraverso un ago sottile al fine di produrre quantità scalari
di emolisi. Le aliquote così trattate sono stati analizzate e
successivamente centrifugate per misurarne l’emoglobina
plasmatica per la valutazione del grado di emolisi
ottenuta.In nessuno dei campioni originari era presente
emolisi significativa,mentre il passaggio attraverso l’ago
ha determinato un’emolisi crescente proporzionale al
numero di passaggi (Hb plasmatica da 0.23 a 10.7g/L). Di
tutti gli analizzatori testati solo ADVIA2120 ha mantenuto
un bias inferiore a quello desiderabile per il conteggio
delle piastrine (6%) fino ad una concentrazione di Hb
plasmatica di 4 g/L, corrispondente a circa il 6% di lisi
eritrocitaria.Gli altri analizzatori hanno evidenziato valori
di bias >6% già per livelli di Hb plasmatica tra 0.5 e 1.0
g/L, rispettivamente corrispondenti circa a 0.8 e 1.6%
di lisi.Il nostro studio conferma che in caso di emolisi
gli analizzatori ematologici, indipendentemete dal metodo
utilizzato per la conta delle piastrine, tendono alla loro
sovrastima,non riuscendo a distinguerle dai frammenti
eritrocitari. Solo ADVIA2120, valutando anche l’indice di
rifrazione e non solo la dimensione,riesce, entro il limite
del 6% di lisi,a fornire una conta piastrinica più accurata.
Dimeski G. Clin Chem 2004;50:976-7.
Scopo: Il conteggio delle piastrine (PLT), associato a
parametri come la Frazione di Piastrine Immature(IPF#
e %), il Volume Piastrinico Medio (MPV), la distribuzione
volumetrica (PDW) e la percentuale di piastrine grandi
(P-LCR%), può essere utile per l’inquadramento e il
monitoraggio delle piastrinopenie e delle piastrinosi.
L’obiettivo è quello di verificare gli intervalli di riferimento
(IR) dei principali parametri piastrinici forniti da XN nella
popolazione adulta considerata.
Materiali e metodi: Per il conteggio delle PLT e
la determinazione dei parametri sopra citati è stato
impiegato l’analizzatore Sysmex XN (Sysmex, Kobe,
Japan) secondo le specifiche del costruttore. Sono stati
indagati 110 campioni di soggetti (57 maschi e 53
femmine) con età compresa fra 19 e 61 anni, reclutati
con criteri di selezione a priori per assenza di malattie
conclamate, valori di emocromo e formula, creatinina,
AST, ALT, LDH, glucosio, proteina C reattiva e ferritina
nella norma. I dati sono stati elaborati con il software
Analyse-it 2.30.
Risultati: Per tutto il campione preso in esame si è
504
9
ottenuto un valore mediano di PLT di 229,5*10 /L con IR
157,6-340,8. I valori mediani nel gruppo di sesso maschile
9
e femminile, rispettivamente di 222*10 /L e di 236*109/
L, danno evidenza di una differenza statisticamente
significativa con p <0.05. Mentre non sono state rilevate
differenze significative di genere per i seguenti parametri
9
e relativi IR: IPF# mediana di 7,1*10 /L e IR di 2,4-14,48,
IPF% mediana di 3% e IR di 1,2-6,66%, MPV mediana
di 11,2 fL e IR di 9,5 -12,67, PDW mediana di 13,75 fL
e IR di 10,61-17,3 e P-LCR% mediana 35,25 fL e IR di
21,11-48,04.
Conclusioni: I valori mediani e gli IR di IPF% e degli
altri parametri analizzati con XN concordano con quelli
riportati in letteratura per XE-2100 e XE-5000 (1). Si
confermano il valore mediano per le PLT e per i
parametri morfologici piastrinici precedentemente ottenuti
nella popolazione adulta della provincia di Bergamo con
XE2100. È necessario comunque confermare i dati su una
più ampia popolazione. Appare utile completare lo studio
valutando soggetti di aree geografiche diverse.
1. Briggs C. Quality counts: new parameters in blood cell
counting. Int J Lab Hematol 2009;31:277-97.
P151
UN CASO DI ANEMIA MEGALOBLASTICA IN UNA
PAZIENTE ANORESSICA
P152
IMAGING ECOGRAFICO DELLA POLICITEMIA VERA
NELLA DIAGNOSI DI TROMBOSI EPATICA
V. Russo
V. Russo
Introduzione: L’Anoressia Nervosa (AN) è una malattia
caratterizzata da severa malnutrizione. Nelle persone
malnutrite si possono riscontrare carenze vitaminiche
(vitamina B12 e folati) ed una significativa riduzione nei
livelli sierici porta ad un quadro ematologico di anemia
megaloblastica. Descriviamo un caso di una ragazza
anoressica con deficit di vitamina B12 e folati.
Presentazione del caso: Riportiamo il caso di una giovane
donna, di 24 anni, con diagnosi di AN posta secondo i
criteri del DSM IV. In particolare erano presenti: Riduzione
del peso corporeo a livelli minori dell’85% del limite
inferiore del peso atteso per la statura; Immagine distorta
del proprio corpo, con estremo timore di guadagnare
peso; Comportamento alimentare compulsivo di tipo
anoressico-bulimico con autoinduzione del vomito. La
paziente giunse alla nostra osservazione con astenia e
pallore di cute e mucose. Negli ultimi due mesi aveva
iniziato una progressiva restrizione alimentare culminata
in un vero e proprio digiuno. Presso l’ambulatorio
del Dipartimento di Ematologia dell’Università di Napoli
Federico II, erano stati eseguiti esami bioumorali che
risultavano nella norma tranne per Hb 9,4 g/dl (V.N. 12-16
g/dL); G.R. 3.940.000 µl (V.N. 4/5,4 µl); MCV 120 fl (V.N.
80-97 fl); vitamina B12 195,6 pg/dl (V.N. 197-866 pg/dl);
folati 1,39 ng/ml (V.N. 3-16,5 ng/dl).
Discussione: Sintomi caratterizzanti in questa paziente
erano l’astenia e il pallore di cute e mucose. L’insieme
dei dati clinici ed ematochimici evidenziava la presenza di
una anemia secondaria a malnutrizione in paziente con
AN. L’esame emocromocitometrico della nostra paziente
documentava un valore di emoglobina inferiore alla norma
ed un MCV >100 fl; il dosaggio di vitamina B12 e folati
confermava la carenza, orientando per un quadro di
anemia megaloblastica.
Le cause principali di anemia megaloblastica sono le
carenze dietetiche come quelle riscontrate in pazienti con
AN.
Questo caso evidenzia come in pazienti particolarmente
delicate come le anoressiche, i deficit di vitamina B12 e/
o folati se non identificati precocemente, concorrono ad
aggravare il quadro clinico.
Introduzione: La policitemia vera (PV) è una malattia
mieloproliferativa cronica caratterizzata dall’aumento
della massa eritrocitaria, stimata dai valori di ematocrito
ed emoglobina.
La trombosi delle vene sovraepatiche è una complicanza
vascolare della PV.
All’esame ecografico B-mode il trombo pùò apparire come
lesione ipoecogena ed il color doppler registra assenza di
flusso.
Descriviamo il caso di un paziente con PV con
epatomegalia e trombosi delle vene sovraepatiche.
di 67 anni, che giunge presso il nostro ambulatorio per il
riscontro occasionale all’esame emocromocitometrico di
eritrocitosi.
Il paziente era asintomatico e l’esame obiettivo
riscontrava organomegalia con fegato a circa 2 cm
dall’arcata costale.
Presso l’ambulatorio del Dipartimento di Ematologia
dell’Università degli studi di Napoli Federico II furono
eseguite indagini ematochimiche che riscontravano un
aumento del LDH (720 U/L), un aumento del fibrinogeno
(400 mg/dL), un emocromo con Hb 18 g/dL (V.N. 14-17,5
g/dL) ed ematocrito 48% (V.N. 38,8-46,4).
L’ecografia dell’addome mostrava la presenza di una
formazione ipoecogena all’ottavo segmento epatico di
circa 3 cm con vene sovraepatiche di calibro aumentato;
il color-doppler confermava una trombosi con assenza di
flusso.
In seguito il paziente risultava positivo alla valutazione
da sangue periferico per la mutazione JAK2V617F ed
inoltre erano soddisfatti i criteri diagnostici aggiuntivi di
policitemia vera.
Discussione: Il paziente con PV, può essere asintomatico;
quando sono presenti dei sintomi, essi possono
essere dovuti all’aumentata massa eritrocitaria, legati
all’iperviscosità ed alle trombosi, sia venose che arteriose.
La trombosi delle vene sovraepatiche è una complicanza
vascolare del paziente con PV.
Nei casi di trombosi recente, come il nostro
paziente, il trombo può apparire ipoecogeno difficilmente
evidenziabile in ecografia B-mode.
Il color-doppler, come nel nostro caso, assume
preminente importanza nel sospetto di trombosi recente
delle vene sovraepatiche,
505
P153
UN CASO DI CARENZA DI ZINCO IN UNA PAZIENTE
ANORESSICA
V. Russo
Introduzione: L’Anoressia Nervosa (AN) è una malattia
caratterizzata da severa malnutrizione con riduzione del
tessuto adiposo ed ipotrofia delle masse muscolari. Si
tratta di una malnutrizione proteico-energetica (MPE)
che si associa a numerose alterazioni biochimiche,
coinvolgendo molti oligoelementi, tra i quali lo zinco, del
quale causa una significativa riduzione nei livelli sierici.
Descriviamo un caso di una ragazza anoressica con
deficit di zinco.
Caso clinico: Riportiamo il caso di una giovane donna con
diagnosi di AN posta secondo i criteri del DSM IV (5).
In particolare erano presenti: Riduzione del peso corporeo
a livelli minori dell’85% del limite inferiore del peso atteso
per la statura; Immagine distorta del proprio corpo, con
estremo timore di guadagnare peso; Comportamento
alimentare compulsivo di tipo anoressico-bulimico con
autoinduzione del vomito. La paziente giunse alla
nostra osservazione con questa storia clinica: astenia e
ipogeusia, inoltre non si alimentava correttamente ed era
in uno scadente stato nutrizionale (Peso Kg 48; h m 1,83;
BMI: 14,1 Kg/m2).
Presso l’ambulatorio del Dipartimento di Ematologia
dell’Università di Napoli Federico II (Direttore prof. F.
Pane) erano stati eseguiti esami ematochimici che
risultavano nella norma tranne per zinchemia = 48 µg/
dL (V.N. 75-120 µg/dL). La paziente ha inoltre eseguito
ecografia dell’addome, radiografia standard del torace ed
ECG che sono risultati nella norma. Successivamente
è stata intrapresa terapia con integratori multivitaminici
contenenti oligoelementi, tra i quali lo zinco per correggere
il deficit.
Discussione: Questo caso evidenzia come la MPE in
pazienti particolarmente delicate come le anoressiche,
può contribuire all’instaurarsi di deficit di oligoelementi, tra
i quali lo zinco.
Non è semplice sospettare una lieve carenza di zinco (Zn
<70 mg/dL), perché molti dei segni e sintomi che essa
provoca non sono specifici.
Essi includono: anoressia, ipogeusia, letargia mentale.
L’identificazione precoce e la correzione del deficit di
zinco evita che si aggravi un quadro clinico già delicato
come quello delle anoressiche con MPE.
506
P154
ANTI PHOSPHATIDYLSERINE–PROTHROMBIN
ANTIBODIES (aPT/PS) REFERENCE RANGES AND
ASSOCIATION WITH MANIFESTATIONS OF THE
ANTIPHOSPHOLIPID SYNDROME (APS)
1
1
1
1
E. De Luna , B. Montaruli , L. Erroi , C. Marchese , D.
1
2
2
1
Cosseddu , M.T. Bertero , A. Kuzenko , M. Migliardi
1
Laboratory Analysis, AO Ordine Mauriziano, Turin, Italy
Immunology Department AO Ordine Mauriziano, Turin,
Italy
2
Aim of study: Aim of our study were to determine upper
limit reference ranges (99th percentile) of IgG and IgM
aPT/PS with a new commercial immunoassay, to evaluate
the analytic performances of these reference ranges and
to study their clinical significance in 118 consecutive
patients referred to our laboratory investigated for APS
associated pregnancy and/or thrombotic complications
and/or autoimmune diseases.
Material and Mehtods: To obtain reference ranges
(calculated 99th percentile) we assayed IgG and IgM
aPT/PS (QUANTA Lite-INOVA Diagnostics, Inc.) in 104
serum samples of patients asymptomatic for thrombosis,
pregnancy morbidity, tumors, infections and autoimmune
diseases (34 males and 70 females). To investigate
the analytical performances of our new cut-off limits,
we studied 118 consecutive patients (20 males and
98 female) investigated for APS clinical findings and/
or autoimmune diseases. IgG and IgM anticardiolipin
(aCL) antibodies and their b2-glycoprotein I (b2GPI)
dependency were also evaluated by ELISA. Lupus
Anticoagulant (LA) was tested by 2 different methods.
Results: 99th percentile were calculated: IgG aPT/PS
= 41 U/mL and IgM aPT/PS = 51 U/mL. Sensitivity
and specificity for the immunoassay used with the
manufacturer’s and 99th percentile cut-off values for
IgG and IgM aPT/PS were evaluated in patients with
(n=54) and without (n=64) APS For classification of
patient samples as far as the clinical features are
concerned, in house and insert cut-off values gave,
comparable conclusions. A significant clinical association
was observed only between clinic features (pregnancy
and/or thrombotic complications) and IgG aPT/PS
positivity with both in house and manufacturer’s cut offs
[manufacturer’s cut (30 U/mL) off OR = 3.0; p=0.0087 and
99th (41 U/mL) percentile cut off OR=3.3; p=0.0083] and
aPS/PT antibodies were as specific as b2GPI-dependent
aCL for APS (82.8% for IgG aPT/PS and 80.6% for b2GpI
IgG). IgG aPS/PT strongly correlated with the presence of
LA (OR 8.75, p <0.0001).
Conclusions: In conclusion we observed that 99th
percentile and the manufacturer’s cut-offs of ELISAs
aPT/PS are similar and have similar performances. The
presence of IgG aPS/PT significantly correlated with
clinical manifestations of APS and with LA. Therefore
testing for aPT/PS can contribute to a better identification
of APS patients.
P155
DISFIBRINOGENEMIE: UN RISCONTRO
OCCASIONALE DI LABORATORIO O ANCHE UN
PROBLEMA CLINICO SOTTOVALUTATO?
1
2
1
1
L. LoCoco , S. Siragusa , M. Ciaccio , C. Colletti , S.
1
1
1
1
2
Vitale , S. Vitale , E. Zora , F. Nicolosi , M. Napolitano
1
U.O.C. - Analisi Chimico-Cliniche – CoreLab; Policlinico
“P.Giaccone”, Palermo
2
U.O. C. Ematologia con Trapianto-Centro di
Riferimento Regionale per le Emocoagulopatie,
Policlinico “P.Giaccone”, Palermo
Obiettivi: Il termine “disfibrinogenemia” si riferisce
ad anomalie congenite o acquisite del fibrinogeno.
Pazienti affetti da disfibrinogenemia congenita possono
aver eventi trombotici, emorragici o essere del tutto
asintomatici. Obiettivo del presente lavoro è stato studiare
otto famiglie con riscontro occasionale di ridotti livelli di
fibrinogeno funzionale
Materiali e metodi: Sono stati arruolati nel presente
studio sedici pazienti appartenenti a otto nuclei familiari,
visitati presso la UO di Ematologia del Policlinico
“P.Giaccone” per riscontro pre-operatorio di bassi livelli
di fibrinogeno funzionale. Sul plasma di ciascun soggetto
sono stati determinati PT, aPTT, TT e TR nonchè
dosaggio di fibrinogeno funzionale (fibrinogeno Clauss), e
immunologico (nefelometrico). Sono state inoltre escluse
eventuali cause secondarie di disfibrinogenemia tramite
determinazione di indici di funzionalità epatica, dosaggio
di alfa-fetoproteina, elettroforesi delle proteine sieriche,
dosaggio di immunoglobuline. In tutti i pazienti, in
presenza di risultati anomali, il test è stato ripetuto per
conferma.
Risultati: I pazienti arruolati erano tutti affetti da
disfibrinogenemia, presentavano nel 31.2% (5/16) dei
casi una anamnesi personale (3/16) o familiare
(2/16) positiva per eventi trombotici. I risultati
dei test effettuati (media +/- deviazione standard)
sono stati: Fibrinogeno sec. Clauss: 97.38+/-47.57
mg/dL; Fibrinogeno antigenico: 254.75+/-90.3 mg/
dL; TT: 31.48+/-11.91 sec; RT=29.84+/-10.02 sec.
Nessun soggetto presentava cause secondarie di
disfibrinogenemia. Tutti i casi indice studiati(n=6) sono
stati sottoposti a procedura chirurgica (4 interventi
di chirurgia minore e 2 di chirurgia maggiore) con
indicazione a profilassi antitrombotica in coloro che
avevano storia di trombosi. Un intervento chirurgico
minore (per cisti sebacea) è stato complicato da
sanguinamento, controllato con terapia topica.
Conclusione: Una valutazione clinico-laboratoristica
accurata di pazienti con ipofibrinogenemia rappresenta
un importante strumento per escludere eventuali
disfibrinogenemie che possono essere associate a
sintomi clinici (trombosi, emorragie) in una percentuale
non trascurabile di casi.
de Moerloose P, Casini A, Neerman-Arbez M. Congenital
fibrinogen disorders: an update. Semin Thromb Hemost
2013;39:585-95.
P156
POLIABORTIVITA E MUTAZIONI DI MTHFR
R. Lanzano, M.P. Bruno, N. Napolitano, I. Gargano, A.
Morello, A. Lanzano
Laboratorio di Biochimica Clinica econda Universita' di
Napoli (SUN)
Una delle maggiori cause di poliabortività e' associata
con trombofilie in sede utero-placentare.Esiste un'
associazione tra abortività ricorrente e stati trombofilici
legati alla presenza di anticorpi antifosfolipidi o deficit
degli inibitori fisiologici della coagulazione (2)deficit di
AT III,deficit di prot.S e/o C. Non c'e'ancora chiarezza
riguardo al ruolo giocato dal Fattore V Leiden (FV
G1691A), dalla mutazione della protrombina G20210A
(PT G20210A) e dalla variante C677T della metilen
tetraidrofolato reduttasi (MTHFR C677T) nel determinare
l’aborto precoce ricorrente. Le regioni geniche, in cui sono
localizzate le mutazioni G1691A del fattore V, G20210A
della protrombina e C677T della MTHFR amplificate
con PCR , mediante l’impiego di specifiche coppie
di oligonucleotidi; successivamente i prodotti amplificati
sono digeriti con specifici enzimi di restrizione (MnlI,
HindIII e HinfI – DASIT). In tutte le pazienti è stata
eseguita la ricerca degli anticorpi anticardiolipina ed
il lupus anticoagulante per escludere la sindrome da
anticorpi antifosfolipidi; inoltre, sono stati dosati la proteina
C, la proteina S e l’antitombrina III (Roche) per escludere
il deficit da inibitori fisiologici della coagulazione. La
maggior parte delle pazienti (301) ha presentato aborto
nel primo trimestre, solo 5 pazienti hanno riferito almeno
un aborto nel secondo trimestre. 26 pazienti portatrici
del Fattore V Leiden in eterozigosi e 16 portatrici della
mutazione G20210A del gene della protrombina, sempre
in eterozigosi. La variante C677T della MTHFR è stata
osservata in 205 donne, 141 in eteroz.e 64 in omoz, con
una frequenza rispettivamente del 46,1% e del 21%. Tra
le 5 pazienti con una storia di aborto nel secondo trimestre
non sono state riscontrate le alterazioni gen. studiate. Tra
le pazienti portatrici del Fattore V Leiden in eterozigosi
9 sono risultate eterozigoti e 4 omozig. per la variante
C677T della MTHFR. La mutazione G2021A del gene
della PT è risultata associata in 10 pazienti con la variante
C677T della MTHFR in eteroz. ed in 3 pazienti in omozig.
Le restanti 16 pazienti presentano la variante wild type
della MTHFR
I risultati suggeriscono che lo screening per le 3 varianti
gen. è utile nelle donne che hanno avuto episodi di poliab.
le prevalenze riscontrate sono significativamente
superiori a quelle della popolazione generale.
507
P157
CASE REPORT OF LABORATORY COAGULATION
PARAMETERS AND HEMODIALYSIS OF A 85-YEAROLD MAN WITH DABIGATRAN OVERDOSE
1
1
2
2
B. Montaruli , L. Erroi , C. Vitale , S. Berutti , D.
1
3
4
Cosseddu , P. Sivera , R. Coglitore , M.
2
1
Marangella , M. Migliardi
1
Laboratory Analysis Department, AO Ordine
Mauriziano, Turin, Italy
2
Nephrology and Dialysis Department, AO Ordine
3
Haematology Department, AO Ordine Mauriziano,
Turin, Italy
4
Cardiovascular Intensive Care Unit. AO Ordine
Dabigatran is an oral direct oral inhibitor indicated for
stroke prevention in patients with atrial fibrillation. Unlike
warfarin, dabigatran’s observed therapeutic window and
minimal drug to drug interaction suggest that laboratory
test and dose adjustment is not necessary; nevertheless
circumstances of excessive anticoagulation, decreased
kidney function, instances of significative bleeding and
thrombosis, require laboratory assessment.
In order to gather experience in the management of
global [Activated Partial Thromboplastin Time (APTT)
and Thrombin Time (TT) with extended end point] and
specific [(Ecarin Chromogenic Assay (ECA) and diluted
Thrombin Time (dTT)] laboratory coagulation tests in
patients receiving Dabigatran with untoward effects, we
describe a case in which hemodialysis was used in
attempt to remove dabigatran in a patient with excessive
anticoagulation, rectal bleeding and severe anemia.
Our experience confirmed that APTT is an unreliable
method for assessment of dabigatran in patients with
acute complications because was often normal in spite
of therapeutic drug plasma levels. Both ECA and dTT
showed a linear correlations with dabigatran levels
over a broad range and identified therapeutic and
supratherapeutic levels. TT assay, with is highly sensitivity
to dabigatran, correlated well and linearly not only with
low drug levels, but also, because of the introduction
of the extended endpoint (400 seconds), with high
concentrations of the drug and demonstrated to be a
simple and reliable alternative to ECA and dTT to assess
dabigatran in patients with acute complications.
508
P158
MONITORING OF COAGULATION STATUS IN A
PATIENT WITH RENAL FAILURE AND DABIGATRAN
TREATMENT
P. Ranieri, R. Lovero, R. Contino, A. Lamanna, S.
Petruzzellis, F. Di Serio
U.O. Patologia Clinica I, Azienda Ospedaliero
Universitaria Policlinico Consorziale, Bari
In patient with atrial fibrillation (AF) an ideal anticoagulant
should not require monitoring and its pharmacokinetic
should be well defined also in patients with renal or
hepatic disease. Dabigatran etexilate, a direct thrombin
inhibitor, has an anticoagulant activity of 2-3 hours after
ingestion and half-life of 14-17 hours in patients with
creatinine clearance (CrCl) normal or superior to 30 mL/
min. The half-life increased to 27 hours in patients with
CrCl less than 30 mL/min (1). Thus, the renal impairment
increases the risk of stroke and bleeding in patients
with AF. Since some patients with renal failure may
accumulate the drug, we wish to know how long the
dabigatran effects are detectable in the plasma patient,
and how the drug influences the screening coagulation
tests. Methods: An 83-year-old woman treated with
dabigatran 75 mg twice/daily for AF and CrCl <30 mL/
min was programmed for parotidectomy surgery when
her coagulation parameters were normalized. To measure
PT, APTT and thrombin time (TT) Innovin, Actin FSL,
and Thromboclotin (Siemens) were used respectively.
The dabigatran plasma concentrations were assayed with
diluted TT (dTT), a sensitive dabigatran-calibrated TT. All
tests were performed on the CS5100 Siemens. Results:
The coagulation times (seconds) were: PT 39, aPTT
74, TT >100 and dTT 84 (dabigatran plasma = 231 ng/
mL) during dabigatran treatment; PT 12, aPTT 38, TT
>100 and dTT 41 (dabigatran plasma = 131 ng/mL) after
one week by drug suspension; PT 11, aPTT 29, TT
68 and dTT 28 (dabigatran plasma 40 ng/mL) after two
weeks; PT 11, aPTT 32, TT 21 and dTT 23 (dabigatran
plasma < 30 ng/mL) after three weeks. Conclusions:
Our case report shows that APTT and TT normalize
slowly after suspension of dabigatran and to exclude the
anticoagulant effect of drug, dTT represents a valuable
tool. Accurate considerations should be taken before
surgery in patients with renal impairment.
1. van Ryn J. Thromb Haemost 2010
P159
PERSISTENTE ALLUNGAMENTO DI INR
NORMALIZZATO DALLA CONTEMPORANEA
SOMMINISTRAZIONE DI VITAMINA K E STEROIDI
1
2
1
2
L. LoCoco , S. Siragusa , M. Ciaccio , P. Arfò , L.
1
1
1
2
Schillaci , A. Caruso , R. Gnoffo , M. Napolitano
1
U.O.C. - Analisi Chimico-Cliniche – CoreLab; Policlinico
“P.Giaccone”,Palermo;
2
U.O. C. Ematologia con Trapianto-Centro di
Riferimento Regionale per le Emocoagulopatie,
Policlinico “P.Giaccone”,Palermo
Obiettivi: Riportiamo il caso di una paziente
improvvisamente sintomatica per ecchimosi ed ematomi
diffusi in cui è stato riscontrato notevole allungamento
di INR, scarsamente responsivo al solo trattamento con
vitamina k ma con brillante risposta alla terapia steroidea
Materiali e metodi: Una paziente dell’età di 55 anni
si è rivolta al nostro PS per la improvvisa comparsa
di ecchimosi, ematoma gluteo sinistro e epistassi. In
anamnesi, la paziente riferiva artrite reumatoide e
ipertensione arteriosa. Sono stati effettuati emocromo
con esame dello striscio periferico,indici di funzionalità
epatica e renale, indagini di coagulazione di I livello
(PT, aPTT, fibrinogeno) e successivamente indagini di II
livello [mixing test, dosaggio fattori della coagulazione,
Antitrombina, Proteina C e S anticoagulante, Lupus
Anticoagulant (LAC), Anticorpi anti-cardiolipina, anticorpi
anti beta2-glicoproteina1]. Sono stati inoltre determinati
gli stessi parametri coagulativi a distanza di 1 e 24
ore dopo somministrazione endo-venosa di vitamina
k e successivamente, in considerazione della scarsa
risposta, in seguito ad aggiunta di steroide a dosi
immunosoppressive.
Risultati: Alle indagini di coagulazione basali si
evidenziava: PT (INR) non misurabile e sensibile
allungamento dell’aPTT (86.6 sec), livelli molto ridotti di
Fattori II (7.8%), VII (1.4%), IX (14.3%), X (9.7%) con
normalità del FV (98.3%), riduzione dei livelli di Proteina
C (9%) e Proteina S (17.7%) anticoagulante,positività per
LAC, ACA (IgM=113 U/mL, IgG=31.7 U/mL) e anticorpi
anti-beta2Gp1 (IgG=63.8 U/ml, IgM=52.2 U/mL). Tali
parametri venivano corretti solo parzialmente al mixing
test, e dopo vitamina k mentre risultavano normalizzati
dalla combinazione di steroide e vitamina k con i
seguenti risultati, a distanza di 24 ore dal trattamento:
INR:1.18, aPTT=36 sec, FII=30%, FVII=38%, FIX=90.6%,
FX=35.2%, PC=46%, PS=40.1%. La paziente dopo
steroide presentava sanguinamenti.
Conclusioni: La presenza di anticorpi incompleti può
interferire come già noto con i test di coagulazione,in
particolare fosfolipide dipendenti, nel caso riportato
l’allungamento di INR e aPTT è stato controllato dalla
somministrazione combinata di trattamento steroideo e
vitamina k.
Kershaw G, Favaloro EJ. Laboratory identification of
factor inhibitors: an update. Pathology 2012;44:293-302.
P160
WHICH COAGULATION TEST SHOULD BE
PERFORMED IN EMERGENCY DURING
DABIGATRAN TREATMENT?
P. Ranieri, L. Loiodice, E. Mascolo, P. Colasuonno, A.
Sollecito, F. Di Serio
U.O. Patologia Clinica I, A.O.U. Policlinico Consorziale,
Bari
Antithrombotic treatment represents a wide spectrum of
drugs with marked differences in pharmacologic effects.
The oldest indirect drug is the unfractionated heparin
(UFH) which interacts with antithrombin, dabigatran, a
new oral anticoagulant (NOA), on the contrary, is a
direct thrombin inhibitor (DTI) with a more predictable
anticoagulant response than UFH. Although routine
laboratory monitoring is not required during treatment
with NOA, global coagulation assays are performed
after drugs administration for perioperative management.
Published studies show a linear relationship between
the aPTT and dabigatran plasma or UFH concentration.
The aim of the study is to know which coagulation
test should be performed in emergency, and how the
aPTT ranges in patients subjected to UFH or dabigatran
treatment. Methods: The study included 10 patients
hospitalized in dabigatran treatment and 10 patients in
UFH iv. treatment, analyzed before surgery or an invasive
procedure. Patients were 75-years-old (average) with
glomerular filtration rate (GFRe) <90 mL/min. The time
for blood sampling, after dabigatran ingestion, was not
yet standardized. The screening tests were PT, aPTT,
TT and diluted TT (dTT) a calibrated thrombin inhibitor
assay (Innovin, Actin FSL, Thromboclotin and Hemoclot).
They were performed on the CS 5100 Siemens. Results:
All patients had TT incoagulable. In dabigatran patients
group PT-Ratio (R) = 1.25±0.12, aPTT-R = 1.5±0.2; in
UFH patients group PT-R = 1.24 ± 0.26 (p=0.8), aPTTR = 2.9 ± 0.98 (p <0.0001). The dabigatran plasma
concentration (dTT assay) ranged 30 to 230 ng/mL and
correlated with aPTT (r2 0.75). Conclusion: Our data show
that TT is too sensitive for monitoring the dabigatran and
UFH plasma effects and the aPTT may not accurately
reflect the concentration of DTI. So, aPTT and TT can
reflect the presence or the absence of dabigatran, but
only dTT assay is directly correlated to drug concentration.
It can be used in emergency laboratory to evaluate the
bleeding patient’s risk.
509
P161
LABORATORY AND DIRECT ORAL INHIBITORS:
PIEMONTE AND VALLE D’AOSTA REGIONAL
RECOMMENDATIONS
1
2
3
4
B. Montaruli , A. Bairo , M.S. Demicheli , A. Insana , C.
5
6
7
8
Linari , L. Marini , E. Muccini , A. Pantano , M.
9
10
7
11
Penna , P. Pergolini , L. Sancinito , S. Stella , R.
7
Romagnoli
1
GEPAL (Gruppo Emostasi Piemonte e valle d’Aosta
Laboratorio), AO Ordine Mauriziano (Torino)
2
Laboratorio), Ospedale Koelliker (Torino)
3
Laboratorio), AO SS Antonio e Biagio (Alessandria)
4
Laboratorio), Ospedale Santa Croce (Moncalieri)
5
Laboratorio), OIRM Città della Salute (Torino)
6
Laboratorio), Ospedale Regionale (Aosta)
7
Laboratorio), Baldi e Riberi Città della Salute (Torino)
8
Laboratorio), Ospedale Martini (Torino)
9
Laboratorio), ASL Asti (Asti)
10
Laboratorio), Ospedale Maggiore (Novara)
11
Laboratorio), AO San Giovanni Bosco (Torino)
Introduction: The direct oral anticoagulants (DOA)
dabigatran etexilate (Pradaxa), rivaroxaban (Xarelto),
and apixaban (Eliquis) have predictable pharmacokinetic
and pharmacodynamic profiles and are alternatives
to warfarin. These long-awaited agents are appealing
because they are easy to use, do not require laboratory
monitoring, and have demonstrated equivalence, or in
some cases, superiority to warfarin in preventing stroke or
systemic embolism in at-risk populations. However, it has
now been realized that in routine clinical settings, there are
several situations where it may be prudent to assess the
level of DOA anticoagulation: circumstances of excessive
anticoagulation, decreased kidney function, instances of
significative bleeding and thrombosis.
Aim: Aim of “Gruppo Emostasi Piemonte e Valle
d’Aosta Laboratorio” (GEPAL) was to introduce regional
recommendations in order to detect and report DOA
according to proposed guidelines.
Methods: GEPAL group discussed with clinicians the
available literature in order to suggest practical strategies
for management based on an understanding of the
pharmacokinetic and pharmacodynamic effects of these
drugs and our current knowledge of the coagulation tests.
Conclusion: With a particular focus on dabigatran,
rivaroxaban and apixaban GEPAL group introduced
regional
recommendations
on
measuring
the
anticoagulant effect of DOAs, as well as their
methodological limitations and the restrictions in
transferring their results into clinical context.
510
P162
VISCOELASTIC AND AGGREGOMETRIC POINTOF-CARE TESTING (POCT) IN PATIENTS WITH
SIRS (SYSTEMIC INFLAMMATORY RESPONSE
SYNDROME)
1
1
1
2
S. Raso , M. Lucchiari , A.R. Vitale , C. Galluzzo , E.
2
2
2
1
Pizzolato , M. Ulla , S. Battista , G. Mengozzi
1
Clinical Biochemistry, Città della Salute e della Scienza
Hospital of Turin
2
Emergency department, Città della Salute e della
Scienza Hospital of Turin
Introduction: Thromboelastometry (Rotem, Tem) has
shown to be useful in the management of bleeding
disorders, in trauma, as well as in surgical patients.The
multiplate electrode aggregometry platelet function
analyser (MULTIPLATE, Roche Diagnostics) can provide
rapid information on the state of aggregation of the patient.
The aim of this study is to investigate the diagnostic
role of viscoelastic and aggregometric POCT to test
early coagulative and platalet-aggregation alterations in
patients with infectious and non infectious SIRS.
Methods: The pilot study was conducted on 72 patients
(51 with sepsis and 19 with severe sepsis or septic
shock and 21 multiple trauma.) Viscoelastic POCT in
citrated whole blood was performed with ROTEM (Extem,
intem, fibtem, aptem tests) The parametres recorded
were: clotting time (CT), clot formation time (CFT),
maximal clot firmness (MCF) and lysis index at 30
min (Li30). Aggregometric poct was performed with
Multiplate. Platelets were stimulated in various ways
(ASPI, ADP, COL, RISTO, TRAP tests). The area under
the aggregation curve (AUC) was calculated.
Results: Comparison were performed between trauma
(T) sepsis (S) and severe sepsis/septic shock (SS)
groups and non infectious SIRS (trauma), and infectious
SIRS (SS). A significant difference was observed in CT
Intem mean values in T, S, SS groups (p=0.031). The
statistical significance was maintened (p=0.012) when
comparing the T population with the S,SS group. The
SS group showed higher CT values in Ap-tem than
the other groups (P=0.018). Significant differences were
observed in the analysis of MCF in T,S,SS groups in
ex-tem (p=0.016) and fib-tem (p <0.0001). The analysys
of platelet aggregation confirmed significant differences
between the two populations with a tendency of low
platelet aggregation in the septic conditions, for ADP
(P=0,036), COL (p=0.0003) and TRAP (p=0.0057) tests.
Conclusions: The results observed in the studies of the
population with suspected infectious SIRS demostrate
how alterations in blood coagulation and platelet system
can accurately identify the difference between these
conditions and those of non infectious origines. Peculiar
alterations has been early observed in the coagulation
system and in platelet aggregation in patients with S, SS.
1. Rahe-Meyer N, Winterhalter M, Boden A, et al. Acta
Anaesthesiol Scand 2009;53:168-75.
P163
INFLUENCE OF AGE ON THE LOSS OF D-DIMER
CUT-OFF LEVEL SPECIFICITY: RESULTS OF A
STUDY ON ELDERLY PATIENTS
P164
PRE-ANALYTICAL VARIABLES IN COAGULATION
TESTING: PIEMONTE AND VALLE D'AOSTA
REGIONAL RECOMMENDATIONS
R. Galeazzi, F. Marchegiani, A. Marziali, F. Moroni, S.
Giovagnetti, S. Appolloni, F. Busco
D. Cabodi , A. Appiani , V. Conterio , E. De Marco , F.
3
6
2
5
Molinari , B. Montaruli , R. Portalupi , S. Prestigio , N.
6
5
4
Renzi , P. Rossetto , R. Romagnoli
Clinical Laboratory and Molecular Diagnostic, INRCA
Natl Inst Hosp, Ancona
Introduction: D-dimer (DD) test combined with clinical
scores is usually used to diagnose suspected deep
vein thrombosis (DVT) and pulmonary embolism (PE).
However, as DD levels are physiologically higher in elderly
patients, these tests lose clinical specificity. To improve
the clinical specificity of DD an age adjusted DD cut-off
level was proposed [ADC=(patient’s age x 0.01) µg/mL].
The aim of our study was to investigate in a community of
very old people how DD levels change during aging.
Materials and Methods: The sample was composed of
1618 patients (mean age±SD; 962 females, 83,8±9,9
and 656 males, 81,8±10,5) consecutively admitted to the
Geriatric Emergency Care Department (GECD) between
January 2013 and February 2014 and for which results
of DD were available. The DD assay was performed on
cs-2100i Sysmex Siemens using a conventional cut-off
level of 0,5 µg/mL. Statistical analyses were performed
using SPSS 11.5.
Results: In our sample, the mean level of DD was
3,35±0,18 µg/mL (mean±SE) and the percentage of
patients with DD concentrations below cut-off value was
only 22,1% (358 patients). The mean of DD in our sample
is six times higher than that of reference. As expected,
a significant age related increase of DD was found (p
<0,05), also when gender was considered.
Conclusions: The main limit of DD for the diagnosis of
DVT and PE is its poor specificity, especially in elderly
patients; using the conventional cut-off of 0,5 µg/mL,
the proportion of our patients with abnormal DD findings
is 78%. Clearly, this percentage is too high and it is
not plausible that all of these patients have DVT and/
or PE. Likely, these high values of DD depend on other
causes rather than DVT and/or PE. Thus, frequently,
only a minority of patients with a positive DD (>0,5 µg/
mL) are finally diagnosed with DVT and PE. This implies
an increase in the overcrowding in GECD and to carry
out expensive and often inappropriate invasive tests for
elderly patients. Also, if we apply the ADC formula the
percentage of patients with a pathological level of DD
doesn’t change significantly. Based on this study, we
suggest a revision of the standard DD cut-off to find a new
value able to improve the specificity for this test, especially
for geriatric patients.
1
2
3
4
1
S.C. Laboratorio Analisi Chimico, Cliniche e
Microbiologiche, Osp. S.G. Bosco, ASLTO2, Torino
2
Laboratorio di Ricerche Chimico Clinice, A.O.U.
"Maggiore della Carità", Novara
3
S.O.C. Laboratorio Analisi Chimico, Cliniche e
Microbiologiche, ASLCN2, Alba-Bra
4
Laboratorio Analisi Chimica Clinica "Baldi e Riberi"
A.S.O. San Giovanni Battista, Torino
5
S.O.C. Medicina Trasfusionale, ASLTO4, Ivrea
6
S.C. Laboratorio Analisi, A.O. Mauriziano "Umberto I" ,
Torino
Introduction:
The
use
of
modern
laboratory
instrumentation with high levels of test reliability and
appropriate quality assurance measures will lead to
very few analytical errors within hemostasis testing.
Nevertheless, incorrect or inappropriate test results are
still reported, often due to events outside the control of
the laboratories performing the tests. This is due primarily
to pre-analytical events associated with sample collection
and processing.
Aim: Because of reorganization of laboratories network
in Piemonte and therefore in order to obtain
appropriate samples collection, processing and storage,
aim of “Gruppo Emostasi Piemonte e Valle d’Aosta
Laboratorio” (GEPAL) was to introduce regional
recommendations on the pre-analytical phase and
providing suggestions on how problems can be minimized
or prevented, thereby improving the likelihood that
reported test results actually represent the true clinical
status of the patient rather than that of an inappropriate
sample.
Methods: GEPAL group discussed the available literature
in order to suggest practical strategies for pre-analytical
phase in hemostasis.
Conclusion: With a particular focus on samples collection,
processing and storage GEPAL group introduced
regional recommendations on pre-analytical phase in
hemostasis. These recommendations should be of value
to laboratory personnel, clinicians and administrative
personnel because an appreciation of these issues will
enable the optimal clinical management of patients.
Adcock DM, Hoefner DM, Kottke-Marchant K, et al.
Collection, transport ad processing of blood specimens for
testing plasma-based coagulation assays and molecular
hemostasis assays: approved guidelines - fifth edition.
Clinical and Laboratory Standard Institute. Wayne PA:
CLSI Document H21-A5,2008.
511
P165
MOLECULAR DIAGNOSIS OF FAMILIAL
HYPERCHOLESTEROLEMIA IN PEDIATRIC COHORT
1
1
1
A. Ruotolo , M.N. D'Agostino , A. D'Angelo , M.D. Di
2
3
4
Taranto , O. Guardamagna , B. Malamisura , A. De
4
5
5
6
Matteo , M.R. Licenziati , S. Lenta , G. Marotta , G.
1
Fortunato
1
CEINGE S.C.a r.l. Biotecnologie Avanzate, Napoli e
Dip. di Medicina Molecolare e Biotecnologie Mediche,
Università degli Studi di Napoli Federico II, Napoli
2
IRCCS Fondazione SDN, Napoli
3
Amb. Dislipidemie e Prevenzione cardiovascolare,
Ospedale Infantile Regina Margherita, Torino
4
Amb. per lo Studio delle Dislipidemie, Dip. di Pediatria,
Università degli Studi di Napoli Federico II, Napoli
5
UOC Auxologia ed Endocrinologia, Dip.di Pediatria
Sistematica e Specialistica, AORN SantobonoPausilipon, Napoli
6
Dip. di Medicina Clinica e Chirurgia, Università degli
Studi di Napoli Federico II, Napoli
Familial Hypercholesterolemia (FH) is a severe
monogenic hyperlipidemia leading to very high
levels of LDL cholesterol, associated with increased
cardiovascular risk and in some cases with the presence
of tendinous xanthomatosis. Causes of FH include defects
in the LDL receptor (LDLR) gene in its ligand Apoliprotein
B (ApoB) and in the Proprotein Convertase Subtilisin/
Kexin-type 9 (PCSK9)gene. The early identification of
FH patients can be useful to establish of an adequate
therapy and the prevention of cardiovascular accidents.
Performing a genetic screening in a paediatric population.
87 unrelated patients <16 years were enrolled in different
Italian clinics, 56 of whom were clinically diagnosed as
possible and 7 as definite FH based on the Simon Broome
criteria. The LDLR, APOB and PCSK9 genes were
amplified by PCR and directly sequenced. MLPA was
performed to identify large rearrangements in LDLR gene.
The screening of candidate genes revealed mutations
in 65/87 FH patients (mutation rate 74.7%). In 65
FH-mutation positive (FH-M+) we found 62 mutations
in the LDLR gene (71.3%) 2 of which are novel, in
the APOB gene we found one new mutation (1.1%)
and in the PCSK9 gene 2 mutations (2.3%) one of
which novel. The presence of the new variants was
excluded in 160 chromosomes from healthy subjects and
in Exome Sequencing Project (ESP). Four algorithms
(SIFT, PolyPhen, PMut and Mutation tasting) were
used to predict the effect of the novel variants. Three
patients are compound heterozygotes (3.4%) and 62 are
heterozygotes (71.2%). Among heterozygote patients the
presence of a radical mutation leads to higher values of
LDL cholesterol (6.6±1.2 mmol/L) compared to carriers
of missense mutations (5.8±1.3 mmol/L) with p <0.0001.
The screening of LDLR, APOB, PCSK9 genes revealed
a mutation rate equal to 74.7%. This result showed a
high mutation rate in paediatric patients, although their
diagnosis was predominantly not definite because the
lack of xanthomatosis due to the young age. Four new
variations were identified, suggesting the whole screening
of candidate genes.
512
P166
STABILITÀ DEI MIRNA IN CAMPIONI DI PLASMA
CONGELATI
1
1
2
1
F. Balzano , A. Mannu , M. Deiana , A.M. Posadino , P.
1
1
1
3
1
Mele , B. Porcu , I. Vidili , P. Pippia , E. Canu , L.
1
Deiana
1
2
3
Fisiologia,Dip. Scienze Biomediche, Università di
Sassari
I miRNA sono piccole molecole endogene di RNA
non codificante, a singolo filamento di 20-22 nucleotidi
principalmente attivi nella regolazione trascrizionale e
post-trascrizionale dell'espressione genica. In questo
studio abbiamo esaminato la quantità e la stabilità di
otto miRNA, (miR-125b, miR-425, miR-200b, miR-200c,
mir-579, mir-212, mir- 126 e mir-21) nel plasma di sette
soggetti (controlli sani) prima e dopo il congelamento (6
mesi a -80 °C). Inoltre, abbiamo esaminato il plasma di
5 campioni congelati da 15 anni, 5 campioni congelati
da 10 anni, 5 campioni congelati da 5 anni e valutata la
quantità di microRNA ancora disponibili. L'RNA totale è
stato isolato usando le colonnine Mirvana miRNA. Sono
stati utilizzati sonde TaqMan per analizzare i profili di
espressione dei miRNA di interesse. I primer e le sonde
sono stati acquistati da Life Technologies (Jin Wang et
al. 2009). I livelli di espressione sono stati quantificati
usando l'IQ5 BIORAD. La real-time PCR è stata eseguita
in triplo. I risultati sono stati normalizzati con u6snRNA.
L'espressione relativa dei miRNA è stata analizzata
utilizzando il software REST. Il test per analizzare i
dati è un test non parametrico (bootstrap) ed è stato
utilizzato per valutare le differenze di espressione dei
miRNA tra casi e controlli.In questo lavoro, i miRNA hanno
mostrato una stabilità ed un’emivita relativamente lunga
post congelamento. Tutti i miRNA studiati non hanno
mostrato differenze significative di abbondanza relativa
tra i campioni freschi e quelli sottoposti a congelamento
per 6 mesi ed oltre, (5 anni). In particolare, il miRNA-212
ha mostrato essere notevolmente resistente al tempo
di congelamento (15 anni). La concentrazione degli altri
miRNA diminuisce dopo lunghi tempi di congelamento,
ma la loro presenza è ancora rilevabile, mostrando
una resistenza elevata. Tutti i miRNA studiati mostrano
differenze di stabilità in relazione al numero delle
sequenze AU o UA
Sethi P, Lukiw WJ, et al. Neurosci Lett 2009;459:100-4.
Ricerca supportata dalla Regione Autonoma della
Sardegna L.R. 7/2007 e dall'Ass. "Isola dei Centenari",
Sassari
P167
USE OF METHYLATION SENSITIVE POLYMERASE
CHAIN REACTION (MS-PCR) IN FRAGILE X
SYNDROME
1
1
1
1
P168
COMPARISON OF GENETIC AND EPIGENETIC
ALTERATIONS BETWEEN PRIMARY TUMORS AND
PLASMA IN COLORECTAL CANCER
1
1
2
M. Benati , G. De Matteis , T. Bonetti , E. Danese , M.
1
1
1
Montagnana , M. Mazzon , E. Meneghelli , F.
2
1
Boscaini , G.C. Guidi
E. Danese , M. Benati , A.M. Minicozzi , M.
1
1
3
3
Montagnana , E. Paviati , M. Gusella , F. Pasini , G.
4
1
Lippi , G.C. Guidi
1
1
Biochemistry Section, University of Verona
2
Dep. of Life and Reproduction Sciences, Infantile
Neuropsychiatry Section, University of Verona
Background: Fragile X syndrome (FXS) is the most
common form of inherited intellectual and developmental
disability in males. This disorder is associated with an
unstable expansion of a polymorphic CGG repeat of
the fragile X mental retardation 1 (FMR1) gene, The
full mutation (FM) is an expanded allele containing
more than 200 CGG repeats and is accompanied
by hypermethylation of the promoter region. Molecular
diagnosis traditionally includes two methods: PCR,
combined with capillary electrophoresis, to accurately size
normal and smaller premutation alleles, and Southern Blot
(SB) analysis to detect larger premutations, FM and to
assess methylation status. Methylation status of FMR1
promoter can be evaluated by MS-PCR.
Aims: (a) to develop and optimize a simple and fast
protocol of MS-PCR; (b) to evaluate the utility of MS-PCR
method in the molecular diagnosis of FXS.
Methods: In order to develop and optimize the MS-PCR
assay, 15 male patients affected by FXS confirmed by
PCR and SB, were included in the study. Successively, 3
male patients with a family history of FXS and a female
subject who showed the absence of methylation status
by SB, were investigated. In all subjects, purified genomic
DNA extracted from peripheral blood was modified
with bisulphite using the EpitectBisulfite kit (Qiagen).
Bisulphite-modified DNA was used for MS-PCR. The
primers for MS-PCR were designed using the software
MethPrimer.
Results: MS-PCR results were in perfect agreement with
that obtained by PCR and SB. Of the three patients
investigated by MS-PCR, two evidenced a FM and one a
methylation mosaicism. The aberrant methylation of the
FMR1 promoter was confirmed by SB analysis, with the
exception of patient with mosaicism. In the female patient,
MS-PCR analysis showed the unmethylated status of
both FMR1 alleles as confirmed by SB. Cytogenetic
analysis revealed in this patient a complex chromosomal
rearrangement.
Conclusion: The MS-PCR assay requires less DNA than
SB analysis and only two working days to obtain a
conclusive molecular diagnosis compared with five or
more days for SB. Moreover, MS-PCR discriminates not
only normal, premutation and FM-affected
males but also is able to detect a methylation mosaicism.
MS-PCR is thus a quick and accurate method that could
be used for the rapid screening of FXS.
Karunasagar A, et al. Indian J Med Res 2005;122:429-33.
Biochemistry Section, University of Verona
2
First division of general surgery, University of Verona
3
Dep. of Oncology, ULSS 18-Rovigo, S. Maria della
Misericordia Hospital, Rovigo
4
Lab. of Clinical Chemistry and Hematology, Academic
Hospital of Parma
Aim: The finding that tumor specific genetic and epigenetic
alterations can be detected in circulating (cell-free)
DNA (cfDNA) extracted from plasma of cancer patients
has shown promise for improving early diagnosis,
prognostication and disease monitoring. cfDNA fragments
carrying tumor specific alterations represent a variable
and generally small fraction of the total cfDNA which leads
to a high variability in the rate of concordance between
alteration patterns detectable in tissue of primary tumors
and corresponding plasma. The aim of the present work
was to compare the status of KRAS mutation and SEPT9
methylation between the primary tumors and the matched
plasma samples in patients with colorectal cancer (CRC).
Methods: plasma and tumor tissues were collected from
85 patients (64±14 years, 56 males). KRAS and SEPT9
alterations were examined by ARMS allele-specific realtime PCR and quantitative methylation-specific PCR
respectively. For KRAS analysis six of the most common
point mutations at codon 12 and 13 were investigated.
Correlations were tested with Spearman’s correlation.
Results: KRAS mutations and SEPT9 promoter
methylation were present in 34.1% (29/85) and in 95.3%
(81/85) of the primary tumor tissue samples. Patients
presented with both genetic and epigenetic alterations
in tissue specimens (31.8%, 27/85) were considered for
further analyses on cfDNA. In 4 primary tumors with KRAS
mutations, identical mutations were not observed in the
corresponding plasma samples. The median methylation
rate in tumour tissues and plasma samples was 64.5%
(12.2–99.8%) and 14.5% (0–45.5%), respectively. The
median KRAS mutation load (for matched mutations)
was 33.6% (1.2-86%) in tissues and 4% (0-17.0) in
plasma samples. A statistically significant correlation was
found between tissue and plasma SEPT9 methylation rate
(r=0.407, p=0.035), whereas no association was found
between tissue and plasma KRAS mutation load (r=0.092,
p=0.651).
Conclusion: These data show a discrepancy in epigenetic
vs. genetic alterations detectable in cfDNA as markers
for tumor detection. Many factors could affect the mutant
cfDNA analysis including the sensitivity of the detection
method and the presence of tumor clonal heterogeneity.
Danese E, Minicozzi AM, Benati M, et al. Br J Cancer
2013;109:807-13.
513
P169
RICERCA E CARATTERIZZAZIONE DI MACRODELEZIONI E MACRO-DUPLICAZIONI DEL GENE
CFTR IN PAZIENTI AFFETTI DA FIBROSI CISTICA,
MEDIANTE UNA METODOLOGIA COMBINATA DI
MLPA E ANALISI DELL’RNA
1
2
1
S.M. Bruno , S. Pierandrei , G. Testino , S.
3
2
Quattrucci , M. Lucarelli
1
1
1
D. Guarino , C. Santonocito , A. Minucci , P. Concolino
1
1
2
2
, A. Costella , I. Saggese , F. Mignone , C.
1
1
1
Zuppi , G.L. Scaglione , E. Capoluongo
1
1
Dipartimento di Biotecnologie Cellulari ed Ematologia,
Sapienza Università di Roma
2
Dip. di Biotecnologie Cellulari ed Ematologia, Istituto
Pasteur – Fondazione Cenci Bolognetti, Sapienza
Università di Roma
3
Dipartimento di Pediatria, Centro di Riferimento
Regione Lazio per la Fibrosi Cistica, Sapienza Università
di Roma
La Fibrosi Cistica (FC) è la malattia genetica recessiva,
cronica, più frequente nella popolazione caucasica.
Il gene responsabile codifica per la proteina Cystic
Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR)
espressa negli epiteli secretori di vari organi dove media
il trasporto transmembrana dello ione cloruro (Lucarelli
et al. 2012, Cystic Fibrosis - Renewed Hopes Through
Research, Chap. 5, InTech Open Publisher). Nonostante
il miglioramento dei metodi di ricerca mutazionale, parte
delle mutazioni del CFTR sfuggono ai più comuni
protocolli. Scopo dello studio è l’individuazione e la
caratterizzazione degli alleli mutati del CFTR non
facilmente individuabili anche dopo ricerca mutazionale
estesa.
In uno studio precedente, abbiamo applicato a 492
pazienti affetti da forma classica di FC una strategia
di ricerca mutazionale multistep nel CFTR basata
sull'applicazione, in sequenza e se necessario, di: pannelli
di mutazioni frequenti; sequenziamento di tutti gli esoni,
zone introniche adiacenti e 5’-flanking prossimale; ricerca
delle macro-delezioni più frequenti. In 14 dei 984 alleli
mutati analizzati (1,4%) non è stata evidenziata alcuna
mutazione tra quelle analizzate. In tale studio è stata
quindi applicata, ai 14 pazienti con una mutazione non
ancora individuata, una metodologia basata su MLPA
(multiplex ligation - dependent probe assay) e analisi
dell'RNA, estratto da brushing nasale, mediante saggio
in RT-PCR. Tale approccio è potenzialmente in grado
di individuare mutazioni non rilevabili con tecniche più
comuni.
All’MLPA sono state finora individuate 2 macroduplicazioni e 2 macro-delezioni, in 6 pazienti: 1
macro-duplicazione dell’esone 19 (HGVS, esone 22)
(2 pazienti), 1 macro-duplicazione dall’esone 6b al 16
(HGVS, esone 7- esone 18) (1 paziente), 1 macrodelezione dall’esone 14b al 17b (HGVS, esone 16 esone 20) (1 paziente) e 1 macro-delezione dell’esone 3
(HGVS, esone 3) (2 pazienti). Per la macro-duplicazione
dell’esone 19 e per entrambe le macro-delezioni è
stato anche completato lo studio a livello di RNA.
L'individuazione di tali alterazioni molecolari, mediante
metodologie specifiche, è importante, oltre che ai fini della
diagnosi e della consulenza genetica, anche per una più
chiara valutazione della patogenesi della malattia.
514
P170
INNOVATIVE WORKFLOW FOR NEXT GENERATION
SEQUENCING (NGS) APPLICATIONS IN THE
MOLECULAR ANALYSIS OF BRCA1/2 GENES
Lab.di Diagnostica Molecolare Clinica e Medicina
personalizzata, Ist.di Biochimica e Biochimica Clinica,
Università Cattolica di Roma
2
Dip. della Scienza e Innovazione Tecnologica, Univ. del
Piemonte Orientale, Italia
Background: About 3-5% of inherited breast cancers
are caused by germline mutations in the breast cancer
BRCA1/2 genes. After the BRCA1/2 genes were identified
(1994-95) genetic testing has become available and it is
now routinely offered to women with familial high-risk.
In this regard we set-up a new workflow to assess single
point mutations, small insertion and deletion (indels), as
well as indels in stretches of homopolymeric nucleotide
sequences of BRCA1/2 genes.
Methods: This novel workflow was validated on 80
samples and is based on: 1) PCR-library amplification
followed by target-specific PCR amplification 2) fragment
analysis on ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied
Biosystems) to ensure both enrichment efficacy and
evaluation of amplicons carrying indels; 3) GS Junior 454
(Roche) sequencing run; 4) standard flow file (SFF) data
analysis by a novel ad hoc bioinformatics tool (“Amplicon
Suite”). BRCA1/2 coding regions amplicon libraries were
generated with BRCA-MASTR v2.0 kit (Multiplicon) and
pyrosequenced on 454. The DNA sequences were
analyzed by both 454 Amplicon Variant Analyzer (AVA)
Software and the “Amplicon Suite”. Two 454 runs (16
samples previously tested with Sanger method) allowed
to validate NGS procedure and to set bioinformatics tool.
The last eight runs were performed to assess 64 unknown
BRCA1/2 profiles.
Results: All mutations detected in the 16 samples
previously analysed by Sanger were correctly identified by
454. Ten samples with indels were promptly identified by
fragment analysis and confirmed by Sanger. NGS results
of the remaining 54 unknown samples were subsequently
confirmed by Sanger. Amplicon Suite software firstly
ensured 454 run quality control and, secondly, it was
able to unequivocally assign each mutation with correct
nomenclature.
Conclusions: This study represents an innovative
workflow for NGS applications for analyzing BRCA1/2
genes. The main concern regards the identification of
indels associated to homopolymers: we have solved this
issue by using fragment analysis. Finally, the ad hoc
bioinformatics tool was completely reliable in terms of:
1) run quality control on 454, 2) rapid identification and
annotation of mutations, allowing an easy elaboration of
laboratory report.
P171
NO STATISTICALLY SIGNIFICANT DIFFERENCE
IN THE EXPRESSION LEVELS OF CIRCULATING
MIR-21 BETWEEN PATIENTS AFFECTED BY
COLORECTAL POLYPS AND CANCER
1
1
1
M. Montagnana , M. Benati , E. Danese , A.M.
2
1
3
3
Minicozzi , E. Paviati , M. Gusella , F. Pasini , G.
4
1
Lippi , G.C. Guidi
1
Biochemistry Section, University of Verona, Italy
2
First division of general surgery, Univ. of Verona, Italy
3
Dep. of Oncology, ULSS 18-Rovigo, S Maria della
Misericordia Hospital, Rovigo, Italy
4
Lab. of Clinical Chemistry and Hematology, Academic
Hospital of Parma, Parma, Italy
Aim: MicroRNAs have been suggested to play an
important role in the pathogenesis of cancer. MiR-21
results up-regulated in tissues of colorectal cancer (CRC)
and its overexpression is closely associated with tumor
proliferation and migration. Moreover, its expression
could be progressively increased in the adenomacarcinoma-advanced carcinoma sequence. Our aim was
to investigate differences in microRNA-21 expression in
plasma between patients with CRC in different stages and
patients affected by polyps.
Methods: Expression levels of miR-21 were investigated
by quantitative reverse transcription polymerase chain
reaction assay (TaqMan MicroRNA Assay, Applied
Biosystems, Foster City, California) in plasma from
CRC patients (n=76) and from patients affected polyps
(n=20). Plasma samples were collected prior to definitive
surgical management and miRNA plasma extraction was
performed by using the miRNeasy Serum/Plasma Kit
(Qiagen, GmbH, Hilden, Germany). All reactions were run
in triplicate on the ABI Prism 7500 Sequence Detection
System (Applied Biosystems, Foster City, California).
The expression levels of miRNAs were normalized to
miR-16, and were calculated utilizing the 2-#Ct method.
Fold change in gene expression between different groups
was calculated by using the 2-##Ct method. MannWhitney test and Kruskal-Wallis test for non-parametric
samples were used to evaluate differences between
groups.
Results: No significant differences were observed in the
expression levels of miR-21 in plasma of CRC patients
and subjects affected by polyps (p >0.05). Moreover,
in CRC patients miR-21 expression levels resulted not
significant higher in advanced (III-IV) respect to early
stages (I-II) (p >0.05). The fold change in miR-21 gene
expression in advanced CRC respect polyps was 1.35.
Conclusion: This study did not confirm the
hypothesis that circulating miR-21 expression is
progressively increased in the adenoma-carcinomaadvanced carcinoma sequence. Accordingly, it can not be
considered an useful tool to discriminate patients affected
by colorectal polyps and different stages of CRC.
Ng EK, Chong WW, Jin H, et al. Differential expression
of microRNAs in plasma of colorectal cancer patients:
a potential marker for colorectal cancer screening. Gut
2009;58:1375-81.
P172
MOLECULAR DIAGNOSIS OF GILBERT'S
SYNDROME: SPOILED OF CHOICE
M. De Bonis, G. Canu, P. Concolino, A. Costella, C.
Zuppi, G.L. Scaglione , A. Minucci , E. Capoluongo
Lab. of Clinical Molecular Diagnostics and Personalized
Medicine, Institute of Biochemistry and Clinical
Biochemistry, Catholic University of Rome
Background: In Caucasians, a single TA insertion into the
TATA-box promoter region of UGT1A1 gene determines
GS: the genotype (UGT1A1*28) exhibits 7TA repeats
instead of the wild-type 6TA ones, leading to a 70%
reduction of bilirubin glucuronidation. Molecular diagnosis
of GS is important to allow the clinicians the diagnosis of
benign forms of hyperbilirubinemia. For these reasons it is
very important to perform a correct molecular diagnosis.
In view of this, we used four different molecular methods
for UGT1A1 TATA-box repeats screening, comparing the
advantages and disadvantages among them.
Methods: We analyzed 30 patients [10 wild-types
(6TA/6TA), 10 heterozygotes (6TA/7TA) and 10
homozygotes (7TA/7TA)], previously genotyped by direct
sequencing, with the following methods: 1) High
Resolution Melting Analysis (HRMA) on the LightCycler
480 Real-Time PCR System (Roche Diagnostic)
previously published, 2) fragment analysis by Gilbert
Syndrome kit FL by Experteam on 3500 Genetic Analyzer
(Applied Biosystems®) and 3) a new “home made” Next
Generation Sequencing (NGS) technology on 454 Junior
System (Roche Diagnostics).
Results: All patients previously genotyped by direct
sequencing were confirmed using all methods. Comparing
the four methodologies we underline that 1) 1X
conventional sequencing presents the difficulty of
identifying heterozygous samples, 2) HRMA needs
a “dedicated” DNA extraction followed by accurate
DNA quantification and 3) fragments analysis has the
limitation of being expensive. On the contrary, “home
made” targeted-NGS offers the possibility of genotyping
TATA-box with an average of~80×median coverage per
sample, decreasing the possibility of inaccurate molecular
genotyping.
Discussion: We evaluated four alternative molecular
methods for (TA)n repeats genotyping. Since all methods
showed a superimposability of 100%, we underline that,
depending on the facilities and organization of each
molecular diagnostic laboratory, we can choose each as
a valid alternative.
Minucci A, Concolino P, Giardina B, et al. Rapid UGT1A1
(TA)(n) genotyping by high resolution melting curve
analysis for Gilbert's syndrome diagnosis. Clin Chim Acta
2010;411:246-9.
515
P173
GELOFUSINE MAYBE IMPLICATED IN RENAL
DYSFUNCTION IN CARDIAC SURGERY
1
2
4
5
E. Koni , S. Storti , E. Macchia , D. Haxhiademi , E.
3
5
2
5
Koni , A. Guadagnuci , V. Zanetti , P. Del Sarto , M.
5
6
6
7
2
Solinas , C. Palmieri , S. Berti , S. Maffei , G. Rossi , S.
1
2
Cau , A. Clerico
1
Scuola Superiore Sant'Anna Pisa, Fondazione Toscana
G. Monasterio - U.O.C Cardiologia Interventistica-Osp.
del Cuore - Massa
2
Fondazione Toscana G. Monasterio - Dipartimento di
Laboratorio - Osp. del Cuore - Massa
3
Dip. della Patologia Clinica - Università di Pisa
4
Dip. della Rianimazione e della Terapia Intensiva Università di Pisa
5
Fondazione Toscana G. Monasterio - Dip. di
Cardiochirurgia - Osp. del Cuore - Massa
6
Fondazione Toscana G. Monasterio - U.O.C
Cardiologia Interventistica-Osp. del Cuore - Massa
7
Fondazione Toscana G. Monasterio - U.O.C Patologie
Mediche e Chirurgiche del Cuore-Osp. del Cuore Massa
Priming solution is an important component of cardiopulmonary bypass pump (CPB). Colloids are frequently
used for extracorporeal circuit priming. Some studies,
based on creatinine changes, raise concern about
negative effects of colloids on renal function. It would be
of interest involving new biomarkers of acute kidney injury
(AKI) in this setting. Neutrophil gelatinase-associated
lipocalin (NGAL) is emerging as an early and reliable
biomarker of AKI. To investigate the renal impact
of colloid solutions assessed by NGAL, in patients
undergoing cardiac surgery. 35 patients undergoing
cardiac surgery were randomly assigned to Gelofusine
(GF 18 patients) versus Ringer solution (17 patients) as
priming fluid for cardiopulmonary bypass (CPB). Urinary
NGAL was sampled at baseline, 2 hours after CPB
initiation, on Intensive Care Unit (ICU) arrival, and 2,
6, 12 hours thereafter. Serum creatinine and cystatin
C were sampled at baseline, 12, 24,48 and 72 hours
after intervention. All continous data were checked for
normal distribution using Kolmogorov-Smirnov test. There
were no statistically significant differences in patient
characteristics (demographics, hemodynamics, and CPB
variables) between two groups. ANOVA revealed a
statistically significant difference on NGAL levels 2 h after
CPB initiation (GF 27.6±29.1 ng/mL vs control 13±14.2,
p=0.019) and on arrival in ICU (GF 548.2±858 ng/mL
vs control 71.6±119, p = 0.029). NGAL levels return to
baseline after 12 h in both groups. Changes on serum
creatinine and cystatine C were not statistically significant
between groups. Administration of GF is associated with
a significant increase in NGAL levels in comparison
with crystalloids in patients undergoing cardiac surgery.
These findings suggest an implication and detrimental
effects of Gelofusine on renal performance. Further
studies are needed in order to clarify the significance and
clinical outcomes in patients that respond with high levels
of kidney injury biomarkers when colloid solutions are
administered.
516
P174
TERAPIA MOLECOLARE MEDIANTE GENE
TARGETING: RUOLO DEI MECCANISMI DI
RIPARAZIONE DEL DNA E DEL CICLO CELLULARE
1
2
2
S. Pierandrei , A. Luchetti , F. Sangiuolo , G.
2
1
Novelli , M. Lucarelli
1
Dip. di Biotecnologie Cellulari ed Ematologia, Istituto
Pasteur – Fondazione Cenci Bolognetti, Sapienza
Università di Roma;
2
Dip. di Bio-Medicina e Prevenzione, Università di Roma
“Tor Vergata"
Il possibile uso di terapie molecolari mirate ha esteso i
campi di applicazione dell’indagine mutazionale dall’area
diagnostica a quella terapeutica. Il gene targeting è
un approccio di terapia genica basato sulla correzione
in situ del difetto genetico che, probabilmente, usa i
meccanismi molecolari della ricombinazione omologa
(HR). Tra i protocolli di gene targeting lo Small
Fragment Homologous Replacement (SFHR) utilizza
piccoli frammenti di DNA (SDF) come templato per la
modificazione nelle cellule riceventi (Luchetti et al., 2012.
PLoS ONE 7 (2):e30851). Lo scopo del lavoro è chiarire i
meccanismi molecolari alla base dell’SFHR focalizzando
l’attenzione sui principali pathway coinvolti nella difesa
contro l’invasione da DNA esogeno e nel mantenimento
dell’integrità genomica.
Cloni cellulari di una linea di fibroblasti embrionali murini
(MEF) immortalizzata, sono stati modificati stabilmente
integrando nel genoma la proteina EGFP wild type
(wtEGFP) o la sua controparte mutata (mutEGFP). Dopo
trasfezione e correzione con un SDF omologo alla
sequenza wild type della proteina EGFP, la fluorescenza
delle cellule MEF-mutEGFP può essere ripristinata.
Mediante array di Real Time PCR quantitativa è stato
indagato il pathway d’espressione di 84 geni coinvolti
nella riparazione del danno al DNA e di 84 geni coinvolti
nel controllo del ciclo cellulare di cellule MEF-mutEGFP.
I geni influenzati dall’SFHR appartengono a differenti
pathway coinvolti nella riparazione del danno al DNA, non
solo alla ricombinazione omologa. Dopo trattamento con
l’SDF la maggior parte di questi geni mostra un precoce
incremento di espressione. Inoltre l’SFHR incrementa
l’espressione di molti geni attivatori dei checkpoint e
regolatori negativi del ciclo cellulare verosimilmente per
permettere l’individuazione e la riparazione di eventuali
danni al DNA. Tali risposte cellulari possono costituire
parte della base molecolare per la correzione.
I
risultati
evidenziano
il
coinvolgimento
e
l'interconnessione dei pathway studiati nella risposta
all’invasione cellulare da parte di DNA esogeno
e forniscono un contributo alla comprensione dei
meccanismi molecolari alla base dell’SFHR e al
miglioramento della sua efficienza.
Il progetto è finanziato dall’Istituto Pasteur-Fondazione
Cenci Blognetti.
P175
ROLE OF INTERLEUKIN-28B rs1297860 IN THE
NATURAL HISTORY OF CHRONIC INFECTION WITH
HEPATITIS C VIRUS
1
1
2
C. Santonocito , D. Guarino , E. Annichiarico , M.
1
1
1
Scapaticci , C. Zuppi , E. Capoluongo
1
Lab. di Diagnostica Molecolare Clinica e Medicina
personalizzata, Ist. di Biochimica e Biochimica Clinica,
Università Cattolica del Sacro Cuore di Roma
2
Dipartimento di Scienze Mediche, Medicina Interna e
Gastroenterologia, Poiliclinico Univerisitario "A. Gemelli",
Roma
Background: Chronic hepatitis C (HCV) is the main cause
of liver disease with a prevalence of 3% in the world. The
standard therapy provides for the administration of PEGIFN and ribavirin, that however is unsuccessful in 50% of
individuals with chronic infection.
Recent studies have shown the role of some variants of
the IL-28 gene, which encodes the IFN-α, spontaneous
healing and infection in response to antiviral therapy.
Methods: In this study we have evaluated the association
of polymorphism rs 1297860 (C>T) localized in the in the
IL28-B gene with the response to antiviral treatment for
the chronic infection C virus and with the development of
epatic disease after the treatment in patients affected by
liver cirrhosis.
We enrolled 139 patients affected by liver cirrhosis treated
with PEG-IFN and ribavirin and exposed to the followup between 2001 and 2013 and divided into four groups
based on disease severity. Patients that undergoing to
antiviral therapy were further divided into two groups
based on the achievement or otherwise of SVR (survival
virological response). The genotypes were detected using
High Resolution Melting analysis (HRMA).
Results: The results obtained in this study demonstrated
that there is a close association of polymorphism with
response to antiviral therapy even in patients with liver
cirrhosis. A significant difference was observed in IL-28B
rs1297860 genotypic frequencies: the frequency of allele
C was 0.55 while the frequency of allele T 0.45. The
genotype CC was present in 27.3% of patients, the
genotype CT in 55.1% and the genotype TT in 16.5%.
The CC genotype showed an association with the SVR,
giving increased survival and a reduced frequency of
interruptions of antiviral therapy.
Conclusions: Our results confirm the usefulness of
rs 1297860 (C>T) molecular assay since it provides
prognostic information regarding the evolution of HCV
cirrhosis under the antiviral treatment.
P176
TRATTAMENTO ALTERNATIVO DELLA FIBROSI
CISTICA: LA TERAPIA EPIGENETICA
1
2
1
1
R. Raso , N. Cifani , G. Ferraguti , S.M. Bruno , F.
2
3
Ascenzioni , M. Lucarelli
1
Dip. di Biotecnologie Cellulari ed Ematologia, Sapienza
Università di Roma
2
Dip. di Biologia e Biotecnologie “Charles Darwin”,
Sapienza Università di Roma
3
Dip. di Biotecnologie Cellulari ed Ematologia, Sapienza
Università di Roma - Istituto Pasteur – Fondazione Cenci
Bolognetti, Sapienza Università di Roma
La Fibrosi Cistica (FC) è una malattia autosomica
recessiva causata da mutazioni nel gene “Cystic Fibrosis
Transmembrane conductance Regulator” (CFTR) che
codifica per un canale dello ione cloruro, espresso nelle
cellule epiteliali di diversi tessuti. L’alterata funzionalità
del CFTR determina, nei polmoni dei pazienti FC,
una riduzione della secrezione del cloruro e un
iperassorbimento dello ione sodio, per una mancata
repressione del canale epiteliale per lo ione sodio (ENaC)
(Gentzsch et al., J. Biol. Chem, 2010, 285:32227-32).
ENaC è composto da tre subunità, α, ß e γ codificate
rispettivamente dai geni SCNN1A, SCNN1B e SCNN1G.
Studi precedenti suggeriscono che la metilazione del DNA
possa controllare la trascrizione dei geni ENaC. Lo scopo
del presente lavoro è quello di ridurre l’espressione dei
geni ENaC mediante manipolazioni epigenetiche.
Come modello di epitelio FC umano in coltura abbiamo
utilizzato le cellule CFBE41o- (F508del / F508del) trattate
con agenti ad azione ipermetilante sul DNA, come la SAM
(S-adenosil-metionina) e ad azione ipercondensante sulla
cromatina, come la curcumina (un inibitore dell’istone
acetiltransferasi p300). L’espressione dei geni ENaC è
stata valutata quantitativamente mediante real time PCR.
Nelle cellule CFBE41o-, i trattamenti con SAM o
curcumina riducono significativamente l’espressione dei
geni SCNN1A e SCNN1B. Il trattamento combinato
con SAM + curcumina determina una riduzione
media dell’espressione dei geni SCNN1A e SCNN1B
rispettivamente del 29% e 25% (ma fino al 36% e
60% in alcuni esperimenti). Inoltre, questi trattamenti non
sembrano influenzare negativamente l’espressione del
CFTR. Il gene SCNN1G risulta espresso a livelli troppo
bassi perché la sua modulazione possa essere valutata in
maniera attendibile.
I nostri risultati suggeriscono che l’espressione dei
geni SCNN1A e SCNN1B possa essere ridotta con
l’utilizzo di trattamenti epigenetici e che approcci sinergici,
che agiscono sia sulla metilazione del DNA sia sulla
condensazione della cromatina, siano particolarmente
efficienti. E’ in corso l’estensione di questi risultati anche
a colture primarie di cellule epiteliali polmonari umane
isolate da pazienti FC.
Questo studio è finanziato dalla Fondazione per la ricerca
sulla Fibrosi Cistica (Progetto #3/2012).
517
P177
VALUTAZIONE DELLO STATO MUTAZIONALE DEI
GENI KRAS, NRAS E BRAF IN PAZIENTI CON KRAS
ESONE 2 WILD-TYPE
1
1
1
1
P178
CLINICAL UTILITY AND PROGNOSTIC VALUE
OF PROSTATE CANCER GENE 3 (PCA3): A
PROSPECTIVE STUDY
5
1
1
1
C. Siracusa , S. Costa , S. Besana , S. Signorini , E.
2
2
2
2
Beretta , P. Nova , G. Giaccon , D. Fagnani , P.
3
Brambilla
L. Tomao , R. Merola , A. Antenucci , S. Masi , C.
1
1
3
1
Mandoj , G. Orlandi , I. Sperduti , R. Fontinovo , S.
4
1
2
1
Sentinelli , G. Cigliana , M. Gallucci , L. Conti
1
1
S.C. Analisi Chimico Cliniche Desio/Carate/Giussano –
AO di Desio e Vimercate (MB)
2
S.C. Oncologia - AO di Desio e Vimercate (MB)
3
Studi di Milano – Bicocca, Monza (MB)
Introduzione: La terapia del carcinoma del colonretto metastatico (mCRC) include l'utilizzo di anticorpi
monoclonali (MAbs) contro Epidermal Growth Factor
Receptor (EGFR). L’attivazione di EGFR coinvolge la via
di trasduzione del segnale mediata dal gene RAS (KRAS
e NRAS) che attiva BRAF e controlla la trascrizione
genica.
L’attivazione costitutiva dell’oncogene KRAS, dovuta a
mutazioni nell’esone 2, è stata riscontrata nel 40% dei
pazienti mCRC non responsivi a terapia con MAbs.
L'analisi dello stato mutazionale di KRAS diviene un
marcatore predittivo della risposta al trattamento. Tuttavia
solo il 20% dei pazienti KRAS esone 2 wild-type (WT) ha
mostrato una risposta oggettiva al trattamento con Mabs.
Alterazioni nei geni che codificano per effettori più a valle
nel pathway di EGFR possono indipendentemente dare
origine a resistenza al trattamento. L’evidenza dello stato
mutazionale di RAS (KRAS e NRAS) WT è ora richiesta
prima di iniziare il trattamento (Informativa AIFA Gennaio
2014).
Scopo: Valutare efficacia del trattamento con MAbs e
prognosi in pazienti con mCRC e KRAS esone 2 WT, in
relazione allo stato mutazionale dei geni KRAS (esoni 3,
4), NRAS (esoni 2, 3, 4) e BRAF (esone 15).
Materiali e metodi: Nel 2013 sono stati analizzati 90
campioni di DNA, estratto da tessuti di pazienti mCRC,
per le mutazioni dell’esone 2 di KRAS. Sui 50 campioni
(55%) risultati WT, da Febbraio 2014 è stata eseguita
l’analisi degli esoni 3, 4 di KRAS e 2, 3, 4 di NRAS
(Sequenziamento diretto) e l’analisi dell’esone 15 del
gene BRAF (RT-PCR).
Risultati e conclusioni: Dei 50 campioni KRAS esone 2
WT, 14 presentano le seguenti mutazioni: 2 nell’esone 3
e 1 nell’esone 4 di KRAS (6%); 2 nell’esone 3 di NRAS
(4%) e 9 nell’esone 15 di BRAF (18%). Nessun campione
presenta mutazioni negli esoni 2 e 4 di NRAS.
Dal nostro studio si evince che il 28% dei pazienti KRAS
esone 2 WT presenta mutazioni in altri geni (RAS e BRAF)
e che i nostri dati sono in linea con quelli riportati in
letteratura.
Questi 14 pazienti mostrano di non rispondere alla
terapia per tempo di sopravvivenza globale, tempo di
sopravvivenza libero da progressione e tasso di risposta
obiettiva [1].
1. Douillard JY, Oliner KS, Siena S, et al. PanitumumabFOLFOX4 treatment and RAS mutations in colorectal
cancer. NEJM 2013;369:1023-34.
518
Clinical Pathology, "Regina Elena" National Cancer
Institute, IRCCS, Rome
2
Urology Dep., Regine Elena National Cancer Institute,
IFO, Rome
3
Biostatistic Div., "Regina Elena" National Cancer
4
Pathological Anatomy, "Regina Elena" National Cancer
5
Dep. of Sciences, "Roma Tre" University, Rome
Introduction: Prostate cancer (PCa) is the most common
male cancer in Europe and the US. The early diagnosis
relies on prostate specific antigen (PSA) serum test, even
if it showed clear limits. Among the new tests currently
under study, one of the most promising is the urine
prostate cancer gene 3 (PCA3), a non-coding mRNA
whose level increases up to 100 times in PCa tissues
when compared to normal tissues.
Objective: To assess the clinical utility and diagnostic
accuracy of the PCA3 test in a population of men with two
or more PCa risk factors and a previous negative biopsy;
secondly, to evaluate the correlation between PCA3
score and the malignancy aggressiveness, expressed as
Gleason score (Gs), in subjects who underwent a postPCA3 biopsy.
Patients and methods: 407 men who entered the Urology
Unit of “Regina Elena” National Cancer Institute were
tested for PCA3 and total PSA (tPSA) markers. Out of the
407 men tested, 195 were positive for PCa and 114 of
them recieved an accurate bioptic staging, so PCA3 score
was correlated to biopsy outcome and its diagnostic or
prognostic values were compared to those obtained from
tPSA.
Results: Out of the 407 biopsies performed after PCA3
test, 195 (48%) resulted positive for PCa and PCA3
score was significantly higher in this population (p
<0.0001), differently to tPSA (p=0.87). Sensitivity (94.9)
and specificity (60.1) for PCA3 test showed a better
balance for a threshold of 35 (when compared to 20).
Finally, comparing PCA3 values between two subgroups
with increasing Gs (Gs ≤7 vs Gs ≥8) and mantaining a
threshold of 35, a significant association between PCA3
score and Gs was found (p=0.03).
Conclusions: In this study PCA3 test showed the best
diagnostic performance, thereby facilitating the rational
selection of patients that may benefit from the repetition of
a prostatic biopsy when the risk for this pathology persists.
Moreover it showed also a prognostic value, as lower
PCA3 score are associated to lower Gs and the higher
values match with the higher aggressiveness.
Day JR, Jost M, Reynolds MA, et al. PCA3: from
basic molecular science to the clinical lab. Cancer Lett
2011;301:1-6.
P179
METABOLIC AND MORPHOLOGICAL VISCERAL
ADIPOSE TISSUE (VAT) CHANGES DURING
OBESITY WITH AND WITHOUT PREGNANCY
1,2
2
1,2
C. Nardelli , L. Iaffaldano , V. Capobianco , A.
3
4
2
2,5
Sirico , G. Labruna , D. Montanaro , A. Baldi , N.
6
7
6
8
Carlomagno , V. Pilone , A. Renda , P. Forestieri , P.
3
1,2
Martinelli , L. Sacchetti
1Dip. di Medicina Molecolare e Biotecnologie Mediche,
Univ. di Napoli Federico II; 2CEINGE-Biotecnologie Avanzate
S.C.a R.L., Naples; 3Dip. di Neuroscienze e Scienze
Riproduttive ed Odontostomatologiche, Univ. di Napoli Federico
II; 4IRCCS Fondazione SDN–Istituto di Ricerca Diagnostica e
Nucleare, Naples; 5Dip. Scienze e Tecnologie Ambientali,
Biologiche e Farmaceutiche, Seconda Univ. di Napoli, Caserta;
6Dip. di Scienze Chirurgiche, Anestesiologiche-Rianimatorie e
dell’Emergenza, Univ. di Napoli Federico II; 7Dip. di Medicina e
Chirurgia, Univ. di Salerno; 8Dip. di Chirurgia Generale,
Geriatrica, Oncologica e Tecnologie Avanzate, Univ. di Napoli
Federico II
The increased incidence of obesity in pregnant women in
the last decades has paralleled that observed in the
general population. Although maternal fat stores increase
during pregnancy, irrespective of pre-pregnancy weight,
the storage capacity of subcutaneous adipose tissue is
impaired, and fat predominantly accumulates in VAT.
VAT is an important risk factor for metabolic imbalance in
human subjects, also during pregnancy. Maternal obesity
is related to offspring obesity, and there is an increased
risk of adverse outcomes for both mother and child.
Moreover, the risk of childhood obesity was quadrupled if
the mother was obese before pregnancy, which suggests
that the in uterus environment could be obesogenic.
Adipose tissue dysfunctions are the primary defects in
obesity and may link obesity to such disorders as type 2
diabetes, dyslipidemia and cancer. To further our
knowledge about VAT morphology (cell size distribution
and presence of inflammatory cells) and serum
biochemical parameters in obese and control women
either pregnant or not we enrolled two cohorts of obese
and control women. We collected VAT and serum
samples from 10 obese and 10 control, pregnant or not,
2
women (mean BMI >30 and <25 kg/m , respectively).
Biochemical parameters were measured by routine
laboratory methods, and leptin and adiponectin by ELISA
assay. Five-micron sections were prepared from all
paraffin-embedded VAT blocks. Slides were then stained
with hematoxylin & eosin. Macrophagic infiltration were
evaluated by CD68 immunohistochemical analysis.
Glucose and lipid metabolism, liver markers and the
leptin/adiponectin ratio were significantly higher in obese
vs control women irrespective of pregnancy (p <0.05).
The number of VAT adipocytes was greater and their
size smaller in obese vs control women irrespective of
pregnancy (p <0.05). Furthermore, the CD68 score, a
VAT inflammation marker, was significantly lower in
control vs obese women irrespective of pregnancy (p
<0.05). Lastly, the morphological characteristics and
CD68 score of VAT adipocytes did not differ between
pregnant and not pregnant obese women. The
morphological characteristics and the inflammation status
in VAT was essentially influenced by pre-existing obesity
and not by pregnancy status.
P180
A NOVEL BRCA2 MUTATION IN A PATIENT WITH
BILATERAL BREAST CANCER: A CASE REPORT
1
2
3
1
M. Greco , G. Ronzino , M. Pellegrino , L. Schirosi , F.
1
1
1
Storelli , P. Tarantino , S. Mauro
1
Lab. of Medical Genetics, Vito Fazzi Hosp., Lecce
Oncology Unit, Vito Fazzi Hosp., Lecce
3
Pathologic Anatomy Unit, Vito Fazzi Hosp., Lecce
2
Hereditary breast and ovarian cancer (HBOC) syndrome
accounts for a 5-10% of breast and 10% of ovarian
cancer. Majority of HBOC cases have underlying cause
in germline mutations in the BRCA1 and BRCA2
susceptibility genes. Carriers of known deleterious
mutations in the BRCA genes have a lifetime risk of
approximately 60 to 80% for development of breast cancer
(BC) and a 15 to 40% lifetime risk for ovarian cancer
(OC) and are also at a heightened risk for some other
cancer type. It is crucial to identify carrier individuals to
offer appropriate cancer management and understand the
contribution of BRCA1 and BRCA2 mutation associated
risks.
Almost 3,500 cancer associated muta¬tions, spread
throughout the two genes, have so far been reported in the
Breast Cancer Information Core (BIC) database (http://
research.nhgri.nih.gov/bic). The present report describe
a newly identified germline mutation in BRCA2 gene
in a proband with bilateral breast cancer. A 44 year
old non-Ashkenazi Italian female diagnosed with breast
cancer (at 39 years old) and controlateral breast cancer
(at 44 years old) was screened for mutation in BRCA1
and BRCA2 genes by automated sequencing. The
results were compared to the consensus wild-type
sequences. An heterozygous 7480delCA/c.7252delCA
frameshift mutation was identified in exon 14 of BRCA2,
which creates a premature truncated protein at codon
2419. Same mutation was identified in tumor tissue
of both cancer episodes and percentage of mutation
correlates with percentage of tumor cells in the tissue.
Interestingly tissue obtained from second cancer surgery
showed a clear prevalence of mutated sequence
which correlates with the percentage of tumor cells
in the tumor selected area thus appearing as a Loss
Of Heterozigosity in the tumor. The newly identified
frameshift mutation creates the same stop codon as other
previously reported pathogenetic mutations. By these two
observations it can be argued that the newly identified
7480delCA/c.7252delCA molecular alteration in BRCA2 is
a predisposition mutation to breast cancer development.
519
P181
CORRELAZIONE TRA PAZIENTI IN ETA’ ADULTA E
PAZIENTI PEDIATRICI AFFETTI DA PANCREATITE
ACUTA E POLIMORFISMO DEL GENE CFTR
1
2
3
1
M. Schioppa , R. Iodice , S. Costanzo , D. Vitelli , V.
1
Panetta
1
U.O.S. di Genetica e Biologia Molecolare A.O.R.N.
Sant'Anna e San Sebastiano, Caserta
2
Scuola di Specializzazione in Biochimica Clinica
Federico II, Napoli
3
Scuola di Specializzazione in Patologia Clinica
Federico II, Napoli
Introduzione: Mutazioni del gene CFTR (Cystic Fibrosis
Transmembrane Conductance Regulator) sono da
sempre associate a pancreatiti croniche e ricorrenti. Lo
scopo del nostro lavoro è stata la ricerca di eventuali
mutazioni del gene CFTR in pazienti affetti da pancreatite
acuta, al fine di stabilire la presenza di una correlazione tra
questa patologia e mutazioni di questo gene. E’ noto che
la lunghezza del tratto T condiziona il buon funzionamento
del gene e quindi la produzione di una normale quantità
di proteina CFTR.
Materiali e metodi: Sono stati analizzati 95 pazienti di
cui 71 affetti da pancreatite acuta. Su tutti è stata
eseguita la ricerca delle mutazioni più frequenti dei geni
CFTR mediante Reverse dot blot utilizzando i kit INNOLIpa CFTR19, INNO-LIpa CFTR17+Tn che consente di
determinare il polimorfismo dell’introne 8 e INNO-LIpa
CFTR Italian Regional.
Risultati: Dei pazienti affetti sottoposti a screening del
gene CFTR (49 maschi e 22 femmine) soltanto 2 hanno
rilevato la presenza di mutazioni. Per quanto concerne il
polimorfismo del T la frequenza osservata è stata per il
5T del 10%, per il 7T del 69% e per il 9T del 21% valori
che si discostano da quelli riscontrati nella popolazione
caucasica nella quale le frequenze sono rispettivamente
del 5%, 15% e 80%. I nostri risultati riconfermano anche
in misura maggiore i nostri precedenti studi. Sono noti
lavori in cui la ricerca delle mutazioni del gene CFTR è
stata effettuata in pazienti pediatrici affetti da pancreatite
idiopatica nei quali il polimorfismo più osservato è stato il
5T.
Conclusioni: Il differente polimorfismo riscontrato tra
pazienti adulti e pazienti in età pediatrica potrebbe essere
messo in relazione ad una insorgenza più precoce
della patologia negli individui che presentano la variante
5T essendo comunque questa sicuramente la variante
associata ad altre manifestazioni cliniche.
520
P182
FEBBRE MEDITERRANEA FAMILIARE: CASE
REPORT
1
1
1
D. Dell'Edera , M. Benedetto , M. Leo , M.L.
2
2
3
Pisaturo , G. Di Pierro , A. Angione , M.
1
4
1
Zaccagnino , M. Pilato , A. Uccelli , C.
1
4
Santacesaria , A.A. Epifania
1
U.O.D. di Citogenetica e Genetica Molceolcare, Osp.
Madonna delle Grazie, Matera
2
U.O.C. di Ostetricia e Ginecologia, A.O.R. San Carlo,
Potenza
3
Centro Regionale per la Farmacovigilanza, Regione
Basilicata
4
U.O.C. di Patologia Clinica, Osp. Madonna delle
Grazie, Matera
Introduzione: La febbre mediterranea familiare (FMF)
è una malattia rara che appartiene al gruppo delle
febbri periodiche e sindromi auto infiammatorie e si
trasmette con modalità autosomica recessiva. Il gene
malattia (MEFV) codifica per una proteina chiamata
pirina/marenostrina la quale espressa principalmente
dai granulociti neutrofili sembra giocare un ruolo nella
regolazione dei meccanismi infiammatori.
La FMF è caratterizzata da episodi febbrili ricorrenti
di breve durata (1-4 giorni), i quali possono essere
accompagnati da dolori addominali e toracico, da pleurite,
interessamento articolare, manifestazioni cutanee tipo
erisipela. La colchicina rappresenta l’unico farmaco
efficace per il trattamento dei pazienti con FMF. Una
terribile complicanza della FMF non adeguatamente
trattata è rappresentata dalla amiloidosi (AA). La
progressione della amiloidosi può causare una
insufficienza renale irreversibile.
Caso clinico: Il piccolo GC giunge alla nostra
osservazione in quanto presentava accessi febbrili
ricorrenti preceduti da dolori addominali e diarrea. Per
tale motivo il clinico di riferimento ha richiesto lo studio
molecolare del gene MEFV. L’analisi molecolare da noi
eseguita prevede la ricerca di 12 mutazioni del gene
MEFV ed individua oltre il 90% di tutte le mutazioni finora
riscontrate. L’analisi molecolare ha rilevato la presenza
nel gene MEFV, della mutazione P369S/V726 entrambe
in eterozigosi. Pertanto, il piccolo GC risulta essere affetto
da FMF. Successivamente abbiamo esteso l’indagine
molecolare anche ai genitori ed alle sorelle. L’analisi
molecolare del gene MEFV, effettuata sulle due sorelle
e sulla madre, ha accertato che queste sono portatrici
sani della mutazione V726A. Il padre risulta ovviamente
portatore sano della mutazione P369S.
Conclusioni: La FMF è una patologia poco conosciuta
perché ritenuta rara e perché è relativamente recente
la scoperta del gene MEFV. Se misconosciuta, la
FMF è spesso altamente invalidante, con impatto
negativo sulla qualità di vita di giovani pazienti e con
potenzialità evolutiva. Come sempre conoscere vuole
anche dire riconoscere una particolare condizione, ciò
potrà significare diagnosi precoci, prevenzione delle
complicanze, impatto enorme sulla qualità della vita dei
pazienti e riduzione dei costi sociali di una malattia
potenzialmente invalidante.
P183
IL DEFICIT DI 5 ALFA REDUTTASI, ASPETTI CLINICI
E MOLECOLARI: CASE REPORT
1
1
1
P184
IL DEFICIT DI 5 ALFA REDUTTASI, ASPETTI CLINICI
E MOLECOLARI
1
1
1
D. Dell'Edera , M. Benedetto , M. Leo , A.
1
2
2
3
Allegretti , M.L. Pisaturo , G. Di Pierro , A. Angione , M.
1
1
1
Zaccagnino , M. Pilato , C. Santacesaria , A.A.
1
Epifania
D. Dell'Edera , M. Benedetto , M. Leo , A.
1
2
2
3
Allegretti , M.L. Pisaturo , G. Di Pierro , A. Angione , M.
1
4
1
Zaccagnino , M. Pilato , C. Santacesaria , A.A.
4
Epifania
1
1
UOD di Citogenetica e Genetica Molecolare, Osp.
2
UOC di Ostericia e Ginecologia, AOR San Carlo,
Potenza
3
Basilicata
Introduzione: I disordini della differenziazione sessuale
(DSD) con cariotipo maschile normale (46,XY) sono
condizioni cliniche rare, nelle quali individui con gonadi
disgenetiche o differenziatesi in testicoli presentano un
fenotipo caratterizzato da vari gradi di ambiguità dei
genitali interni e/o esterni. Una condizione di questo
tipo può rendersi evidente in epoca neonatale, potendo
determinare anche dei dubbi sull’attribuzione del sesso.
Fra i difetti della differenziazione sessuale presentiamo un
caso di un neonato affetto da deficit di 5 alfa reduttasi. La
modalità di trasmissione è di tipo autosomico recessivo.
Caso clinico: C.M. giunge alla nostra osservazione al
decimo giorno di vita per sottoporsi allo studio del cariotipo
in quanto alla nascita si sono riscontrate, a livello dei
genitali, le seguenti anomalie: micropene, scroto bifido,
persistenza del seno urogenitale. Lo studio del cariotipo
evidenzia che CM presenta un cariotipo maschile normale
(46,XY). In seguito, il neonato è stato sottoposto alle
seguenti indagini ormonali: testosterone basale (77,6
ng/dL), DHT basale (5,8, ng/dL), T/DHT basale (13,4);
dosaggio del testosterone dopo stimolazione con hCG
(496,3 ng/dL), del DHT (38,2 ng/dL) e rapporto T/
DHT (12,99). Successivamente si è proceduto all’analisi
molecolare del gene SRD5A2 attraverso sequenziamento
automatico (3130 Genetic Analyzer Applera) degli esoni
1,2,3,4,5 del gene SRD5A2.
L’indagine molecolare ha confermato che il piccolo CM
presenta nel gene SRD5A2 la trasversione da A a T al
nucleotide 704 dell’esone 5 in omozigosi. A livello della
proteina la mutazione descritta determina la sostituzione
aminoacidica della Tirosina con una Fenilalanina in
posizione 235 (Y235F). Successivamente l’indagine
molecolare è stata estesa ai genitori; confermando che
entrambi sono eterozigoti (portatori sani) per la mutazione
Y235F.
Conclusioni: In situazioni come quella descritta, è
fortemente importante che la diagnosi venga posta
precocemente, anche per l’aspetto psico-relazionale del
paziente e della famiglia.
Ostrer H. Disorders of Sex Development (DSDs): An
Update. J Clin Endocrinol Metab 2014;99:1503-9.
U.O.D. di Citogenetica e Genetica Molceolcare, Osp.
2
UOC di Ostericia e Ginecologia, AOR San Carlo,
Potenza
3
Basilicata
4
U.O.C. di Patologia Clinica, Osp. Madonna delle
Grazie, Matera
Introduzione: I disordini della differenziazione sessuale
(DSD) con cariotipo maschile normale (46,XY) sono
condizioni cliniche rare, nelle quali individui con gonadi
disgenetiche o differenziatesi in testicoli presentano
un fenotipo caratterizzato da vari gradi di ambiguità
dei genitali interni e/o esterni. Una condizione di
questo tipo può rendersi evidente in epoca neonatale,
potendo determinare anche dei dubbi sull’attribuzione
del sesso. Fra i difetti della differenziazione sessuale
presentiamo un caso di un neonato affetto da deficit
di 5 alfa reduttasi (sindrome di Imperato-McGinley).
Nei soggetti maschi affetti da deficit di 5 alfa reduttasi
non si verifica la conversione del testosterone in DHT,
ormone responsabile della mascolinizzazione del seno
urogenitale. La modalità di trasmissione del difetto
genetico è di tipo autosomico recessivo.
Caso clinico: C.M. giunge alla nostra osservazione al
decimo giorno di vita per sottoporsi allo studio del
cariotipo. L’indagine citogenetica è stata richiesta in
quanto si sono riscontrate, a livello dei genitali, le
seguenti anomalie: micropene, scroto bifido, persistenza
del seno urogenitale. Lo studio del cariotipo evidenzia
che CM presenta un cariotipo maschile normale (46,XY).
In seguito al riscontro del cariotipo il neonato è stato
sottoposto alle seguenti indagini ormonali: testosterone
basale (77,6 ng/dL), DHT basale (5,8, ng/dL), T/
DHT basale (13,4); dosaggio del testosterone dopo
stimolazione con hCG (496,3 ng/dL), del DHT (38,2
ng/dL) e rapporto T/DHT (12,99). Successivamente si
è proceduto all’analisi molecolare del gene SRD5A2
attraverso sequenziamento automatico (3130 Genetic
Analyzer Applera) degli esoni 1,2,3,4,5 del gene SRD5A2.
L’indagine molecolare ha confermato che il piccolo CM
presenta nel gene SRD5A2 la trasversione da Adenina
a Timina al nucleotide 704 dell’esone 5 (c.704 A>T
Genebank accession number L03843) in omozigosi.
L’indagine molecolare sui genitori ha confermato che
entrambi sono eterozigoti per la mutazione Y235F.
Conclusioni: Un corretto iter diagnostico deve richiede
un approccio multidisciplinare specialistico. In situazioni
come quella descritta, è fortemente importante che la
diagnosi venga posta precocemente, anche per l’aspetto
psico-relazionale del paziente e della famiglia
521
P185
A VDR POLYMORPHISM AS RISK FACTOR FOR
MALIGNANT MELANOMA IN ITALIAN PATIENTS
1
1
1
V. Maione , G. Stinco , S. Cauci
1
Dermatology Clinic, Dip. Experimental and Clinical
Medical Sciences, Univ. Udine
2
Dip. Medical and Biological Sciences, Univ. Udine, Italy
Background: Skin cancer is currently the most common
cancer worldwide, including Italy. Melanoma (M) is
one of the most aggressive human skin cancers.
Genetic, environmental, and behavioural factors have
been implicated in melanoma susceptibility and possibly
in prognosis. However, so far, biomarkers associated
to the development of malignant metastatic melanoma
(MM) remain elusive, inconsistent findings may partly
derive from heterogeneous ethnic background. Recent
evidence indicates vitamin D and vitamin D receptor
(VDR) implication in melanoma.
Methods: In a case-control study, we explored the
association of BsmI polymorphism (rs 1544410, in intron
8 of VDR) and smoke habits among 84 M cases (47 nonmetastatic M grade 1 or 2, and 37 MM grade 3 or 4) and 84
controls from white population resident in Friuli-VeneziaGiulia Region in the North East Italy.
Results: We did not find a different frequency of
BsmI genotypes between cases and controls. However,
the bb genotype was 3 times more frequent in MM
than in non-metastatic M (OR = 2.97, CI 1.08-8.15),
this association remained significant after adjustment
for potential confounders. Moreover, the bb genotype
combined with lifelong smoking for ≥ 20 years had
adjusted OR = 9.17 (CI 1.03-81.9) for MM.
Conclusions: To our knowledge, this is the first geneenvironment study attesting that a genetic trait associated
to vitamin D combined with lifelong smoking habits was
a prognostic marker among melanoma patients. Our
study suggests that homogeneous genetic background
and lifestyles should be considered to evaluate MM
risk. However, further enlarged studies are warranted to
substantiate our findings.
522
P186
CORRELAZIONE DELLA TRANSTIRETINA CON I
PARAMETRI EMATOCHIMICI IN UNA POPOLAZIONE
LONGEVA SARDA
1
1
1
1
S. Pasella , A. Baralla , S. Pinna , E. Canu , A. Mannu
1
1
2
1
1
, V. Ventura , M. Deiana , B. Porcu , S. Sotgia , L.
1
Deiana
1
2
La transtiretina (TTR) è una proteina globulare
extracellulare presente sia nel plasma sia nel liquido
cerebrospinale coinvolta nel trasporto degli ormoni tiroidei
e del retinolo. Ridotti livelli plasmatici di TTR sono
comunemente associati a stati di infiammazione e
di malnutrizione proteica sebbene non esista un’alta
specificità di ridotte concentrazioni di questa proteina
per la diagnosi di malnutrizione calorico-proteica. Inoltre
le misurazioni delle variazioni di TTR durante stati
di infiammazione dovrebbero essere sempre effettuate
insieme a quelle della proteina C-reattiva (PCR).
Nel presente lavoro viene descritta la variazione dei
valori di concentrazione plasmatica di TTR di una
popolazione sarda di 264 individui suddivisa per fasce
d’età (range 20-108 anni, rapporto maschi:femmine 1:1) e
la correlazione tra questi valori e i parametri ematochimici
esaminati nella medesima popolazione.
La concentrazione di TTR è stata valutata mediante il
kit Assay Max Human Prealbumin ELISA (Assaypro);
la determinazione dei parametri ematochimici è stata
effettuata nel laboratorio generale di base dell’ASL n°1 di
Sassari. L’analisi statistica dei dati è stata fatta mediante
il test Kruskal Wallis e Spearman Rank OrderCorrelation.
I risultati mostrano una diminuzione dei livelli plasmatici
di TTR con l’avanzamento dell’età, in particolare nella
fascia dei centenari, con nessuna importante differenza
tra maschi e femmine. La TTR risulta correlata in
maniera statisticamente significativa (pvalue <0.001) con
differenti parametri ematochimici (antitrombina III, VES,
sideremia, HDL, prot.totali, bilirubina totale, transaminasi
GPT, fosfatasi alcalina, calcio, PCR, RBC, HGB); tuttavia
nessuno dei parametri esaminati mostrava un coefficiente
di correlazione >0.05. La PCR ad esempio mostra una
correlazione negativa con ρ= -0.28.
I dati ottenuti confermano la scarsa chiarezza del ruolo
della TTR nell’infiammazione, suggerendo la necessità
di ulteriori studi per una migliore conoscenza do questo
complesso rapporto.
Sassari
P187
STUDIO DELLA LUNGHEZZA TELOMERICA NELLA
POPOLAZIONE SARDA
1
1
1
1
A. Mannu , I. Marchesi , S. Pinna , S. Pasella , V.
1
1
1
2
Bulla , V. Ventura , F. Pudda , M. Deiana , A.
1
1
Zinellu , L. Deiana
1
2
I telomeri sono strutture nucleoproteiche all’estremità dei
cromosomi.Nell’uomo misurano tra le 5 e le 15 Kb, e sono
costituiti da unità esameriche con sequenza TTAGGG.I
telomeri proteggono le estremità cromosomiche da
danni a carico del DNA, e sono associati alla
membrana nucleare per mantenerne l’organizzazione.
Sono caratterizzati da un filamento 3'- protrudente, che si
ripiega ed invade la regione a doppio filamento, formando
il “T-loop”, dato da appaiamenti non-Watson e Crick
tra residui di guanina.Il “T-loop” protegge le estremità
cromosomiche da danni a carico delle esonucleasi.La
lunghezza telomerica decresce all’aumentare dell’età,
come risultato dell’incompleta replicazione delle estremità
cromosomiche ad ogni divisione cellulare.La telomerasi
stabilizza l’accorciamento telomerico aggiungendo
ripetizioni esameriche alle estremità cromosomiche. E’
stato proposto che l’accorciamento telomerico possa
giocare un ruolo importante nel processo di “Senescenza
cellulare”. La senescenza quindi, potrebbe rappresentare
la manifestazione dei processi di invecchiamento
cellulare.In questo lavoro, è stata analizzata la lunghezza
telomerica nella popolazione sarda in relazione all’età ed
al sesso.L’età dei soggetti arruolati nel progetto di ricerca
AKeA era compresa tra i 20 ed i 105 anni. La lunghezza
telomerica è stata determinata utilizzando la metodica
di real time messa a punto da Cawthon nel 2002.I dati
sono stati analizzati mediante il metodo di quantificazione
relativa comparativa, in cui la quantità del target viene
normalizzata rispetto al controllo endogeno ed espressa
relativamente ad un campione comparatore che diventa
il campione 1x, mentre tutte le altre quantità vengono
espresse come (n) volte relativamente al campione.I
risultati hanno mostrato una correlazione negativa tra
lunghezza telomerica ed età.Inoltre, la media della
lunghezza telomerica nelle donne è risultata inferiore
rispetto agli uomini, in disaccordo con i risultati di altri
lavori scientifici.Infine, alcuni centenari hanno mostrato
una lunghezza telomerica insolitamente alta.
Cawthon RM. Telomere measurement by quantitative
PCR. Nucleic Acids Res 2002;30:e47.
Sassari
P188
MICRODELEZIONI DEL CROMOSOMA Y IN
SOGGETTI INFERTILI
1
2
1
G. Niro , M. Magri , R. Gigli
1
U.O.S. Biologia Molecolare, P.O. A.Cardarelli,
Campobasso
2
U.O.C. Medicina di Laboratorio, P.O. A.Cardarelli,
Campobasso
È oggi noto che il 10-15% delle azoospermie e
gravi oligozoospermie riconosce una base genetica
rappresentata dalla sindrome di Klinefelter e dalle
microdelezioni del cromosoma Y. La spermatogenesi
viene regolata attraverso un complesso meccanismo
da alcuni geni che si trovano sul braccio lungo del
cromosoma Y in una regione chiamata AZF (Azoospermia
Factor) suddivisa in tre sub regioni AZFa, AZFb e AZFc.
Nei lavori presenti in letteratura i valori di incidenza
delle microdelezioni variano da 1,3% a 28%. Questa
variabilità è legata a vari fattori (accuratezza dell’analisi,
inquadramento clinico, etnia) ma il più importante risulta
la presenza di pazienti azoospermici rispetto a quelli
oligozoospermici nel gruppo di studio. MATERIALI E
METODI Il kit impiegato, PCR multiplex con rilevazione
dei prodotti amplificati tramite elettroforesi su gel agarosio,
utilizza un pannello di diverse STS (Sequenze Tag Sites)
che permette l’amplificazione di 13 loci AZF e 2 geni
di controllo. Un ulteriore kit è a disposizione per la
determinazione dell’estensione delle microdelezioni del
cromosoma Y in pazienti risultati deleti alla prima analisi
analizzando 8 STS localizzate alle estremità prossimali e
distali delle regioni AZFa e AZFb. RISULTATI Presso il
nostro laboratorio ad oggi sono stati analizzati 81 pazienti,
di questi la maggior parte provenivano da centri di PMA
altri all’esame del liquido seminale mostravano un oligo/
azoospermia. I risultati evidenziavano un unico paziente
con la delezione gr/gr, tale delezione coinvolge più della
metà della regione AZFc rimuovendo 9 unità trascrizionali
con espressione testicolo-specifica che è alla base
della ridotta produzione di spermatozoi. CONCLUSIONI
Il test delle microdelezioni del cromosoma Y è oggi
nell’iter diagnostico per la ricerca delle cause genetiche
dell’infertilità maschile ed è all’interno del protocollo di
preparazione alla fecondazione assistita.
523
P189
PREVALENCE AND SPECTRUM OF MUTATIONS
IN A COHORT OF UNRELATED ITALIAN PATIENTS
WITH HYPERTROPHIC CARDIOMYOPATHY
1
1
1
2
P190
SINDROME DA IPERFERRITINEMIA CATARATTA
CONGENITA: DIAGNOSI MOLECOLARE DI UNA
FAMIGLIA
1
1
1
2
N. Botto , S. Vittorini , M.S. Parri , L. Ait-Ali , M.G.
1
1
1
1
Colombo , F. Bernieri , S. Storti , A. Clerico
A.P. Capra , E. Ferro , M.A. La Rosa , S. Briuglia , C.
3
4
4
Salpietro , F. De Luca , G. Zirilli
1
1
U.O.C. Medicina di Laboratorio, Fondazione G.
Massa
2
U.O.C. Cardiologia Pediatrica, Fondazione G.
Massa
Background: Hypertrophic Cardiomyopathy (HCM),
an autosomal dominant disorder characterized by
unexplained ventricular myocardial hypertrophy and a
high risk of sudden cardiac death, is mostly caused by
mutations in sarcomeric genes. Interestingly, two or more
sequence alterations present either in the same or in
different sarcomeric genes were demonstrated to occur in
3–5% of HCM patients.
Aim: To report the frequency of single and multiple gene
mutations in an Italian cohort of HCM to evaluate the
distribution of the disease genes, and to determine the
best molecular strategy in clinical practice.
Methods: We report the molecular screening of 42
unrelated index cases with familial or sporadic HCM by
direct sequencing of all coding regions and intron-exon
boundaries of the MYBPC3, MYH7, and TNNT2 genes
(CEQ 8800 Beckman Coulter, Germany).
Results: Disease-causing mutations were identified in 14
index patients (33%), and 12 different mutations, including
4 novel ones, were identified. MYBPC3 mutations (86%)
represent the most prevalent cause of HCM. Missense
mutation was identified in 57% of our HCM population; two
were nonsense mutations and the MYBPC3 IVS5+5G>C
splice mutation was also identified. Interestingly, of the 4
novel MYBPC3 mutations three were frameshift mutations
leading to a premature stop codon. Moreover, a mutation
was found in 7 of 21 index cases with sporadic HCM
(33%). Finally, more than one mutation was identified in
one young proband, and clinical evaluation suggested a
more severe phenotype in this patient.
Conclusions: This results emphasizes once again the
genetic complexity of HCM and might have implications
for genetic diagnosis strategy and, subsequently, for
genetic counselling. First, our experience highlighting the
importance of screening other HCM-causing genes even
after a first mutation has been identified, particularly in
young patients with a severe phenotype. Second, this
finding has relevant implications for clinicians because
even in sporadic cases, a genetic cause should be
suspected.
Maron BJ, Maron MS, Semsarian C. Genetics of
hypertrophic cardiomyopathy after 20 years: clinical
perspectives. J Am Coll Cardiol 2012;60:705-15.
524
UOC di Genetica ed Imm. Ped., Dip. Materno Infantile,
AOU G. Martino Messina
2
UOC Pediatria, Dip. Materno Infantile, AOU G. Martino
Messina
La ferritina è la proteina responsabile del deposito e
della distribuzione del ferro a livello intracellulare,costituita
da H-ferritina e L-ferritina, trascritte da due differenti
geni localizzati sui cromosomi 11q13 e 19q13. La
loro sintesi è regolata a livello post-trascrizionale. La
sindrome da iperferritinemia-cataratta ereditaria (HHCS)
è una rara malattia a trasmissione autosomica dominante,
caratterizzata da valori elevati di ferritina sierica, con
normale saturazione della transferrina, a cui si associa
insorgenza precoce di cataratta. Il caso in oggetto
riguarda una bambina di 6 anni, con un riscontro
occasionale di iperferritinemia senza apparente causa
(1400 ng/mL costante nel tempo) senza alcun segno di
sovraccarico marziale. Anamnesi perinatale e familiare
negative ad eccezione della presenza di cataratta
congenita. Esame clinico, parametri auxologici, test di
funzionalità epatica ed ecografia addome risultavano nella
norma. Il dato anamnestico di cataratta congenita rendeva
suggestiva l’ipotesi diagnostica di HHCS. Dall'anamnesi
familiare emergeva che anche la madre era affetta
da cataratta e la sorella minore e altri componenti
della linea materna. E' stato avviato lo studio familiare
da campioni di sangue, prelevati previo consenso
informato, ed è stata analizzata l’intera sequenza IRE
del gene della L-ferritina. Nella probanda, così come
in altri 6 familiari risultati affetti, è stata riscontrata in
eterozigosi la mutazione +32G>C nella regione IRE di
FTL. Ciò determina un considerevole aumento della
concentrazione di ferritina, mentre lo sviluppo della
cataratta sembra sia determinato dal progressivo deposito
della proteina a livello del cristallino. L’analisi molecolare
ha permesso di confermare la diagnosi di HHCS nella
probanda, sottolineando l’importanza di una attenta
valutazione dei casi di iperferritinemia isolata, affinché si
evitino inutili esami come la biopsia epatica, o approcci
terapeutici dannosi come i salassi. In sede di consulenza
genetica si è informata la famiglia sull'alto rischio di
ricorrenza e è stato intrapreso un follow-up oculistico per
valutare la gravità della cataratta.
Millonig
G,
Muckenthaler
MU,
Mueller
S.
Hyperferritinaemia–cataract
syndrome:
Worldwide
mutations and phenotype of an increasingly diagnosed
genetic disorder. Hum Genomics 2010;4:250-62.
P191
DUE NUOVE MUTAZIONI IN FAMIGLIE CON
POLIPOSI ADENOMATOSA FAMILIARE
1
1
1
G. Caliendo , G. D'Elia , A.L. Gambardella , G.
2
1
1
2
Pellino , A.M. Molinari , M. Cioffi , F. Selvaggi , M.T.
1
Vietri
1
Dip. di Biochimica, Biofisica e Patologia Generale,
Seconda Università di Napoli
2
Dip. di Scienze Mediche, Chirurgiche, Neurologiche,
Metaboliche e dell'Invecchiamento, Seconda Università
di Napoli
La Poliposi Adenomatosa Familiare (FAP) è una
patologia autosomica dominante caratterizzata da polipi
adenomatosi intestinali, che variano da 100 a 1000 e che
predispone al carcinoma del colon.
I pazienti con FAP possono presentare anche
manifestazioni extracoliche, come tumore desmoide,
osteoma, anomalie dentali, ipertrofia congenita
dell’epitelio pigmentato retinico e altri tumori. In un’alta
percentuale di casi la FAP è dovuta a mutazioni del
gene APC. La localizzazione delle mutazioni nel gene
può influenzare il fenotipo clinico. In particolare, mutazioni
tra i codoni 1250 e 1464 sono associate alla FAP
profusa, mutazioni nella regione N-terminale (codone
1-157 e 216-412) e nella C-terminale (codone 1595-2843)
predispongono alla FAP attenuata, mentre mutazioni che
ricadono nelle rimanenti regioni sono associate alla forma
intermedia. La localizzazione della mutazione, inoltre,
influenza l’insorgenza delle manifestazioni extraintestinali
della malattia.
Obiettivo del nostro studio è stato valutare la presenza di
mutazioni del gene APC in pazienti con FAP.
L’analisi molecolare è stata eseguita su DNA estratto da
sangue periferico di 6 pazienti (4F e 2M), amplificando e
sequenziando i 15 esoni del gene APC.
L’analisi di sequenza ha permesso di identificare
mutazioni patogenetiche in 3/6 (50%) pazienti.
Due delle tre mutazioni frameshift sono state identificate
nel nostro laboratorio mentre la terza è stata
precedentemente descritta nella popolazione cinese. In
particolare, la mutazione c.3927_3931delAAAGA, già
descritta, ricade nel codone 1309 e determina un codone
di stop in posizione 1311. È stata identificata in un
paziente con FAP profusa.
La mutazione c.1605_1606delTG genera un prematuro
codone di stop in posizione 538, è stata identificata in
una paziente di 56 anni con FAP intermedia e tumore
desmoide.
La mutazione c.510_511insA determina la formazione
di un prematuro codone di stop in posizione 176. Tale
mutazione è stata identificata in una paziente con FAP
intermedia.
I nostri dati sono in accordo con la correlazione genotipofenotipo suggerendo che l’identificazione delle mutazioni
di APC può rivelarsi utile per un diverso approccio clinico
nei pazienti affetti da FAP e per il monitoraggio delle
manifestazioni extracoliche.
P192
STUDIO DEL DEFICIT DI ALFA-1 ANTITRIPSINA
NELLA POPOLAZIONE SARDA
1
1
1
2
A. Gigante , F. Puggioni , M. Lilliu , G. Orru' , M.
1
1
1
Pautasso , R. Faa , F. Coghe
1
Cagliari
2
Introduzione: L’AATD e’ una forma genetica abbastanza
comune di malattia epatica nel bambino e di enfisema
polmonare ed epatopatia nell’adulto, e fa parte delle
malattie rare. Si manifesta spesso con sintomatologia
clinica aspecifica, con tempi e modalità variabili, e
spesso non sono utilizzati i test molecolari per una
diagnosi definitiva. La diagnosi di laboratorio spesso
casuale e puo’ essere posta partendo dall’assenza del
picco delle α1-globuline all’EPS. Tale carenza induce a
sospettare l’AATD, che deve essere prima confermata
con il dosaggio sierico e quando necessario deve
essere studiato il profilo genico. Per questi motivi,
e’ragionevole pensare che l’AATD sia una condizione
clinica sottostimata, da considerarsi probabilmente non
una malattia rara, ma raramente diagnosticata. In
Sardegna i casi di AATD sono correlati ad una mutazione
nota come MMalton/M-Cagliari, rarissima nelle altre
popolazioni, o alla mutazione S. Non disponiamo ancora
di dati attendibili circa la frequenza di questa mutazione.
Scopo del lavoro: individuare i soggetti con AATD e
calcolare la frequenza della mutazione nella popolazione
da noi considerata, trovare un cut-off decisionale di
laboratorio da utilizzare per decidere quali pazienti
studiare per la mutazione.
Materiali e metodi: Si sono considerate le foresi di
pazienti studiati nel periodo compreso dal 18 marzo
al 18 giugno 2014. Sono stati selezionati i sieri con
picchi bassi di α1-globuline e si e’proceduto al dosaggio
dell’AAT. La foresi e’stata eseguita su gel di agarosio
mediante strumento Interlab G26. Il dosaggio di AAT
e’ stato eseguito con metodo immuno-turbidimetrico
su analizzatore OLYMPUS AU640. I dati sono stati
confrontati con altri indici di flogosi quali PCR e VES.
Risultati: I dati preliminari confermano la prevalenza della
variante M-Malton/M-Cagliari nei portatori, e la presenza
della mutazione S e il cut-off e’risultato leggermente
maggiore di quello indicato in metodica (103 vs 90).
Conclusioni: si dimostra che il controllo costante e attento
dei picchi di α1 anomali consente al clinico di individuare
precocemente i pazienti con AATD che ancora non
presentano i sintomi della malattia e/o che non sanno di
essere portatori di questo deficit.
525
P193
UN ESEMPIO DI DIAGNOSI DI EMOFILIA … UN
SECOLO DOPO
1
1
2
3
P. Nardiello , R. Ingino , A. Rocino , A. Coppola , P.
4
3
5
Gresele , G. Di Minno , G. Castaldo
1
CEINGE-Biotecnologie avanzate, Napoli
2
Centro Emo#lia e Trombosi, Osp. S.G. Bosco, Napoli
3
Centro di Coordinamento Regionale Emocoagulopatie,
Dip. di Medicina Clinica e Chirurgia, Univ. degli Studi di
Napoli Federico II, Napoli
4
Dip. di Medicina Interna, Univ. degli Studi di Perugia
5
CEINGE-Biotecnologie avanzate, Napoli; Dip. di
Medicina Molecolare e Biotecnologie Mediche, Univ.
degli Studi di Napoli Federico II, Napoli
In genere, la richiesta di diagnosi molecolare per l’Emofilia
riguarda bambini con sintomatologia clinica suggestiva,
o soggetti in età riproduttiva per l’identificazione delle
portatrici. In alcuni casi la diagnosi molecolare viene
richiesta a livello prenatale.
Negli ultimi anni, l’attenzione alla malattia permette di
identificare le forme di Emofilie A e B di tipo moderato
e lieve (attraverso l’analisi funzionale del fattore VIII o
del fattore IX), e di porre diagnosi in pazienti in età non
pediatrica con sintomi meno severi di malattia. Lo sviluppo
di metodologie di sequenziamento massivo consente di
identificare i difetti genetici responsabili di queste forme
meno severe, confermando la diagnosi.
Tuttavia, è stato sorprendente dover firmare un referto
(positivo!) di analisi molecolare per Emofilia B (HB)
moderata in un paziente di 101 anni. Leggendo la data
di nascita sul referto, il primo pensiero è stato quello di
un errore di sovrastima di … circa 100 anni nella data
di nascita. Ma discutendo il caso clinico con i Colleghi di
corsia, abbiamo confermato l’età, ma anche la diagnosi.
Si tratta di una forma moderata di malattia (cioè associata
a valori di attività del fattore IX compresi tra 1 e 5%) che
in genere è sintomatica, mentre l’accurata anamnesi …
remota nel nostro paziente ha escluso episodi maggiori di
sanguinamento, intervenuti soltanto in questi ultimi mesi,
giustificando quindi l’avvio dell’iter diagnostico. Inoltre,
non avendo mai subito interventi chirurgici di rilievo,
l’eventuale diagnosi basata sulla discordanza tra PT
(normale) ed aPTT (allungato) non è mai stata effettuata.
Tra l’altro, si deve trattare di un signore ben attento ai
problemi di “spending review” che ha preferito evitare,
nella sua lunga vita, esami di laboratorio non necessari!
In realtà, il difetto emorragico di tipo moderato, pur
rappresentando uno stato di malattia per il longevo
paziente, potrebbe addirittura avere agito da gene
modulatore positivo (Franchini M, Favaloro EJ, Lippi
G. Hemophilia, cancer and cardiovascular disease.
Blood Coagul Fibrinolysis 2010;21:1-2), proteggendolo da
eventi di tipo trombotico e favorendo il suo ingresso tra gli
ultracentenari.
Ringraziamenti: Ministero della Salute, Ricerca
finalizzata, annualità 2008.
526
P194
PENETRANZA INCOMPLETA ED ESPRESSIVITA'
VARIABILE IN HFE-HH : CASE REPORT
P. Olivieri, G. Grande, M. Calabtrese, C. Langella, R.
Amantea, A. Tafuri, R. Tortora, G. Pacifico, M. Ingenito
Lab. di Genetica Molecolare e Citogenetica, Osp.
Tortora, Pagani
L’emocromatosi ereditaria è un disordine del metabolismo
del ferro, caratterizzato da un progressivo sovraccarico
marziale nei tessuti. L’emocromatosi HFE-HH, o
emocromatosi di tipo 1 è autosomico recessiva
caratterizzata da penetranza incompleta, non tutti
i soggetti omozigoti manifestano la malattia, ed
espressività variabile delle manifestazioni cliniche in
individui con lo stesso genotipo. Le due principali
mutazioni del gene HFE sono la H63D e la C282Y.
Riportiamo il caso di una famiglia campana giunta alla
nostra osservazione per valori elevati di ferritina e di
saturazione della transferrina in un suo componente.
Il probando,dell’età di 33 anni, riferiva iperferritinemia
1910 ng /ml trattata con salassi, dall’età di 26 anni.
L’anamnesi evidenziava talassemia minor (HGB 11,6
g/dl, MCV 61 fl), sindrome da anticorpi antifosfolipidi
e lupus eritematoso sistemico.Il DNA del probando
era estratto da sangue periferico in EDTA. Venivano
amplificate con una Multiplex PCR, le sequenze target
dei geni HFE,TFR2,FPN1, responsabili di Emocromatosi
ereditaria, presenti nel pannello della Nuclear Laser
Medicine.Seguiva Reverse dot blot.L’analisi molecolare
veniva estesa ai genitori ed al fratello del probando.La
madre risultava wild type, il padre omozigote H63D/
H63D, il fratello eterozigote H63D come il probando. Il
padre dell’età di 64 anni, risultava asintomatico.Il fratello
presentava iperferritinemia ma assenza di manifestazioni
cliniche.La ferritina gioca un ruolo nell’insorgenza e
progressione di differenti patologie tra cui anche quelle
autoimmuni. L’iperferritinemia che nel nostro probando
aveva raggiunto valori > a 1000 nanogrammi/ml prima
dei salassi, può aver innescato un feedback positivo
che ha favorito la comparsa delle patologie autoimmuni.
Oggi si tende a ritenere che l’ espressività variabile
dell’emocromatosi ereditaria sia dovuta a geni modificatori
che hanno anch’essi un ruolo nel metabolismo del ferro
ed influenzano la severità del fenotipo.
P195
SINDROME DI KARTAGENER E FERTILITA' IN PMA
R. Lanzano, V. Calamiello, T. Nicolò, r. Ianniello
U.O.C. di Patologia Clinica e Molecolare
Tutti i soggetti affetti dalla Sindrome di Kartagener
o Sindrome delle ciglia immobili, hanno disturbi della
fertilità (sub-fertili) in quanto associano quasi sempre ,
ipo-astenozoospermia, idrocele ed oligospermia; solo
raramente sono normocinetici ed in tal caso i parametri
seminali sono normali.Nei casi di disturbi della motilita',
si ricorre a tecniche di fecondazione assistita Ins.
Intracit. Sperm. (ICSI)."La sindrome delle ciglia Immobili"
si associa alla carenza dell'enzima CarbossiMetilasi
(COCH3).
Le donne con Sindr. di K. presentano ipofertilita' ed
aumentato rischio di gravidanze ectopiche.
P196
ANALISI DELLA MUTAZIONE DPYDIVS14+1G>A NEL
GENE DIIDROPIRIMIDINA DEIDROGENASI (DPYD) IN
PAZIENTI ONCOLOGICI
1
2
2
2
E. Saba , A. Pinna , R. Serra , P.A. Manchia , E.
2
Rimini
1
Dip. di Scienze Biomediche, Biochimica Clinica e
Biologia Molecolare Clinica, Università di Sassari
2
ASL N.1 Sassari, Lab. Analisi chimico-cliniche e
Microbiologia, Osp. SS.ma Annunziata, Sassari
L'enzima Diidropirimidina Deidrogenasi (DPD) riveste un
ruolo critico nel catabolismo del 5-fluorouracile (5-Fu),
farmaco utilizzato per pazienti oncologici. Il gene DPYD è
altamente polimorfico, in particolare il polimorfismo DPYD
IVS+1 G>A risulta associato allo sviluppo di tossicità
elevata in seguito a terapia con 5-Fu (Van Kuilenburg
et al. 2002). La mutazione riguarda la sostituzione di
una guanina con una adenina nel sito di giunzione
dell'esone 14. Lo scopo del lavoro è stato quello di
valutare la frequenza della mutazione DPYDIVS+1G>A
in eterozigosi in pazienti oncologici prima di essere
sottoposti alla terapia col 5-Fu. Il test di farmacogenomica
per il polimorfismo del gene DPYD è stato messo a
punto nel 2011 presso il settore di Biol. Mol. del Lab.
di Analisi dell’Osp. Civile SS.ma Annunziata di Sassari;
in questo lavoro riportiamo i dati relativi al triennio
2011-2013. Sono stati analizzati 658 pazienti oncologici
sottoposti a terapia con 5-Fu. Il DNA genomico è stato
estratto da sangue periferico, successivamente è stato
amplificato utilizzando la tecnica di Real Time PCR.
Il pirosequenziamento è stato condotto utilizzando una
miscela di primers specifici per la sequenza da analizzare.
Sono stati individuati due individui eterizigoti per la
mutazione G/A e nessun individuo omozigote per la
mutazione A/A. La frequenza del polimorfismo G/A è
risultata dello 0,3% contro quella del polimorfismo G/G
pari al 99,7%. La frequenza trovata è risultata inferiore a
quella riportata in letteratura (1%); questo dato può essere
spiegato considerando sia il numero dei campioni che la
loro provenienza, poiché si riferisce ad una popolazione
costituita solo da pazienti oncologici. Un caso particolare
ha riguardato un paziente che ha sviluppato tossicità
in seguito a trattamento con 5-Fu nonostante il suo
genotipo per la mutazione fosse G/G. Le reazioni avverse
ai farmaci possono riguardare sia enzimi diversi, sia
polimorfismi differenti per lo stesso gene. Recenti studi
dimostrano che il numero di varianti alleliche associate
allo sviluppo di reazioni avverse alle fluoropirimidine è
aumentato, evidenziando la necessità di implementare il
pannello di mutazioni da analizzare per poter elaborare un
trattamento farmacologico che sia più idoneo al singolo
paziente.
527
P197
SLC29A1 POLYMORPHISM AND PREDICTION OF
ANEMIA SEVERITY IN PATIENTS WITH CHRONIC
HEPATITIS RECEIVING TRIPLE THERAPY
1
1
2
2
F.S. Falvella , S. Cheli , C. Magni , S. Landonio , C.
3
4
2
4
Mazzali , A.M. Peri , G. Rizzardini , M. Galli , E.
1
4
Clementi , L. Milazzo
1
L. Sacco University Hospital, Unit of Clinical
Pharmacology, Milan, Italy
2
L. Sacco University Hospital, I Unit of Infectious
Diseases, Milan, Italy
3
Università degli Studi di Milano, Department of Clinical
Sciences, Section of Biostatistics, Milan, Italy
4
Università degli Studi di Milano, Department of
Biomedical and Clinical Sciences L. Sacco, Milan, Italy
Hepatitis C virus (HCV) is one of the main cause of
chronic liver disease worldwide. The combination of
a new protease inhibitor boceprevir or telaprevir with
pegylated interferon-α and ribavirin (RBV) has increased
significantly the rates of virological response but also
the frequency and severity of anemia. Polymorphisms
in inosine triphosphatase (ITPA) gene have been
correlated with accumulation of inosine triphosphate
in red blood cells and protection against the decline
in Hb concentration during anti-HCV treatment. The
main protein involved in RBV cellular uptake is the
transporter ENT1, encoded by “the solute carrier family
29, member 1 (SLC29A1)”. Polymorphisms of SLC29A1
gene were associated with higher mRNA levels. In this
study, we investigated the role of ITPA and SLC29A1
polymorphisms on RBV induced anemia, in patients
treated with triple therapy.
Methods: Genomic DNA was extracted from whole blood
samples using Maxwell 16 (Promega). All genotypes
(rs7270101 and rs1127354 in ITPA and rs760370 in
SLC29A1) were determined by Real-Time PCR, using
LightSNiP (Roche).
Results: We enrolled 40 patients starting anti-HCV triple
therapy with telaprevir. A significant Hb reduction (>3 g/
dL) within week 12 of treatment was observed in 87.5%;
Hb levels dropped below 10 g/dL in 42.5% and 40%
showed a Hb decline >5 g/dL from pretreatment value.
The onset of severe anemia (defined by Hb decline >5
g/dL and/or EPO use or blood transfusion) was most
frequently seen from weeks 8 to 12. All genotypes are
in HWE. No association was found with ITPA SNPs.
SLC29A1 rs760370 GG genotype was associated with
the severity of hemoglobin decrease as expressed by
the Hb nadir delta from baseline (p=0.05) and by the Hb
decrease > 5 g/dL (p=0.006). Patient with GG genotype at
rs760370 developed severe anemia more frequently and
at an earlier time point (log-rank, p=0.01).
Conclusion: We present the first study on the association
between SNP in SLC29A1 gene and RBV-induced
anemia. If our observation is confirmed, the identification
of SLC29A1 risk genotype should be introduced into the
clinical practice as a tool to aid physicians in the decision
making process of reducing the dose of the RBV during
the anti-HCV triple therapy.
528
P198
DETERMINAZIONE DELLA MUTAZIONE V600E
DI BRAF NEL CARCINOMA PAPILLARE DELLA
TIROIDE E NELLE METASTASI LINFONODALI
A.L. Gambardella, G. Caliendo , G. D'Elia , M.C.
Guerra, M. Cioffi, M.T. Vietri
Dip. di Biochimica, Biofisica e Patologia Generale,
Seconda Università di Napoli
La mutazione somatica V600E di BRAF rappresenta
l'evento genetico prevalente nel carcinoma papillare
tiroideo (PTC). Diversi studi indicano che la mutazione
V600E si associa a caratteristiche clinico-patologiche
più severe, quali maggiore invasività, rischio di ripresa
di malattia e variante istologica tall cell. Inoltre tale
mutazione si associa alla perdita della capacità di captare
131
lo I e quindi ad una scarsa risposta terapeutica.
L’obiettivo del nostro studio è stato valutare la presenza
della mutazione V600E di BRAF in tessuti di pazienti affetti
da PTC con metastasi linfonodali laterocervicali.
Lo studio è stato condotto su 5 pazienti (4F e 1M).
L’analisi mutazionale è stata eseguita sul DNA estratto sia
dal tessuto tumorale tiroideo sia dal tessuto linfonodale.
L’esone 15 del gene BRAF è stato amplificato e
sequenziato.
Nessun paziente presentava la mutazione V600E nel
tessuto tiroideo, mentre è stata ritrovata in 1 dei 5 tessuti
linfonodali analizzati. La paziente con mutazione nel
tessuto linfonodale presentava un PTC plurifocale con
variante tall cell, mentre dei quattro pazienti con tessuto
tiroideo e linfonodi negativi alla mutazione V600E, tre
presentavano un PTC con variante istologica classica e
un paziente PTC con variante follicolare.
In accordo con quanto già descritto, la mutazione si
trova associata alla variante tall cell. La presenza della
mutazione nel linfonodo e la sua assenza nel tumore
primario può essere causata dalla multicentricità del PTC
o dalla possibilità che la mutazione nella lesione primaria
vada ad interessare un ristretto clone cellulare.
La valutazione di BRAF V600E nel tessuto tiroideo è
importante per la sua associazione con le caratteristiche
clinico-patologiche della neoplasia e la resistenza alla
terapia, infatti, i pazienti con V600E potrebbero essere
sottoposti a protocolli terapeutici alternativi che prevedono
l’uso di BAY43-9006 (Sorafenib e Nexavar) un inibitore di
RAF, VEGFR e PDGFR.
I nostri dati suggeriscono che nei pazienti con PTC e
metastasi l’analisi genetica deve essere condotta sia sul
tessuto neoplastico che su tessuto metastatico per la
corretta progettazione di approcci terapeutici mirati.
P199
HARMONIZATION OF TOTAL 25OH VITAMIN D
IMMUNOASSAYS: A MULTICENTER STUDY
1
2
3
1
G. Lippi , G.L. Salvagno , A. Fortunato , M. Dipalo , R.
1
4
3
Aloe , G. Da Rin , D. Giavarina
1
Laboratory of Clinical Chemistry and Hematology,
Academic Hospital of Parma, Parma, Italy
2
Academic Hospital of Verona, Verona, Italy
3
Laboratory of Clinical Chemistry and Hematology, San
Bortolo Hospital, Vicenza, Italy
4
Service of Laboratory Medicine, Hospital of Bassano
del Grappa, Bassano del Grappa (VI), Italy
Background: The assessment of total 25OH vitamin D
(25OH-D) is constantly growing, since its deficiency is
associated with several human disorders. Although a
number of automated immunoassays is now available,
inter-laboratory comparability remains an unresolved
challenge.
Methods: One hundred and twenty outpatient serum
samples (58 males and 72 females; mean age 54±18
years) referred to the local service of laboratory medicine
with a specific request for total 25OH-D testing were
centrifuged, divided in aliquots, frozen and then shipped to
four Italian laboratories. Total 25OH-D was measured with
a reference chromatographic method (Chromsystems
Instruments & Chemicals GmbH) adapted to a simple
isocratic HPLC systems with UV detection (Gilson Aspec
XL), as well as with seven automated commercial
immunoassays (Roche Cobas E601, Beckman Coulter
Unicel DXI 800, Ortho Vitros ES, DiaSorin Liaison,
Siemens Advia Centaur, Abbott Architect I System and
IDS iSYS). Data were compared with the reference
HPLC system before and after harmonization by means
of coefficients obtained by linear regression analysis of
individual data plotted against the results of the HPLC.
Results: Before harmonization, the mean value of 25OHD obtained with all seven immunoassays was significantly
different from that of the HPLC (all p <0.01), but the
difference was no longer significant after harmonization
(all p >0.5). Even more importantly, the general agreement
of data between the seven immunoassays and the HPLC
according to different thresholds of 25OH-D (i.e., <20;
20-30; 30-50; >50 ng/mL) increased from 0.68 (95% CI,
0.61-0.76) to 0.74 (95% CI, 0.71-0.78; p=0.049) after
harmonization. Substantial improvement of comparability
with HPLC was found for six out of seven methods.
Conclusions: The results of this multicenter study
clearly show that inter-assay harmonization of 25OH-D
measurement is effective to improve the comparability
of data across different laboratories, and should hence
be regarded as a primary target by the different
manufacturers.
P200
SIMULTANEOUS SALIVARY CORTISOL AND
CORTISONE MEASUREMENT BY SPE-LC-MS/MS IN
A CLINICAL LABORATORY PRACTICE
1
2
2
2
G. Antonelli , C. Artusi , M. Marinova , L. Brugnolo , M.
2
1
Zaninotto , M. Plebani
1
Padova
2
Introduction: Salivary cortisol (sF) and cortisone (sE)
measurements are used in the investigation of disorders
of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis. Latenight salivary cortisol (namely 11pm) is recommended
as a frontline test for the diagnosis of Cushing’s
syndrome. Salivary cortisol at the awakening (namely
8am) could be useful in the hypocortisolism and during
the hormone replacement therapy. A highly sensitive and
specific method is mandatory to analyse two very similar
compounds such as F and E in the very low levels found
in saliva. LC-MS/MS can provide the necessary sensitivity
and the specificity required to eliminate interference by
steroids related to cortisol.
Aim: To develop and to validate a SPE-LC-MS/MS
method for F and E in saliva, suitable for a routine clinical
laboratory.
Methods: After SPE with HLB cartridge, chromatographic
separation of F and E was achieved on Zorbax Eclipse
XDB-C18 (4.6 mm x 50 mm, 1.8 µm), using on-line SPE.
F, E, d4F and d7E were detected in the multiple-reaction
monitoring mode. Both quantitative and qualitative m/z
transitions were used to monitor F (363-121, 363-327)
and E (361-163, 361-145), with single transitions for
the internal standards (d4F 367-121, d7E 369-169), with
positive ESI. Linearity, imprecision and recovery were
evaluated. Reference sF, sE were determined in 80
apparently adult volunteers (36 males, 44 females; age
range 22-88 yrs) at 8am and 11pm.
Results: Calibration curves were linear throughout the
studied ranges (F: 0.5-51.0 nmol/L, E: 0.5-55.4 nmol/L)
2
with r >0.998 for both analytes. LOQ were 0.5 nmol/L for
F and E. The intra- and inter-day imprecisions were <10%
for both analytes. Recoveries ranged from 87 to 115%.
Non parametric reference intervals were 3.0-21.1 nmol/
L and 10.2-42.5 nmol/L at 8am and 0.5-2.6 nmol/L and
1.6-13.2 nmol/L at 11pm for F and E, respectively.
Conclusions: The proposed method demonstrated
satisfactory linearity, analytical sensitivity, imprecision
and accuracy for F and E. Diagnostic performances have
to be evaluated in Cushing’s syndrome, but also in other
pathological conditions. So, we could conclude that the
method can be proposed for the application in the routine
clinical laboratory.
Inder WJ, Dimeski G, Russell A. Clin Endocrinol (Oxf)
2012;77:645-51.
529
P201
SIMULTANEOUS DETERMINATION OF 6 SERUM
STEROIDS BY LC-MS/MS: COMPARISON WITH
ROUTINE IMMUNOASSAYS
1
2
3
P202
PERFORMANCE CLINICA DEL CORTISOLO
SALIVARE NOTTURNO NELLA DIAGNOSTICA
DELLA SINDROME DI CUSHING
2
1
G. Antonelli , C. Artusi , R. Bozic , M. Marinova , L.
2
2
2
1
Brugnolo , D. Faggian , M. Zaninotto , M. Plebani
1
Padova
2
3
PerkinElmer Italia, Monza
TM
precipitation protocol based on IVD reagent kit (CHS
MSMS Steroids Kit-PerkinElmer). We analysed 50 serum
samples from our routine analyses (28 males, 47±12
yrs). LC-MS/MS was compared with immunoassay
measurements performed on COBAS 6000 (Roche) for
T and P, Immulite 2000 (Siemens) for F, A, DHEAS
and by manual ELISA method (DRG diagnostics) for
17OHP. The Passing-Bablok fit was applied to account for
the imprecision of both methods; Bland-Altman test was
drawn for agreement estimation.
Results: The obtained Passing-Bablok fits were: y=1.16x
+0.06 for DHEAS, y=1.36x-47.65 for F; y=2.43x-1.56 for
A; y=7.21x-1.63 for P; y= 1.00x+0.18 for T; y=0.90x+0.55
for 17OHP. By Bland-Altman test we obtained a bias of
19% (95%CI:16% to 22%) for DHEAS; 21% (95%CI:16%
to 26%) for F; 52% (95%CI:39% to 64%) for A; 84%
(95%CI:53% to 115%) for P; 7% (95%CI:2% to 13%) and
14% (95%CI:6% to 22%) for T; 15% (95%CI:-1% to 31%)
for 17OHP. The bias for T below 1.2 nmol/L was 28%
(95%CI:6% to 50%).
Conclusions: The comparison of UPLC-MS/MS method
with routine immunoassays revealed acceptable
agreement for DHEAS, F and T above 1.2 nmol/L and
poor agreement for A, P, 17OHP and testosterone below
1.2 nmol/L. Studies are compelling in order to evaluate the
possibility to replace immunoassays in the clinical routine
with a mass spectrometry based method.
Couchman L, Vincent RP, Ghataore L, et al. Challenges
and benefits of endogenous steroid analysis by LC-MS/
MS. Bioanalysis 2011;3:2549-72.
3
1
Introduction: The simultaneous quantitative measurement
of circulating steroids is an important research tool, as
well as in diagnosis and management of the disorders
related to their synthesis and metabolism. HPLC-MS/MS
has the potential to become a competitor for widely used
immunoassays for steroid analysis for high selectivity,
specificity, sensitivity and accuracy.
Aim: To compare the results of 6 serum steroids
(DHEAS, cortisol-F, androstenedione-A, testosteroneT, progesterone-P, 17 hydroxyprogesterone-17OHP)
obtained by LC-MS/MS with those provided by
immunoassays employed in our routine laboratory.
Methods: Analysis was performed on a UPLC tandem
mass spectrometer system (Acquity UPLC-TQD Waters)
in positive mode electrospray ionization and Multiple
Reaction Monitoring acquisition after a simple protein
530
2
C. Carrozza , P. Locantore , P. Campanella , S. Di
1
2
2
2
Leva , E. Cumbo , R.M. Paragliola , S.M. Corsello , C.
1
Zuppi
Dip. di Diagnostica e Medicina di Laboratorio Università Cattolica - Policlinico Agostino Gemelli Roma
2
U.O.C. di Endocrinologia Università Cattolica Policlinico Agostino Gemelli - Roma
3
Dipartimento di Sanità Pubblica – Università Cattolica Policlinico Agostino Gemelli - Roma
Introduzione: Il cortisolo salivare notturno (ore 23) è un
test di primo livello per lo screening della Sindrome
di Cushing (SC). Le misurazioni del cortisolo salivare
riflettono accuratamente le concentrazioni di cortisolo
libero plasmatico. Il cortisolo salivare ha numerosi
vantaggi legati alla stabilità del campione, alla semplicità
della procedura di raccolta, che può essere eseguita a
domicilio ed è priva di stress, condizione che può inficiare
il risultato del test.
Obiettivo: Verificare la performance clinica del cortisolo
salivare notturno nella diagnosi di SC, valutandone il
relativo cut-off.
Pazienti e metodi: Sono stati studiati 56 pazienti con
diagnosi confermata di SC pervenuti nella nostra struttura
da gennaio 2010 a maggio 2014. I pazienti hanno raccolto
un campione di saliva alle ore 23 mediante tamponcini in
cotone (Salivette Cortisol, Sarstedt®). Sono stati inoltre
valutati 30 campioni di saliva delle ore 23 di volontari
sani come controllo. Le provette sono state centrifugate
a 4000 giri a 4°C per 10 minuti e congelate a -80
°C sino al dosaggio, che è stato eseguito con metodo
ECLIA su Cobas e411 (Roche Diagnostic), senza alcun
pretrattamento del campione. La sensibilità analitica del
metodo è di 0.02 µg/dL.
Risultati: I pazienti affetti da SC presentavano valori di
cortisolo salivare più elevati rispetto al gruppo di controllo
(p <0.01). Il valore di cortisolo salivare nel gruppo CS è
stato di (media ± DS) 0.95 ± 1.1 µg/dL (valore minimo 0.3
µg/dL; massimo 7.9 µg/dL; mediana 0.6 µg/dL). L’analisi
della curva ROC ha mostrato un’area sotto la curva pari a
1, identificando così il cortisolo salivare notturno come test
altamente predittivo. Basandosi su tale curva, il valore di
cut-off prescelto è stato 0,3 µg/dL fornendo una sensibilità
del 100% ed una specificità del 100%.
Conclusioni: I nostri dati confermano l’utilità del cortisolo
salivare come test di primo livello ad elevata accuratezza
diagnostica nella valutazione della sindrome di Cushing.
È opportuno che ogni laboratorio calcoli il proprio cutoff diagnostico e validi l’accuratezza clinica in base del
metodo di dosaggio utilizzato.
Raff H. Utility of salivary cortisol measurements in
Cushing's syndrome and adrenal insufficiency. J Clin
Endocrinol Metab 2009;94:3647-55.
P203
ISOLATED HYPOGLYCEMIA, IN ADDITION TO
TYPE A INSULIN-RESISTANCE SYNDROME, IS
A CLINICAL PHENOTYPE OF PATIENTS WITH
HETEROZYGOUS MUTATIONS IN THE TYROSINE
KINASE DOMAIN OF THE INSULIN RECEPTOR
GENE
1
2
1
1
V. Grasso , S. Innautato , F. Pastacaldi , F. Barbetti
1
Dip. Medicina Sperimentale e Chirurgia, Università Tor
Vergata, Roma
2
SOC di Pediatria, Az. ULSS 18, Rovigo
Mutations of the insulin receptor (INSR) gene cause three
clinical phenotypes of severe insulin resistance: Donohue
syndrome (DS), Rabson-Mendenhall syndrome (RMS)
and type A insulin resistance (TypeA-insR)(1). The lifethreatening conditions DS and RMS are associated with
biallelic mutations of INSR gene, whilst TypeA-insR can
be caused by biallelic mutations as well as by dominantnegative mutations in the tyrosine kinase domain of
the receptor (1). In addition, a large Danish family
suffering from HYPOglycemia and carrying the INSR
mutation R1201Q (tyrosine kinase domain) has been
described in 2004. The congenital DS and RMS share
common metabolic features, with alternance of HYPER
and HYPOglycemia; TypeA-insR is usually diagnosed
in adolescent females with signs of hyperandrogenism
(hirsutism), menstrual cycle disturbances, and acanthosis
nigricans (1). We screened the 22 exons of the insulin
receptor gene by polymerase chain reaction amplification
of genomic DNA and DNA direct sequencing in 13
patients with clinical and metabolic evidence of severe
insulin resistance (extreme fasting and postprandial
hyperinsulinemia in the absence of obesity). We found
biallelic INSR mutations in 2 patients with the clinical
diagnosis of DS, in 5 patients with the clinical diagnosis
of RMS, and in 1 patient with an intermediate phenotype
between DS and RMS. In one of the three patients with
TypeA-insR, who presented with episodes of postprandial
“faintness”, the heterozygous INSR mutation R1201Q was
identified. The same mutation was also detected in an
adult patient with hyperinsulinism who was referred to us
for recurrent hypoglycemic episodes. A novel mutation
in the tyrosine kinase domain of the INSR was also
identified in a proband with hyperinsulinemia and severe
hypoglycemic crisis.
We conclude that mutations in the tyrosyne kinase domain
of INSR are an emerging cause of HYPERinsulinemic
HYPOglycemia.
1. Taylor SI, Cama A, Accili D, et al. Mutations in the
insulin receptor gene. Endocr Rev 1992;13:566-95.
P204
DIAGNOSTIC ACCURACY OF CALCITONIN ASSAY
ON FINE-NEEDLE ASPIRATE WASHOUTS IN
MEDULLARY THYROID CARCINOMA
1
2
2
2
G. Canu , D. Maccora , M. Raffaelli , R. Bellantone , C.
1
1
Zuppi , C. Carrozza
1
Dep. of Diagnostic and Laboratory Medicine,
“A.Gemelli” Hospital, School of Medicine, Catholic
University of Rome, Italy
2
Dep. of Endocrine and Metabolic Surgery, “A.Gemelli”
Hospital, School of Medicine, Catholic University of
Rome, Italy
Background: The prevalence of Medullary Thyroid
Carcinoma (MTC) varies from 5 to 10% among all thyroid
tumors and from 0.4 to 1.4% among thyroid nodules.
Ultrasound-guided fine-needle aspiration biopsy cytology
(FNA-C) is the most common procedure to confirm the
diagnosis of primary or metastatic MTC but the sensitivity
of FNA-C is not very high (about 45-63%). In the last
years, the calcitonin (CT) measurement in the needle
wash-out (FNA) combining to cytology has been proposed
to improve the diagnostic accuracy.
Methods: We collected FNA-C and FNA-CT samples
from 62 thyroid nodules or lymph nodes of 38 patients
with suspicious MTC before initial surgery or during
post-surgery follow up. Samples for serum CT (sCT)
measurement were obtained in all the patients before
performing FNA-C. After obtaining a FNA-C specimen,
the needle was washed with 0.5 mL of saline solution.
ROC analysis was performed to determine the absolute
FNA-CT cut-off and the cut-off ratio between FNA-CT and
sCT with the highest sensitivity and accuracy. Diagnostic
accuracies of the established cut-offs were compared with
that of FNA-C.
Results: Primary or metastatic MTC was found at final
pathology examination in 18 cases (29.0%). sCT and
FNA-CT values were 217.5 pg/mL ± 599.1 (range
3.0-3110.0 pg/mL) and 317.9 pg/mL ± 687.4 pg/mL
(range 1.6-2000.0 pg/mL), respectively. ROC analysis
indicated absolute levels of FNA-CT >10.4 pg/mL and
FNA-CT/sCT ratio >1.39 as the more accurate cutoffs. Sensitivity, specificity, overall accuracy, positive and
negative predictive values were: respectively for FNA-C
50%, 100%, 85%, 100 and 83%; for FNA-CT 89%, 100%,
97%, 100% and 96%; for FNA-CT/sCT ratio 83%, 93%,
90%, 83% and 93%. One out 2 patients with false negative
FNA-CT result and one out 3 patients with false negative
FNA-CT/sCT ratio were correctly diagnosed by FNA-C.
Eight out 9 non-diagnostic FNA-C were correctly classified
by FNA-CT and 7 by FNA-CT/sCTratio.
Conclusion: FNA-CT level alone seem more accurate
(97%) than FNA-CT/sCTratio (90%). FNA-CT should
integrate but not substitute FNA-C to detect primary or
metastatic MTC. FNA-CT is particularly useful in presence
of non diagnostic FNA-C because the biochimical
variation is ahead of time than cytological diagnosis.
531
P205
TESTOSTERONE LIBERO O BIODISPONIBILE:
QUAL'È L'INFORMAZIONE CORRETTA?
A. Fortunato, G.F. Pinaffo, C. Marchetti
Laboratorio di Chimica cliinica ed Ematologia - Ospedale
"San Bortolo" Vicenza
Il testosterone (TST) circola nel sangue per la maggior
parte legato a proteine di trasporto a causa della sua
insolubilità in soluzioni acquose; in particolare è legato
ad alta affinità con SHBG e a bassa affinità con
albumina. Solo una modesta frazione di testosterone
è libero da legami (LTST) e quindi in grado di
espletare la propria attività biologica. Comunemente si
considera come testosterone biodisponibile (bioTST) la
frazione libera sommata alla frazione legata all’albumina.
Dal punto di vista clinico il dosaggio del TST, e in
particolare della frazione libera, sono utili nella diagnostica
dell’ipoganadismo maschile. Per questo steroide sono
utilizzati diversi metodi di dosaggio (RIA, CLIA, ELISA),
ma si considera la spettrometria di massa come metodo
di riferimento. La determinazione della frazione libera può
essere eseguita tramite dialisi all’equilibrio (considerata
come metodo di riferimento) o metodi immunometrici,
in alternativa si possono stimare le quote di LTST o
bioTST tramite l’uso di algoritmi che integrano valori di
TST, SHBG e ALB. Abbiamo valutato un totale di 103
soggetti con età tra 8 e 70 anni, di cui 57 maschi e 46
femmine, in cui sono stati dosati TST (Siemens Advia
CentaurXP), LTST (RIA Immunotech), SHBG (Roche
Cobas E411), ALB (Siemens Dimension Vista) e si è
utilizzato per i calcoli di LTST e bio-TST il calcolatore
messo a disposizione dalla International Society for
the Study of the Aging Male (ISSAM). La popolazione
maschile presa in esame ha evidenziato valori nella
norma per il 95% dei campioni misurati per TST e LTST,
mentre l’89% dei soggetti risulta al di sopra dell’intervallo
di normalità se applicato l’LTST calcolato, utlizzando
invece il bioTST la quota dei patologici scende al 28%
con il 65% dei campioni classificati come normali. La
popolazione femminile ha evidenziato valori nella norma,
o addirittura inferiori all’intervallo di riferimento,nella quasi
totalità dei campioni misurati per LTST e del 60% per TST;
mentre il LTST calcolato evidenzia il 9% di valori elevati.
In conclusione i metodi calcolati sembrano correlare
meglio ai metodi misurati nella popolazione femminile
rispetto alla maschile, ma una più accurata valutazione dei
risultati dovrebbe essere subordinata ad una più ampia
valutazione dei limiti di riferimento utilizzati.
532
P206
RESULTS OF A SURVEY ON THE USE OF
BIOCHEMICAL MARKERS OF BONE METABOLISM
IN ITALY
1
2
2
3
F. Pagani , U. Basile , C. Callà , R. Dittadi , A.
4
5
6
7
Fortunato , S. Gelsumini , A. Terreni , A. Vernocchi
1
Dipartimento di Medicina di Laboratorio, Fondazione
Poliambulanza Istituto Ospedaliero, Brescia
2
Dipartimento di Medicina di Laboratorio, Policlinico A.
Gemelli, Roma
3
Lab. Biochimica Clinica, Osp. dell'Angelo, Venezia
4
Lab. Chimica Clinica ed Ematologia, Osp. San Bortolo,
Vicenza
5
Lab. Analisi, Osp. di Circolo e Fondazione Macchi,
Varese
6
Lab. Generale, AO-Universitaria Careggi, Firenze
7
Servizio di Medicina di Laboratorio, IRCCS
Multimedica, Milano
53 laboratories spread across the country (21 north,
19 middle, 13 south) responded to a survey on
the use of biochemical markers of bone metabolism
sent to the members of SIBioC. Bone markers are
required especially in post-menopausal and secondary
osteoporosis and neoplasms, for the follow-up of the
therapy, the therapeutic decision making but also for
diagnostic purposes. The high biological and analytical
variability are considered limits for their use in clinical
practice. 84% (43/51) performs the vitamin D and
parathyroid hormone, 2 also perform 1-25 OH vitamin
D. 37 laboratories perform markers of remodeling, of
these 62% performs both markers of bone formation
and bone resorption (one or more), 24% only markers
of formation, 14% only markers of resorption. The most
commonly used is a marker of formation, osteocalcin
(70% of the laboratories), followed by bone alkaline
phosphatase (65%), the urinary crosslinks of pyridinium
(deoxipyridinoline) are performed by 46% of laboratories,
the telopeptide C-terminal of collagen of type I (CTXI) by 40%, only 3 laboratories performing the peptide
N-terminal of procollagen type I (PINP), 2 performing
the telopeptide N-terminal of collagen of type I (NTX-I)
and 2 osteoprotegerin. About the type of urinary sample
required half of laboratories used the sample of 24 hours
while the remaining half the extemporaneous urine; in
most cases the result is reported to the concentration
of urinary creatinine. The IQC is performed in 96% of
laboratories, 83% in each run, 69% over 2 levels and 19%
over three levels. 70% use control materials supplied by
the manufacturer of the kit. 73% participate in VEQ. With
respect to the methods used for the assay the automation
with chemiluminescent is by far the most represented
(75%) followed by immunoenzymatic methods (11%), RIA
(8%) and HPLC (6% ). Only one laboratory determined the
bone isoform of alkaline phosphatase by electrophoresis.
Compared to a similar survey conducted in 2007 we
observed an increase of laboratories carrying out the bone
markers with a more distribution throughout the country,
an increase of laboratories performing CTX-I (40 vs 30%)
and a greater diffusion of the automatic methods.
P207
LE IPONATREMIE: LE STRATEGIE E IL RUOLO DEL
LABORATORIO CLINICO
1
2
1
1
A. Ognibene , A. Peri , B. Salvadori , M. Lorubbio , S.
1
1
1
1
Rapi , C. Gattini , R. Girolami , A. Baldi
1
Laboratorio Generale, Azienda OspedalieroUniversitaria Careggi, Firenze
2
Unità di Endocrinologia, Dipartimento di Fisiopatologia
Clinica, Università di Firenze
Introduzione: La sindrome da inappropriata secrezione
di ADH (SIADH) è causata dalla mancata regolazione
della secrezione dell'ormone ipofisario che promuove
il riassorbimento di acqua nella parte distale del
nefrone con conseguente iponatremia. L’iponatremia è
spesso associata a sintomi neurologici come i deficit
di attenzione, cadute che sono spesso i motivi di
ospedalizzazione del paziente anziano, inoltre una
severa iponatremia (<130 mEq/L) è responsabile di
scompensi motori e cognitivi talvolta con esiti fatali. Il
laboratorio riveste un ruolo importante per la diagnosi
e la stratificazione del rischio dei soggetti affetti da
SIADH, alcuni esami di chimica clinica sono sufficienti
per indirizzare la diagnosi. In questo studio, utilizzando
dati retrospettivi, verifichiamo se una diversa strategia
potrebbe migliorare l’identificazione e la stratificazione del
rischio dei soggetti affetti da SIADH.
Materiale e metodi: Sono stati estratti dal database i
dati relativi alla determinazioni del sodio effettuati dal
laboratorio dal 01/01/2012 al 30/06/2012. I dati così
estratti sono stati elaborati per ottenere le seguenti
informazioni: risultati esami ematici (sodio, glucosio, urea,
ac. urico, creatinina), esami urinari (chimico-fisico, sodio,
osmolarità), dati anagrafici, reparto richiedente. I dati
raccolti su un file di Excel (Microsoft), sono stati elaborati
utilizzando SPSS (ver. 11.5).
Risultati: Su 71.126 determinazioni di Sodio plasmatico
come primo accesso, 787 sono risultate <130 mEq/L ( 1.1
%). Dei 787 (M 388-F399) con età compresa tra 19 e 101
anni (M 73±15.6) il 50% proveniva dal PS (Na 125±4.3
mEq/L), il 44 % erano degenti (Na 127±2.8 mEq/L), il
2% dagli ambulatori specialistici (Na 128±1.4 mEq/L) e
il 4% dal CUP(Na 127±2.4 mEq/L). I test per il calcolo
dell’osmolarità plasmatica erano presenti solo nel 55% dei
casi, il campione di urina solo nel 10%.
Discussione e conclusioni: La maggior parte dei soggetti
con iponatremia severa pervengono dal Pronto Soccorso
o sono ospedalizzati. L’individuazione dei campioni
biologici da parte del laboratorio, di questi soggetti
e la configurazione di reflex test sia plasmatici che
urinari (urina estemporanea) possono guidare verso una
tempestiva diagnosi, prima che questa possa in qualche
modo essere impedita da terapie correttive (diuretici,
infusioni iperosmolari etc).
P208
25(OH) VITAMINA D: STANDARDIZZAZIONE E
VALORI DI RIFERIMENTO
M. Lorubbio, B. Salvadori, S. Rapi , D. Tinalli , R.
Palumbo , D. Deninno , T. Tuzzi, A. Ognibene
Laboratorio Generale, Azienda Ospedaliero Universitaria Careggi, Firenze
Introduzione: Il NIH Office of Dietary Supplements
(ODS) in collaborazione con la CDC National Center
for Environmental Health (NCEH), il National Institute of
Standards and Technology (NIST) e la Ghent University,
nel Novembre 2010 hanno costituito il Vitamin D
Standardization Program (VDSP). Recentemente le ditte
produttrici di reagenti del dosaggio della Vitamina D
(25-OH-VitaminaD) stanno aderendo al programma di
standardizzazione. In questo contributo presentiamo i
valori di riferimento ottenuti nella popolazione generale
utilizzando un metodo standardizzato.
Materiali e metodi: I valori di riferimento sono stati ottenuti
da 222 campioni provenienti da una popolazione di
donatori presumibilmente sani. La determinazione della
25-OH-VitaminaD è stata effettuata su Advia Centaur
XP (Siemens) con i reagenti ADVIA Centaur Vitamina D
Totale riformulati con la procedura di riferimento ID-LC/
MS/MS. Il ID-LC/MS/MS è il metodo di riferimento del
programma VSDP (Vitamin D Standardization Program).
Per i calcoli statistici dello studio è stato usato SPSS
(versione 11.5).
Risultati: I campioni sono dello studio sono stati esaminati
durante i mesi di maggio e giugno. La popolazione
studiata (80 F e 142 M) e’ risultata avere un’età
mediana di 35 anni compresa nel range 18-62 anni. La
concentrazione media della Vitamina D nella popolazione
studiata è risultata di 16.6 ng/mL (95% C.I. 16.7-18.2 ng/
mL), non è risultata nessuna correlazione significativa con
età e sesso (P >0.5). I valori di riferimento sono risultati
compresi tra 9.8 e 28.5 ng/mL, rispettivamente al 5° e
il 95° percentile. Discussione: I risultati ottenuti sono in
linea con le dichiarazioni dell’ Institute of Medicine (IOM)
che identifica, in presenza di un normale apporto di calcio
con la dieta, il rischio di rachitismo per livelli di 25(OH)
Vitamina D inferiori a 10 ng/mL e 16 ng/mL il rischi di
fratture.
533
P209
RIVALUTAZIONE DEI LIMITI DI RIFERIMENTO
DEI PARAMETRI ORMONALI DOSATI PRESSO IL
LABORATORIO CENTRALIZZATO BALDI E RIBERI
DELLA AZIENDA OSPEDALIERO-UNIVERSITARIA
CITTA' DELLA SALUTE E DELLA SCIENZA DI
TORINO
1
2
2
A.T. Bertagna , P. Massarenti , C. Ambrogio , A.M.
1
2
2
Barberis , M. Lucchiari , G. Martinasso , C.
1
2
1
2
Niceforo , G. Priolo , M. Taliano , G. Mengozzi , E.
1
Ghigo
1
S.C.Endocrinologia,Diabetologia e Metabolismo, A.O.U.
Città della Salute e della Scienza di Torino
2
S.C. Biochimica Clinica, A.O.U. Città della Salute e
della Scienza di Torino
Scopo: L’obiettivo di questo studio consiste nella
rivalutazione sperimentale e monocentrica degli effettivi
limiti di riferimento e/o decisionali per i principali ormoni
dosati routinariamente presso il laboratorio confrontandoli
con gli attuali esistenti e con quelli proposti dai produttori
dei reagenti utilizzati per i dosaggi.
Metodo: I dosaggi sono stati effettuati in una popolazione
di donatori di sangue (200 uomini e 200 donne)
arruolata nell’arco di un anno, secondo criteri predefiniti
di inclusione ed esclusione, previa sottoscrizione del
consenso informato. Sono stati valutati i seguenti ormoni:
TSH, fT4, calcitonina, TRAb, AbTPO, ACTH, cortisolo,
DHEAS, PRL, FSH, LH, estradiolo (se femmine),
testosterone totale, aldosterone, PRA, PTH, inibina
B, SHBG, IGF-1, AMH , androstendione, 17 OH
progesterone, vit.D. I dosaggi sono stati eseguiti con
i metodi utilizzati nella routine: chemiluminescenza,
RIA-IRMA ed ELISA. I risultati sono stati classificati
secondo i criteri previsti dalla letteratura, ed elaborati
mediante statistica descrittiva non parametrica: mediana
e 2.5-97.5mo percentile.
Risultati: Tra i parametri esaminati, i limiti di riferimento
sono stati confermati per calcitonina e testosterone
nelle donne, mentre per vitamina D e Ab anti TPO è
stata considerata la necessità di sostituire l’intervallo di
riferimento con i limiti decisionali a conferma di quanto
indicato dalla letteratura; una distribuzione differente da
quella adottata è stata rilevata per 13 parametri che
comporterebbe una variazione degli attuali valori. Ulteriori
valutazioni si rendono invece necessarie per 12 parametri.
Conclusioni: I risultati ottenuti rispecchiano in modo
più preciso la popolazione di riferimento, anche in
considerazione dei criteri di elaborazione utilizzati,
più dettagliati rispetto alla situazione precedente. La
valutazione analitica dei limiti di riferimento costituisce
solo il primo passo nel percorso di revisione ed
eventuale modifica degli intervalli, che, soprattutto in
ambito endocrinologico, non può prescindere dalla
collaborazione con gli specialisti per una corretta
interpretazione nel contesto clinico più appropriato.
534
P210
PENTRASSINE (PTX3) E LEPTINA MARCATORI DI
QUALITA' OVOCITARIA
R. Lanzano, C. Saporito, A. Lanzano, T. Pagano, G.
Pagano
Dipartimento di Biochimica Clinica e Patologia Generale
UNINA2
Nei protocolli tradizionali di fecondazione in vitro (FIV) gli
ovociti ritenuti più idonei ad essere fecondati sono scelti
in relazione ad una valutazione morfologica, i successivi
zigoti da essi ottenuti dopo fecondazione, la loro ulteriore
analisi morfologica può essere indicativa di successo.
Da tale premessa si evince che uno scoring combinato
che tiene conto dello score dei gameti, dello zigote da
esso ottenuto e dallo stato degli embrioni pre-transfer può
rappresentare un sistema predittivo di qualità ovocitaria,
embrionaria e del prosieguo della gravidanza.
Negli ultimi tempi la tendenza a cercare dei marcatori
molecolari associabili allo stato di maturazione ovocitaria
ci ha portato a questo studio. Si sono valutati i livelli intrafollicolari dei relativi ovociti associati di PTX3 e Leptina
nei pazienti sottoposti a procedure di Procreazione
Medicalmente Assistita (PMA) e verificare se possono
rappresentare degli indici prognostici di fecondazione
sicuramente certa di gravidanza. Lo studio è stato
effettuato su 60 pazienti. La percentuale di successo della
tecnica riscontrata è stata del 54% delle pazienti che sono
giunte, e proseguito con gravidanza. In queste pazienti la
concentrazione delle pentrassine e della leptina, eseguite
su fluido follicolare con tecnica immunometrica, sembrano
correlare con lo stato di qualità dell'ovocita e dell'indice di
successo delle gravidanze ottenute.
P211
DETERMINATION OF REFERENCE VALUES OF
HbA1c: A MULTICENTER STUDY
1
1
1
2
M. Pieri , S. Pignalosa , F. Duranti , C. Calla , F.G.
3
1
1
Martino , S. Bernardini , M. Dessi
1
Department of Experimental Medicine and Surgery,
"Tor Vergata" University Hospital, Rome (Italy)
2
Department of Laboratory Medicine, “Policlinico
Gemelli” University Hospital, Rome (Italy)
3
Radiological Sciences and Laboratory Medicine
Department, S. Filippo Neri Hospital, Rome (Italy)
Hemoglobin A1c (HbA1c) is the major fraction of glycated
hemoglobin and is characterized by the non-enzymatic
binding of glucose on N-terminal valine residues of
hemoglobin β chains. HbA1c is considered the gold
standard of diabetic survey, since its evaluation provides
retrospective information on the glycemic balance of
patients for the past 6–8 weeks (1). Elevated HbA1c
values are associated with the development of long-term
complications in both type 1 and type 2 diabetes.
In 2010, the International Expert Committee proposed
use of HbA1c level of 6.5% (48 mMol/mol) or higher as
a new threshold for diagnosing diabetes; this threshold
was subsequently adopted by the American Diabetes
Association and the World Health Organization. However,
this recommendation did not differ for gender and age, so
the aim of this study was to redefine the cut-off values
of on the basis of gender. It can help clinicians to better
assess the pharmacological therapy and reduce the risk
due to diabetic complications.
We analyzed data from three Hospitals of Rome
("Tor Vergata" University Hospital, “Policlinico Gemelli”
University Hospital, S. Filippo Neri Hospital) to evaluate a
possible HbA1c differences for gender using the capillary
electrophoresis technique (capillarys 2 flex piercing;
SEBIA). We collected blood samples (300) from healthy
donors. Our data show a significant difference in gender
(male 31,5 ± 4,1 mMol/Mol; female 29,9 ± 3,5 mMol/Mol;
mean ± SD; p<0,05; Anova with Bonferroni test post hoc).
Specific HbA1c cutoff points may identify patients in
diabetes early stages and also aid the clinician to
maintain a good glycemic control; also it can reduce the
development and progression of diabetic complications
such as retinopathy, nephropathy and neuropathy.
Future studies on an increased cohort of patients and age
stratification of HbA1c values, may improve the accuracy
of the cut off.
1. Sacks DB, Arnold M, Bakris GL, et al. Guidelines and
recommendations for laboratory analysis in the diagnosis
and management of diabetes mellitus. Diabetes Care
2011;34:e61-99.
P212
CLARKE AND PARKES ERROR GRIDS: WHICH IS
THE BEST?
M.A. Isgro', R. Morelli, C. Zuppi, D. Scribano
Policlinico Gemelli, Roma
Background: Blood glucose monitoring systems (BGMS)
require a high level of accuracy, as reliable results are
prerequisite for ensuring adequate therapeutic decisions
for diabetic patients. In this context, it should be kept
in mind that a range of endogenous and exogenous
substances can adversely affect BGMS performance. The
aim of this study was to evaluate the different ability of
Clarke and Parkes error grids in assessing and predicting
the clinical outcome of eventual analytical errors of BGMS,
in the presence of interfering substances.
Methods: Tested BGMS included StatStrip Glucose
(Menarini), Accu-Chek Inform II (Roche) and Freestyle
Optium (Abbott) as hospital blood glucose meters, and
Breeze 2 (Bayer) as a self-monitoring blood glucose
meter. Accuracy studies were performed according
to CLSI EP7. The effects of high concentrations of
interfering substances and different haematocrit levels
were assessed in whole blood specimens at low,
intermediate and high glucose concentrations and results
compared to those obtained by hexokinase automated
method. The relevance of therapeutic decisions due to
clinically critical/uncritical errors of BGMS results was first
evaluated independently by means of Clarke and Parkes
error grids. Then, an analysis based on the comparison
between the two methods allowed us to identify the most
reliable clinical tool.
Results: The analytical accuracy of BGMS assessed was
influenced by several of the interfering substances. Clarke
error grids detected 10 clinically critical errors, 2 of which
falling in zone C, 7 in D and 1 in E. Among these, Parkes
grid analysis detected only 3 clinically critical errors, of
which 2 falling in zone C and 1 in D. Moreover, the severity
of errors detected by Parkes error grids was always
underestimated, determining an altered risk assessment.
Conclusions: Not all analytical errors will determine a
potential adverse event for the patient. In this scenario, a
tool useful to discriminate the “clinical severity” of BGMS
inaccuracy is mandatory. Comparing Clarke and Parkes
error grid analyses, the former seems to be more clinically
reliable than the latter, which underestimates potentially
life-threatening analytical errors.
535
P213
RUOLO DELLA TAURINA E DEL SUO
TRASPORTATORE NEI PAZIENTI AFFETTI
DA DIABETE DI TIPO I: CORRELAZIONE CON
MARCATORI DI DANNO OSSIDATIVO
1
1
3
3
Z. Napoli , S. Donati , A. Berti , R. Anichini , G.
3
2
1
1
Seghieri , F. Franconi , R. Lari , L. Bianchi
1
Lab. Analisi Chimico-Cliniche e Microbiologiche, Osp.
S. Jacopo, Pistoia
2
Dipartimento di Biotecnologie, Università degli Studi di
Cagliari
3
Diabetologia,Ospedale S. Jacopo, Pistoia
Introduzione: La taurina (Tau) ha proprietà protettive
verso lo stress ossidativo del diabete e gioca un ruolo
fondamentale nella funzione retinica. Il suo trasportatore
TauT viene down-regolato da alte concentrazioni di
glucosio, e la sua espressione è aumentata di 4 volte nelle
cellule mononucleate del sangue (MBC) di diabetici tipo 2.
Scopo: Scopo di questo studio è valutare il grado di
espressione di TauT nei pazienti diabetici di tipo 1 e la
sua relazione col compenso metabolico (HbA1c) e con
marcatori di stress ossidativo o di danno endoteliale in
MBC di diabetici tipo 1.
Metodi: L’espressione di TauT è stata valutata mediante
PCR real-time in MBC di 30 diabetici tipo 1 e in 30
soggetti di controllo appaiati per età e sesso, e confrontata
mediante metodo ∆∆Ct con l’espressione del gene housekeeping HPRT.
Risultati: L’espressione di TauT è risultata invariata
nei pazienti diabetici rispetto ai controlli (media ∆Ct =
3.9±0.24 vs 4.3±0.28), così come i valori di Tau nel
plasma e intracellulari (51 vs 47 µmoli/l e 38 vs 54
nmoli/106cellule rispettivamente). L’espressione di TauT
è risultata raddoppiata nei pazienti con valori di HbA1c >
10 (∆Ct=5.02±1.71) ed inversamente correlata alla durata
di malattia (p=0.02). Inoltre l’espressione di TauT correla
inversamente con i valori di omocisteina plasmatica
(p=0.04), risultando quasi raddoppiata nei pazienti con
omocisteina ≤10 (media ∆Ct=4.66±0.51) e debolmente
aumentata (1.52 volte) nei pazienti senza retinopatia (IC
95%: 1.24-1.85).
Conclusioni: Anche se l’espressione di TauT nelle MBC
dei pazienti di tipo 1 risulta correlata direttamente
con diversi marcatori di danno ossidativo (livelli di
HbA1c, retinopatia) ed inversamente con la durata della
malattia e i livelli di omocisteina, non risulta in media
significativamente più elevata come osservato nei pazienti
di tipo 2 (1.32 vs 3.9). Questo suggerisce l’ipotesi di un
diverso meccanismo di regolazione del trasportatore, in
accordo con la diversa natura patogenetica della malattia
diabetica.
Bianchi L, Lari R, Anichini R, et al. Taurine transporter
gene expression in peripheral mononuclear blood cells of
type 2 diabetic patients. Amino Acids 2012;42:2267-74.
536
P214
EFFICACY OF SITAGLIPTIN IN INSULIN DEFICIENT
TYPE 1 AND TYPE 2 DIABETIC PATIENTS.
RESPONSE OF BIOMARKERS
1
2
3
L. Rossi , G. Pellegrini , L. Della Bartola , O. Giampietro
3
3
, E. Matteucci
1
Clinical Pathology Laboratory, University Hospital of
Pisa
2
Clinical Chemistry Laboratory, University Hospital of
Pisa
3
Department of Clinical and Experimental Medicine,
University of Pisa
Background: Sitagliptin has been proven to be effective
and safe as add-on to insulin in adult patients with type
2 diabetes and absolute insulin deficiency. Recently, it
has been suggested to extend the use of dipeptidylpeptidase-4 inhibitors to type 1 diabetes. The aim of this
study was to evaluate and compare the effects of a longterm, fixed-dose combination of sitagliptin and metformin
as add-on to insulin on body mass index, fasting
plasma glucose, fructosamine, HbA1c, lipids (cholesterol,
triglycerides, HDL and LDL), and daily dose of insulin in
both type 1 diabetes and insulin-treated type 2 diabetes.
Material and methods: We recruited 25 patients with type
1 diabetes (mean age 51 ± 10 years, mean disease
duration 26 ± 13 years) and 31 insulin-treated type 2
diabetic patients (mean age 66 ± 8 years, mean disease
duration 19 ± 9 years), who received sitagliptin with
metformin as a fixed-dose combination (50/1000 mg once
or twice daily) or sitagliptin (100 mg once daily, if intolerant
to metformin) in addition to ongoing insulin therapy for 46
± 19 weeks and 56 ± 14 weeks, respectively.
Results: After 21 ± 9 weeks, patients with type 1
diabetes had a significantly lower body mass index,
fasting plasma glucose, fructosamine, HbA1c, and daily
insulin requirement. After 49 ± 17 weeks, they maintained
their weight loss and total daily insulin dose and showed a
significant reduction in low-density lipoprotein cholesterol
levels, whereas their HbA1c had returned to baseline
values. In patients with type 2 diabetes, long-term
treatment remained weight-neutral but had persistent
beneficial effects on short-term, intermediate-term, and
long-term biomarkers of metabolic control, as well as
on low-density lipoprotein cholesterol levels and insulin
requirement.
Conclusion: Clinical outcomes differed according to type
of diabetes in terms of quality and over time. In type 2
diabetes, the combination therapy significantly improved
metabolic control and the lipid profile, and decreased
insulin requirements, even in the absence of clinically
significant weight loss. In type 1 diabetes, the combined
therapy only temporarily improved metabolic control,
but significantly decreased body weight, low-density
lipoprotein cholesterol levels, and insulin requirements.
P215
VARIABILITY OF HBA1C IN DIABETICS
CORRELATED WITH EGFR TO EVALUATE THE
CARDIOVASCOLAR RISK
L. Loiodice, E. Mascolo, L. Nisi, M. Pasculli, T.
Troiano, A. Colacicco, T. Calabria, G. Ferrara, A.M.
Rutigliano, F. Di Serio
Azienda Ospedaliera - Universitaria Policlinico
Consorziale Bari U.O. Clinic Pathology
Introduction: In the time the Glycosilate Haemoglobin
changes in patients with glycemic intollerance and in
diabetics. Every repetition of HbA1c would have to reduce
the value until the glycemic control is optimal. The
values have different variations of mean (µ) and deviation
standard (SD); in this patients the diet or the therapy
becomes really necessary. On the contrary, a better
changed metabolism produces a reduction of HbA1c until
the normal value has been reached. The oscillations of
HbA1c, considerated as µ or SD, can be related to the
eGFR that decreases if the metabolic balance has been
lost: in the renal diabetic disfunction, the eGFR evaluates
the grade of CVD risk.
Material and methods: The HbA1c has been measured in
38 intollerant or diabetic subject, average age 60 years
old, followed up in our operative unit and chosen for
our study: 21 cases with reduced eGFR including the
interval of values 33 –89; 17 cases with normal eGFR. The
HbA1c (reference interval: 20-42 mmoli/moli) has been
mesaured on EDTA whole blood: the DS value has been
correlated with the relative eGFR calculated with MDRD
(normal value >90). The interval of oscillations of HbA1c
has happened in a period of 3 years.
Results: The increased or decreased eGFR (respectively
mean: 65±15.8 and 105.7±11.38) has been found
statistically significant if it has been related with SD HbA1c
value: respectively, in the two groups, the mean of SD
is 4.7±5 and 6.34±8.16; P Student paired samples and
P Wilcoxon are <0.001. In diabetic nephropathy with
hypertriglyceridemia and in monoclonal gammopathy the
correlation is, also, statistically significative. The Odds
Ratio is 1: therefore, the therapeutic choice is correct in
both groups; the bias correction factor Cb for accuracy is
0.039.
Discussion and conclusion: the significative correlation,
between oscillations (SD) of HbA1c and eGFR, evidences
that the CVD risk becomes lower when there is a correct
metabolic balance and HbA1c improves if the patient is a
good respoder after therapeutic treatment.
P216
SCREENING PER L'IDENTIFICAZIONE DI
MALATTIE AUTOIMMUNI O LINFOPROLIFERATIVE
ALL'ESORDIO IN PAZIENTI HCV NAIVE A
TRATTAMENTI ANTIVIRALE
1
1
2
1
F. Gulli , U. Basile , N. De Matthaeis , L. Colacicco , P.
3
2
Cattani , G. Rapaccini
1
Dipartimento di Medicina di Laboratorio Policlinico A.
Gemelli Università Cattolica del S. Cuore Roma
2
Istituto di Medicina Interna Policlinico A. Gemelli
Università Cattolica del S. Cuore Roma
3
Istituto di Microbiologia Policlinico A. Gemelli Università
Cattolica del S. Cuore Roma
Introduzione: Il virus dell’epatite C (HCV) seppur
epatotropo, è responsabile di un ampio spettro di
manifestazioni extra-epatiche. In particolare, l'infezione
cronica delle cellule immunocompetenti è alla base
della proliferazione “benigna”, dei linfociti B tipica della
crioglobulinemia mista. La parte innovativa dello studio
consiste nel cercare dei markers che identifichino il
passaggio tra uno stato silente di malattia linfoproliferativa
o autoimmune ed una franca patologia.
Materiali e metodi: Sono stati reclutati 33 pazienti
HCV positivi naive a trattamento antivirale con assenza
di sintomi di patologie autoimmuni e linfoproliferative.
La ricerca degli anticorpi antinucleo (ANA) è fatta in
immunofluorescenza indiretta (IFI), in immunodot quella
gli autoanticorpi diretti verso gli antigeni M2, Gp210,
Sp100, LKM1, LC1, SLA, F-actina. La ricerca delle
Free light chain (FLC) in turbidimetria. La ricerca delle
crioglobuline è effettuata in tubi di Wintrobe a 37 °C. La
ricerca del criofibrinogeno è effettuato in provette con
E.D.T.A. a 37°C.
Risultati: I risultati evidenziano la presenza di
crioglobulinemia nell’84% dei pazienti, una positività agli
ANA per circa il 27% di essi, una trascurabile positività
agli autoanticorpi epatopatici e la negatività alla presenza
di criofibrinogeno. Il dato rilevante è il riscontro di
elevati dosaggi di FLC per il 73% dei pazienti, dei
quali il 21% presentano una ratio elevata che mostra
uno sbilanciamento a favore delle catene leggere libere
Kappa. Lo studio statistico eseguito incrociando i risultati
ottenuti hanno mostrato che i pazienti aventi crioglobuline
e ratio delle FLC superiore a 1.7 risultano positivi alla
ricerca degli ANA.
Discussione e Conclusioni: Un’analisi critica dei risultati
evidenzia come la positività agli anticorpi antinucleo
sia indice della presenza di uno stimolo persistente
antigenico. La presenza di crioglobulinemia suggerisce
la persistenza della stimolazione linfocitaria. Il dato
interessante rilevato riguarda la presenza di valori elevati
di FLC e la possibilità che un valore di cut off possa
identificare il passaggio tra un probabile stato silente di
malattia linfoproliferativa o autoimmune ad una franca
patologia.
Terrier B, Sene D, Saadoun D, et al. Ann Rheum Dis
2009;68:89-93.
537
P217
ELF TEST AS A NEW DIAGNOSTIC TOOL FOR
NON-INVASIVE DIAGNOSIS OF LIVER FIBROSIS
IN PATIENTS WITH NONALCOHOLIC FATTY LIVER
DISEASE
1
2
3
4
M.A. Isgro' , L. Miele , C. Caldarella , C. Cefalo , A.
1
1
2
Giannace , C. Morlacchi , G.L. Rapaccini , A.
4
4
1
1
Gasbarrini , A. Grieco , C. Zuppi , T. De Michele
1
Dept. of Diagnostic and Laboratory Medicine, "A.
Gemelli" Hospital, Rome
2
Dept. of Medical Sciences, "A. Gemelli" Hospital,
Rome; Clinical Division of Internal Medicine,
Gastroenterology and Liver Unit, "Complesso Integrato
Columbus" Hospital, Rome
3
Institute of Nuclear Medicine, Dept. of Radiological
Sciences, "A. Gemelli" Hospital, Rome
4
Dept. of Medical Sciences, "A. Gemelli" Hospital, Rome
Background: The identification of fibrosis in patients with
nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) is important
for prognosis and selection of patients candidates for
therapeutic interventions. The reference standard for
detecting liver fibrosis is liver biopsy; however, such an
invasive procedure, it can be painful and hazardous,
and assessment subjective and prone to sampling error.
Recently, the serum Enhanced Liver Fibrosis (ELF) Test
has been developed for staging liver fibrosis in patients
with chronic liver diseases. The aim of our study was to
evaluate the ELF Test performance in predicting fibrosis
stage in an independent adult cohort of NAFLD patients.
Methods: 82 patients (mean age 46 years) with suspected
NAFLD were enrolled undergoing percutaneous liver
biopsy and serum sampling. Fibrosis was assessed and
scored by using the modified Brunt classification (F0=no
fibrosis; F1=perisinusoidal/periportal; F2=perisinusoidal
and portal/periportal; F3=bridging fibrosis; F4=cirrhosis).
The ELF Test was determined in all patients by means
of an algorithm combining hyaluronic acid, aminoterminal propeptide of type III collagen and tissue
inhibitor of metalloproteinase 1. Diagnostic accuracy was
assessed determining the area under receiver operating
characteristic curves (AUCs).
Results: The distribution of fibrosis stages in our cohort
was as follows: F0 = 7.3% (n=6), F1 = 39.0% (n=32), F2
= 35.4% (n=29), F3 = 6.1% (n=5), F4 = 12.2% (n=10).
The ELF Test had an AUC of 0.988 (95% Confidence
Interval C.I. 0.967-1.008; P <0.001) for distinguishing
cirrhosis, 0.948 (C.I. 0.883-1.014; P <0.001) for severe
fibrosis, 0.682 (C.I. 0.568-0.797; P=0.005) for significant
fibrosis and 0.658 (C.I. 0.401-0.915; P=0.200) for any
fibrosis. ELF scores were significantly higher in patients
with severe fibrosis/cirrhosis in respect to ones with no/
mild/moderate fibrosis (median 11.26 vs. 8.53; P <0.001).
Severe fibrosis and cirrhosis were correctly identified in
91% of patients.
Conclusions: In our cohort of NAFLD patients, the ELF
Test was able to discriminate severe fibrosis and cirrhosis
with an excellent diagnostic accuracy. It may result useful
for the selection of cases with more advanced fibrosis
stage and for therapeutic follow-up, thus avoiding liver
biopsy.
538
P218
CRYOGLOBULINS AND AUTOANTIBODIES:
ANTI-NUCLEAR ANTIBODIES DETECTION IN
CRYOPRECIPITATES OF AN HCV-POSITIVE
COHORT
1
1
3
2
U. Basile , F. Gulli , E. Torti , N. De Matthaeis , L.
3
4
2
Colacicco , P. Cattani , G. Rapaccini
1
Dip.di medicina di laboratorio, Università Cattolica del
S. Cuore, Pol. A. Gemelli, Roma
2
Istituto di Medicina Interna, Università Cattolica del S.
Cuore, Pol. A. Gemelli, Roma
3
Istituto di Biochimica, Università Cattolica del S. Cuore,
4
Istituto di MIcrobiologia, Università Cattolica del S.
Cuore, Pol. A. Gemelli, Roma
Anti-nuclear antibodies (ANAs) are immunoglobulins
(Igs) specific for self-antigens contained within the
nucleus of cells. ANA levels are especially elevated
in a subset of autoimmune diseases. ANAs are also
found in HCV-positive (HCV+) patients, indicating an
association between chronic HCV infection and the
onset of several autoimmune diseases. Moreover, Mixed
Cryoglobulinemia (MC) often accompanies autoimmune
diseases and HCV. Despite recent advances in research,
early discrimination of HCV+ patients at risk of
autoimmune disease development is not clear. Our
study therefore aims at comparing ANA detection in
cryoprecipitates of HCV+ versus RA-positive patients, but
also analyzes the differential content of Ig subclasses in
cryprecipitates of each cohort in order to assess their
predictive value for the onset of extrahepatic diseases in
HCV affected individuals.
Materials and methods - 40 HCV+ patients with no
symptoms of autoimmune diseases were recruited
along with 50 HCV-negative controls with Rheumatoid
Arthritis (RA). All patients had Type III MC. Samples
were processed at 37°C and serum was transferred
to Wintrobe tubes for storage (15 days at 4°C). An
aliquot was retained for RF testing (AXA Diagnostics,
Italy). Supernatant and resuspended cryoprecipitate were
tested for ANA by Indirect Immuno Fluorescence (IIF) on
HEp-2 cells (INOVA, USA), and analysed by microscopy.
Ig subclasses were assessed by Immunofixation (Sebia,
France).
Results and Conclusions – Differential IIF patterns
suggest a discrepancy between Ig subclasses in
cryoprecipitates from HCV+ patients as opposed to RA
controls. Moreover, most HCV+ patients who were also
ANA+ were IgG3 positive. IgG3 are autoreactive clones
which are not specifically directed to the viral capside
but can activate several cell clones: this implies they are
likely to constitute the decisive factor for activation of
autoimmune mechanisms These results may be a valid
diagnostic tool for early detection of autoimmune onset in
HCV-affected patients.
P219
NEW BIOCHEMICAL MARKERS FOR LIVER
FIBROSIS: RELATIONSHIP BETWEEN SERUM
VALUES AND LIVER BIOPSY
P220
VALUTAZIONE ESTERNA DI QUALITÀ PER IL
SANGUE OCCULTO NELLE FECI: OTTO ANNI DI
ATTIVITÀ
V. Pecoraro, R.M. Russo, S. Granata
L. Sciacovelli, S. Secchiero, M. Plebani
Lab Analisi Chimico Cliniche e Microbiologia – S.S. di
Biochimica Clinica, A.O. Niguarda Ca’Granda, Milano
Centro di Ricerca Biomedica, Azienda Ospedaliera
Università di Padova
Background: There has lately been an increasing interest
in non-invasive methods that could replace liver biopsy
in the evaluation of liver fibrosis. Immunoenzymatic
assays using monoclonal antibodies have been recently
developed to investigate the diagnostic utility of serum
L’accuratezza dei risultati del Sangue Occulto nelle feci
(FOBT) ha un forte impatto sulla gestione e sugli esiti
del paziente con sospetto di carcinoma colon-rettale.
La valutazione ed il monitoraggio delle prestazioni del
laboratorio è uno strumento importante per evidenziare
gli errori e garantire la sicurezza del paziente. In questo
contesto il Centro di Ricerca Biomedica ha implementato
uno Schema di Valutazione Esterna di Qualità (VEQ)
per il FOBT. Lo scopo di questo lavoro è descrivere le
specifiche dello Schema e riportare i risultati ottenuti dal
2006 al 2013. Nel corso di un anno sono distribuiti 8
campioni di controllo in 4 esercizi. I risultati quantitativi
sono elaborati con procedura non parametrica ed il
valore di consenso (mediana, VA) ed il coefficiente di
variazione percentuale (CV%) sono calcolati per gruppo
omogeneo di metodi/sistemi diagnostici, dopo esclusione
dei valori aberranti. Un differente giudizio è assegnato alla
prestazione del laboratorio sulla base dello scostamento
del risultato dal VA ed in riferimento a limiti definiti sulla
base dello stato dell’arte (media dei CV%). Di seguito
è riportato il giudizio ed i limiti: ottima, 0-6%; buona,
6%-12%; accettabile, 12%-18%; non accettabile, >18%.
I risultati qualitativi (positivo, negativo, dubbio) sono
conteggiati ed è riportata la percentuale.
La percentuale delle prestazioni analitiche ottenute dai
laboratori partecipanti, nel 2006 e 2013, sono riportate
in relazione al giudizio ottenuto (56 campioni, circa
90 partecipanti): non accettabile, 35%-21%; accettabile,
14%-12%; buona, 22%-24%; ottima, 27%-43%.
Il CV% risulta strettamente dipendente dalla
concentrazione del campione: alta per concentrazioni
inferiori a 30 µg/L (da 30% a 70%), stabile (circa 10%) per
concentrazioni uguali o più alti di 100 mg/L.
I risultati evidenziano un generale miglioramento delle
prestazioni analitiche soddisfacenti (63% nel 2006, 79%
nel 2013) dimostrando che la continua valutazione
delle informazioni fornite nei rapporti di VEQ è un
elemento strategico nella gestione della qualità. I
laboratori possono, infatti, monitorare le loro prestazioni,
evidenziare le criticità dove focalizzare i progetti di
miglioramento, conoscere e monitorare le prestazioni dei
sistemi diagnostici disponibili in commercio.
1
biomarkers in patients with hepatitis.
Objective: The aims of our work are: to assess
the applicability, accuracy and repeatability of the
Maglumi 2000 instrument (Snibe), to determine variability
and clinical significance of markers, to evaluate the
relationship between serum values and staging obtained
by liver biopsy.
Methods: We considered the following markers: coliglicin
(CG), hyaluronic acid (HA), procollagen III peptide (PIIIP),
CIV and laminin (LN). All markers were analyzed by a
new chemiluminescence immunoassay. We enrolled 16
patients with chronic hepatitis with available liver biopsy
results. Additionally, we compared the serum marker
levels of patients with the serum markers levels of 11
healthy volunteers. The accuracy tests were performed for
all markers using three serum pools at two concentration
levels.
Results: Preliminary results showed a significant increase
in the levels of HA (p=0.015), CIV (p=0.02), CG (p=0.012)
and PIIIP (p <0.001) in patients with liver fibrosis
compared with healthy controls. The difference between
markers levels in early and advance liver fibrosis was not
statically significant. For LN, a significant difference was
observed only when comparing patients with advanced
fibrosis and healthy volunteers (p=0.015). Intra-assay
CVs were 3.6% for CG, 4.9% for HA, 14.6% for CIV and
22.8% for PIIIP.
Conclusions: The major advantages of the Maglumi
2000 instrument are its operating speed and full
automation, user-friendly software and ready-to-use
reagents. Biochemical markers seem promising in the
assessment of fibrosis in patients with chronic hepatitis,
although further studies are needed to conclusively
establish their utility.
1. Baranova A, Lal P, Birerdinc A, et al. Non-Invasive
markers for hepatic fibrosis. BMC Gastroenterology
2011;11:91.
539
P221
CREATININA E eGFR: RISULTATI DEL
PROGRAMMA DI VALUTAZIONE ESTERNA DI
QUALITA’ (VEQ) DEL CENTRO DI RICERCA
BIOMEDICA
S. Secchiero, L. Sciacovelli, M. Plebani
Centro di Ricerca Biomedica, Azienda OspedalieraUniversità, Padova
Introduzione: L’accuratezza dei risultati della Creatinina
impatta sulla stima del Filtrato Glomerulare (eGFR)
e conseguentemente sull’outcome dei pazienti con
malattia cronica renale (CKD). Il Programma di VEQ per
Biochimica Clinica del CRB dal ciclo 2013 ha incluso la
creatinina con valore target e l’eGFR.
Scopo: Valutare l’accuratezza dei metodi per la
determinazione della creatinina e confrontare i valori di
eGFR forniti dai laboratori vs l’eGFR calcolato con valore
target (VT) di creatinina.
Metodi: Sono stati analizzati i risultati di creatinina di 210
laboratori relativi ai 12 campioni di controllo degli ultimi
6 esercizi di VEQ. I VT della creatinina, assegnati con
Metodo di Riferimento GC-IDMS dall’Instand e.V., erano:
58,9; 60,7; 67,5; 68,3; 84,5; 100,3; 113,3; 130,6; 174,3,
179,3; 320,2; 492,0 µmol/L, con un’incertezza di misura
espansa = 1%.
Per ciascun campione è stato calcolato il valore di
eGFR con VT di creatinina (maschio di 50 anni, razza
caucasica), con formula CKD-EPI: 10,9; 17,9; 35,0, 36,1;
50,4; 59,4, 68,4; 83,3; 106,5, 108,0; 121,9; 126,4 mL/
2
min/1,73m e con formula MDRD: 11,0; 18,5; 37,2; 38,5;
54,5; 64,7; 75,0; 92,3; 105,7; 106,2; 110,9; 112,3 mL/
min/1,73m2 ed è stato analizzato il bias dei risultati forniti
da 51 laboratori.
Risultati: E’ riportato il bias come media e (range).
Creatinina = metodo enzimatico (n=50): -2,0 (-4,8 –1,1);
metodo IDMS tracciabile (n=40): -3,8 (-13,5–5,7); metodo
IDMS tracciabile con compensazione (n=40): -6,1 (-18,5–
2,2); metodo Jaffè (n=65 ): +2,8 (-6,6–9,6); chimica secca
(n=15): -6,8 (-16,8–3,1).
eGFR = CKD-EPI (n=17): -0,5 (-6,4–4,0); MDRD (n=34):
2,5 (-2,8–6.8).
Discussione: creatinina: tutti i metodi presentano un bias
in relazione alla concentrazione; negativo fino a 113 µmol/
L ad eccezione del metodo jaffè con bias positivo fino a
130 µmol/L. Il metodo enzimatico è quello che presenta
bias inferiori.
Il calcolo dell’eGFR con CKD-EPI presenta bias più
contenuti rispetto al calcolo con MDRD.
Conclusioni: Creatinina: il metodo enzimatico è risultato
il più accurato anche rispetto ai “cosiddetti” metodi IDMS
tracciabili. eGFR: la formula MDRD è la più utilizzata, tra
i partecipanti alla VEQ, nonostante la sovrastima rispetto
alla CKD-EPI e la non comparabilità per valori > 90 mL/
2
min/1,73m .
540
P222
UTILIZZO DEI DATI OTTENUTI DAI LABORATORI
PARTECIPANTI A PROGRAMMI DI VEQ PER
LA MESSA A PUNTO DI UN PROCESSO DI
ARMONIZZAZIONE PER I METODI DI DOSAGGIO
IMMUNOMETRICI PER IL TSH
1
2
1
2
M. Franzini , A. Ripoli , S. Masotti , C. Prontera , M.
3
3
3
1
Pierini , S. Giovannini , G. Zucchelli , A. Clerico
1
Scuola Superiore Sant'anna, Pisa
Fondazione Toscana Gabriele Monasterio, Pisa
3
QualiMedLab & Istituto di Fisiologia Clinica CNR, Pisa
2
I dati raccolti nei programmi di verifica esterna di qualità
(VEQ) sono comunemente utilizzati per confrontare i
risultati forniti da differenti metodi immunometrici di analiti
come gli ormoni tiroidei o i peptidi natriuretici. Per
questi test non è ancora disponibile un processo di
standardizzazione, tuttavia i dati VEQ possono essere
utilizzati per promuovere il processo di armonizzazione
tramite il calcolo della media di consenso e la valutazione
della variabilità intra- e inter-metodo mediante una
comune analisi della varianza (ANOVA). E’ però possibile
utilizzare tecniche più complesse di analisi statistica
per valutare il bias tra metodi, come ad esempio
l’analisi fattoriale che permette sia la valutazione delle
componenti di variabilità che il calcolo di un valore
corrispondente alla media di consenso, detto “variabile
latente random” (VLR).
Scopo di questo studio è applicare l’analisi fattoriale delle
componenti principali per il calcolo della variabilità tra
metodi di misura del TSH e la loro ricalibrazione.
Sono stati analizzati i dati raccolti nello studio
ImmunoCheck di QualiMedLab relativi ai cicli VEQ
2012-2014 (30385 misure di TSH effettuate su 42
campioni di controllo, da mediamente circa 80 laboratori,
con 10 metodi diversi). La ricalibrazione matematica
è stata ottenuta utilizzando un metodo di regressione
lineare pesato su VLR; il coefficiente di variazione
tra metodi (CV) è stato calcolato prima e dopo
ricalibrazione per valori di TSH corrispondenti a 2;
4; 8 e 16 mUI/L. Dopo ricalibrazione i valori di CV
sono significativamente più bassi mediamente del 45%
(P=0.0033; 2 mUI/L: 8.8% vs. 4.7%; 4 mUI/L: 7.3% vs.
3.9%; 8 mUI/L: 6.1% vs. 3.3%; 16 mUI/L: 5.1% vs.
2.7%). La relazione tra la concentrazione di TSH e il CV
può essere descritta con un’equazione esponenziale, i
coefficienti della quale sono modificati dalla ricalibrazione:
CV
(pre-calibrazione)=10.526
-0.265
TSH
-0.263
;
CV
(post-
calibrazione)=5.662 TSH
.
In conclusione l’analisi fattoriale delle componenti
principali dei dati VEQ raccolti per l’analisi del TSH è
un utile strumento per promuovere l’armonizzazione dei
metodi immunometrici in commercio.
Stöckl D, Van Uytfanghe K, Van Aelst S, et al. A statistical
basis for harmonization of thyroid stimulating hormone
immunoassays using a robust factor analysis model. Clin
Chem Lab Med 2014;52:965-72.
P223
“MODELLO DI INDICATORI DI QUALITÀ” DELL’IFCC
WG-LEPS : RISULTATI ED EVOLUZIONE DEL
PROGETTO
L. Sciacovelli, A. Aita, A. Padoan, M. Plebani
Dipartimento Medicina di Laboratorio, Azienda
Ospedaliera Università di Padova
Il progetto implementato dal gruppo di lavoro dell’IFCC
“Laboratory Errors and Patient Safety” (WG-LEPS) ha
lo scopo di diminuire il tasso di errore e migliorare
la sicurezza dei pazienti rendendo disponibile a livello
internazionale: un Modello di Indicatori di Qualità (MQI)
condiviso; un sistema di raccolta dati che garantisca
la comparabilità dei dati; un rapporto che descrive il
confronto tra i dati del singolo laboratorio e quelli degli altri
partecipanti.
Gli indicatori di qualità (IQs) proposti nel 2013 riguardano
tutte le fasi del processo, analitico ed extraanalitico,
e sono: 34 per la fase pre-, 7 per la intra- e 15
per la post-analitica e 3 per i processi di supporto. Il
laboratorio può partecipare, gratuitamente, fornendo i
risultati per tutti gli IQs proposti o solo per alcuni. La
trasmissione dei risultati è effettuata per via telematica
nell’area riservata del sito web dedicato (www.ifccmqi.com) alla quale si accede mediante username
e password confidenziali. Periodicamente i laboratori
ricevono i rapporti comprensivi dell’elaborazione dei
risultati. La valutazione dei dati di ogni singolo laboratorio
è effettuata mediante l’applicazione della metrica sixsigma o altri strumenti statistici (media, mediana, ecc.).
Da gennaio 2014, MQI è stato aggiornato sulla base dei
risultati raggiunti nella recente Consensus Conference
organizzata a Padova nell’ottobre 2013.
Scopo di questo lavoro è descrivere le informazioni
fornite nel rapporto periodico e riportare i risultati raccolti
nell’anno 2013.
A titolo di esempio è riportato il range dei valori sigma degli
IQs relativi ad alcune fasi del processo: identificazione
del paziente, 4.4-5.1; inserimento della richiesta, 3.5-4.4;
raccolta del campione, 4.8-5.4; trasporto del campione,
3.7-5.4; accettazione del campione, 3.3-5.0; tempestività
della refertazione dei risultati, 4.2-4.6; accuratezza della
refertazione dei risultati, 3.8-5.1.
L’uso degli IQs all’interno di un programma
interlaboratorio permette ai laboratori di: monitorare le
proprie prestazioni; conoscere il valore sigma e le
relative necessità di miglioramento; definire le priorità di
intervento; confrontare i propri risultati e condividere i
progetti di miglioramento con quelli degli altri partecipanti
stimolando le attività di benchmarking.
P224
FIT E ...NUVOLE
1
1
1
F. Torricelli , R. Corradini , F. Zambelli , A.R.
1
2
3
4
Soliera , R. Colla , P. Menozzi , M. Boni , E.
4
6
1
5
Montanari , P. Selva , F. Giovannini , A. Camoni , F.
7
8
Marandini , C. Naldoni
1
AUSL di Modena
AUSL di Reggio Emilia
3
AOSP di Reggio Emilia
4
AUSL di Ferrara
5
AUSL di Piacenza
6
AUSL di Bologna
7
AUSL di Parma
8
Regione Emilia Romagna
2
Introduzione: Il test del sangue occulto è l'indagine di
primo livello del programma di screening del Cancro del
colon-retto(CCR.), importante iniziativa di Sanità pubblica
della Regione Emilia Romagna(RER). I referenti dei 9
Laboratori del Gruppo di Riferimento Regionale(GRR)
definiscono e verificano la qualità del percorso analitico.
Scopo: “ Sperimentare”un modello innovativo di
condivisione/confronto in rete delle performance
analitiche dei singoli laboratori del GRR, in particolare
degli indicatori di qualità condivisi nel PDT (Piano
diagnostico terapeutico) regionale.
Materiali e metodi: Il metodo immunologico al lattice FIT
è comune a tutti i laboratori partecipanti. Gli indicatori
di qualità individuati sono 1) Errore Totale sperimentale
per CQI: accettabilità secondo criteri indicati dall’Ente
VEQ 2) Partecipazione VEQ massimo 1 risposta fuori
accettabilità/anno 3) restituzione risposte VEQ accettabile
1 invio mancato. Per consentire un confronto dei risultati
nel modo più omogeneo possibile è stato concordato
con la ditta fornitrice del controllo di terza parte, liofilo,
l'invio di un unico lotto per un anno. Il foglio di calcolo
necessario alle elaborazioni dei dati, inseriti con cadenza
mensile, è stato collocato in una nuvola informatica
(Cloud-computing).Ogni partecipante inserisce la propria
media e CV % sul QCI calcolati da Dicocare e il proprio
risultato VEQ Careggi. Vengono calcolati BIAS e errore
totale dal GRR.
Risultati: I dati preliminari mostrano che la nuvola
consente condivisione e confronto puntuale degli
indicatori tra laboratori, da cui può scattare un alert
precoce per eventuali difformità cui fare seguire
una azione correttiva tempestiva. Nel confronto si è
verificata la instabilità del controllo liofilo ricostituito
fonte di maggiore variabilità: per questo motivo si è
ritenuto di modificare l’ accettabilità dell’indicatore ETs,
aumentandola.
Discussione e conclusioni: Il modello sperimentato si è
dimostrato un utile strumento per la costruzione di un
unico laboratorio virtuale, con l'obiettivo di una maggiore
concordanza dei risultati del test di primo livello in ambito
regionale, garanzia di equità di trattamento per il cittadino.
Inoltre questa modalità di lavoro, in rete, può essere
esportabile anche in altri campi analitici.
541
P225
VALUTAZIONE DEL SISTEMA PROTUBE DI INPECO
NEL PROCESSO DEL PRELIEVO DI SANGUE
F. Tosato, E. Piva, G. Vecchiato, D. Basso, D.
Bernardi, L. Billeri, N. Divitofrancesco, M.G. Epifani, P.
Fogar, N. Gallo, M.C. Sanzari, M. Varagnolo, M. Plebani
P226
GESTIONE DELLE NON CONFORMITÀ DEI PRELIEVI
TERRITORIALI: DALLA SEGNALAZIONE AL
MIGLIORAMENTO
S. Schiavon, L. Zardo, L. De Valentin, R. Turrini, G.
Piaserico
Dipartimento Medicina di Laboratorio, Azienda
Ospedaliera Università di Padova
Laboratorio Analisi, Ospedale “San Giacomo” – ULSS 8,
Castelfranco V.to (TV)
Introduzione: Il sistema ProTube (Inpeco, Lugano,
Svizzera) garantisce la tracciabilità del processo del
prelievo attraverso la completa automazione delle
fasi effettuata per singolo paziente, in particolare:
identificazione del paziente con tessera sanitaria e/o
codice specifico di accettazione, visualizzazione su tablet
della tipologia di provette per test prescritti, etichettatura
delle provette e check-out.
Metodi: ProTube è stato valutato per 20 settimane nel
Centro Prelievi dell’UOC di Medicina di Laboratorio di
Padova, in 2 ambulatori dedicati a pazienti pediatrici
e con età maggiore di 70 anni. I dispositivi sono di
ridotte dimensioni e permettono con efficacia funzionale
di organizzare ogni fase per singolo paziente in ciascun
punto di prelievo. Sono stati analizzati: i dati di gestione
del flusso, i tempi del processo, la prevenzione e la
gestione degli errori e degli eventi avversi.
Risultati: ProTube ha consentito di completare
correttamente il processo del prelievo per 5588 pazienti
con etichettatura di 16804 provette. I tempi del processo
non sono stati significativamente superiori ai sistemi
precedenti. Con ProTube per i prelievi pediatrici la media
±DS è stata di 3.21±1.13 minuti rispetto a 3.37±1.19,
mentre per i prelievi nei pazienti >70a., la media
con ProTube è stata di 2.47±0.38 minuti rispetto a
2.31±0.57. La gestione del singolo paziente con ProTube
permette i seguenti vantaggi: identità inequivocabile
del paziente con conseguente abbattimento degli errori
d’identificazione; abbattimento degli errori di tipologia di
provette per l’associazione con i test richiesti e il checkout a fine prelievo; corretta apposizione dell’etichetta sul
100% delle provette, rilevata in precedenza nell’86% delle
provette, garantendo l’ispezione del livello di riempimento.
Nel periodo di valutazione, gli interventi tecnici sono stati
7, dovuti a problematiche di riconoscimento di specifiche
tipologie di provette.
Conclusioni: Il sistema ProTube costituisce una valida
soluzione per la corretta gestione del processo del
prelievo, nel rispetto delle raccomandazioni SIBioCSIMeL e degli standard internazionali definiti da Joint
Commission, WHO, IHE, CLSI, ISO.
Plebani M, Sciacovelli L, Aita A, et al. Quality indicators to
detect pre-analytical errors in laboratory testing. Clin Chim
Acta 2014;432:44-8.
Gli errori nella fase di accettazione ed esecuzione del
prelievo rappresentano la maggior parte degli errori
di laboratorio e aumentano nei punti prelievo extraospedalieri, dove la formazione del personale e il
monitoraggio delle performance è più difficile. L’esigenza
di gestire al meglio i pazienti sul territorio dell'ULLS n.8 ha
portato alla messa a punto di un sistema di segnalazione
rapida delle non conformità (NC) dei campioni di questi
pazienti. Le NC che comportano la necessità di ripetere
il prelievo, vengono riportate in referto e segnalate
in giornata, via mail, al referente del punto prelievo,
consentendo un richiamo veloce del paziente.
Scopo del lavoro è vedere quali sono le NC riscontrate e
la loro frequenza monitorandone l’andamento nel tempo.
Sono stati elaborati i dati relativi alle NC segnalate
da luglio 2011 a maggio 2014 e riguardanti i 7 Centri
Prelievo Territoriali (CPT), i 2 Servizi Cure Domiciliari di
Castelfranco V.to e di Montebelluna (SCD-CFV e SCDMB) e le 11 Case di Riposo (CDR): data di rilevamento,
tipologia di provetta affetta da NC e natura della NC.
L'attività di prelievo per ogni servizio si è mantenuta
costante nel tempo. Sono state segnalate in totale 471
non conformità, col seguente andamento semestrale dal
2011 al 2014: 57, 85, 125, 94, 64, 46.
Le NC riguardano 204 provette tappo azzurro (43,4%),
258 tappo lilla (54,6%) e 9 di altro tipo (2,0%).
Il tipo di NC riscontrate sono state: campione coagulato
184 (39,0%), campione insufficiente 153 (31,8%),
provetta errata 75 (15,9%), campione non pervenuto
51 (10,8%), errore di accettazione 8 (1,7%), altro 4
(0,8%). L'analisi nel tempo delle NC dimostra, dopo un
iniziale aumento dei casi, una stabilizzazione e quindi una
progressiva diminuzione di segnalazioni che riguarda tutti
i servizi e tutte le tipologie di NC: Asolo -12,5%, Crespano
del Grappa -11,7%, Giavera -29,2%, Pederobba -32,8%,
Riese Pio X -14,3%, Valdobiadene -5,8%, Vedelago
-23,8%, SCD -13,3%, CDR -15,6%.
La segnalazione rapida delle NC al territorio, oltre a
consentire una più rapida disponibilità del dato necessario
alla gestione della terapia, ha portato a una maggior
attenzione da parte degli operatori nella gestione del
prelievo con la conseguente riduzione degli errori in
questa fase del processo analitico.
542
P227
I COSTI DELLA QUALITÀ
1
1
1
1
F.B. Ronchi , S. Caria , G. Demuro , G.B. Scrocco , G.
2
Serra
1
Laboratorio Unico Logico, Servizio di Patologia Clinica,
Dip.dei Servizi, P.O. San Gavino M.le, ASL Sanluri (CA),
Italia
2
degli Studi di Cagliari, Italia
Introduzione: È opinione comune che la qualità richieda
un aumento delle risorse. Le linee guida SIBioC del
2009, pur nel tentativo di ridurre il gap tra efficacia ed
efficienza, affermano che “il controllo di qualità (CQ)
comporta un dispendio economico di non poco conto per
esami eseguiti e tempo dedicato”. Il percorso intrapreso
dal Laboratorio Unico Logico (LUL) dimostra che l’utilizzo
appropriato del CQ permette di limitare le spese.
Metodi: Il LUL utilizza CQ Bio-Rad gestiti dal programma
UNITY Interlaboratory Program, Bio-Rad, Laboratories.
La valutazione qualitativa dei risultati giornalieri è
effettuata tramite confronto interlaboratorio del Controllo
Qualità Allargato (CQA) che permette la verifica del
mantenimento dei traguardi analitici d’imprecisione e di
errore totale basati sulla variabilità biologica/analitica.
Risultati: Il percorso intrapreso, iniziato nel 2011,
si è concretizzato in tre azioni: 1. Appropriatezza
della richiesta; 2. Gestione adeguata del CQA; 3.
Riorganizzazione delle attività. Per effetto delle tre azioni,
il costo medio/test si è ridotto, a parità di numero (n.) di
esami eseguiti, da 3,5 € nel 2010 (anno in cui non erano
applicate le tre azioni) a 2,4 € nel 2013. Considerando i
soli esami immunometrici, l’azione 1 ha portato ad una
riduzione del n. test (-9842) con un risparmio/anno di
35.706 €. L’azione 2 ha permesso di ridurre il n. delle
calibrazioni (-615) e degli esami ripetuti (-2080) con una
valorizzazione/anno pari a 23.071 €. Idem per le attività
di chimica clinica (risparmio 14.877 €) per un totale,
nell’intero settore, di 37.948 € che si aggiunge a una
minore necessità di personale tecnico (-0,8 unità FTE) con
risparmio di 32.000 €.
Conclusioni: Per effetto della gestione adeguata del
CQA, nel settore di immunometria e biochimica, si è
ottenuto un risparmio nel 2013 pari a 69.948 €. È
consuetudine che, in molti laboratori, l’attendibilità del
risultato sia garantita da ripetizioni esami, calibrazioni e
sostituzioni reattivi non necessari. L’utilizzo appropriato
del CQA ha modificato, nel LUL, l’approccio culturale
favorendo la riduzione degli sprechi e delle operazioni non
necessarie e permettendo di raggiungere, nel contempo,
obiettivi di efficacia (attendibilità) e di efficienza (risparmio
economico).
P228
ACCURATEZZA ED ERRORI CASUALI DI ALCUNI
TEST IMMUNOLOGICI SU PIATTAFORMA SIEMENS
AD ALTA AUTOMAZIONE
B. Salvadori, A. Finizio , M. Pellegrini, M. Tonelli, F.
Martone, A. Ognibene, S. Rapi
Laboratorio Generale, Azienda OspedalieroUniversitaria Careggi, Firenze
Introduzione: Una attenta analisi delle caratteristiche
e delle prestazioni dei sistemi analitici e la stima
degli errori casuali nel flusso di lavoro è un target
estremamente significativo per la valutazione delle
performance del singolo laboratorio. Alla fine del
2013 è stata implementata nel Laboratorio Generale
dell’Ospedale Careggi di Firenze una piattaforma ad alta
automazione fornita da Siemens Healthcare Diagnostics
USA, che gestisce 4 analizzatori Dimension Vista 1500,
e 2 Advia Centaur XP. Scopo di questo studio è stata la
stima degli errori casuali e dell’accuratezza del sistema
analitico secondo le nostre condizioni operative.
Materiali e metodi: Per raggiungere lo scopo dello
studio sono stati selezionati alcuni dei più importanti test
immunometrici eseguiti sui Dimension VISTA (Troponina
I, TSH, hCG) ed investigati preferenzialmente i range
analiticamente più significativi (troponina 0.04–0.1 ug/
L; TSH, 0.005-0.3; hCG 1 – 50 mUI/mL). Dopo
aver predisposto e controllato gli strumenti secondo
le normali procedure operative, sono stati selezionati
alcuni campioni biologici già refertati ed ancora conservati
nel magazzino refrigerato del sistema (T=4-8°C, tempo
conservazione <24 h), ed è stata richiesta la ripetizione
di un test su uno strumento diverso da quello utilizzato
per il primo dosaggio. Le differenze sono state analizzate
utilizzando il metodo di Bland Altman considerando
significativa la variazione >/= 10% dal valore medio
delle due ripetizioni. Il numero di campioni inclusi nello
studio risulta quindi legato al numero di strumenti utilizzati
giornalmente per l’esecuzione del lavoro (4, 3 e 2
strumenti rispettivamente per Troponina, TSH e hCG).
Risultati: Sono state effettuate complessivamente 730
ripetizioni e sono emersi 23 errori casuali (3.15%). La
distribuzione degli errori è risultata significativamente
diversa nei tre metodi: Trop 12 su 330 (3.6%), TSH 10 su
240 (4.2%) e 1 su 160 per hCG (0.62%) (p <0.01). Non
sono stati osservati bias tra gli strumenti.
Discussione. L’incidenza degli errori casuali nel flusso
di lavoro quotidiano è significativa anche per sistemi ad
alta automazione. L’utilizzo di campioni biologici sembra
essere uno strumento valido per il monitoraggio della
precisione inter-strumentale e delle prestazioni generali
del sistema.
543
P229
RIDUZIONE DEI TEMPI DI ATTESA AI CENTRI
PRELIEVI ATTRAVERSO UN SERVIZIO CLOUD
PER LA PRENOTAZIONE DELLA CHIAMATA ALLO
SPORTELLO
A. Bevilacqua, A. Paternoster, A. Tomasini, U.
Pizzolato, B. Faresin, E. Marotto, D. Giavarina
Lab. di Biochimica Clinica, Osp. S. Bortolo, Vicenza
Introduzione: Nell’ambito delle direttive regionali Venete,
molti laboratori hanno da anni eliminato le prenotazioni
di accesso, garantendo l’accesso diretto e immediato alle
prestazioni. Tale procedura elimina le liste di attesa ma
determina sovente lunghe attese nelle sale per ottenere
la prestazione. Al fine di migliorare l’organizzazione del
servizio di accoglienza è stato implementato un servizio
Cloud per la prenotazione degli accessi, che consente agli
utenti di prenotare via web la data e l’ora in cui verranno
chiamati allo sportello (denominato Zero Coda Lab), con
un ritardo massimo di 4 minuti. Abbiamo valutato la
riduzione dei tempi di attesa a distanza di un anno dallo
star-up.
Materiali e Metodi: Il sistema è stato applicato su 4
centri prelievi dell’ULSS n.6 di Vicenza, pari all’85%
di tutta l’attività ambulatoriale: Ospedale S. Bortolo
(8 sportelli), 147.893 accessi; Struttura Polispecialistica
Territoriale - Vicenza - (2 sportelli), 25.991 accessi;
Ospedale di Noventa Vicentina (4 sportelli) 44.020
accessi; Ex Ospedale di Sandrigo (3 sportelli), 35.147
accessi, per un totale di circa 253.000 accessi/anno.
Attraverso il sistema informativo di chiamata allo sportello
(eliminacode) sono stati misurati i tempi dall’emissione del
numero alla chiamata, prima dell’introduzione del sistema
di prenotazione “cloud” e dopo un anno di esercizio.
Risultati: Prima dell’introduzione del sistema i tempi medi
di attesa, compresi gli accessi prioritari, erano di 42,6
minuti. Dopo un anno, la prenotazione via web è utilizzata
da circa il 40% degli utenti. I tempi medi di attesa, rispetto
all’ora prenotata, sono mediamente di 2,5 minuti. I tempi
medi di attesa degli utenti non prenotati sono di 30,32
minuti. Nel primo anno di esercizio si sono risparmiate
circa 60.000 ore di attesa, (pari a 1/3 del totale), a parità
di layout e di risorse.
Conclusioni: Il sistema Zero Coda Lab riduce a quasi
zero i tempi di attesa per l’accesso agli sportelli dei centri
prelievi. La distribuzione ordinata degli arrivi, determinata
dagli slots di prenotazione disponibili consente di
diminuire drasticamente il sovraffollamento della sala
d'attesa, con una riduzione dei tempi anche per i non
prenotati, di oltre il 50%.
544
P230
E’ POSSIBILE LA COLLABORAZIONE TRA
LABORATORIO E CONTROLLO DI GESTIONE
AZIENDALE? APPLICAZIONE DEL METODO
HEALTH ACTIVITY BASED COSTING (HABC) AL
LABORATORIO ANALISI
1
1
1
1
N. Jordaney , B. Bernardi , R. Daniele , G. Bonfant , S.
2
2
1
Grumolato , L. Noto , M. Di Benedetto
1
S.C. Analisi Cliniche, Osp. U. Parini, Aosta
S.C. Controllo di Gestione, Az. U.S.L. Valle d'Aosta,
Aosta
2
L’attuale contesto socio-economico impone l’uso di
strumenti per elaborare, analizzare e valutare i costi,
soprattutto per confrontarsi con realtà analoghe, anche
attraverso la produzione dei costi standard. Per sapere
cosa effettivamente accade in una data realtà ospedaliera
è indispensabile conoscere il costo realmente sostenuto
per una prestazione sanitaria e l’eventuale divario con
quello di riferimento. E’ stato costituito un Gruppo di lavoro
multidisciplinare (Laboratorio-Controllo di Gestione) per
riesaminare tariffario e codifiche, valutare l’appropriatezza
economica e prescrittiva, ed agire sull’organizzazione.
Si è utilizzato il metodo Health Activity Based Costing
(HABC), che collega risorse e risultati con determinanti
di costo per attività/prestazione/fattore produttivo. Tappe
dello studio: 1-analisi organizzativa per settori, con
suddivisione delle prestazioni per grado di automazione
e livello di urgenza. 2-associazione settore/prestazione/
fattori produttivi (personale, attrezzature e materiale). 3inserimento dei parametri nel programma HealthCare
Performance Costing. 4-calcolo, per ogni prestazione, di
Costi Specifici, tempi di lavoro delle figure professionali
e Costi Pieni (comprensivi di Costi Comuni Aziendali).
Risultati: analisi del risultato economico specifico
(differenza tra il Tariffato, derivante dalla valorizzazione
definita a livello regionale, e il Costo Pieno); il Tariffato
Totale copre il totale dei Costi Specifici e parte dei
Costi Comuni. Esempi (valori medi/settore): Urgenze
20,5% del numero totale di esami, Tariffato 18,5%, Costo
Pieno 25,6% (servizio H24); Ematologia 6,4%, Tariffato
6,0%, Costo Pieno 6,8%; Chimica Clinica 52,3%, Tariffato
27,9%, Costo Pieno 20,3%. Grazie alla collaborazione tra
le figure del Gruppo, sono stati analizzati la copertura
dei costi totali rispetto alla tariffa, i costi di attrezzature/
materiali, la distribuzione delle risorse nella struttura.
Abbiamo così riorganizzato l’attività in funzione dei dati
ottenuti, ponendo le basi per estendere il lavoro alle
altre strutture del Dipartimento. Auspichiamo che la
metodologia sia adottata da altri laboratori per effettuare
un benchmarking.
Burnett L, Wilson R, Pfeffer S, et al. Benchmarking
in pathology: development of an activity-based costing
model. Pathology 2012;44:644-53.
P231
L'IMPATTO DI VINCOLI ALLE RICHIESTE DI
LABORATORIO NELL'ATTUALE SCENARIO
ECONOMICO
P232
THE NEW PERKINELMER’S HB DELFIA
IMMUNOASSAY FOR FAST AND RELIABLE
NEWBORN SCREENING OF SICKLE CELL DISEASE
F. Martinelli, M. Lucchiari, S. Incerdona, G. Mengozzi
C. Ialongo , R. Colletti , L. Vestri , J. Alessandroni , I.
1
1
Antonozzi , P. Ialongo
Laboratorio di Biochimica Clinica "Baldi & Riberi"
ospedale Molinette, Città della Salute e delle Scienza di
Torino.
Introduzione: Nel 2011 la Spesa Sanitaria Pubblica
italiana ammontava a circa 112 miliardi di euro, pari
al 7,1 % del PIL nazionale. Tale sistema rende
intollerabile l'uso inappropriato di procedure diagnostiche.
Il 70% delle diagnosi mediche dipende da esami di
laboratorio. Ciononostante, percentuali rilevanti (20-40%)
di esami sono richiesti senza motivazione e senza
utilità. Le motivazioni che conducono all'abuso dei
test diagnostici sono molteplici: interesse industrie,
disinformazione su caratteristiche dei test, insistenza
del paziente(Consumerismo), sottovalutazione costi reali
per l‘Azienda, eccesso di prudenza del medico per
tutelarsi(Medicina difensiva).
Scopo del lavoro: L’obiettivo di questo lavoro è valutare
la riduzione dei costi diretti del laboratorio e quelli di
ribaltamento sugli altri centri di costo con la riduzione del
numero di esami di laboratorio richiesti attraverso l'utilizzo
del software Prometeo (NoemaLife S.p.a.) che prevede
l'impostazione di Vincoli o Gating-rules alla prenotazione
di test di laboratorio.
Materiali e metodi: Lo studio è di tipo osservazionale:
vengono riportati il numero di esami eseguiti presso
il Laboratorio durante tutto il 2012 e i relativi costi
associati da Tariffario. Successivamente, in modo
retrospettivo, con l'applicazione dei Vincoli ai test già
richiesti nel 2012, verrà quantificato il numero e il
costo degli esami che possono essere risparmiati. Il
Numero di esami inappropriati estrapolati dal database
a nostra disposizione è stato moltiplicato X la Tariffa
corrispondente al test, ottenendo così il totale dei
costi dovuti ai test richiesti inappropriatamente. Per
questo motivo abbiamo creato 4 diversi tipi di avviso
suddividendo i vincoli in base a : Ridondanza nel dosaggio
dell'analita legata all'invarianza nel tempo (MRI: Minimum
Re-testing Interval), Associazioni errate di 2 o più test
all'interno della stessa richiesta del paziente, Età del
paziente, Sesso del paziente. Da questi calcoli sono
stati esclusi reparti come trapianti, urologie, oncologie,
neurologie che per motivi clinici posso scavalcare i vincoli.
Risultati: Il numero totale delle richieste esaminate è di
965.290 di cui 241.794 (25% ) erano inappropriate, il che
riconduce ad uno spreco di 1.115.628 euro tra materiale
sanitario e personale di laboratorio mal allocato.
2
1
1
3
1
Dep. of Experimental Medicine, University of Rome
"Sapienza", Rome
2
Dep. of Laboratory Medicine, University of Rome "Tor
Vergata", Rome
3
IRCCS San Raffaele - Pisana, Rome
Background: Sickle cell disease (SCD) is the most
common inherited blood disorder affecting approximately
one out of every 500 newborns. In Italy its incidence
is increasing due to migration from Africa, Middle East
and Asia. Subject affected by SCD are susceptible to
infections (S. Pneumoniae) and to spleen infarction, thus
all newborns resulting positive at the screening should be
started on prophylactic penicillin as early as possible. In
times of spending revue, we have decided to test limitedly
expensive but highly efficient test to screen the newborns
in Latium
Aim: this study is aimed to test the new PerkinElmer ‘s
HbS immunoassay based on the analytical Delfia platform
to carry on a fast and reliable newborn screening on dried
blood spot (DBS)
Materials and methods: A total number of 4,950 neonatal
DBSs were tested. For each sample, calculating the
A to S haemoglobins ratio according to the individual
percentage results. If the ratio was <1, then the sample
was recognized as being SCD positive. Conversely, if the
ratio was >4, the sample was reported to be normal. For
all those samples were HbA% was considerably low even
in absence of a clear HbS signature, the test was repeated
for further confirmation. In some cases, a high HbA/
HbS ration was given by the presence of some common
variants (namely HbC or HbD), even in absence of HbS.
Control samples were FA, FAS and FSS haemoglobins
respectively.
Results: Of the 4950 DBSs tested, 13 were reported to be
SCD carriers (FAS phenotype). These results were fully
confirmed by the PerkinElmer IEF Resolve testing, with
neither false positive nor false negative.
Discussion and conclusions: Delfia platform is accredited
to produce an output of 1 sample each 4 minutes, which
results in a total throughput of more than 400 samples
in an overnight run (5 microplates of 96 wells). If we
consider that the platform also integrates the Wallac DBS
Puncher, which automates the punching and recording
of the IDI number and position of each DBS tested,
then we can consider it as a suitable solution for a high
throughput routine. Furthermore, given that the system
can ensures the same analytical performances as the
reference method (no false positives or negatives), then
we can say that such diagnostic solution is fully compliant
with the requirements of a screening procedure.
545
P233
PROCEDURA INTERDIPARTIMENTALE PER
L'ESECUZIONE DELL'ANALISI CELLULARE DEL
LIQUIDO DI LAVAGGIO BRONCOALVEOLARE
1
2
2
1
R. Pajola , R. Di Gaetano , B. Callegari , E. Daddio , M.
2
1
2
De Benedetto , F. Sicurella , G. Tagariello , G.
1
Piaserico
1
Lab. Analisi, Osp. San Giacomo, Castelfranco Veneto
(TV)
2
Centro Trasfusionale e di Immunologia, Osp. San
Giacomo, Castelfranco Veneto (TV)
L'analisi cellulare del BAL (liquido di lavaggio
broncoalveolare) supporta la diagnosi di molte patologie
polmonari.
Nell’ULSS 8 il prelievo per BAL è eseguito in due presidi
(Castelfranco e Montebelluna), mentre l'analisi cellulare
è svolta in Unità differenti con sede a Castelfranco (la
conta cellulare totale e differenziata in Laboratorio Analisi,
lo studio citofluorimetrico al Centro Trasfusionale).
Tale situazione, visto le numerose variabili preanalitiche,
determinava campioni spesso inadeguati.
Per limitare le cause di errore e facilitare l'integrazione
di un test eseguito in sedi diverse, è stata proposta
una procedura interdipartimentale con indicazioni sulla
gestione del campione dalla raccolta al referto in
ottemperanza alle linee guida IFCC.
La stesura della procedura ha richiesto più audit delle
Unità coinvolte per valutare le esigenze e organizzazioni
di ogni reparto e per pianificare le diverse fasi di
esecuzione del test.
E' stato proposto un apposito modulo da compilare con
sospetto diagnostico, dati anamnestici, ora, volumi e
sede. Sono stati fissati giorni e orari di esecuzione,
modalità e tempi di trasporto e definita una refertazione
unica.
Dal periodo di transizione ad oggi sono stati analizzati
54 BAL, dei quali 25 dopo emissione della procedura, la
quale ha ridotto i campioni pervenuti senza informazioni
da 86% (25/29) a 8% (2/25), ha contenuto i tempi di
trasporto e ha azzerato il 34% (11/29) dei BAL non
completamente adeguati all'analisi.
La procedura ha determinato una maggiore adeguatezza
facilitando la conservazione della cellularità con riduzione
dei debris, la precisione nella conta totale e microscopica,
l'allestimento di vetrini più consoni alla valutazione di
anomalie e di cellule contaminanti, la definizione del
rapporto fra le popolazioni, il mantenimento di elementi
cellulari meno resistenti, una più proficua valutazione
citofluorimetrica per conservata espressione antigenica.
La sinergia tra Unità e la collaborazione dei pneumologi
hanno portato a maggiore standardizzazione del
campionamento, alla riduzione di campioni inadeguati,
alla riduzione dei tempi e modi di esecuzione e
validazione, ad approfondimenti diagnostici sulla base
dei dati clinici e alla realizzazione di un referto unico
dipartimentale più completo ed efficace.
546
P234
IL LABORATORIO DI PATOLOGIA CLINICA E GLI
ESAMI IN URGENZA. UN TREND IN CONTINUO
AUMENTO
B. Palma, G. Candido, N. Colasanto, V. De Simone, G.
Madonia
Laboratorio di Patologia Clinica Ospedale Civico
A.R.N.A.S. Civico-Di Cristina - Palermo
Introduction: Clinical Pathology Laboratory (CPL)
Ospedale Civico, A.R.N.A.S. Civico-Di Cristina Palermo
performed in the course of 2013 2,274,513 assays, with a
total of 228946 hits. Assays carried out under "Urgency"
were 998428 (44% of the total). Our data show a steady
increase in requests for urgency.
Methods: We conducted a survey of workflows in urgency
reached in March 2014, in order to better evaluate our
activity related to the Daily Time Bands.
Results: Data highlight a significant increase in requests
for urgency with a trend of increase estimated +20.2%.
The greatest number of exams per Time Bands has been
detected in the 20:00 to 8:00 Time Band: 1380 tests
(42.6%). Then the 8:00 to 14:00 Time Band: 1122 tests
(34.7%). Slightly below the 14:00 to 20:00 Time Band: 734
tests (22.7%).
Conclusions: Our data showed a significant increase in
“Urgency” requests. This increase, however, does not
seem to fully attributable to clinical-diagnostic-therapeutic
reasons. The excessive use of the laboratory in urgency
can certainly be content with a better organization of the
departments, with a more rigorous demands of an urgency
and with a significant increase in the reversal of costs for
urgent requests to departments that require urgency.
P235
DOWN SINDROME PRENATAL SCREENING
GUIDELINES
1
1
1
E. Pavanello , D. Dall'Amico , V. Guaraldo , E.
1
2
2
2
Muccinelli , E. Viora , I. Dusini , V. Ruggeri
1
Laboratorio Screening Prenatale e Neonatale, AOU
Citta della Salute e della Scienza, Torino
2
Centro di Ecografia e Diagnosi Prenatale, AOU Citta
della Salute e della Scienza, Torino
The guideline (printed on Biochimica clinica, 2011, vol. 35,
n. 3 -229) formulated by SIBioC, ELAS (European Ligand
Assay Society), AOGOI (Italian OBGYN Association) and
SIEOG (Italian OBGYN Ultrasound Society) reviewed the
options available for non-invasive screening and made
recommendations for patients and health care workers.
Piedmont applied guidelines and introduced in 2009 the
“Pregnancy Agenda”. All the samples of pregnant women
of Piedmont and Aosta Valley are proceeded in our centre
on the basis of a defined procedure reported in a specified
document.
This paper reports the results obtained from 2007 to 2012.
The data were obtained from 3 sources: regional flows
of specialistic activity outpatient, delivery assistance
certificates (CEDAP) and clinical audits produced from
our screening center. They were divided in two threeyears period, with approximately the same number of birth
(around 107,000 birth each).
We analyzed the effects of the introduction of a defined
procedure.
In the second three-year period we found an increased
number of women who underwent prenatal screening,
with better awareness in the choice of the test and an
enhancement of the integrated test. We also improved the
enrolment of foreign and elder women.
The management of the whole procedure, also reporting
performances audits with pregnancies outcomes, allowed
the laboratory to enhance best performance tests
(integrated test) and to improve their effectiveness.
We propose here an example of upgrade with the active
participation of the laboratory staff which is involved non
only in the analytical test, but also in the management of
the whole procedure.
P236
REORGANIZATION, RATIONALIZATION,
RECONVERSIONS, PLAIN OF REENTRY, CLINICAL
GUIDELINE, APPROPRIATENESS, SANITARY
CONSUMERISM: WHICH ROLE AND ASSIGNMENT
FOR THE MODERN MEDICINE OF LABORATORY?
M. D'Amora, G. Gentile
Asl Napoli 3 Sud
in this job it is faced in the order:
1-a synthesis of the most meaningful aspects in theme of
sanitary politics of Italy reported to the last decade,
2- some reflections on the relationship question and offer
of the sanitary performances with a particular attention to
the diagnostic one of laboratory,
3- the examination of the process of improvement of the
"Clinical Governance" with the necessary share of the
Medicine of Laboratory
4- finally discusses some role of a scientific society,
the Italian Society of Clinical Biochemistry and Biology
Molecular Clinic (SIBioC), in the analyzed context.
547
P237
POEMS SYNDROME: HEAVY LIGHT CHAINS VS
FREE LIGHT CHAINS MEASUREMENTS
1
1
1
1
M. Seguso , K. Proko , D. Ciubotaru , S. Altinier , M.
1
1
2
1
Varagnolo , M. Zaninotto , F. Adami , M. Plebani
1
Dept. of Laboratory Medicine, University-Hospital,
Padova
2
Dept. of Medicine, Hematology Unit, University of
Padova
Background: POEMS syndrome is a rare paraneoplastic,
multisystemic, plasma cell dyscrasia characterized by
polyneuropathy, organomegaly, endocrinopathy, skin
changes and monoclonal gammopathy. Most patients
have been reported to have high serum free light chains
(sFLC) concentrations but a normal sFLC ratio (sFLCR)
(Katzmann et al, Clin Chem 2009). HevyLite (HLC)
is a new method that allows separated quantification
of the kappa- and lambda- bounded levels of the six
isotype-specific immunoglobulins. In this study HLC and
sFLC provided by Binding Site were measured on BNII
nephelometer.
Case 1: A 54 years old man was diagnosed as myeloma
multiple IgA lambda and POEMS syndrome. He was
treated with the standard chemotherapy, having an initial
remission followed by a relapse two years later. Then
radiation and chemotherapy were started with just a
partial remission followed by autologous transplant. Five
months later biochemical markers and PET/TC total body
evidenced a complete remission. During this period 14
serum samples were collected to measure sFLC and HLC.
All the results of the sFLCR were within the reference
range: 0,15-3,35. The abnormal values of the serum
HLC ratio (HLCR) re-entered the normal range (IgA k/l:
0,8-2,04) four months after the therapy was started and
continued to be normal until the therapy was stopped.
The subsequent relapse was indicated by abnormal HLCR
(0,26) several months before the clinical worsening. After
the autologous transplant the HLCR returned to the
normal range.
Case 2: A 49 years old woman was diagnosed as
POEMS syndrome with amyloidosis AL, which resulted in
a severe cardiomyopathy condition excluding autologous
transplant. She was treated with standard chemotherapy
for a year resulting in a partial remission. During this
period 10 serum samples were collected to measure sFLC
and HLC. All the results of the sFLCR were within the
reference range, whereas the HLCR was abnormal before
the therapy and re-entered the normal range six months
after, reflecting the disease course. Currently, the HLCR
continues to be normal and the patient is asymptomatic.
Conclusions: The sHLCR may provide additional
informations to assess residual disease, allowing
detection of relapse earlier than clinical status in patients
with POEMS syndrome.
548
P238
ANTICORPI ANTI-HMGCOA REDUTTASI:
MARCATORI PER LA MIOPATIA AUTOIMMUNE
NECROTIZZANTE INDOTTA DA STATINE
1
1
2
M.G. Giudizi , R. Biagiotti , E. Vivarelli , D.
3
2
4
1
Cammelli , A. Ferraro , M. Mahler , F. Almerigogna
1
Dipartimento di Medicina Sperimentale e Clinica,
Università di Firenze
2
Scuola di Specializzazione di Allergologia e
Immunologia Clinica, Università di Firenze
3
SOD Immunoallergologia - DAI Biomedicina, AOU
Careggi Firenze
4
Inova Diagnostics Inc, San Diego CA - USA
Introduzione: E’ noto che l’assunzione di statine
può provocare la comparsa di miopatie (1) ma
solo recentemente è stata descritta la Miopatia
autoimmune necrotizzante associata a statine (MANAS).
Questa malattia è caratterizzata a livello istologico
da estesa mionecrosi con scarso infiltrato flogistico e
da autoanticorpi anti-3-idrossi-3-metil-glutaril-CoA (HMGCoA) reduttasi.
Caso clinico: Un uomo di 76 anni, con anamnesi positiva
per adenocarcinoma del colon, glaucoma bilaterale,
diabete mellito tipo II ed ipertensione, è giunto alla
nostra osservazione per comparsa di marcata astenia e
mialgie ai muscoli prossimali degli arti con fascicolazioni
diffuse, associate ad incremento dei marcatori di danno
muscolare. Il paziente assumeva atorvastatina da 6 anni
per dislipidemia.
Risultati: Nonostante la sospensione dell’atorvastatina
dopo il rilievo di segni e sintomi di danno muscolare,
gli enzimi muscolari rimanevano elevati (CPK>2000
U/L). L’elettromiografia dei quattro arti documentava
miosite in fase di attività. La biopsia muscolare mostrava
marcata sofferenza muscolare di natura infiammatoria
ad impronta necrotizzante. L’immunofluorescenza su
Hep2 rilevava modesta fluorescenza citoplasmatica, con
negatività a livello nucleare. Negative tutte le specificità
autoanticorpali studiate, ad eccezione degli anticorpi antiHMGCoA reduttasi. La tipizzazione HLA documentava
l’allele HLA-DRB1*11, che presenta associazione con la
patologia. Il paziente è stato trattato con glicocorticoidi,
methotrexate e immunoglobuline per via endovenosa con
buona risposta clinica.
Conclusioni: La diagnosi di MANAS è supportata
dalla comparsa del quadro dopo anni di terapia con
atorvastatina (in letteratura esposizione media di alcuni
anni), dalla mancata regressione dopo sospensione del
farmaco, dall’istologia e dalla presenza di anticorpi antiHMGCoA reduttasi e dell’allele HLA DRB1*11.
1. Mohassel P, Mammen AL. The spectrum of statin
myopathy. Curr Opin Rheumatol 2013;25:747-52.
P239
USEFULNESS OF THE HEVYLITE ASSAY
IN DIAGNOSIS AND FOLLOW UP OF AN AL
AMYLOIDOSIS PATIENT WITH BICLONAL
GAMMOPATHY
1
1
1
2
P240
“LOW-COST” REMOVAL OF FREE LIGHT CHAINS
IN CHRONIC RENAL DIALYSIS PATIENTS:
POLIMETHYL METHACRYLATE (PMMA) VS.
HAEMOFILTRATION WITH ENDOGENOUS
REINFUSION (ONLINE HFR)
V. Valentini , F. Lavatelli , P. Milani , T. Bosoni , L.
2
2
2
1
Pirolini , F. Li Bergolis , G. Sarais , G. Palladini , G.
1
Merlini
P. Parisi , M. Sarma , R. Mancini , P. Selva , E.
2
2
3
2
Hoxha , G. Donati , A. Marchetti , G. La Manna
1
1
Introduction: AL amyloidosis patients often have small
monoclonal components (MCs), difficult to quantify by
densitometry. IgA are most problematic, due to anodic
migration and masking under ß-zone proteins. Hevylite
assays separately quantify the different light chain types
of each immunoglobulin class and infer clonality from their
ratio. We evaluated the usefulness of Hevylite to quantify
the MCs, at diagnosis and during follow up, in an AL
amyloidosis patient with a biclonal gammopathy.
Patient and methods: A 50-year-old woman was
referred to the Pavia Amyloidosis Center due to
suspicion of cardiac amyloidosis. Amyloid deposits were
demonstrated by Congo red staining on subcutaneous fat
and typed by immuno-electron microscopy (IEM). Serum
MCs were characterized, at diagnosis and during followup, through protein electrophoresis and immunofixation
(SPE-IFE), quantification of free light chains (FLC, Freelite
assay) and Hevylite assay.
Results: Amyloid deposits were typed as λ by IEM.
Echocardiography was suggestive for amyloid deposition
and cardiac biomarkers were elevated (NT-proBNP 17408
ng/L, cTnI 0.342 ng/mL). IFE identified a small IgGλ band
in γ region and an IgAλ one in ß2, not quantifiable at
SPE. Lambda FLC (26 mg/L) were within the normal
range, with abnormal κ/λ ratio (0.19). Hevylite assay
showed increased IgGλ (7.49 g/L) with abnormal IgGκ/
IgGλ ratio (0.26). IgAλ were also elevated (8.45 g/L),
with abnormal IgAκ/IgAλ ratio (0.02). After two cycles
of CyBorD treatment, λ FLC persisted within normal
range (21.8 mg/L), with normalization of κ/λ ratio. Cardiac
response was documented by NT-proBNP decrease
(8007 ng/L). A 27% decrease in IgGλ (5.46 g/L, IgGκ/IgGλ
0.39) and a 56% in IgAλ concentration (3.74 g/L; IgAκ/IgAλ
0.09) were documented by Hevylite.
Conclusions: Hevylite assay was the only mean
to quantify the monoclonal components in this
AL amyloidosis patient with biclonal gammopathy.
In particular, it allowed assessment of treatment
hematological response, which would not be measurable
by free light chain quantification. This case shows the
usefulness of Hevylite in the clinical setting, expecially
emphasized in case of IgA-type MCs.
Introduction: Removal of κ and λ free light chains (FLC),
regardless of their monoclonality, is one of the objectives
in patients with chronic renal insufficiency in order to
reduce intoxication by medium molecules and to improve
patient inflammation condition.1
Aim of the study: To compare the PMMA filter (Toray 26 euro per filter) vs. the online HFR technique (Bellco –
64 euro per filter) in FLC removal in 16 chronic dialysis
patients.
Materials and methods: criteria for the inclusion of patients
in the study are an abnormal electroforetic pattern in
region of gamma-globulin zone and dosable FLC in
serum.Type of study: randomised crossover (A and B
groups).3 dialysis sessions a week for 4 weeks (12
sessions). Group A: 2 weeks of dialysis with PMMA filter
followed by 2 weeks of dialysis with HFR filter. Group
B: 2 weeks of dialysis with HFR filter, followed by 2
weeks of dialysis with PMMA filter. Dialyses n.5 and
n.11: FLC dosing at the beginning, 120', end of dialysis
Amyloidosis Research and Treatment Center,
Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo, Pavia, Italy
and Department of Molecular Medicine, University of
Pavia, Italy
2
Clinical Chemistry Laboratories, Fondazione IRCCS
Policlinico San Matteo, Pavia, Italy
1
1
1
1
Central Laboratory, S.Orsola Malpighi University
Hospital, Bologna
2
Nephrology, Dialysis and Transplanation Unit, Dep.
of Experimental, Diagnostic and Specialty Medicine,
S.Orsola Malpighi University Hospital, Bologna
3
Dep. of Medicine and Public Health, Bologna University
TM
(Freelite , The Binding Site – Instrument: IMMAGE
Beckman Coulter).
Results: 11 of 16 treated patients presented polyclonal
FLC while the other 5 presented monoclonal FLC. The
depuration effeciency of the 2 filters on the tested
molecules seems to be comparable and no significant
differences have been found between online HFR and
PMMA among time 0' and time 240'. On the opposite,
the values of FLC result more decreased by PMMA
filter among time 0’ and time 120’, with the possibility to
increase the depuration capacity of each dialysis session
by the replacement with a new PMMA filter at 2nd hour.
Furthermore, no loss of albumine has been observed with
any of the 2 filters used.
Conclusions: Patients in chronic dialysis with increase
of FLC independently of their monoclonality, have been
studied for the removal of FLC in few retrospective
studies. The crossover randomisation design preceded by
a wash out stage permits to ascribe completely the results
at the 2 filters. The comparison of the 2 filters shows
comparable depuration capabilities, with early depuration
effect of PMMA filter.
1. Lamy T, Henri P, Lobbedez T, et al. Comparison
between On-Line High-Efficiency hemodiafiltration and
Conventional High-Flux Hemodialysis for Polyclonal Free
Light Chain Removal. Blood Purif 2014;37:93-8.
549
P241
Ig-FREE LIGHT CHAINS KAPPA-INDUCED
DYSFIBRINOGENEMIA: A CASE REPORT
1
1
1
P242
EARLY ASSESSMENT OF MULTIPLE MYELOMA
RELAPSE WITH THE HEVYLITE™ ASSAY
2
M. Martelloni , L. Caponi , A. Paolicchi , N. Cecconi , M.
2
Petrini
1
S.D. Laboratorio di Patologia Clinica, Azienda
Ospedaliero-Universitaria Pisana
2
U.O. Ematologia, Azienda Ospedaliero-Universitaria
Pisana
Despite several disease are associated with free-light
(FLC) chains deposition in human tissues, only few
cases are described of human disease dependent
on the specific binding activity of monoclonal FLC
(Dear A et Al. Acquired dysfibrinogenemia caused by
monoclonal production of immunoglobulin λ light chain.
Haematologica 2007;92:e111-e117).
A 65-year old, male patient, with prolonged thrombin
time (TT ratio >5.0), activated partial thromboplastin time
(42 sec) prothrombin time (16.4 sec) and undetectable
functional fibrinogen was admitted to the Hemathology
Clinic of the University Hospital of Pisa. After excluding
all potential causes of acquired dysfibrinogenemia we
performed immunofixation of serum and plasma samples:
while serum did not show detectable monoclonal bands,
immunofixation of plasma revealed the presence of FLCk co-migrating with fibrinogen. The serum FLC-k levels
(24.3 mg/dL) were far lower than plasma levels (203
mg/dL), thus suggesting that most of the Ig-FLC were
bound to fibrinogen and remained associated to fibrin after
clotting.
Only the FLC purified from the patient, but not from a
group of 20 patients with multiple myeloma, inhibited the
functional fibrinogen assay on a control plasma pool, thus
confirming their role in inhibiting fibrinogen polymerization.
The hypothesis that the light chain may interfere with
the active sites of fibrinogen necessary for the binding
with platelets, were excluded because the patient showed
the absence of hemorrhagic manifestations and a normal
platelet function documented by the aggregation test.
Bone marrow biopsy showed monoclonal plasma cells
with k light chains.
The patient was diagnosed with MGUS-k. After two
courses of dexamethasone (20 mg/day for 4 days
repeated after 15 days), the level of FLC-k decreased and
coagulation tests except for thrombin time, normalized.
Studies are ongoing to verify at which level the FLC-k may
interfere with polymerization phase.
550
G. Di Noto, L. Paolini, D. Ricotta
Dept. Molecular and Translational Medicine, University
of Brescia
A 60-years-old woman was admitted in the
Hemathology ward. The diagnosis was IIIA IgAK
multiple myeloma (MM) with a bone plasmocytoma
in D9. After 4 cycles of chemotherapy (Vincristin,
Doxorubicine, Dexamethasone) and autologous bone
marrow transplantation MM completely remitted. After
2 years the patient presented lower back pain. Serum
and urine immunofixation showed the presence of an
IgAK monoclonal component (MC). MC quantification
was not possible due to its migration in the β region
of serum protein electrophoresis (SPE) densitogram.
IgA nephelometric measurement (IgAtot) was out of the
reference ranges (2710 mg/dL). Serum Freelite assay
(FLC) showed a normal k FLC value (k 14.5 mg/L), λ FLC
< 0.01 mg/L, so the k/λ FLC ratio was not computable
(NQ). In order to to quantify the MC, laboratorists decided
to perform the Hevylite IgG and IgA assay. The IgAk/IgAλ
ratio was strongly altered (IgAk/IgAλ 184.88) while the
IgGk/IgGλ ratio was normal (IgGk/IgGλ 2.32) confirming
the presence of an IgAk MC. Hematologists decided to
start a new cycle of treatment with bortexomib 1 mg/m2
and dexamethasone 20 mg/day, twice a week. After 2
weeks of treatment the clinical picture did not change
with elevated IgAtot (2752 mg/dL), k/λ FLC ratio NQ (k
FLC 13.96 g/L, λ FLC< 0.01 mg/L), altered IgAk/IgAλ
ratio (IgAk/IgAλ 253.27) and MC migrating in β in SPE.
During the following weeks IgAtot decreased (511 mg/
dL), k/λ FLC ratio normalized (k/λ FLC ratio 1.63) and
only IgAk/IgAλ ratio remained altered (IgAk/IgAλ 48.89,
IgAk 9.04 g/L, IgAλ 0.185 g/L). After the third and forth
cycle of therapy, according to IgAtot (IgAtot 89 mg/dL, 43
mg/dL) and k/λ FLC ratio (k/λ FLC ratio 1.53, 1.60), the
clone seems to respond to treatments and only the IgAk/
IgAλ ratio highlighted the suspect of therapy resistance
(IgAk/IgAλ ratio 2.38, 2.04). At the end of the fifth cycle
of chemotherapy this suspect was confirmed because all
monitored parameters increased again (IgAtot 511 mg/dL,
k/λ FLC ratio 2.31, IgAk/IgAλ 24.49) and clinicians decided
to re-discuss the therapeutic approach.
In conclusion the Hevylite assay helped laboratorists to
quantify the MC during all therapy process. This value and
the IgAk/IgAλ ratio helped hematologists to monitor the
MC response to therapy being the only parameter that
constantly pointed out a therapy resistance.
P243
CARATTERIZZAZIONE CLINICA E MOLECOLARE DI
UNA PAZIENTE CON DELEZIONE 18q22.1-q23 DE
NOVO
1
1
2
P244
MONITORAGGIO CON IL TEST FREELITE DI UN
CASO ALTAMENTE AGGRESSIVO DI MIELOMA
MULTIPLO MICROMOLECOLARE LAMBDA CON
AMILOIDOSI ASSOCIATA
B. Mancuso , M. Miraglia , R. Camodeca , D.
2
1
1
1
Sperlì , M. Vitiritti , C. De Rosa , S. Vaccarella
F. Abud Mussad , A. Pascarella , D. Ferrante , M. Arini
1
1
UOC Laboratorio Analisi Cliniche, Biomolecolari e
Genetica, A.O. di Cosenza
2
UOC Pediatria
Questo è il caso di una bambina di 14 mesi di vita
che presenta ritardo di crescita, ritardo psicomotorio,
ipotonia, ipermetropia e anteriorizzazione dell’ano. E’
stata eseguita l’analisi del cariotipo su coltura di linfociti
da sangue periferico che ha evidenziato una monosomia
18q22.1-q23. Per confermare la presenza della delezione
e per la ricerca di eventuali altre delezioni/duplicazioni
non visibili con la citogenetica convenzionale è stata
eseguita l’analisi array-CGH, utilizzando un vetrino Agilent
con risoluzione 4*44Kb e come software di analisi
il MULTIFUSE della Blugnome. L’analisi array-CGH
ha confermato la delezione definendo precisamente
l’estensione, la quale è di 12.8 Mb, si estende
dalla posizione genomica 63,338,194 a 76,110,994 e
comprende 19 geni OMIM. Per definire se la delezione
è de novo o ereditata è stato eseguito il cariotipo
anche sui genitori della bambina che ha rilevato due
cariotipi normali, quindi si tratta di una delezione de
novo. La monosomia 18q è una sindrome da delezione
da geni contigui, dovuta alla perdita di una porzione
del braccio lungo del cromosoma 18. È un’ anomalia
autosomica compatibile con la vita che ha un’incidenza
stimata di 1 su 40000 nati vivi. Classicamente, i
pazienti con tale sindrome presentano ritardo di crescita,
microcefalia, ipotonia, dimorfismi facciali, malformazioni
genito-urinarie, anomalie neurologiche ed oculari, ritardo
dello sviluppo, ritardo mentale, atresia aurale congenita
con danni uditivi e anomalie degli arti. La presenza
o l’assenza di queste caratteristiche cliniche potrebbe
dipendere dall’estensione e dalla posizione della regione
deleta. Il grado di severità della sindrome 18q- risulta
essere variabile. Questo studio aggiunge preziose
informazioni per la correlazione genotipo-fenotipo per la
sindrome 18q- e il confronto dei nostri dati con quelli
riportati in letteratura contribuisce a delineare la presenza
di regioni critiche e quindi l’identificazione di geni candidati
responsabili delle diverse manifestazioni fenotipiche.
Kline AD, et al. 1993.
1
2
1
1
Lab. Analisi Chimico Cliniche, Osp. dell'Angelo, Mestre
Venezia
2
U.O. Ematologia, Osp. dell'Angelo, Mestre Venezia
3
Venezia
4
Venezia
Una paziente di 43 anni è giunta in osservazione per
astenia ingravescente, dispnea, grave anemia e focolai di
osteolisi.
Ulteriori indagini hanno evidenziato un'elevata proteinuria
(33 g/die), una componente monoclonale costituita
da catene leggere lambda libere amiloido genetiche
e un tessuto midollare completamente sostituito da
elementi plasmacellulari atipici, con una ratio freelite di
0,0004(Lambda 8550 mg/L). Gli accertamenti eseguiti
hanno permesso di porre la diagnosi di Mieloma
multiplo micromolecolare lambda stadio III A. La paziente
pur trattata con bortezomid-desametazone presentava
progressione di malattia con Freelite in aumento
(Lambda 23.000). Le Freelite sono state decisive per
il passaggio alla terapia di seconda linea (DT-PACE)
e la pianificazione di autotrapianto con staminali. Dopo
la chemioterapia si è ottenuta una risposta parziale
(protenuria 9 g/die, Lambda libere 4500 mg/L e
plasmacellule midollari intorno al 30%).
La prima mobilizzazione non ha ottenuto cellule in
quantità sufficiente, possibile solo dopo due ulteriori
mobilizzazioni.
La rivalutazione post trapianto ha dimostrato un quadro
di remissione con risposta stringente completa con
Freelite normalizzate quindi si decide per una terapia di
mantenimento con Lenalidomide.
Vista la giovane età e l'elevata aggressività della malattia
è stata eseguita la tipizzazione HLA dei fratelli che non
sono risultati compatibili, pertanto è stata avviata la ricerca
di un donatore da registro presso il centro trapianti di
Vicenza che ha dato esito positivo. Dopo 2 mesi le
Freelite evidenziano una ratio normale. Dopo 1 anno
viene eseguito con successo il trapianto allogenico di
cellule staminali da donatore non familiare (MUD) HLA
compatibile.
In conclusione l'esame Freelite aiuta i laboratoristi a
confermare il sospetto di Mieloma e i clinici a definire
la migliore terapia e il monitoraggio del decorso della
malattia.
A differenza della proteinuria, che si è mantenuta su valori
modicamente alterati, il normalizzarsi dell'esame Freelite
in linea con l'Immunofissazione sierica e urinaria (negative
per componenti mono e oligoclonali) ha permesso di
stabilire un quadro di remissione con risposta completa
stringente.
551
P245
SERUM AND CSF ANALYSIS OF
IMMUMOGLOBULINS AND FREE LIGHT CHAINS
(FLC) IN A PATIENT WITH A NEW DISCOVERED
AUTOINFLAMMATORY DISEASE TREATED WITH
STERIODS AND TOCILIZUMAB
1
1
2
1
A. Rizzo , F.L. Sciacca , E. Salsano , M. Lazzaroni , D.
2
1
Pareyson , G. Bernardi
1
U.O. Lab. di Patologia Clinica e Genetica Medica,
Fondazione IRCCS INN Besta, Milano
2
U.O. Neurologia VIII, Fondazione IRCCS INN Besta,
Milano
We recently reported a case of a young patient with
a new phenotype that sheds light on the emerging
field of the auto-inflammatory syndromes (Salsano et
al, 2013). Although the aetiology is yet undetermined,
a selective IL6 overproduction occurs in serum and
CSF. Disease is characterized by meningitis, progressive
hearing loss, persistently raised inflammatory markers
and diffuse leukoencephalopathy on brain MRI. Syndrome
is characterized by anaemia, hyperleukocytosis, elevated
VES and PCR, repeat CSF studies showed fluctuating
pleocytosis, increased Albumin ratio, high IgG indices,
fluctuating oligoclonal bands. Main marker was persistent
increase in IL6 levels in CSF and serum, but no increase
in IL1-beta and TNF-alpha. Sequencing of IL6 gene
and its promoter region, array-CGH, total-body 18FDGPET, were negative. Search for mutations in genes
associated with interleukin-1-pathway demonstrated a
novel NLRP3 mutation and a previously described MEFV
mutation, but their combination was found to be nonpathogenic. In vitro IL-6 production from monocytes
suggest that the deregulation of IL-6 occurs primarily
in CNS. We observed a marked clinical improvement
using Tocilizumab, a IL6-receptor targeting drug. As
Tocilizumab is blocked by blood brain barrier, neurological
symptoms were slightly reduced. Under treatment
serum levels of VES and PCR turned to normal
values, serum IL-6 concentration significantly increased,
serum immunoglobulin decreased. CFS Albumin ratio
decreased, IgG Indices became normal, oligoclonal bands
disappeared, IL-6 level remained very high.
Serum and CSF Kappa and Lambda FLC were measured.
Before treatment we found normal serum Kappa FLC,
low serum Lambda FLC levels with high K/L ratio, in
absence of monoclonal gammapathy. In CSF we found
very high Kappa and Lambda indices, confirming CSF
inflammation.
After treatment serum FLC dramatically fall down near
to undetectable values. CSF FLC values were reduced,
but FLC indices remained very high, confirming persistent
CSF inflammation.
This is the first report on Tocilizumab and Prednisone
treatment effects in serum and CSF FLC parameters: as
suggested by this case report FLC measurement both in
serum and CSF may be a very useful marker both for
diagnosis and therapeutic drug monitoring.
552
P246
FREELITE ASSAY SOLVED A PUZZLING DIAGNOSIS
OF NONSECRETORY MULTIPLE MYELOMA: A CASE
REPORT
1
2
1
1
C. Caprioli , F. Malberti , A. Rambaldi , M. Galli
1
U.O. Ematologia, Ospedale Papa Giovanni XXIII,
Bergamo
2
U.O. Nefrologia e Dialisi, A.O. Istituti Ospitalieri,
Cremona
The serum immunoglobulin free light chain (FLC)
Freelite assay (Binding Site) measures levels of free
κ and λ chains by immunonephelometry and has
undoubtedly exhibited clinical utility in the management
of plasma cell (PC) disorders. In fact, it has been
shown to improve sensitivity at screening, to assess
prognosis and treatment response, and to monitor
residual disease in oligo-nonsecretory Multiple Myeloma
(MM) [1]. However, the test has both technical and
economic limitations because of potential fluctuations
in reproducibility and additional costs, impacting on the
actual cost-effectiveness in clinical practice. For these
reasons, its use should be carefully weighted and limited
to defined clinical situations.
We describe a case in which Freelite assay was used
to reach a correct diagnosis of nonsecretory MM in a
patient who presented with severe renal failure (serum
creatinine 2.9 mg/dl, creatinine clearance 22.8 ml/min)
and hypogammaglobulinemia (IgA 20, IgG 279 and IgM 7
mg/dl) of uncertain origin. A PC disorder was suspected,
but a preliminary screening showed neither measurable
monoclonal protein in serum nor Bence Jones proteinuria
and the bone marrow biopsy revealed 15% monoclonal
κ PC proliferation without amyloid deposition detectable
by Congo red staining. On these bases, a diagnosis of
MM according to IMWG criteria could not be reached.
Meanwhile, a kidney biopsy was performed, revealing a
histological picture of focal segmental glomerulosclerosis
along with monoclonal κ PC involvement of the renal
interstitium. Therefore, Freelite assay was used, which
demonstrated an abnormal FLC ratio (7.38) in serum with
an involved κ chain of 172 mg/L. This solved the diagnostic
uncertainty and allowed to conclude for nonsecretory
MM. Moreover, Freelite determination provided a baseline
value for subsequent evaluation of IMWG Response
Criteria, overall response rate and progression free
survival upon initiation of treatment.
In conclusion, Freelite assay confirms its powerful role in
difficult diagnostic processes of PC disorders.
1. Dispenzieri A, Kyle R, Merlini G, et al. International
Myeloma Working Group guidelines for serum-free light
chain analysis in multiple myeloma and related disorders.
Leukemia 2009;23:215–24.
P247
PARAGANGLIOMA VESCICALE DI TIPO FAMILIARE
SECERNENTE NORADRENALINA
1
1
2
A. Calcinari , A.M. Gambini , G. Giacchetti , M.
1
Tocchini
1
Lab. Analisi Osp. Riuniti Ancona
Clinica di Endocrinologia e malattie del metabolismo,
Osp. Riuniti Ancona
2
Paziente di 24 anni con crisi ipertensiva (220/120
Hg) associata a cefalea,sudorazione giunge al pronto
soccorso.Gli esami richiesti sono stati: emocromo,
funzionalità renale, ed epatica, metabolismo glico-lipidico,
elettroliti sierici, PTH e calcitonina risultati nella norma;
cromogranina, catecolamine urinarie e plasmatiche
patologiche. Il paziente viene ricoverato presso la clinica
di endocrinologia. All’anamnesi risulta che il paziente
è stato sottoposto ad intervento chirurgico all’età di 7
anni per paraganglioma vescicale. Anamnesi familiare:
2 fratelli e la mamma in buona salute, padre con
pregresso infarto del miocardio e familiarità per malattie
cardiovascolari, la linea materna presenta uno zio affetto
da paraganglioma carotideo non secernente.
Il paziente è stato sottoposto ad esami strumentali: RMN
collo torace addome e a scintigrafia ossea.
I risultati della RMN, della scintigrafia ossea, il
monitoraggio delle catecolamine plasmatiche e urinarie e
delle metanefrine urinarie hanno portato alla diagnosi di
paraganglioma vescicale, con localizzazioni multiple, di
tipo familiare secernente noradrenalina.
Il 10-50% dei casi di paragangliomi del capo e del
collo e circa il 10% dei feocromocitomi hanno una storia
familiare positiva. Il paziente e suoi familiari sono stati
quindi sottoposti ad analisi genetica e presentavano una
mutazione a carico del gene della SDH di tipo B, forma
che viene trasmessa come difetto autosomico dominante
a penetranza incompleta con imprinting materno.
Le concentrazioni delle catecolamine urinarie prima
dell’introduzione della terapia erano: norepinefrina 2021
mcg/24h; epinefrina 18 mcg/24h; dopamina 322.2
mcg/24h.
Il paziente è sottoposto da subito a terapia con
doxazosina, metoprololo e somatostatina
Sono state determinate le concentrazioni delle
catecolamine plasmatiche ed urinarie e delle metanefrine
urinarie periodicamente (più frequentemente nel primo
anno di osservazione e più raramente negli anni
successivi). Le concentrazioni della norepinefrina
urinaria (927.3±570.6 mgc/24h), della norepinefrina
plasmatica (6750.7±3136 pg/ml) e della normetanefrina
urinaria (2358.3±2415.3 mcg/24h) continuano ad essere
altamente patologiche, nonostante una diminuzione del
54% della norepinefrina. Le condizioni del paziente sono
soddisfacenti.
P248
ALTERED FREE LIGHT CHAIN LEVEL AND RATIO
PREDICTED THE RELAPSE AFTER AUTOLOGOUS
STEM CELL TRANSPLANTATION: A CASE REPORT
1
1
1
C. Ferraris Fusarini , F. de Liso , I. Silvani , R.
1
2
1
Maiavacca , F.G. Rossi , E. Torresani
1
Lab. of Clinical Chemistry and Microbiology,
Fondazione IRCCS Ca' Granda Osp. Maggiore
Policlinico, Milano
2
Div. of Hematology 1/CTMO, Fondazione IRCCS Ca’
Granda Osp. Maggiore Policlinico, Milano
Serum free light chain (FLC) measurement can be
used for diagnosis and management of plasma cells
disorder, according to International Myeloma Working
Group (IMWG) guidelines.
We present a case of a 53 years-old woman diagnosed
for λ light chain myeloma in 2011. She arrived at our
department with the following clinical history: diffuse
bone pain with lytic lesions evidenced by total body XRay; hematological evaluation highlighted anemia (Hb
9.4 g/dL) and polyclonal immunoglobulin depression;
urinary assay showed λ Bence Jones proteinuria (BJP)
along with massive 24h proteinuria (13 g). After several
investigations such as backbone RMN, bone marrow
aspirate (25% plasma cells, PC) and biochemical
assessment (immunofixation (IF): monoclonal free λ
chain; FLC k: 20.12 mg/L and FLC λ: 5582 mg/
L; turbidimetric method, Freelite ™, The Binding Site
Ltd, Birmingham, UK) clinicians diagnosed lambda light
chain myeloma III stage based on international staging
system. She was submitted to chemotherapy (Velcade,
Thalidomide and Desametasone, VTD) and, after CD34+
collection, to autologous stem cell transplantation (SCT).
After SCT, total body X-Ray and backbone RMN showed
no worsening; bone marrow aspirate: <5% plasma cells;
serum analysis normalized (IF: negative; FLC k: 10 mg/L,
FLC λ: 5.37 mg/L, FLC k/λ ratio: 1.86 [reference interval
0.26-1.65]; BJP: negative; 24h proteinuria: 0.14 g).
According to IMWG criteria, the treatment lead to a near
complete response (nCR).
After nine months without bone lesions progression
and relevant hematological alterations, FLC λ began to
increase (28.94 mg/L) even if FLC ratio (0.44) was still
within reference interval; then FLC ratio altered too (FLC
k: 8.27 mg/L, FLC λ: 177.22 mg/L, FLC k/λ ratio: 0.04) with
BJP still negative and 24h proteinuria of 0.22 g.
Three months later, also λ BJP became positive together
with glomerular and tubular proteinuria and an increase of
24h proteinuria (1.59 g).
Based on these results new bone marrow evaluation was
conducted (14% PC) and confirmed the relapse and the
necessity of a new therapy.
In this case report serum FLC level and its ratio were the
first altered parameters predicting the relapse and lead
clinician to carry out further investigations.
Jenner E. Serum free light chains in clinical laboratory
diagnostics. Clin Chim Acta 2014;427:15-20.
553
P249
ULTRASOUND IMAGING IN DIAGNOSIS OF
SPLANCHNIC VENOUS THROMBOSIS AND SPLENIC
INFARCTION IN A PATIENT WITH POLYCYTEMIA
VERA
P250
ATYPICAL PRESENTATION OF MULTIPLE
MYELOMA IN YOUNG MAN WHO PRESENTED WITH
NEPHROTIC SYNDROME DUE ONLY TO URINARY
LIGHT CHAINS
V. Russo
L. de Galasso , T.V. Ranalli , M.T. Muratore , C.
4
5
1
Meschini , M. Montanaro , S. Feriozzi
Introduction: Polycytemia vera (PV) is a myeloproliferative
disorder that result from an acquired mutation of a
single hematopoietic stem cell. The JAK2 V617F somatic
mutation is the molecular marker most frequently detected
and its presence excludes secondary polycytemia,
according revision of the current WHO diagnostic criteria
for PV.
Thrombotic complications are the major cause of
morbidity and mortality as splanchnic venous thrombosis
in PV.
Abdominal B-mode ultrasound (US) may showe the
presence of hypoechoic lesions.
Color doppler US may show an area with no blood supply,
but CT scan is the diagnostic method wich has the highest
sensitivity and specificity in these cases.
Case: A 67-year-old man had been treated with
hydroxyurea for 5 years because of a diagnosis
of Polycytemia Vera (PV) before admission to our
hospital for abdominal pain and severe erythrocytosis
(Hb 19,5 g/dL). Bone marrow aspirate showed
increased number of erythrocytes with dysplastic
features, dysmegakaryopoiesis, no ringed sideroblast
was observed; polymerase chain reaction (PCR) was
positive for JAK2 V617F mutation. An abdominal B-mode
US detected the presence of 2,3x4,1 cm hypoechoic
lesion showing a roughly triangular shape with the base
facing the splenic capsule.
Color doppler US showed an area with no blood supply.
CT scan confirmed a splanchnic venous thrombosis with
splenic infarction.
Discussion: Splanchnic venous thrombosis and splenic
infarction is one of the leading causes of morbidity and
mortality in patient with PV.
The incidence of splenic infarction is 9,7%; infarction is
caused by occlusion of the splenic vein thrombosis of the
splenic sinusoids. Splenic infarction normally causes pain
of varying intensity in the left upper quadrant.
Abdominal B-mode ultrasound (US) may showe the
presence of hypoechoic lesions.
Color doppler US may show an area with no blood supply,
but CT scan is the diagnostic method wich has the highest
sensitivity and specificity in these cases.
554
1
2
3
1
U.O. Nefrologia e Dialisi, Osp. Belcolle, Viterbo
U.O. Anatomia Patologica, Osp. Belcolle, Viterbo
3
U.O. Medicina di laboratorio, Osp. Belcolle, Viterbo
4
U.O. Medicina Interna, Osp. Civita Catellana
5
U.O. Ematologia, Osp. Belcolle, Viterbo
2
A previously healthy, 37-year-old man was admitted to
our nephrology unit for worsening of serum creatinine and
nephrotic proteinuria.
Two weeks before he was admitted to hospital
for asthenia, progressive slimming and chest pain
with dyspnea. At hospital admission laboratory
results revealed neutrophilic leucocytosis and elevated
infiammatory tests, haemoglobin 12 g/dL, normal renal
function and electrolytes, low serum proteins and
albumin. Serum protein electrophoresis demonstrated
hypogammaglobulinemia and a monoclonal component
within the β-globulin band; quantification yielded
decreased IgG, IgA and IgM. Urinalysis was significant
for 1+ proteinuria. Pleural and pericardial effusions
were detected. Serological tests for immunological and
infective causes of pleuropericarditis were all negative. An
empiric antibiotic therapy was started, followed by antiinflammatory drugs with no clinical improvement.
At time of the presentation in nephrology ward his serum
creatinine was 1,55 mg/dL and the spot urine protein/
creatinine ratio was 4.4 grams per day. A diagnosis
of nephrotic proteinuria was made, and the patient
underwent a renal biopsy. It unexpectedly revealed a cast
nephropathy: numerous eosinophilic, fractured tubular
casts, surrounded by macrophages and multinucleated
giant cells were present within distal tubules. At
immunofluorescence investigation there was not any
deposition of immunoglobulins, complement components
and light chains in the glomeruli. A positive staining for λlight chain was present on tubular casts.
Serum immunofixation confirmed the presence of a IgG-λ
type monoclonal component, serum light chain assay
(Freelite®) revealed λ-light chain at 504 mg/dL. Urinalysis
showed the presence of selective proteinuria and urine
immunoelectrophoresis showed λ-light chain excretion
of 5.4 g/day. At bone marrow aspirate there was 42%
of atypical plasma cells. A diagnosis of IgG-λ multiple
myeloma (MM) was made and chemotherapy was started.
We describe an atypical presentation of MM in a young
man. Renal biopsy, performed for unexplained renal
disease, and serum and urinary light chain assay allowed
the diagnosis of multiple myeloma.
Wirk B. Renal failure in multiple myeloma: a medical
emergency. Bone Marrow Transplant 2011;46:771-83.
P251
MONITORAGGIO DELLA RISPOSTA
ALLA TERAPIA IN UNA PAZIENTE CON
MIELOMA MICROMOLECOLARE CON
IPOGAMMAGLOBULINEMIA E IMMUNOFISSAZIONE
NEGATIVA
1
1
1
2
L. Bani , C. Salemi , C. Sarto , P. Brambilla
1
Servizio Universitario di Medicina di Laboratorio, A. O.
di Desio e Vimercate, Desio (MB)
2
Dip. di Scienze della Salute, Università degli Studi di
Milano – Bicocca, Monza (MB)
Introduzione:
Tra
le
gammopatie
monoclonali,
caratterizzate da proliferazione plasmacellulare nel
midollo osseo con produzione di un solo tipo di
immunoglobuline (CM - componente monoclonale) si
annovera il Mieloma Micromolecolare (MM micro, 4% di
tutti i casi di MM). Difficilmente diagnosticabile negli stadi
iniziali per mancanza di sintomi e per negatività di alcuni
parametri ematochimici, è caratterizzato da plasmacellule
che producono un solo tipo di catene leggere (κ o λ),
rilevabili con ricerca di proteine di Bence-Jones (BJ) nelle
urine e con dosaggio delle catene leggere libere nel siero
(sFLC) (1).
In questo report descriviamo un caso di MM micro seguito
nel tempo con dosaggio di sFLC.
Case Report: In una donna di 84 anni ad un primo
riscontro nel 1999 sono state rilevate: anemia microcitica
e ipogammaglobulinemia (4,8 g/dL – IgG 388 mg/
dL, IgA 37 mg/dL, IgM 18 mg/dL), assenza di CM,
immunofissazione negativa nel siero ma presenza di
proteina di Bence-Jones costituita da catene leggere di
tipo k che ha consentito la diagnosi di MM micro stadio
IA. Dall’Ottobre 2011 è stato eseguito periodicamente il
dosaggio delle sFLC.
Nel Giugno 2013 la paziente ha iniziato un primo ciclo
terapeutico con Alkeran e Deltacortene a seguito del
peggioramento dei parametri ematochimici e all’aumento
della concentrazione della sFLC coinvolta k (k 1000,5 mg/
L; λ 2,61 mg/L; k-λ 997,9 mg/L; k/λ 383,36). La terapia è
stata sospesa per pancitopenia e ripresa a Marzo 2014
con nuovi farmaci (Revlimid e Desametasone) che hanno
prodotto la riduzione delle catene leggere k a 44,9 mg/dL
pari al 5% della concentrazione prima della terapia (2).
Conclusioni: L’introduzione del dosaggio delle FLC e il
calcolo della loro differenza κ-λ, in una paziente con
componente monoclonale non dosabile con elettroforesi
del siero, ha permesso all’ematologo di monitorare nel
tempo la risposta alla terapia.
1. Derelli E, Donati E, Martinazzoli F, et al. Contributo
del laboratorio alla diagnosi dimieloma micromolecolare.
Descrizione di 5 casi. Quad Sclavo Diagn 1984;20:171.
2. Bradwell AR, Carr-Smith HD, Mead GP, et al. Serum
Test For assessment of patients with Bence Jones
myeloma. Lancet 2003;361:489-91.
P252
EVALUATION OF SERUM FREE LIGHT CHAINS
TM
KAPPA AND LAMBDA BY THE FREELITE ASSAY:
A CASE REPORT
1
2
1
R. Caracciolo , G. Di Cara , M.D. Scimone , G.
1
1
2
Cassata , R. Mangiapane , I. Pucci-Minafra
1
La Maddalena Hospital, Palermo, Italy
Centro di Oncobiologia Sperimentale, La Maddalena
Hospital, Palermo, Italy
2
The serum immunoglobulin free light chains (sFLC)
represent useful serological markers for the diagnosis and
the follow-up of Multiple Myeloma and other monoclonal
gammopathies. Increased serological concentrations of
monoclonal FLC are associated with increased levels of
plasma cell proliferation.
The dosage sFLC allows overcoming the limitations of
the classical determinations on serum (higher sensitivity
compared to assay of total proteins) and urine (poor
patient compliance to the 24-hours urine collection and
traceability of these proteins in the urine in advancedstage disease).
The Freelite® kit (The Binding Site) is utilized to perform
the quick and accurate turbidimetric quantification of the
kappa and lambda FLC in serum.
The present case report shows the results of the
monitoring of a subject affected by MM carried out during
the therapy, for which the Freelite™ determination of
sFLC was fundamental.
Indeed the detection of the serum proteins by the classical
protein electrophoresis (SPE) and the immunofixation
electrophoresis (IFE) did not allow the comprehensive
evaluation of clinical parameters necessary for the
diagnosis.
The results of the latest assessments revealed the
significant reduction of the concentration of κ chains (0.62
mg/L, Normal Range:3.3-19.4 mg/L) and the remarkable
increase of the λ chains (1815.00 mg/L, NR: 5.71-26.9),
with the κ/#λ ratio equal to zero (NR: 0.26-1.65).
These findings confirmed the presence of a monoclonal
component type λ (although slightly visible in the
electrophoretic pattern) and were coherent with the
hematologic determinations, previously performed on
serum samples of the same patient.
The integrated assessment of biochemical data and
anamnesis performed by the onco-hematologist resulted
in a diagnosis of "Multiple myeloma without mention
of remission". On the basis of the diagnosis, the
hospitalization of the patient was predisposed, in order to
perform an accurate re-evaluation of the disease.
In conclusion, the turbidimetry-based Freelite® assay
has been proved, to date, be a useful tool for the
determination of sFLC and therefore for the rapid and
accurate assessment of the hematological profiles related
to multiple myeloma, both in the diagnostic phase and in
the monitoring of 'clinical evolution of the above mentioned
pathology.
555
P253
SINDROME EMOFAGOCITICA IN CORSO DI MORBO
DI STILL
1
1
1
1
M. Ruscio , V. Moretti , N. Franzolini , E. Fumolo , L.
1
Perale
1
Dipartimento Diagnostico e Strumentale, Ospedale di
San Daniele del Friuli (Ud)
2
Dipartimento di Medicina Ospedale di San Daniele del
Friuli (Ud)
3
Friuli (Ud)
4
Friuli (Ud)
5
Friuli (Ud)
Introduzione: La linfoistiocitosi emofagocitica è una
sindrome iperinfiammatoria potenzialmente fatale
caratterizzata da febbre, epatosplenomegalia e citopenia.
E’ frequentemente associata all’artrite idiopatica
giovanile, può presentarsi o come manifestazione
d’esordio di una malattia reumatica misconosciuta o come
complicanza di una malattia autoimmune nota.
Caso clinico: donna di 33 anni con febbre da 3
giorni, diarrea e vomito. In Pronto Soccorso ipotesa
e tachicardica. In anamnesi storia di episodi di febbre
non meglio inquadrati da 15 anni con rilievo da
5 anni di splenomegalia. Agli esami di laboratorio
leucocitosi neutrofila, anemia normocitica, piastrinopenia,
incremento della PCR e della procalcitonina, rialzo della
creatinina. Inizialmente nel sospetto di uno stato settico
a partenza addominale si avviavano terapia antibiotica,
supporto inotropo e idratazione. Il quadro clinico
peggiorava. Comparivano successivamente eritema
fugace e sierosite. Gli esami colturali erano negativi.
L’evoluzione del quadro clinico ha consentito di porre
diagnosi di morbo di Still complicato da sindrome
emofagocitica e di avviare la terapia steroidea, con
notevole miglioramento delle condizioni della paziente.
Conclusioni: La sindrome emofagocitica è spesso
un’entità
clinica
sottodiagnosticata,
che
può
compromettere la prognosi del paziente. La
presentazione clinica può essere difficilmente distinguibile
dai sintomi delle malattie reumatiche. Il trigger infettivo
dovrebbe sempre essere accuratamente ricercato e un
trattamento antibiotico iniziato in caso di evidenza di
infezione.
556
P254
OCULO-FACIO-CARDIO-DENTAL SYNDROME
(OFCDS): IDENTIFICATION OF A DELETION IN
THE BCOR AND OTC GENES USING ARRAY
COMPARATIVE GENOMIC HYBRIDIZATION IN A
FEMALE CHILD
1
1
2
C. Fabbricatore , B. Lombardo , I. Caliendo , C.
1
1
3
4
Munno , L. Pastore , I. Franzese , G. Franzese , M.
2
3
Ergoli , C. Di Stefano
1
Ceinge-Biotecnologie Avanzate, Dip.di Medicina
Molecolare e Biotecnologie Mediche, Università degli
Sudi di Napoli “Federico II”, Naples, Italy
2
U.O.D. Diagnostica Ematologica, P.O. “Umberto I",
Nocera Inferiore, Italy
3
U.O. Terapia Intensiva Neonatale P.O.“Umberto I",
Nocera Inferiore, Italy
4
Dip.di Pediatria, Università degli Studi “Magna Grecia”,
Catanzaro, Italy
Background:
Oculo-facio-cardio-dental
syndrome
(OFCDS) is an uncommon syndrome characterized by
microphthalmia, congenital cataracts, facial dysmorphic
features, congenital heart defects and dental anomalies.
OFCD syndrome is an X-linked dominant trait, and it might
be lethal in males. The syndrome is usually caused by
mutations in the BCOR (BCL6 co-repressor) gene, which
maps to Xp11.4 region.
Clinical Report: We described a female child with a
mild phenotype of OFCDS. She was born at term
after a pregnancy characterized by ecografic features of
right lens thickening and right heart dilatation. She had
congenital anomalies, right mycrophtalmia and secondary
cataract, DIA Type OS, restrictive muscular DIV, mild PDA
and persistent left superior vena cava. Also she showed
dismorhic features.
Methods and Results: Conventional G-banding karyotype
analysis, performed on amniotic fluid sample,was normal
46,XX. Array-comparative genomic hybridization (a-CGH)
analysis revealed a de novo heterozygous deletion in
Xp11.4,of approximately 2,3 Mbp, that includes BCOR
and OTC (Ornithine Carbamoyl-transferase) genes. The
deletion observed was subsequently confirmed by real
time-PCR. Moreover, the proband showed a skewed
X-chromosome inactivation (XCI) pattern for the X
chromosome harboring the alteration in the region
Xp11.4.
Conclusions: Until now are described sixthy-four cases of
OFCDS with missense, nonsense, frameshift and splicing
mutations and five cases with deletions in the Xp11.4
region. All these mutations include BCOR gene. In this
study, was observed, for the first time, in a female child
with a mild phenotype of OFCDS a deletion covering both
BCOR and OTC genes.
1. Hilton E, Johnston J, Whalen S. BCOR analysis
in patients with OFCD and Lenz microphtalmia
syndromes,mental retardation with ocular anomalies,
and laterality defects. Eur J of Human Genet
2009;17:1325-35.
2. Hedera P, Gorski JL. Oculo-facio-cardio-dental
syndrome: skewed X chromosome inactivation in mother
and daughter suggest X-linked dominant inheritance. Am
J Med Genet 2003;123A:261-6.
P255
A FALSE POSITIVE CASE OF CARDIAC TROPONIN I
IDENTIFIED WITH CK-MB REFLEX TESTING
1
1
2
G. Lippi , R. Aloe , G. Cervellin
1
Unità Operativa Diagnostica Ematochimica, Azienda
Ospedaliero-Universitaria di Parma, Italy
2
Unità Operativa Pronto Soccorso e Medicina
d'Urgenza, Azienda Ospedaliero-Universitaria di Parma,
Parma.
Background: Although cardiospecific troponins are
currently considered the biochemical gold standard for
diagnosing myocardial injury, some false positive cases
may occur due to the occurrence of a vast array of
biological and analytical interference.
Methods: We describe here the case of a 77 years old
man, who was admitted to the emergency department
(ED) with a suspect of acute myocardial infarction (AMI).
The patient had suffered since the past 5 days from a
moderate chest pain, accentuated by the cough. The
results of testing upon admission to the ED revealed a
non-diagnostic ECG and a modestly increased value of
troponin I (i.e., 310 ng/L; 99th percentile of the reference
range: 32 ng/L), measured with Beckman Coulter AccuTni
+3. The generation of a diagnostic troponin value in our
facility is always accompanied by the measurement of
creatine kinase MB (CK-MB) by automatic reflex testing,
in order to identify potential false positive cases. In this
patient, the result of CK-MB (1.3 µg/L) was comprised
within the normal reference range (i.e., <4.0 µg/L).
Results: Due to the combination of an increased value of
troponin I and non diagnostic results of both ECG and CKMB, the emergency physician contacted the laboratory in
the suspect of a biological or analytical interference. Since
the presence of hemolysis was excluded, the sample was
treated with a heterophilic antibodies blocking reagent
(HBR, Scantibodies Laboratory Inc, Santee, CA) and then
tested for troponin I along with an untreated sample. The
troponin value in the untreated sample was confirmed
(i.e., 320 ng/L), whereas that in the HBR-treated specimen
decreased to 20 ng/L, and thereby lower than the 99th
percentile of the reference range.
Conclusions: Heterophilic antibodies are relatively
frequent causes of interference in immunoassays,
including troponin I testing. The final clinical diagnosis of
our patient was bronchitis. In our facility, the systematic
implementation of CK-MB reflex testing in troponinpositive samples was proven to be a reliable means to
promptly identify this interference and safeguard patient
safety.
P256
AN UNUSUAL CASE OF HYPONATREMIA
AND HYPOKALEMIA IN THE EMERGENCY
DEPARTEMENT
1
2
1
R. Aloe , G. Cervellin , G. Lippi
1
Academic Hospital of Parma, Parma, Italy
2
Emergency Department, Academic Hospital of Parma,
Parma, Italy
Background: Hyponatremia and hypokalemia are medical
emergencies that are frequently observed in patients
admitted to the emergency department (ED). The prompt
recognition of these conditions is as vital as the
identification of the underlining cause.
Methods: We describe here the case of a man in
therapy with warfarin for atrial fibrillation, admitted to the
ED with a severe gluteal haemorrhage. The results of
laboratory testing upon admission revealed a dramatically
elevated prothrombin time-international normalized ratio
(PT-INR) of 29.8, a concomitantly increased value of
activated partial thromboplastin time (APTT, 8.7, ratio),
anemia, decreased glomerular filtration rate (GFR, 30
ml/min/1.73m2), along with values of serum sodium (60
mmol/L) and serum potassium (1.3 mmol/L) that were
clearly incompatible with the clinical condition.
Results: After consultation with the emergency physician,
a second blood sample was collected 90 min after
the former (both drawn in 13x100 mm, 5.0 mL BD
Vacutainer® SST II Plus serum tubes). In the meanwhile,
the patients had received a i.v. injection of vitamin K
to restore a safe degree of anticoagulation. The test
results on the second sample were almost unchanged,
with the exception of a substantial reduction of both
INR (3.5) and APTT (1.7), along with normal values of
both serum sodium (144 mmol/L) and potassium (3.5
mmol/L). The visual analysis of the former specimen
revealed the presence of a feeble clot in serum. The most
reliable explanation for this unusual case of hyponatremia
and hypokalemia can hence be brought back to partial
aspiration of clot by the probe of the ion selective
electrode module. This is likely attributable to the fact
that the first patient sample was sent to the laboratory
immediately after collection, and the severe degree
of actual anticoagulation prevented optimal clotting of
sample, which instead coagulated after the centrifugation
process and with ineffective separation of fibrin clot from
serum.
Conclusions: Serum samples typically need to clot
completely prior to centrifugation and processing.
Although it is conventionally recommended that serum
tubes should be allowed to clot for not less than 30 min,
this time may be insufficient in frankly overcoagulated
patients.
557
P257
UPPER LIMB HYPOESTHESIA IN A 28 YEARS OLD
WOMAN: A POSSIBLE MULTIPLE SCLEROSIS?
1
1
1
2
F. Duranti , M. Pieri , Z. Rossella , F. Buttari , D.
2
1
1
Centonze , S. Bernardini , M. Dessi
1
Department of Experimental Medicine and Surgery,
"Tor Vergata" University Hospital, Rome (Italy)
2
Department of Systems Medicine, “Tor Vergata”
University Hospital & IRCCS Fondazione Santa Lucia,
Rome (Italy)
Free Light Chains (FLCs) have been detected in
cerebrospinal fluid (CSF) in several Multiple Sclerosis
(MS) studies. Although previous reports have shown that
kFLCs might be suitable for the detection of intrathecal
immunoglobulin synthesis, oligoclonal bands (OCBs)
continue to be the gold standard for the diagnosis
of intrathecal immunoglobulin synthesis. The recent
application of nephelometric assay to determinate FLC in
CSF makes it possible the use of this test in clinical routine
to support diagnostic procedures in MS. The sensitivity
of the nephelometric determination of kFLCs is known to
be comparable with that of OCBs, furthermore an even
higher sensitivity of kappa light chains compared with
OCBs has been recently discussed in MS. We measured
kFLCs in CSF and serum, using a nephelometric assay,
in a MS patient who underwent lumbar puncture for
diagnostic purposes. A healthy 28 years old Italian woman
suddenly manifested left upper limb hypoesthesia in
October 2012. Blood and urinary analysis were normal.
CSF analysis revealed negative IgG index, borderline
oligoclonal IgG expression and increased kFLC Index.
Magnetic resonance imaging showed a demyelinating
leukoencephalopathy without signs of disease activity.
She was discharged four days after hospital admission
with the diagnosis of clinically isolated syndrome (CIS).
Five months later, the patient developed a lower extremity
hyposthenia. She repeated brain and spinal cord MRI that
showed increased lesion load. The diagnosis of Multiple
Sclerosis was made. This case suggests that an altered
kFLC Index may improve the accuracy of the current
criteria for MS diagnosis (1), especially in CIS, and may
be a predictive factor for prognosis.
1. Duranti F, Pieri M, Centonze D, et al. Determination of
κFLC and κ Index in cerebrospinal fluid: a valid alternative
to assess intrathecal immunoglobulin synthesis. J
Neuroimmunol 2013;263:116-20.
558
P258
A CASE OF SEPTIC SHOCK
1
1
1
1
A. Giacomini , P. Carraro , M. Miolo , H. Afshar , M.
2
2
3
1
Chiesa , C. Maifredini , G. Gagliardi , M. Plebani
1
Department of Laboratory Medicine, ULSS 16 - AOP University of Padova, Italy
2
Emergency Department, S. Antonio Hospital, Padova,
Italy
3
Critical Care Unit , S. Antonio Hospital, Padova, Italy
Introduction: Septic shock is defined as sepsis induced
hypotension despite adequate fluid resuscitation. The
time between hypotension onset and the commencement
of antimicrobial therapy critically affects patient survival,
therefore a quick diagnosis is very important.
Clinical case: A 17 year-old male presented at our
Emergency Department (ED) after three days of high
temperature, mild abdominal pain and vomiting. His
background was negative. Asked for risk factors he
said that he canoed down a river 12 days before. On
examination he was hyperthermic (38.2°C), tachycardic
(110 bpm), hypotensive (60/110 mmHg), hypoxic (SatO2
94%), did not have positive fluid balance. Blood tests
showed raised CRP (220 mg/L), leukocytosis (12x10.9/
L), low platelet count (115x10.9/L), no coagulation
abnormality, elevation of plasma glucose (6.5 mmol/L)
and creatinine (117 µmol/L), and abnormal liver function
tests (AST 211 U/L, ALT 92 U/L). Positivity for protein,
haemoglobin and bilirubin was evident on urinalysis.
Chest X-ray was normal. Tests for infectious diseases
were requested. Four hours later, blood cultures were
taken and broad spectrum antibiotics (cephalosporin
+ciprofloxacin) commenced for presumed sepsis. Seven
hours after admission, procalcitonin (2.6 µg/L) and acid
lactate (3.9 mmol/L) were determined; the patient was
then hospitalized. Within a few hours the patient’s
condition worsened: hypotension increased despite fluid
resuscitation (60/35 mmHg, 120bpm), he was still
hypoxic (SatO2 94%) and had developed a "white lung";
renal function also worsened (creatinine 173 µmol/L,
contracted urine output) despite treatment with C-PAP,
and vancomycin and dopamine being added to therapy.
Twenty hours after ED admission the patient was moved
to a Critical Care Unit (CCU) where his condition slowly
improved. Two days after ED admission a diagnosis of
septic shock and severe respiratory distress in anicteric
Leptospirosis was made on a serological basis. The
patient was discharged from the CCU five days later.
Conclusion: This case demonstrates that Laboratory
Medicine can contribute to the early diagnosis of septic
shock through a multimarker approach, allowing effective
antimicrobial therapy.
Jones AE, Puskarich MA. The surviving sepsis campaign
guidelines 2012: update for emergency physicians. Ann
Emerg Med 2014;63:35–47.
P260
PRENATAL DIAGNOSIS OF A CASE OF SMITHLEMLI-OPITZ SYNDROME (SLOS)
P259
CYP21A2 GENETICS: WHEN MOLECULAR
DIAGNOSIS DOES NOT MEET THE CLINIC
1
2
1
1
1
1
1
C. Paola , R. Aurora , C. Cinzia , C. Alessandra , Z.
1
1
Cecilia , C. Ettore
E. Pavanello , D. Dall'Amico , V. Guaraldo , E.
1
2
2
1
Muccinelli , E. Viora , I. Dusini , R. Fiorito
1
Lab. di Biochimica Clinica e Biologia Molecolare,
Università Cattolica del Sacro Cuore, Roma
2
Dip. di Pediatria, Università Cattolica del Sacro Cuore,
Roma
1
Congenital adrenal hyperplasia (CAH) is one of the most
frequent inborn errors of metabolism and more than 90%
of cases are due to 21-hydroxylase deficiency. In families
with history of CAH, prenatal genetic diagnosis is offered.
We present a case of an infant whose parents were
identified to carry severe mutations on the CYP21A2
gene. The fetal DNA analysis, performed in an outside
hospital, demonstrated that the fetus (46,XY) carried the
paternal p.Q318X mutation and the maternal 655A/C›G
mutation. In addition, the genetic laboratory report of
paternal grandmother, performed in an another diagnostic
center, showed the p.Q318X mutation in heterozygosis
with a negative southern blotting for CYP21A2 gene
duplication. Based on these analysis, we assumed
the fetus affected with salt wasting CAH. However,
his clinical presentation at birth was not consistent
with the diagnosis since no macrogenitosomia and
scrotal hyperpigmentation were observed. In the fourth
and eleventh day of life, hormonal and biochemical
examinations, including ACTH test, showed results within
normal ranges. Based on these clinical data, no therapy
was been administered, while diagnosis of classical CAH
was questioned: therefore, we decided to perform a new
genetic testing on the whole family. MLPA and sequencing
analysis showed the CYP21A2 duplication on paternal
chromosome with the p.Q318X mutation on CYP21A2
gene downstream of the TNXB gene and a CYP21A2 wild
type copy downstream of the TNXA gene. The maternal
allele carried the 655A/C›G mutation. The trimodular
haplotype, containing two copies of CYP21A2 gene, was
detected in the father and most probably was present
also in paternal grandmother. The baby was established
unaffected and his follow-up was clinically normal.
In conclusion, the existence of rare trimodular haplotypes
is a condition that must be strongly considered when
CAH genetic analysis is offered at prenatal level since the
correct molecular diagnosis represents a powerful tool for
clinicians who have to make decision regarding therapy
administration.
Smith-Lemli-Opitz syndrome (SLOS) is a severe
malformative autosomal recessive syndrome, resulting
from mutations of the 7-dehydro-cholesterol reductase
(DHCR7) gene.
SLOS prevalence is: 1/20.000-40.000 among Caucasian
women (Tint et al. 1994)
Mutation in the gene DHCR7 causes SLOS by blocking
the conversion of 7-DHC to cholesterol and consequently
leading to low tissue content of cholesterol and increased
content of 7-DHC.
We report here the prenatal diagnosis of a case of
SLOS, detected by a low maternal serum concentration of
unconjugated estriol (0.14 MoM), elevated levels of 7DHC
in the amniotic fluid (>1 mg/dL) and abnormal findings in
the ultrasound scans.
In the Prenatal Screening SLO risk were 1:2, evaluated
with Alpha LMS software, the interpretive software used
in antenatal screening for Down’s syndrome, open neural
tube defects and pre-eclampsia.
The prenatal data were:
Karyotype: 46,XY
7-DHC:16.7 mmol/L (n.v.<0.26)
Ultrasounds imaging: postaxial polydactyly, genital
anomalies with sexual ambiguity
Outcome
Pregnancy termination at 22 weeks.
Autoptic findings
Fetus biometry corresponding to 21 week GA (400 gr,
BPD 58 mm. Lenght 27 cm)
Dysmorphic facial features (small upturned nose, sloping
forehead, ipognatia, low-set ears, extra fingers (postaxial
polydactyly), 2-3 syndactyly of the toes, genital anomalies
with sexual ambiguity, kidneys malformations.
Conclusions: Low maternal serum concentrations (<0.35
MoM) of unconjugated estriol (uE3) found during the
second trimester serum screening must warrant further
investigation, even if the screening test results negative
for Down’s syndrome and/or ODTNs.
Prenatal diagnosis of SLOS can be made biochemically
by testing 7-DHC in the amniotic fluid.
Laboratorio screening prenatale e neonatale, AOU Citta
2
Centro di Ecografia e Diagnosi Prenatale, AOU Citta
559
P261
TWO NOVEL VARIANTS OF THE LPL GENE
FOUND IN A YOUNG PATIENT WITH SEVERE
HYPERTRIGLYCERIDEMIA
1
2
1
C. Giacobbe , M.D. Di Taranto , A. D'Ettore , M.
3
3
1
Malamisura , R. Auricchio , G. Fortunato
1
CEINGE S.C.a r.l. Advanced Biotechnology, Naples,
and Department of Molecular Medicine and Medical
Biotechnology, University Federico II, Naples, Italy
2
IRCCS Foundation SDN, Naples, Italy
3
Department of Translational Medical Sciences, Section
of Pediatrics, University Federico II, Naples, Italy
Introduction: Familial Severe Hypertriglyceridemia (HTG)
is a rare autosomal recessive disorder characterized
by high plasma levels of triglycerides (TG>10.
mmol/L), eruptive xanthomas, lipaemia retinalis and
recurrent pancreatitis, with a population prevalence of
approximately one in a million. HTG is caused by
mutations in five different genes: Lipoprotein lipase
(LPL), Apolipoprotein A-V (APOA5), Apolipoprotein C-II
(APOC2), Glycosyl-phosphatidyl-inositol-anchored HDLbinding protein (GPIHBP1), and Lipase maturation
factor-1 (LMF1) (1) .
Case Report: We present a seven-year-old patient,
recruited at the Department of Translational Medical
Sciences, Section of Pediatrics, University of Naples
Federico II, with severe HTG. He had a lipid profile
characteristic of the pathology (TG > 23 mmol/L).
Following a therapy with ESKIM 1000 on alternate days,
the patient shows poor dietary compliance and delayed
growth.
Methods: After genomic DNA extraction from peripheral
blood samples, the LPL, ApoAV, ApoC2, GPIHBP1
and LMF1 genes, were amplified by PCR and directly
sequenced.
Results and Conclusions: We have found 2 different novel
variants, at heterozygous state, in the LPL gene: c.1A>G
(p. Met1Val) and c.821T>A (p.Leu274His) in exon 1 and
exon 6 respectively. No other mutation was found in
ApoAV, ApoC2, GPIHBP1 and the LMF1 genes.
The presence of the two new variants was also found
in the parents at heterozygous state; in fact the mother
shows the variant c.821T>A while the father c.1A>G.
The presence of the variant was excluded in 100
chromosomes from healthy subjects. These substitutions
are predicted to be a “probably damaging” change,
according to the algorithm SIFT, PMut, Poly-Phen2 and
Mutation Taster. The assay on the measurement of mass
and activity of LPL is being carried out to verify the effect
of the mutations on the enzyme LPL. However, we can
assume that mutation c.1A>G, affecting the start codon
of the protein, has a deleterious effect on its synthesis,
whereas the second c.821T>A mutation, that is to be close
to the catalytic triad of the enzyme, can somehow alter its
function.
Genetic diagnosis confirms HTG; the patient will be
subjected to a more stringent follow-up especially to
prevent the onset of acute pancreatitis.
560
P262
OVERTREATMENT PER VALORI FALSAMENTE
ELEVATI DI CALCITONINA SIERICA
C. Autilio, G. Canu, P. Lulli, R. Morelli, C. Zuppi, C.
Carrozza
Policlinico Universitario “A.Gemelli”, Roma
Background: La calcitonina sierica (CT) ha un importante
valore diagnostico e prognostico nel carcinoma midollare
della tiroide (CMT). Sebbene la valutazione della CT
sierica ha un’elevata sensibilità per la diagnosi di CMT,
presenta una bassa specificità. E’ stato, infatti, dimostrato
che solo il 10-40% di tutti i pazienti con elevati livelli
di CT associati a nodulo tiroideo, presentano CMT.
Inoltre, diversi autori hanno segnalato la presenza di
anticorpi eterofili (AE) nel siero di pazienti con elevati
livelli di CT. Pertanto, valori elevati devono essere
valutati attentamente prima di un qualsiasi approccio
terapeutico, considerando che nessun immunodosaggio
è completamente libero da interferenze.
Metodi: Presentiamo il caso di una donna di 38
anni con noduli tiroidei e ipercalcitoninemia, sottoposta
a tiroidectomia totale. Alla diagnosi, la CT è stata
dosata su IMMULITE 2000 (Siemens) in due differenti
laboratori. Dopo l'intervento chirurgico, è stata rivalutata
nei precedenti laboratori e anche nel nostro ospedale su
Liaison XL (DiaSorin).
Risultati: Prima della tiroidectomia, i valori di CT dosati su
IMMULITE erano 843 e 860 pg/mL. L’istologico definitivo
è risultato: "tiroide con aspetti isolati e focali di iperplasia
nodulare, non associati con CMT ed iperplasia delle
cellule C". Nonostante la tiroidectomia, entro un mese
dall’intervento, gli alti livelli di CT sono stati riconfermati
nei primi due laboratori in due dosaggi consecutivi (910
e 882 pg/mL). Nel nostro laboratorio, invece, la CT della
paziente risultava indosabile in due misure consecutive
(<3 pg/mL).
Conclusioni: Il caso clinico discusso sottolinea
l’importanza di una stretta collaborazione tra clinici e
laboratoristi, per evitare diagnosi errate e trattamenti
inadeguati. Infatti, l’ipercalcitoninemia, causata da
un’interferenza nell’immunodosaggio, ha portato ad
un’indicazione chirurgica per erronea diagnosi di CMT.
In assenza di familiarità e conferma citologica, può
essere utile assicurarsi dell’ipercalcitoninemia, ritestando
il campione con un kit di un altro produttore.
P263
IDENTIFICAZIONE DI PARZIALE MONOSOMIA 21 IN
SEGUITO A SCRENING PRENATALE EFFETTUATO
SU PAZIENTE IN TERAPIA CORTISONICA
1
2
3
4
V. Guaraldo , E. Muccinelli , E. Pavanello , I. Dusini
1
Screening Anomalie Cromosomiche, Dipartimento di
Medicina di Laboratorio, Città della Salute, Torino
2
3
4
Scuola di Specializzazione Ginecologia ed Ostestricia,
Facoltà di Medicina e Chirurgia, Università di Torino
La paziente di anni 28, affetta da Sclerosi Multipla, giunge
alla nostra attenzione per eseguire test integrato.
L’anamnesi
farmacologica
prossima
evidenzia
l’assunzione di Eutirox, insulina e cortisone a scalare da
alcuni giorni.
L’elaborazione del test fornisce un rischio per sindrome di
Down 1/770, peggiorativo rispetto al rischio età (1/1100),
e un estriolo libero al di sotto del cut-off previsto per
l’attivazione del protocollo di indagine apposito (0.15 ng/
mL, 0.20 Mom; cut-off 0.35 Mom).
In considerazione della pregressa terapia cortisonica, che
potrebbe aver soppresso la produzione di estriolo, è stato
proposto alla paziente, prima di affrontare una eventuale
amniocentesi ai fini di valutazione del dosaggio del 7DHC,
di ripetere il prelievo. Contestualmente ci si aspettava
anche un miglioramento del rischio, legato all’aumento
dell’analita.
La ripetizione del prelievo evidenzia un aumento in termini
assoluti e di Mom dell’estriolo (0.391 ng/mL, 0.38 Mom),
ma anche un aumento del hCG totale, che peggiora il
rischio per SD a 1/490.
Il risultato interlocutorio del 2° test, ma soprattutto
l’ulteriore peggioramento del rischio, ci spingono a
proporre alla paziente una consulenza genetica per
valutare comunque l’opportunità di una diagnosi invasiva,
pur in presenza di un test integrato di basso rischio (cutoff per la SD: 1/350) e di un valore di estriolo libero tornato
al di sopra del cut-off.
La paziente, avendo compreso il significato statistico del
test e in considerazione del suo stato di salute, opta per
la diagnosi invasiva.
La QF-PCR evidenzia trisomia a carico dei cromosomi
del gruppo 21, ma l’analisi citogenetica diagnostica un
cariotipo maschile a mosaico con due linee cellulari, una
normale e l’altra con delezione parziale del braccio lungo
di un cromosoma 21 e conseguente parziale monosomia
21.
La successiva consulenza genetica non consente una
precisa definizione del quadro clinico associato a tale
alterazione citogenetica; la paziente decide pertanto di
eseguire ITG.
P264
REAL TIME PCR AND DIAGNOSTIC
EFFECTIVENESS: A CLINICAL CASE OF
MENINGOENCEPHALITIS WITH HERPETIC
COINFECTION
L. Bianchi, Z. Napoli , S. Donati, R. Giannecchini, F.
Santoni, R. Lari
Lab. Analisi Chimico-Cliniche e Microbiologiche, Osp. S.
Jacopo, Pistoia
Background: Diagnosis of meningoencephalitis requires
multidisciplinary skills and integration between
emergency and routine, with implementation of molecular
technologies like Real Time (RT) PCR able to decrease
cost/effectiveness ratio (1).
Objectives: The choice of this clinical case has the
purpose to highlight the importance of a RT-PCR platform
in meningoencephalitis diagnosis, in order to increase
therapeutic effectiveness, reducing Turn Around Time
and increasing sensitivity and specificity of biochemical,
serological and bacteriological tests.
Methods: A 51 years old patient, previously affected by
Burkitt’s lymphoma, arrived to the hospital emergency
with high fever (38 °C), headache, mental confusion
and vertigo. A mild leukocytosis and neutrophilia was
detected, patient was hospitalized and empiric therapy
was begun. After 24 h lumbar puncture was performed
and cerebrospinal fluid (CSF) was tested for: physicalchemical, stained bacterioscopic (Gram) and cultural
exams; virus (Biomérieux) and bacteria (Eurospital; DID)
molecular detection.
Results: CSF was mild turbid with hypoglycorrhachia
(16 mg/dL), high protein level (125 mg/dL), numerous
lymphocytes and absence of neutrophils. In serum no
EBV IgM were detected. After 48 h of hospitalization
EBV (3600 copies/mL) and HHV-6 (1240 copies/mL)
were detected in CSF. Patient’s conditions deteriorated
with behavioral disorders. After 10 days of corticosteroid
therapy patient was discharged.
Conclusions: 1) Glycorrhachia and CSF protein level
don’t allow discrimination between bacterial and viral
meningitis; 2) In cases of viral re-activation no information
is provided by serum IgM; 3) RT-PCR is a powerful tool
for a rapid and effectiveness diagnosis and quantification
of pathogen load allow an appropriate patient’s followup; 3) there is a need of implementation of molecular
screening methods like FilmArray to include in emergency
regimen and their integration with RT-PCR methods will
increase diagnostic effectiveness in meningoencephalitis
and sepsis.
Bianchi L, Niccolai M, Lencioni P, et al. Clin Chem Lab
Med 2010;48:A128.
561
P265
SINDROME DI MILLER-FISHER: CASO CLINICO IN
LABORATORIO
B. Cinti, G. Ciarrocchi, S. Suppressa, M. d'Anzeo, L.
Marinelli, M. Tocchini
Introduzione: La disponibilità di metodi sierologici per
la diagnosi delle neuropatie periferiche autoimmuni ha
assunto un ruolo rilevante per la differenziazione di
tali patologie. Tali sindromi neurologiche, di cui la
sindrome di Guillan-Barrè (SGB) costituisce una delle
principali espressioni cliniche, inducono spesso danni
per demielinizzazione o lesioni a diversi componenti
neuronali. Il sospetto di SGB può essere confermato con
test sierologici, in particolare con la ricerca di anticorpi
specifici contro antigeni della cellula neuronale quali i
gangliosidi.
Caso clinico: Una donna, A.M. di 48 anni si presentava
al Pronto Soccorso con rinolalia, difficoltà di pronuncia
ed offuscamento del visus. La visita otorinolaringoiatrica,
neurologica e gli esami strumentali (RMN) davano esito
negativo. Gli esami ematochimici richiesti all’esordio, tra
cui esame chimico fisico del liquor, ricerca di anticorpi
antiacetilcolina, elettroforesi sieroproteica, risultarono
negativi. In corso di approfondimento diagnostico la
paziente riferiva disturbi gastrointestinali dopo ingestione
di carne cruda nei giorni precedenti. Il quadro complessivo
era compatibile con la SGB. Furono richiesti esami
per anticorpi anti Campylobacter jejuni (metodo RFCDIESSE) e anti-gangliosidi tra i quali: sulfatidi, GQ1b,
GT1a, GT1b, GD3, GD1b, GD1a, GM3, GM2 e GM1
(metodo DOT-BLOT,GA).
Risultati: Anticorpi anti Campylobacter jejuni POSITIVO
1:16 (c.o. = 1:10)
Anticorpi anti gangliosidi Ac. Anti-GQ1b IgG POSITIVO +
+, Ac.Anti-GT1a IgG POSITIVO +++.
I risultati erano compatibili con la Sindrome di Miller-Fisher
(SMF)
La paziente è stata sottoposta a trattamento con
immunoglobuline e.v. a flusso continuo per 7 giorni con
remissione dei sintomi e conseguente dimissione.
Conclusioni: La SMF è una variante della Sindrome di
Guillain-Barrè e generalmente insorge dopo un’infezione
batterica (Campylobacter j., Micoplasma pneumoniae)
o virale (Cytomegalovirus,.). Gli anticorpi diretti verso
strutture simili ai gangliosidi di questi organismi possono
cross-reagire con il rivestimento mielinico delle fibre
nervose e indurre processi infiammatori e conseguente
demielinizzazione. La rilevazione degli anticorpi antigangliosidi associata ad una evidenza clinica facilita la
definizione diagnostica.
562
P266
REAZIONE ANAFILATTICA IN CORSO DI
MASTOPLASTICA ADDITIVA: RUOLO DELL'OSSIDO
DI ETILENE
1
2
2
1
B. Cinti , M.F. Brianzoni , L. Antonicelli , M. Tocchini
1
SOD Allergologia, A.O.U. Ospedali Riuniti, Ancona
2
Introduzione: L’ossido di etilene (EtO) è il più
semplice composto eterociclico contenente ossigeno;
è un gas incolore dall’odore dolciastro, estremamente
infiammabile, tossico per inalazione, esplosivo se
mescolato all’aria.
Il suo utilizzo come agente sterilizzante in ambito
medico è stato largamente ridimensionato a causa della
associazione a reazioni allergiche importanti, soprattutto
in pazienti dializzati. Attualmente si mantiene l’uso
dell’EtO per sterilizzare prodotti medici e farmaceutici
non in grado di sopportare la tradizionale sterilizzazione
ad alta temperatura, come dispositivi che includono
componenti elettronici, imballaggi o contenitori di plastica,
membrane biologiche, protesi in silicone, materiali di
sutura. Le industrie produttrici garantiscono peraltro un
periodo di degassaggio volto a rimuovere l’EtO residuo al
fine di evitare l’insorgere di reazioni avverse.
Caso clinico: Una donna russa, C.C, di anni 39,
sottoposta in passato nel suo paese di origine ad
interventi chirurgici per inserimento di protesi mammarie,
ha avuto recentemente una grave reazione allergica
intraoperatoria in corso di un ulteriore intervento per
sostituzione di protesi.
L’allergologo chiamato in consulenza ha richiesto
il dosaggio delle IgE specifiche (sIgE) per lattice,
succinilcolina, folcodina, gelatina, formaldeide, ossido di
etilene.
Il dosaggio delle sIgE, eseguito su un analizzatore UniCap
250- metodo FEIA (Thermo Fisher), ha evidenziato la
presenza di sIgE per folcodina (c261) = 1,29 KU/L ed un
elevato livello di sIgE per l’ossido di etilene (k78) = 33,1
KU/L.
La folcodina è un amino alchil etere della morfina utilizzato
in alcuni paesi come antitussigeno, che sembra indurre
un aumento delle sIgE associato a reazioni a bloccanti
neuromuscolari.
Nel caso specifico la reazione anafilattica è
verosimilmente da associare all’ossido di etilene
evidentemente ancora presente, anche se in minime
quantità, nelle protesi mammarie.
Conclusioni: La sensibilizzazione all’ossido di etilene, in
soggetti sottoposti ripetutamente ad interventi chirurgici
o in soggetti sottoposti ad interventi per posizionamento
di protesi, può assumere un ruolo rilevante in caso di
reazione anafilattica intraoperatoria.
P267
FENOMENI EDTA-DIPENDENTI: UN CASO DI
FAGOCITOSI PIASTRINICA DA PARTE DEI
NEUTROFILI
P268
RISCONTRO CASUALE DI COMPONENTE
MONOCLONALE
S. Sale, M. Fumi, Y. Pancione, V. Rocco
C. Perani , D. Diano , M.C. Tumminello, V. Musitelli, F.
Cuomo, S. Parisi, C. Gambarini, L. Auriemma
U.O.C Patologia Clinica - A.O.R.N. G. Rummo di
Benevento
Medicina di Laboratorio, Azienda Ospedaliera Bolognini
di Seriate
Introduzione: Il “satellitismo piastrinico” è un fenomeno
caratterizzato dall’adesione piastrinica sulla superficie
dei neutrofili, anche se occasionalmente osservabile su
monociti, eosinofili, nonché basofili e linfociti. Solitamente,
nei casi di satellitismo piastrinico non vi è fagocitosi
cellulare, tuttavia, raramente e solo da alcuni elementi
cellulari, è possibile un’internalizzazione delle piastrine
adese.
Scopo: inquadramento della piastrinopenia riscontrata
in un uomo di 42 anni, in buono stato di salute,
da mesi in follow up per piastrinopenia non trattata
farmacologicamente.
Metodologie: CBC su sangue periferico raccolto in
EDTA-3K e sodio citrato; striscio di sangue periferico e
colorazione MMG.
Risultati: L’esame emocromocitometrico su provetta
EDTA-3K mostrava una piatrinopenia di grado medio
(72x10^3/mcL), senza segnalazione della presenza
di aggregati da parte dell’analizzatore (ADVIA 2120i
Siemens). La valutazione dello striscio di sangue
periferico evidenziava fenomeni di satellitismo e, in
maniera inattesa, elementi granulocitari fagocitanti
piastrine. Si effettuava quindi un time-course per il
conteggio PLT a 0, 2 e 4 ore, con relativa esecuzione
di striscio di sangue periferico per campioni raccolti sia
in EDTA-3K che in sodio citrato. Su provetta EDTA-3K il
CBC, mostrava una progressiva riduzione del conteggio
piastrinico e, il controllo microscopico, un aumento
dei fenomeni di fagocitosi piastrinica (T0: 178x10^3/
mcL, T2h: 99x10^3/mcL, T 4h: 65x10^3/mcL). Non si
riscontravano variazioni della conta piastrinica su provetta
con Sodio Citrato.L’anamnesi e la valutazione degli altri
esami permetteva di escludere patologie di rilievo.
Conclusioni: In letteratura sono riportati rari casi di
fenomeni di fagocitosi piastrinica EDTA-dipendente sia
in soggetti malati che sani. Il caso riportato si riferisce
ad un soggetto sano, con anamnesi patologica remota
negativa in cui, il riscontro sullo striscio di sangue
periferico di elementi granulocitari fagocitanti piastrine,
ha consentito il corretto inquadramento della condizione
come“pseudopiastrinopenia EDTA-dipendente”, evitando
ulteriori inutili e dispendiosi approfondimenti, nonché un
eventuale iter terapeutico del paziente per piastrinopenia.
Senzel L, Chang C. Platelet phagocytosis by neutrophils.
Blood 2013;122:1543
Nel novembre 2013 la pediatria dell'Azienda Ospedaliera
di Seriate invia una richiesta di Elettroforesi sieroproteica
al laboratorio per un neonato di dieci giorni di età
nato nell'Ospedale dell'Azienda. La richiesta di tale
esame non è consueta in pazienti pediatrici ed in
effetti scopriamo, dopo l'esecuzione dell'elettroforesi, che
il codice dell'esame era stato digitato per errore al
posto di quello delle proteine plasmatiche. Il tracciato
elettroforetico evidenzia una componente monoclonale
identificata all'immunofissazione come IgG Lambda (circa
0.6 g/dL). Si richiede quindi un nuovo prelievo nel sospetto
di uno scambio di provetta e ,in presenza del tracciato
che si riconferma , si decide di procedere ad indagine
su sangue materno . Non risultava nessuna richiesta
di elettroforesi sieroproteica in archivio dal 2008 per
la mamma e nessuna nota anamnestica di discrasia
plasmacellulare. L'elettroforesi su sangue materno ha
evidenziato anch'essa una componente monoclonale
identificata come IgG Lambda (circa 1.5 g/dL). La mamma
è stata quindi indirizzata al reparto di ematologia . Al
bambino viene ripetuta l'elettroforesi dopo quattro mesi:
la componente monoclonale appare in tracce (circa 0.1 g/
dL).
563
P269
FALSELY NORMAL PLATELET COUNT IN
THROMBOCYTOPENIC PATIENT: PRE-ANALYTICAL
ERROR?
P270
VALUTAZIONE SU UN CASO DI
ISOELETTROFOCUSIG DEL LIQUOR CON
NUMEROSSIME BANDE ED ELETTROFORESI
G. Lima-Ol#veira, F. Dima, M. Montagnana, G.L.
Salvagno, G.C. Guidi
M. Falcone , S. Petti , M. Angiolilli , M.G. Bonfitto , M.A.
1
1
2
Prencipe , F. Simone , D. Giodice
Laboratory of Clinical Biochemistry, Department of Life
and Reproduction Sciences, University of Verona, Italy
This case report is aimed to describe a falsely
normal platelet count in a thrombocytopenic inpatient.
In the morning of January 1st 2014 we performed a
complete blood count on the ADVIA2120i hematological
analyzer, for a 79-year-old woman with a long history
of thrombocytopenia (platelet count between 50 and 119
X 109/L) HCV related. Surprisingly, platelets resulted
in the normal range (383 X 109/L). In the afternoon
a new blood sample showed low count (87 X 109/
L). In the following morning a new platelet count was
normal (282 X 109/L) and in the afternoon platelet
count resulted low (60 X 109/L), both in K3EDTA
and Na citrated anticoagulated blood specimens. The
third day complete blood analysis was performed at
room temperature and after heating the sample for 30
minutes at 37°C. Blood counts were performed using
two different blood cell counters: ADVIA 2120i and
Beckman Coulter UniCel® DxH 800. Both instruments
reported falsely elevated platelet counts (282 and 337 X
109/L, respectively) in specimens at room temperature.
Contrarily, in specimens incubated at 37°C platelet count
resulted low (87 and 84 X 109/L, respectively). At room
temperature the histogram of platelet volume distribution
showed asymmetry in the platelet size histogram because
the scatter of platelets detected cryoglobulins as small
particles at the left of the diagram and both instruments
highlighted with flags the presence of nucleated red
blood cells. Blood film was prepared from specimen
obtained at room temperature, stained according to the
May-Grünwald-Giemsa technique and was examined at
room temperature with a phase-contrast microscope. No
precipitates of pale amorphous particles between red cells
were macroscopically observed. Type II cryoglobulinemia
HCV-related was confirmed by biochemical methods
in serum sample. Accordingly, by immunofixation, the
cryoglobulins precipitate contained monoclonal IgM, with
κ light chains only, whereas IgGs components were
polyclonal. In conclusion, since cryoglobulinemia is not a
very rare phenomenon, especially in HCV patients, we
recommend to identify and record affected patients and to
perform CBC in specimens incubated at 37°C.
564
1
1
1
1
1
1° Laboratorio Analisi Cliniche, Azienda Ospedaliero
Universitaria OO. RR. di Foggia, Foggia
2
Medical Systems, Genova
Nel mese di marzo 2014 è giunto in Laboratorio un liquor
dal Reparto di Malattie Infettive, di una donna di 52
anni. Gli esami di chimica clinica su siero evidenziavano
lieve leucocitosi e GGT elevata. Il 1° campione di
liquor è stato esaminato solo in Microbiologia, test
Multiplex meningite: negativo per CMV, HHV6, EBV,
HSV1-2, VZV; Positivo per Listeria monocytogenes;
colturale: Positivo per Listeria monocytogenes. Dopo 12
giorni è stato inviato un altro liquor per esame chimico
fisico; colore limpido, glicorachia 57 mg/dl, protidorachia
78,8 mg/dl, ac. lattico 30 mg/dl, n. di cellule 60 /ul,
prevalenza di mononucleati. La paziente dopo qualche
giorno dal secondo prelievo è stata dimessa in buone
condizioni. Sul 2° campione di liquor è stata eseguita
una elettroforesi delle proteine liquorali in capillare, su
V8 Helena Biosciences Europe Inghilterra / Medical
Systems Italia, Genova. L’elettroferogramma, disegnato
da V8, ha mostrato le normali frazioni proteiche ed una
tipica Componente Monoclonale (CM) in zona gamma.
I dati numerici sono stati: prealbumina 5.26%, albumina
46.19%, alfa1 10.61%, alfa2 5.24%, beta 7.07%, gamma
25.63%, CM in gamma 13.57%. La CM espressa in mg/
dl ha dato 10.69. Sul siero del paziente, della medesima
data, è stata eseguita una elettroforesi sierica in CE e
l’elettroferogramma non ha mostrato alcuna CM. Questo
e il liquor sono stati sottoposti ad Isoelettrofocusing (IEF),
con kit SAS IgG IEF, costituito da un gel d’agarosio
in gradiente di pH, anticorpo anti-IgG e colorante, della
stessa Ditta. Questo test ha mostrato un pattern di tipo
2: presenza di bande oligoclonali nel liquor e assenza nel
siero. L’aspetto peculiare è la estrema numerosità delle
bande oligoclonali, oltre 20. Su V8 si è anche proceduto
ad eseguire una Immunosottrazione (ISE) e la CM è
stata tipizzata come IgG kappa. Questo caso evidenzia
la specifica risposta immunologica non sistemica, non un
danno di barriera, ma una sintesi intratecale di anticorpi
di tipo IgG kappa. L’elettroforesi liquorale ha evidenziato
subito la CM, l’ISE l’ha tipizzata in totale automazione.
La CE potrebbe fornire dati di laboratorio utili alla clinica,
minimizzando il TAT (Turn Aroun Time).
P271
IL LAVAGGIO BRONCOALVEOLARE COME
“BIOPSIA LIQUIDA”: UN CASO DI PROTEINOSI
ALVEOLARE
P272
FALSA POSITIVITA’ AL CONTEGGIO DELLE
CELLULE LIQUORALI PER INTERFERENZA DA
DEPOCYTE© (CITARABINA)
M. Fumi, Y. Pancione, S. Sale, V. Rocco
A. Motta , R. Milani , M. Trbos , M. Locatelli
U.O.C. Patologia Clinica - A.O.R.N. G. Rummo di
Benevento
1
Introduzione: Il Lavaggio Broncoalveolare può essere
considerato una sorta di “biopsia liquida”, e pertanto
“trasporta” con sé un potenziale diagnostico notevole.
L’utilità clinica del BAL nella diagnosi e nella gestione dei
pazienti con interstiziopatia polmonare è stata oggetto di
dibattiti e controversie.
Scopo: Dimostrare l’utilità della valutazione morfologica
del BAL nell’inquadramento di una interstiziopatia in una
donna di 79 anni ricoverata presso l’U.O. di Pneumologia
per dispnea in trattamento da due mesi con cortisonici
sistemici, senza risultati apprezzabili.
Metodologie: CBC su ADVIA 2120i; Caratterizzazione
immunofenotipica con MoAb CD3, CD19, CD4, CD8,
CD16, HLADR, valutazione morfologica dello striscio con
colorazione (MMG e PAS).
Risultati: Il campione giunto in laboratorio presentava un
aspetto opalescente. L’immunofenotipizzazione rilevava
rapporti tra le popolazioni linfocitarie rispettati. Al controllo
microscopico (colorazione MMG), oltre ad un aumento
dei linfociti e dei neutrofili, si repertava la presenza
di macrofagi schiumosi e di materiale amorfo basofilo
extracellulare, poi risultato positivo alla colorazione PAS.
I dati citomorfologici del BAL, risultavano compatibili con
un quadro di proteinosi alveolare, pur in assenza del
tipico aspetto lattescente del campione. Dopo un mese
con terapia di supporto (antibiotici, steroidi sistemici,
ecc.), a fronte di un notevole miglioramento della
sintomatologia e dei parametri funzionali respiratori, si
procedeva comunque ad un nuovo BAL che riconfermava
la proteinosi alveolare.
Conclusioni: Nelle interstiziopatie: a) la HRTC è
assolutamente indicativa nella individuazione del sospetto
diagnostico, b) il quadro immunofenotipico del BAL
è specifico solo in pochi casi (sarcoidosi, istiocitosi,
ecc.), c) al contrario, l’esame citomorfologico, anche
se maggiormente operatore dipendente, può fornire dati
inattesi e di elevata utilità diagnostica, d) laddove la
diagnosi di proteinosi si associ ad un aspetto non
lattescente, legato probabilmente ad un impegno minore,
anche il BAL non a scopo terapeutico, può produrre
miglioramenti clinici.
Bibl:
Borie R, Danel C, Debray MP, et al. Pulmonary alveolar
proteinosis. Eur Respir Rev 2011;20:98-107.
1
2
1
1
Servizio di Medicina di Laboratorio Ospedale San
Raffaele, Milano
2
Servizio di Imunnoematologia e Medicina
Trasfusionale, Ospedale San Raffaele, Milano
Il Depocyte© è un farmaco utilizzato per il trattamento
delle meningiti linfomatose, mediante somministrazione
per via intratecale (iniezione lombare o intraventricolare).
La veicolazione del suo principio attivo (citarabina)
avviene mediante liposomi e la sua emivita relativamente
lunga (4-10 giorni) fanno si che si riscontri nel
liquido cefalo-rachidiano anche dopo molti giorni dalla
somministrazione.
Attraverso le immagini presentate nel poster si
evidenzia l’importanza della conoscenza delle terapie
farmacologiche somministrate al paziente e la necessità
di una stretta relazione tra clinica e laboratorio, al fine di
evitare false errori nella conta della cellularità liquorale.
Il Depocyte© determina infatti nel liquido cefalorachidiano la creazione di artefatti che facilmente possono
essere confusi con strutture cellulari,
Questi artefatti persistono in ragione della lunga sua
emivita anche a molta distanza dalla somministrazione e
possono indurre false diagnosi di ipercellularità liquorale.
565
P273
“TOO YOUNG TO DIE”: LUCI E OMBRE
NELL’IDENTIFICAZIONE DI PAZIENTI A RISCHIO DI
MORTE CARDIACA IMPROVVISA (MIC). UN CASO
CLINICO EMBLEMATICO
1
1
1
1
L. Marinelli , G. Ciarrocchi , M. d'Anzeo , B. Cinti , I.
2
2
3
Battistoni , G.P. Perna , F. Alessandrini , M. Pesaresi
3
3
1
, A. Tagliabracci , M. Tocchini
1
Laboratorio Analisi, Ospedali Riuniti di Ancona
Cardiologia Ospedaliera e UTIC, Ospedali Riuniti di
Ancona
3
Medicina Legale, Università Politecnica delle Marche,
Ancona
2
Introduzione: Le patologie cardiache rappresentano la
principale causa di morte nel mondo occidentale. Nel
giovane l’incidenza è più bassa, ma aumenta nello
sportivo. La MIC rappresenta un evento inaspettato
e drammatico, secondario a patologia coronarica,
a cardiomiopatie o a sindromi aritmiche primarie
(canalopatie). Le canalopatie ereditarie (LQTS, SQTS,
Brugada, CPVT) sono sindromi associate a mutazioni
genetiche a carico dei canali ionici, che alterano
l’equilibrio delle correnti del potenziale d’azione cardiaco,
innescando aritmie ventricolari potenzialmente letali. La
diagnosi genetica, definendo la predisposizione e la
suscettibilità individuale, riveste un’importanza strategica
nel fornire le basi per nuove strategie di trattamento e
prevenire gli eventi cardiovascolari.
Caso clinico: K.Q., maschio, 18 anni giunto al P.S. per
dolore toracico. Anamnesi familiare negativa per patologie
cardiache. Non fumo e/o assunzione di alcool. Riferito,
in anamnesi, episodio sincopale durante attività sportiva,
complicato da arresto cardiaco per FV, trattata con CV
esterna. Esami ematochimici ed Ecocardiogramma nella
norma. All’ECG riscontro di un intervallo QT accorciato:
300 ms (QTc: 330). Viene deciso il ricovero per una
valutazione approfondita del caso. Durante la degenza
sono stati effettuati: un ECG dinamico che ha evidenziato
episodi di onda T negativa a branche asimmetriche; un
EEG con evidenza di alterazioni puntute; un Eco-doppler
carotideo e un Tilt test entrambi negativi. E’ stata richiesta,
inoltre, indagine genetica nel sospetto di SQTS. Tale
indagine, in corso, è stata eseguita presso l’Istituto di
Medicina Legale, utilizzando una NGS (Next generation
sequencing) PGM Ion Torrent della Life Technologies.
Conclusioni: SQTS è associato ad una elevata incidenza
di MIC ed aritmie ventricolari. L’ereditarietà è di tipo
AD con eterogeneità genetica. Sono state descritte
anomalie “gain-of-function” nei canali del potassio (geni
KCNH2 , KCNQ1 e KCNJ2) e un’anomalia “loss-offunction” nei canali CACNA1C, CACNB2b e CACNA2D1.
Se identificati i pazienti hanno un decorso favorevole.
Nei soggetti sintomatici, con pregressa sincope o AC, la
terapia d’elezione è l’ICD, mentre nei pazienti asintomatici
e nei bambini può essere proposta una terapia con
idrochinidina.
566
P274
IGM ANTI-CMV ASSENTI IN SIEROCONVERSIONE:
EVENTO RARISSIMO?
1
1
1
1
G. Mazzei , L. Ferrari , R. Casnici , P. Nolli , M.E.
1
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Manfredini , M. Arrigoni , S. Testa
1
Lab. Analisi, Az. Ist. Osp. Cremona
U.O. Gastroent., Az. Ist. Osp. Cremona
2
Introduzione: L’infezione da Citomegalovirus acquisita in
gravidanza, può essere trasmessa al feto in percentuale
variabile a seconda del periodo di gestazione, dal
quale dipende la gravità degli esiti clinici. Conoscere la
condizione sierologica della madre all’inizio e durante
tutta la gravidanza permette di effettuare le procedure più
idonee che vanno dalle norme igienico-comportamentali
nelle donne sieronegative ad un corretto counselling in
caso di sieroconversione. La ricerca delle IgG e delle IgM
anti-CMV costituisce lo strumento più utilizzato.
Case report: Il 17/04/2013 viene testato, presso il
Laboratorio di Microbiologia dell’Ospedale di Cremona,
il siero di una donna alla 35° settimana di gestazione
per ricerca di anticorpi IgG e IgM anti-Citomegalovirus,
risultata negativa al precedente controllo avvenuto in
data 01/04/2013: si evidenziava una positività per IgG
anti-CMV con IgM negative. La signora ripeteva il
prelievo dopo 2 giorni con valore IgG raddoppiato e
IgM negative. Contestualmente, riprocessando il primo
campione analizzato in data 01/04/2013 e stoccato
presso il laboratorio, si confermava la condizione di
sieronegatività iniziale. In tutti i campioni analizzati con
lo strumento Liaison-Diasorin utilizzato per lo screening
le IgM anti-CMV rultavano assenti, dato confermato dal
Vidas-BioMèrieux. Il test di avidità delle IgG anti-CMV
eseguito su Liaison indicava infezione in atto con un indice
basso di avidità pari a 0.0257. Sottoposta a valutazione
infettivologica, la signora presentava una clinica silente.
Al successivo controllo del 23/04/2013 si è evidenziata la
comparsa di IgM anti-CMV e di DNA virale positivo. La
signora partorisce il 23/05/2013 una bimba con infezione
da CMV confermata in biologia molecolare su urine e
sangue, ma per il momento asintomatica.
Conclusioni: Nelle donne suscettibili al CMV, lo screening
mensile per tutta la durata della gravidanza rappresenta
l’unico strumento per diagnosticare precocemente
sieroconversioni, anche con presentazioni anomale come
quella qui illustrata, e attuare tempestivamente misure
diagnostico-terapeutiche sul neonato.
P275
EPATITE FULMINANTE DA VIRUS C: RARA MA
LETALE?
1
2
2
2
E. Vaccaro , N. Boffa , A. Caruso , L. Greco , R.
2
2
1
Punzi , R. Santoro , A. Massari
1
Dip. Patolgia Clinica e Medicina Trasfusionale, A.O.U.
San Giovanni di Dio e Ruggi D'Aragona, Salerno
2
U.O.C. Malattie Infettive, A.O.U. San Giovanni di Dio e
Ruggi D'Aragona, Salerno
Il caso che descriviamo si riferisce ad una epatite
a decorso fulminante HCV correlata di recente
rilevazione.Paziente maschio, italiano, 69 anni. Moglie
HCV positiva con carica virale 1.980.000 ui/ml (Cobas
Ampliprep/Cobas Taqman,Roche Molecular Sistem) e
genotipo 1b (Versant HCV Siemens Healthcare). Dal
20 aprile c.a. lamenta dolore periombelicale e cefalea
frontale. Nei giorni successivi manifesta nausea, vomito,
anoressia spiccata ed astenia. Il 27 aprile c.a. effettua
controlli ematochimici con i seguenti risultati ALT 5398 U/L
AST 5345 U/L BILIRIBINA TOTALE 10.84g/l BILIRUBINA
INDIRETTA 6.80 POTASSIO 7.8 EMOCROMO: RBC
5.71MM/ul WBC 7.0 M/ul HB 18.2g/l PLT 142.000
M/ul, attività protrombinica 22% (30.2 secondi), INR
2.82, APTT 41.8 sec , Fibrinogeno 219.8 mg/dl AntiHCV negativo HBsAg negativo. Il 29 aprile è ricoverato
presso la nostra A.O.U. a causa di uno stato itterico
ingravescente: il quadro clinico-laboratoristico orienta per
un’epatite probabilmente ad etiologia infettiva. Il paziente
è comunque lucido, partecipe, autonomo e anche l’esame
elettroencefalografico non rileva alterazioni. Nei giorni
successivi si rileva incremento delle transaminasi, della
bilirubina totale e diretta e della lattico deidrogenasi
ed INR in progressivo aumento. Il 30 aprile si registra
una debole positività per anticorpi anti-HCV (1.12 S/
CO ARCHITECT HCV, Abbott) con una carica virale di
HCV-RNA >170.000.000 UI/ml genotipo 1b. I marcatori di
epatite B mostrano una positività solo per HBcAb totale
e HBsAb (19 ui/ml). Negativi anti-HIV e test treponemico
per lue Il quadro siero-proteico non è ancora seriamente
compromesso, ma l’incontrollabile e rapida alterazione
dell’attività coagulativa (attività PT in decremento, INR
in ascesa) impongono il trasferimento presso un centro
di riferimento trapiantologico nell’ipotesi di epatite acuta
fulminante, ma il paziente decede a tre giorni dal
trasferimento. Abbiamo ritenuto interessante riportare
questa nostra esperienza in virtù dell’eccezionalità di
questi eventi,di cui si annoverano pochissimi casi in
letteratura HCV correlati. Inoltre è rilevante considerare
che si tratta di un’infezione primaria e non di
una riattivazione di una pregressa infezione, come
testimoniato dallo stato sierologico del paziente al
momento del ricovero.
P276
UNEXPECTED EVOLUTION OF HEPATITIS VIRUS B
1
1
2
2
E. Vaccaro , G. Coppola , N. Boffa , R. Santoro , R.
2
1
Punzi , A. Massari
1
Dip. Patolgia Clinica e Medicina Trasfusionale, A.O.U.
San Giovanni di Dio e Ruggi D'Aragona, Salerno
2
U.O.C. Malattie Infettive, A.O.U. San Giovanni di Dio e
Ruggi D'Aragona, Salerno
Il caso che descriviamo è datato maggio 2011, allorchè
presso la divisione di Malattie Infettive della nostra
A.O.U. si ricovera un paziente maschio,italiano, 46 anni,
affetto da epatite acuta B, con i segni tipici dell’infezione
(iperbilirubinemia, ipertransaminasemia, positività per
HBsAg, HBcAb IgM, HBcAb, HBeAg, HBV-DNA 773.000
UI/ml). Il contagio è probabilmente avvenuto per via
sessuale a causa di occasionali rapporti mercenari. Si
ritiene utile valutare lo stato sierologico della moglie per
procedere alla vaccinazione. La partner, italiana 42 anni,
risulta negativa a tutti i marcatori sierologici (ARCHITECT
ABBOTT) ma positiva all'HBV-DNA con carica 23 UI/
ml(Cobas Ampliprep/Cobas Taqman,Roche Molecular
Sistem). Si ripetono tutti gli esami dopo 7 giorni e si rileva
sempre e solo HBV-DNA 98 UI/ml. Inizia un follow-up
con controlli settimanali: la donna, asintomatica, senza
alterazioni dei parametri ematochimici di funzionalità
epatica mostra una viral load in progressivo lento
incremento. Dopo circa 1 mese compare per la prima volta
una debole positività per HBsAg (1.54 S/CO) senza altri
marcatori e la carica virale raggiunge il valore di 1.330 UI/
ml. Il prelievo successivo (dopo 7 giorni) fa registrare un
inizio di HBsAb (1.4 UI/ml) e una carica virale di 3.850
UI/ml, mentre tutti gli altri marcatori, compreso HBsAg,
sono negativi. A due settimane da questo riscontro HBVDNA diventa negativo, compaiono HBcAb IgM e HBcAb
e il titolo anti-S diventa 437 UI/ml. La rivalutazione a
due mesi mostra lo stesso pattern sierologico ma il
titolo diventa superiore a 1.000 UI/ml. La paziente è
stata quindi monitorata ogni 3 mesi per un altro anno
e il quadro è rimasto invariato fino all’ultimo controllo
datato aprile 2013 in cui l’HBsAb è sempre >1.000 UI/
ml, persiste HBcAb IgM mentre HBeAg/HBeAb non sono
mai comparsi. Questo caso ci è sembrato veramente
“indimenticabile” per l’evoluzione così peculiare di una
infezione asintomatica da virus B, ma soprattutto per la
constatazione che lo stesso virus (dobbiamo ritenerlo tale
con altissima probabilità) ha infettato due soggetti ed
ha avuto una progressione totalmente diversa nei due
pazienti, a dimostrazione che le espressioni patologiche
delle infezioni sono relazionabili per la gran parte
all’organismo ospite e in minor misura alle caratteristiche
dell’agente infettante.
567
P277
COPEPTINA E TROPONINA NELLA DIAGNOSI
PRECOCE DI SINDROME CORONARICA ACUTA
(SCA) SENZA ELEVAZIONE ST. UN CASO CLINICO
INDIMENTICABILE
1
1
1
1
I. Cataldo , I. Griffo , F. Paolini , S. Martinotti , F.
2
2
Ricci , R. De Caterina
1
Patol. Cli. Osped. Clin. SS. Annunziata, Chieti
2
Istituto di Card. Università Chieti
Ogni anno nel nostro paese circa 15 milioni di pazienti si
presentano al Pronto Soccorso (PS) con dolore toracico:
il 40% di questi ha una SCA, mentre nel 17,6% la
diagnosi finale è infarto miocardico acuto (IMA). E' quindi
fondamentale una rapida valutazione di questi pazienti
per indirizzare con più precisione le strategie diagnostiche
e terapeutiche. Le linee guida prevedono, nel sospetto
di IMA, l'utilizzo di marcatori cardiaci come la troponina
(hscTnI) e l'esecuzione di un elettrocardiogramma (ECG),
ma la hscTnI ha una bassa sensibilità all'esordio. La
rapidità e la sicurezza nell'escludere un IMA rappresenta
una grande necessità all'interno del PS ed è proprio
in questo contesto che la copeptina, utilizzata come
marcatore di stress endogeno,può essere di grande
supporto. Caso clinico: un paziente maschio di 81 anni
iperteso con pregresso infarto rivascolarizzato si presenta
al PS dell'ospedale Clinicizzato Chieti con un dolore
toracico di origine non traumatica insorto da almeno 6 ore.
Viene sottoposto ad un ECG ed a un prelievo di sangue
per il dosaggio della hscTnI e la copeptina. Il paziente
è inserito in un protocollo di studio per la valutazione
della copeptina nella diagnosi precoce della sindrome
coronarica senza elevazione ST. Il protocollo prevedeva
una valutazione del chest pain score che è risultato di
2 (=<4 basso rischio e >4 alto rischio) e un TMI RISK
SCORE che era di 2. L'ECG è risultato negativo e il
valore di hscTnI era di 0,018 ng/mL (cutoff 0,045 ng/
mL) mentre la copeptina era di 14,27 pmol/L (cutoff 14
pmol/L).Il paziente rifiuta il ricovero presso l'osservazione
breve e firma per l'autodimissione. Ritorna nuovamente
al PS a distanza di 6 ore circa per la persistenza della
sintomatologia e viene ricoverato in Unita' di Terapia
Intensiva Cardiologica per sindrome Coronarica Acuta
(NSTEMI) e muore dopo poche ore. In questo caso clinico
l'utilizzo della copeptina insieme alla troponina sarebbe
stato di notevole utilità nell'inquadramento diagnostico del
paziente.
568
P278
RASH MACULOPAPULOSO ASSOCIATO A SIFILIDE
SECONDARIA
G. Lobreglio, S. Negro, F. Sicuro
U.O. Patologia Clinica, Presidio Ospedaliero "Vito
Fazzi", ASL Lecce
Un uomo di 23 anni è giunto alla nostra osservazione
per la presenza di un rash maculopapuloso insorto da
tre settimane e tumefazioni linfonodali in sede laterocervicale, ascellare ed inguinale bilaterale. Le eruzioni
cutanee erano diffuse su tutta la superficie cutanea,
compresi i palmi delle mani e le piante dei piedi,
ed erano costituite da maculo-papule rotondeggianti o
ovalari di circa 2-3 mm di diametro, di colorito brunastro,
alcune con iniziali segni di desquamazione e non erano
pruriginose. I linfonodi erano di diametro variabile da 1 a 2
centimetri, di consistenza teso-elastica, mobili rispetto ai
piani superficiali e profondi, e non dolenti.
Il paziente era stato inviato in laboratorio per l'esecuzione
di alcune prestazioni diagnostiche per il sospetto di
eruzione cutanea da allergia o intolleranza alimentare e
per l'accertamento diagnostico delle linfoadenopatie. La
presenza del caratteristico rash maculopapuloso anche
su palmo e pianta di mani e piedi e la storia clinica di
multipli rapporti sessuali non protetti con partners di sesso
femminile, ha fatto ipotizzare il sospetto diagnostico di
sifilide, sebbene il paziente non ricordasse la presenza
di lesioni primarie nodulari e/o ulcerose né nella regione
anogenitale né sulle membrane mucose dell'orofaringe. É
stata eseguita la ricerca degli anticorpi anti Treponema
pallidum con un test in chemiluminescenza che utilizza
antigeni ricombinanti di T. pallidum (LIAISON Treponema
Screen, DiaSorin) che ha dato risultato fortemente
positivo, con valore indice >70 (valore indice dei campioni
negativi: < 0,9); in linea con le raccomandazioni delle
LG internazionali (IUSTI: 2008 European Guidelines on
Management of Syphilis) il risultato è stato confermato
con il test di agglutinazione al lattice con antigene
treponemico (TPPA) che è risultato positivo con titolo di
1:2560; come test per l'attività sierologica di sifilide è stata
eseguita la RPR che è risultata fortemente reattiva (+++
+). Altri test di laboratorio per infezioni da Toxoplasma,
Chlamydia, Gonococco e virus HIV, sono risultati negativi.
E' stata posta diagnosi di sifilide in stadio II; il paziente
è stato trattato con una singola dose intramuscolare di
2,4 MU di penicillina G benzatina che ha determinato la
risoluzione completa del rash.
P279
ACCIDENTAL FINDINGS OF VARIANT
HEMOGLOBIN DURING GLYCATED HEMOGLOBIN
DETERMINATION
P280
BIASED COAGULATION FACTOR DEFICIENCY IN
A PATIENT WITH LIVER CIRRHOSIS AND LUPUS
ANTICOAGULANT
M. Teti, D. Scribano, C. Zuppi, T. De Michele
P. Pradella , C. Abazia , P. Simioni , A. Simsig , R.
3
3
Patti , L.S. Crocè
Dip. di diagnostica e di medicina di laboratorio, U.O.C.
Analisi 1 Pol. A.Gemelli-Università Cattolica del Sacro
Cuore
Background: The glycated hemoglobin(HbA1c) is the
gold standard for the assessment of glycemic control in
diabetic patients and its measure has to do according to
the ADA and IFCC standardization criteria. For improving
the validation of HbA1c as data throughput rate and
quality levels we put in validation algorithm software
of our instrument Tosoh other warm flags respect to
those already present (hemoglobin variants, area too low
and too high)with the consequent stop of on-line result
storage.
Methods: We analyzed routine laboratory 14000 samples
over a period of one year after the introduction of new
flags in glycohemoglobin Tosoh Bioscience automated
HPLC-723 analyzer (IFCC-NGSP standardized). These
new flags are: foetal hemoglobin > 2.0%, HbA1c
<20 mmol/mol and> 140 mmol/mol, theorethical plates
numbers <250, HbA1c retention time 0.59±0.2 seconds.
The instrument accuracy was provided by the daily CQI
on 2 levels(CV <2%).
Results: On the overall dosages, after the implementation
of the validation algorithm, 292 results were not sent to
LIS, with chromatogram visual inspection and manual
report addition with suitable comment. 60 of these
samples were stopped and studied for Hb Variants.
After the chromatogram inspection we point out the
variant presence suggesting hematological clinical tests.
The HbA1c result is calculated for all detectable Hb
heterozygous variants (HbD, HbS, HbC), except only for
the HbE variant. One chromatogram with alert variant flag
drowned our attention: In fact we observed an anomalous
peak between the peaks of labile(LA1C+) and stable A1c
(SA1C). The HbA1c result was 24 mmol/mol. The patient’s
blood count showed microcytic ipochromic anaemia with
glucose-6-PDH deficiency, which however did not justify
the peak presence. After the notice to the haematologist,
it was carried out a pathological hemoglobin research with
diagnosis of suspect HBH disease; in corfirmation of this,
it was mandatory to do molecular tests.
Conclusion: Thanks to close chromatogram examination
it is possible not only to observe the presence of Hb
structural variants, even if infrequent, but to make critical
analysis about the HbA1c results and to help hematologist
colleagues to do very quickly a differential diagnosis of
microcytic ipochromic anaemias.
NGSP. HbA1c assay interferences; 2012. http://
www.ngsp.org/interf.asp.
1
3
2
1
1
Lab. di Patologia dell'Emostasi, Dip. di Medicina
Trasfusionale, Azienda O.U. "Ospedali Riuniti", Trieste
2
Dip. Scienze Cardiologiche, Toraciche, Vascolari,
Università di Padova
3
Cl. Patologie del Fegato, Dip. ad Attività integrata di
Medicina Interna, Università di Trieste
Case Report: During a follow up for a chronic liver injury,
an 84-years-old woman was found with abnormal PT
and APTT. She had a history of pulmonary carcinoid,
diabetes and dyslipidemia with a fatty liver progressing
to cirrhosis. Liver fibrosis without ascites was evident
at the abdominal scan without any HBV and HCV
infection. Laboratory test showed a platelet count of
3
128x10 /µl, AST of 48 U/L, ALT of 37 U/L , normal
albumin level, PT-INR of 1.31 and APTT-Ratio of 2.99.
Then the assays for Lupus Anticoagulant and antiphospholipid antibodies were performed with strongly
positive results only for Lupus. The levels of natural
anticoagulants Antithrombin, protein C and protein S were
normal. Subsequently the patient reported a recent rectal
hemorrhage and large hematomas at the right arm after
a plaster. To assess an impaired synthesis and/or an
acquired deficiency the activity of coagulation factors was
tested with results quite normal for FII, FV, FVII and FX,
in spite of FVIII very low (11%), but FIX, FXI and FXII
undetectable. The parallel Line Bioassay with the onestage coagulation factor method, performed to neutralize
the non-specific inhibition of Lupus Anticoagulant, was
unsuccessful. Moreover searching for specific coagulation
inhibitors was mystifying. A blood sample was sent to
a Reference Laboratory to be tested by other reagents,
where coagulation factor activities resulted normal.
A virtual endoscopy revealed a gut angiodysplasy which
could account for the rectal bleeding.
Conclusions: In this patient the laboratory picture proper
to the liver disease was affected by the presence of
Lupus Anticoagulant with misleading results of some
coagulation parameters such as factor activity. A probable
explanation may be the nature of the APTT reagent
used for the coagulation factor assay. Indeed in our
Laboratory the APTT is based on synthetic phospholipids
while in the Reference Laboratory a reagent with extracted
phospholipids is used.
569
P281
A CASE OF KIKUCHI-FUJIMOTO DISEASE; MULTIDISCIPLINARY APPROACH
R. Catania, M. Machi
Studio di Medicina della Riproduzione e Pediatria
Kikuchi-Fujimoto disease is a benign syndrome affecting
young woman in reproductive age.
It was supposed an autoimmune or viral cause (EBV,
herpes virus, and other). Symptoms present painful
cervical lymphadenopathy, with skin lesions, pain and
less frequently weight loss, nausea, and vomiting. The
result of a wide range of laboratory studies are normal.
The diagnosis generally after histologic examination with
excisional biopsy of the node. Therefore, in literature,
recurrence rate of 3% to 4% has been documented,
there are different opinions about autoimmune associated
pathology. Here is a case described of a 37 year old
woman, with KFD diagnosis 8 years ago. Dismissed
in November, from an internal medicine department
with Lupus and Antiphospholipid Syndrome therapy on
low dose corticosteroids and diuretic. In July, after six
months, the patient seeks care again. We reported at
the clinical senologic examination in right axillar region
a tender lymph nodes; an extranodal. Recognition of
KFD is important, because it can be suspected malignant
lesion like a lymphoma. The patient takes triphasic oral
contraceptives and asked for better family reproductive
planning. After laboratory research various professional
specialists, such as hematologist, internist, dermatologist
for a definitive diagnosis it is necessary, to exclude hidden
malignancy. The reproductive age and better medical
family planning. The well-being and acceptance must
become first aim and preconception planning prophylaxis
of thrombophilia complications in accordance with Branch
2011 must be applied.
570
P282
STATE OF THE ART OF ITALIAN CLINICAL
TOXICOLOGY LABORATORIES: RESULTS FROM
THE FIRST NATIONAL SURVEY PROPOSED BY
SIBIOC
1
2
2
M. Vidali , F. Evangelisti , G. Petricciani , I.M.
2
2
Sbarbaro , P. Bucchioni
1
Lab. Ricerche Chimico-Cliniche, Osp. Maggiore della
Carità e Università degli Studi del Piemonte Orientale
“Amedeo Avogadro”, Novara (NO)
2
Lab. Farmaco-Tossicologia, Osp. S. Bartolomeo, ASL 5
Liguria, Sarzana (SP)
Background: Analyses for Workplace drug and substance
abuse on the road testing represent a considerable part of
the daily workload of the Pharmacotoxicology Laboratory.
In the absence of specific rules directed by National or
Regional Laws, Toxicology Laboratories have developed
their own analytical drug testing procedures and, in turn,
personalized reports and interpretations. The Toxicology
Study Group of SIBioC in 2013 started a national survey
to assess the situation of the Italian Pharmacotoxicology
laboratories involved in drug testing. In this study, data
from this first national survey are reported.
Materials and Methods: The survey included two
questionnaires aimed to clarify laboratory procedures
used for, respectively, Workplace drug and drug and
alcohol on the road.
Results: Data clearly showed a very low response rate to
the survey (<30 respondents) and a high heterogeneity of
laboratory procedures, including pre-analytical (chain of
custody, methods of collection, sample volume, sample
adulteration check), analytical (instrumentation, analytical
method, cut-off) and post-analytical aspects (qualitative or
quantitative reporting), in some cases even different from
procedures required by Italian Law, when available.
Conclusion: To avoid subjective interpretations, which in
turn could lead to unequal treatment of citizens, a careful
revision of the analytical procedures used by the Italian
Pharmacotoxicology Laboratories is mandatory.
Pacifici R, Gori P, Martucci L, et al. Considerazioni sulle
matrici biologiche idonee alla valutazione dell’“attualità
d’uso di sostanze illecite” ai fini degli articoli 186 e 187 del
nuovo Codice della Strada. Biochim Clin 2014;38:27-31.
P283
THERAPEUTIC DRUG MONITORING OF
EVEROLIMUS BY LC-MS/MS: METHOD VALIDATION,
EXTERNAL QUALITY PROGRAM RESULTS AND
APPLICATION TO PEDIATRIC PATIENTS
1
2
1
1
S. Barco , S. Winter , P. Bonifazio , L. Barbagallo , A.
1
1
1
1
Maffia , D. Bugnone , M. Talio , G. Tripodi , G.
1
Cangemi
1
Laboratorio Centrale di Analisi, Istituto Giannina
Gaslini, Genova
2
Novartis Pharma AG, Forum 1, Novartis Campus,
CH-4056 Basel, Switzerland
Everolimus (RAD-001) is an inhibitor of mammalian target
of rapamycin (mTOR) which acts by suppressing cytokinedriven T-lymphocyte proliferation. It is currently used
as an immunosuppressant to prevent rejection of organ
transplants and treatment of renal cell cancer and other
tumours. Therapeutic drug monitoring (TDM) is necessary
to secure the therapeutic effect and avoid toxic exposure.
Liquid chromatography tandem mass spectrometry (LCMS/MS) is the gold standard methodology for everolimus
measurement because it ensures high specificity and
sensitivity. The aim of this work is to describe the
validation process that we have followed for the setting
up of this new laboratory test in our laboratory. A method
based on a modification of a commercially available kit
(Chromsystems, Munich, GmbH) has been applied on
a TSQ Quantum Access LC-MS/MS (ThermoScientific,
Milano, Italy). The chromatographic separation and
calibration range have been modified with the aim to
improve the method performance. The new method has
been validated following international guidelines and it
is suitable for the determination of everolimus using
deuterated everolimus as internal standard, over the
range of 0.5 ng/mL (LLOQ) to 50 ng/mL starting from
100 µL whole blood with appropriate accuracy and
reproducibility. A cross-check test has been successfully
performed at the request of Novartis Pharma to ensure
inter-laboratory reproducibility with the Novartis laboratory
(Basel, Switzerland). In the period between October 2012April 2014 the LC-MS/MS method has been applied on 18
patients (age 4- 32 years) of the Istituto Giannina Gaslini
under everolimus therapy. Everolimus concentrations
measured on 148 samples were in the range 0.7-35 ng/
mL. The method has been routinely used in our laboratory
by six different laboratory technicians. The international
proficiency testing (IPT, Analytical Services International,
London, UK) performed over the same period ensured a
good accuracy over time with results being always within
the ranges of acceptance. The new LC-MS/MS method
provides high specificity, sensitivity, accuracy, precision
and reproducibility for the measurement of everolimus and
it is suitable for TDM in the routine clinical laboratory.
P284
POSITIVITÀ NON CONFERMATE AL TEST
DI SCREENING PER MDMA: IL CASO DEL
FENOFIBRATO
E. Rasio, C. Rota, E. Cariani, A. Veronesi, T. Trenti
Dipartimento di Medicina di Laboratorio. Ospedale S.
Agostino Estense, Modena
Nell’arco del 2013 sono pervenuti, presso il Laboratorio
di Tossicologia e Diagnostica Avanzata (AUSL di
Modena) 2281 campioni urinari per il dosaggio di
Ecstasy, 3,4-metilenediossimetanfetamina, (MDMA) con
metodica semiquantitativa di screening EMIT (Architect
ci8200 Abbott, Milano). 1362 campioni provenivano
da lavoratori sottoposti a controllo nell’ambito della
valutazione dell’idoneità al lavoro dei soggetti operanti
con mansioni a rischio.
Il limite inferiore di quantificazione del metodo è fissato
a 22 ng/mL e il limite superiore a 1000 ng/mL. Il cutoff per i lavoratori è fissato per legge a 500 ng/mL. I
soggetti risultati postivi al test di screening devono venire
allontanati dalla mansione lavorativa fino all’esecuzione
del test di conferma, è quindi importante escludere il più
possibile la rilevazione di falsi positivi.
14 campioni dosati nel 2013 sono risultati positivi (MDMA
>500 ng/mL), 9 derivanti da soggetti afferenti ai pronto
soccorso della provincia (età media 26.2±4.9, MDMA
>1000 ng/mL) e 5 provenienti da lavoratori con mansione
a rischio (età media 55±4.7, MDMA = 570.4±55.1 ng/
mL). Nel periodo Ottobre 2009-Maggio 2014, 13 campioni
derivanti da soggetti con mansione a rischio (8 lavoratori)
sono risultati positivi al dosaggio immunometrico di MDMA
(560.3±53.3 ng/mL). Tutti sono risultati negativi alla
successiva conferma in gas cromatografia.
Per indagare l’origine della falsa positività dello screening
si sono valutati i farmaci assunti dai lavoratori. 12 dei 13
campioni falsamente positivi provenivano da soggetti che
avevano dichiarato di essere in terapia con fenofibrato.
In questo lavoro abbiamo valutato la possibile crossreattività del farmaco col dosaggio EMIT di MDMA: 7
campioni positivi (anni 2013 - 2014) sono stati dosati
di nuovo col kit in uso e con un kit EMIT alternativo
(Siemens, Milano).
Tutti i campioni si sono confermati positivi nel primo caso
mentre sono risultati ampiamente al di sotto del cut-off al
dosaggio col secondo kit (6 su 7 con MDMA <100 ng/mL).
In conclusione, è necessario valutare la possibilità che
risultati positivi ma vicini al cut off del test di screening per
MDMA siano dovuti in realtà all’utilizzo di fenofibrato.
571
P285
VALUTAZIONE DEL METODO QMS TEMA
TACROLIMUS
D. Leogrande, L. Varraso, R. Lovero, E. Mascolo, A.
Massaro, R. Contino, P. Mastrolonardo, F. Di Serio
Lab. Patologia Clinica I, Azienda OspedalieroUniversitaria Policlinico, Bari
Il tacrolimus è un antibiotico macrolide di origine funginea,
con una potente attività immunosoppressiva utile in
pazienti sottoposti a trapianto d’organo.
Lo scopo del lavoro è stato quello di valutare il nuovo
metodo QMS TEMA per il dosaggio ematico della
concentrazione del Tacrolimus. I dosaggi sono stati
eseguiti sugli analizzatori CDX 90 (TEMA) e VIVA
(Siemens) rispettivamente.
Materiali e metodi: Per la valutazione della precisione
analitica del metodo, sono stati utilizzati materiali di
controllo (QC), a tre livelli di concentrazione di Tacrolimus
(More Diagnostics), testati per cinque giorni consecutivi
sul CDX90. Per lo studio di comparazione e la valutazione
della concordanza tra i metodi, 50 campioni di sangue
intero sono stati analizzati sul CDX90 (range = 2.2 – 17.1
ng/ml) e sul VIVA. I dati sono valutati con la regressione
di Passing and Bablok e l’analisi di Bland and Altman.
Risultati: Studio di precisione CDX : QC Livello 1: media
= 9.14 ng/mL, CV tra-serie= 3.2%; CV intra-serie=1.3%;
QC Livello 2: media = 19.3 ng/mL, CV tra-serie=2.8%,
CV intra-serie=0.7%; QC Livello 3: media = 28.6 ng/
mL, CV tra-serie=1.7%, CV intra-serie = 0.1%. Test di
concordanza, (Passing and Bablok): y = 0.98 (95% CI,
da 0.87 a 1.13)x + 0.84 (95% CI, da -1.1 a 0.98). Test di
comparazione,(Bland-Altman): bias assoluto= 0.79 ng/mL
(da CI 95% - 0.3 a CI 95% 1.60); limiti di agreement: lower
= -4.81 upper = 6.38
Conclusione: I nostri dati preliminari mostrano che il
nuovo metodo QMS TEMA è un metodo preciso e
correla con il metodo EMIT2000. La presenza di un
bias statisticamente significativo indica che i due metodi
non possono essere interscambiabili. Al fine di ridurre il
rischio di errori clinici derivanti da errori post-analitici, in
caso di pazienti sottoposti a monitoraggio terapeutico, un
appropriato commento sul referto dovrebbe indicare se un
cambio di metodo sia subentrato.
572
P286
PENTRASSINE : POSSIBILE FATTORE
PROGNOSTICO DELLA VASCOLARIZZAZIONE E
DELLE VASCULITI
M. Papa, R. Lanzano, G. Lanzano
Azienda Universitaria Policlinico SUN
Si è indagato sul ruolo che può avere il sistema
immunitario innato (attraverso i suoi fattori) in patologiche
riguardanti il sistema vascolare. Le pentraxine lunghe
(PTX) sono molecole appartenenti al sistema immunitario
innato, prodotte da numerosi tipi di cellule, quali
macrofagi, cellule dell'endotelio vasale, cellule detritiche,
e del tessuto vidimale. In particolare entrano nei
complessi meccanismi della risposta infiammatoria, esse
sono complessi proteici circolanti di P.M. pari a circa
43 KDa costituiti da una catena di 360 aa. Tali proteine
è stato scoperto che hanno un'importante funzione
nelle cellule dell'endotelio vascolare agendo a livello
di messaggeri di segnali che a livello strutturale delle
stesse cellule; molto probabilmente coordinano la risposta
all'infiammazione di origine vascolare, mediando sul
processo di apoptosi (regolatori). PTX3 possiede ruolo
di attivatore sia di PGF2alfa che di VEGF. A riguardo
dell'azione angiogenetica esse regolano la formazione del
"lumen" vascolare nelle cellule endoteliali staminali che
dovranno formare il nuovo sistema vascolare.
Materiali e metodi: 100 pazienti di cui 40 affetti da vasculite
40 da malattie vascolari di tipo misto e 20 rappresentanti
popolazione sana
E' stata eseguita una correlazione tra conc. di PTX3
sierico. Dosaggio effettuato con tecnica ELISA con
anticorpi, standars e controlli specifici per PTX3 forniti
DIAGNOSTICA SENESE (DS).
Il coefficiente di correlazione r tra i valori delle variabili
correlate è stato calcolato con la funzione di Pearson.(NO)
I risultati derivanti da tale studio sembrano aprire buone
prospettive nel capire se PTX3 possono avere un ruolo di
indice prognostico in tali patologie.
P287
INTERACTIONS BETWEEN CHLORHEXIDINE AND
SODIUM HYPOCHLORITE: CHEMICAL ANALYSIS
1
2
1
1
C. Calla' , A. Lupi , B. Giardina , G. Nocca
1
Ist. Biochimica e Biochimica Clinica, UCSC, Roma
Ist. di Chimica del Riconoscimento Molecolare, CNR,
Roma
2
Endodontic failure may occur in cases of persistent
bacteria in the root canal system (RCS). Mechanical
instrumentation alone is not able to obtain a complete
cleaning of the RCS, so a commonly used method of
disinfection in endodontic treatments consists in the use
of sodium hypochlorite (NaOCl) followed by the use
of chlorhexidine gluconate (CHX). After each irrigating
solution, distilled water should be used to prevent possible
reaction among the components. In fact, if NaOCl is
present when CHX is added, a brown precipitate is formed
with a possible negative effect on the outcome of the
treatment. Some literature works reported the presence of
4-chloroaniline (PCA) in brown precipitate, other, on the
contrary, didn’t observed its formation; in our study, we
have tried to explain the reason of this discrepancy using
HPLC-UV technique.
To 1.0 mL of 2% CHX were added different volumes of
6.0% NaOCl (from 0.01 to 0.12 mL). Also the reaction
mixtures between 6.0% NaOCl and PCA (5 mg /mL in
methanol) were prepared.
The specimens were centrifuged (13400 x g 5 min)
and both supernatants (SNs) and precipitates (PTs) (resuspended in 1 mL of methanol) were analyzed.
The column used was a Discovery HS C18 (250mm ×
4.6mm, 5 µm) (SUPELCO, PA, USA), flow rate 0.7 mL/
min, detection 214 nm. Water (A) and acetonitrile (B) were
used for the elution: from 50% (B) to 70% (B) in 10 min
and to 85 % (B) in 5 min.
The chromatograms of CHX showed a signal with a
Retention Time (RT) 3.0 min. When NaOCl was added,
many other signals appeared with RT between 20 and
25 min. Similar results were obtained in the PTs. The
presence of PCA signal was not observed neither in PTs
nor in SNs.
The HPLC analysis of mixture between NaOCl and
PCA showed the presence of signal with RT 9.1 min
(PCA), its intensity decreases when NaOCl was added,
and completely disappeared with 0.12 mL of NaOCl.
Simultaneously signals with RT between 20 and 25
minutes are produced, similarly to what was observed for
the CHX. In PTs are present many peaks with RT around
2-3 min and at 25-30 min.
The obtained results showed that PCA is transformed in
presence of NaOCl. Thus, the discrepancy of literature
data could be due to the reaction conditions: the newlyformed PCA reacts with NaOCl and is transformed.
P288
IMMUNOHISTOCHEMICAL EVALUATION OF
ANDROGEN RECEPTOR IN HUMAN PREPUCE
FROM PATIENTS WITH POST-FINASTERIDE
SYNDROME AFTER FINASTERIDE USE FOR
ANDROGENETIC ALOPECIA
F. La Marra, C. Di Loreto, S. Cauci
Dip. Medical and Biological Sciences, Univ. Udine, Italy
Finasteride is an inhibitor of 5-α-reductase used against
male androgenetic alopecia (AGA). Reported side effects
of finasteride comprise sexual dysfunction including
erectile dysfunction, male infertility, and loss of libido.
Recently these effects were described as persistent in
some subjects, this condition was definied as PostFinasteride Syndrome (PFS). Molecular events provoking
PFS are unexplored.
This study was designed as a retrospective case-control
study to assess if androgen receptor (AR) and nerve
density in foreskin prepuce specimens were associated
with persistent sexual side effects including loss of
sensitivity in the genital area due to former finasteride
use against AGA. Cases were 8 males (aged 29-43
years) reporting sexual side effects including loss of
penis sensitivity over 6 months after discontinuation of
finasteride who were interviewed and clinically visited.
After informed consent they were invited to undergo a
small excision of skin from prepuce. Controls were 11
otherwise healthy matched men (aged 23-49 years) who
undergone circumcision for phimosis, and who never took
finasteride or analogues.
Differences in AR expression in dermal prepuce were
evaluated in the 2 groups. Density of nuclear AR in stromal
and epithelial cells was higher in cases (mean 40.0%, and
80.6% of positive cells, respectively) than controls (mean
23.4%, and 65.0% of positive cells, respectively), P=0.023
and P=0.043, respectively. Conversely, percentage of
vessel smooth muscle cells positive for AR were similar
in the 2 groups.
Our findings revealed that modulation of local AR levels
might be implicated in long-term side effects of finasteride
use. This provides the first evidence of a molecular
objective difference between patients with long-term
adverse sexual effects after finasteride use (i. e. PFS)
versus drug untreated healthy controls in certain tissues.
573
P289
STUDIO PROSPETTICO DI FARMACOCINETICA DEL
CHEMIOTERAPICO 5-FLUOROURACILE (5-FU)
1
1
1
2
V. Viola , M. Brugia , M. Tocchini , R. Berardi
1
Lab. Biochimica Clinica e Microbiologia, Osp. Riuniti di
Ancona
2
Clinica di Oncologia Medica, Osp. Riuniti di Ancona
Premesse e scopo dello studio: Il 5-fluorouracile(5FU) è uno dei farmaci antitumorali più utilizzati per
il trattamento di neoplasie, quali cancro colonrettale,
pancreatico, gastrico e della mammella. Studi hanno
evidenziato che solo il 20-30% dei pazienti riceve una
dose appropriata.
La finalità dello studio è stato di valutare la variabilità
individuale di assorbimento del 5-FU in pazienti oncologici
trattati, seguiti presso la Clinica di Oncologia Medica.
Materiali e metodi: Sono stati dosati in totale 21 campioni
di sangue prelevati almeno 1 ora prima della fine
dell’infusione, raccolti in provette contenente stabilizzante
(Sample stabilizer Saladax), mantenuti congelati a -20°C.
Il test utilizzato per la determinazione quantitativa di 5-FU
nel plasma si basa su agglutinazione di nanoparticelle (5FU-PCM-Saladax Biomedical) eseguito su analizzatore
CDx90Tema Ricerca. E’stata calcolata l’area sotto la
curva (AUC) che tiene conto delle ore di infusione. Il cutoff utilizzato : AUC superiore a 20 - 25 h*mg/L.
Risultati: I 21 pazienti studiati (13 maschi e 8 femmine,
età media 61 anni) 5 avevano diagnosi di carcinoma
gastrico, 8 carcinoma del colon, 5 carcinoma pancreaticoe
3 carcinoma del retto. Dei 21 pazienti: 7 (32%) AUC <20
h*mg/L, 3 (14%) AUC compreso tra 20-25 h*mg/L, 12
(55%) AUC >25 h*mg/L.
Conclusioni: I dati preliminari ottenuti mostrano che
il 55% dei pazienti ricevono dosi eccessive di 5FU
che potrebbero provocare segni di tossicità importanti.
Per questo motivo il monitoraggio dei livelli plasmatici,
in combinazione agli altri dati clinici, offre al medico
Oncologo uno strumento di supporto nella gestione del
trattamento terapeutico ottimale. I nostri dati mostrano
peraltro situazioni di sottodosaggio (32%) che potrebbero
comportare una limitata efficacia terapeutica.
La messa a punto di un immunodosaggio automatizzato
risulterebbe un’alternativa pratica, economica e rapida
rispetto all cromatografia liquida accoppiata a
spettrometria di massa (LC-MS/MS) attualmente usata.
574
P290
A COMPARISON BETWEEN SERUM
CARBOHYDRATE-DEFICIENT TRANSFERRIN
AND HAIR ETHYL GLUCURONIDE IN DETECTING
CHRONIC ALCOHOL CONSUMPTION
1
1
2
1
V. Bianchi , S. Premaschi , A. Raspagni , S. Secco , M.
3
Vidali
1
Toxicology Reference Laboratory, SS Antonio e Biagio
e C. Arrigo Hospital, Alessandria
2
School of Medicine, Insubria University, Varese
3
Clinical Chemistry Unit, Maggiore della Carità Hospital
and Dept. of Health Sciences, University Amedeo
Avogadro of East Piedmont, Novara
Aim: In heavy alcohol consumption laboratory tests
represent an objective evidence. To this aim several
biomarkers and different biological matrices may be
evaluated. In this study we compared common alcohol
biomarkers in blood and in hair.
Methods: Carbohydrate-Deficient Transferrin (CDT), Ethyl
Glucuronide (EtG), AST, ALT, GGT, MCV were measured
in 562 subjects (M 92%, F 8%; median age 36y, IQR
29-45, min-max 19-79). All people declared no alcohol
consumption within the last three months. Serum CDT
was measured by kit CDT by HPLC (Bio-Rad, Milan) and
expressed as relative amount of disialotransferrin (cut-off
1.7%). EtG was measured in hair by a validated homemade method in LC-MS/MS (cut-off 30 pg/mg).
Results: Median %CDT, EtG, AST, ALT, GGT, MCV in
the whole sample were respectively 1.1% (IQR 0.9-1.3),
8 pg/mg (IQR 6-20), 21 UI/L (IQR 18-25), 22 UI/L
(IQR 17-31), 20 UI/L (IQR 14-32) and 92.4 fL (IQR
88.9-95.3). 42 (7.5%) and 76 (13.5%) subjects resulted
positive, respectively, to %CDT and EtG. In particular,
30 (5.3%) subjects were positive to both tests, 12 (2.1%)
positive only to %CDT, while 46 (8.2%) only to EtG. The
agreement (positive and negative pairs) between %CDT
and EtG was 89.7%. %CDT-positive subjects displayed
significantly higher MCV (median 94.7 vs 92.3 fL;
p=0.003) and EtG (median 46 vs 8 pg/mg; p <0.0005), but
not AST, ALT and GGT, than %CDT-negative subjects.
EtG-positive subjects displayed significantly higher MCV
(median 94.0 vs 92.1 fL; p=0.001), GGT (28 vs 19 UI/L; p
<0.0005) and %CDT (1.4% vs 1.1%; p <0.0005), but not
AST and ALT, than EtG-negative subjects. Interestingly,
up to 6 out of 12 (50%) only %CDT-positive subjects had
EtG <15 pg/mg, whereas up to 27 out of 46 (59%) only
EtG-positive subjects had %CDT<1.1%.
Conclusion: Large variability exists between %CDT and
EtG in detecting chronic alcohol consumption. To identify
alcohol abuse in a forensic context, such as traffic
medicine, the combination of different alcohol biomarkers
and appropriate medical history is mandatory for the
correct interpretation of individual cases.
P291
VALUTAZIONE DELL’USO ABITUALE DI ETANOLO
MEDIANTE DETERMINAZIONE DI TRANSFERRINA
DESIALATA IN SOGGETTI CON VALORI DI
ETANOLEMIA ELEVATI
A. Veronesi, C. Rota, E. Rasio, E. Cariani, T. Trenti
Dipartimento di Medicina di Laboratorio, Nuovo
Ospedale S. Agostini Estense, Modena
Nel Dipartimento di Medicina di Laboratorio di Modena,
che risponde alle esigenze diagnostiche di tutta la
provincia (700.000 abitanti), nel 2013 sono stati valutati
per etanolemia 1422 campioni, 546 dei quali (38.3%)
sono risultati positivi (>0.5 g/L). Al fine di conoscere
la percentuale di soggetti utilizzatori abituali di etanolo
tra i positivi per etanolemia, è stata analizzata la %
di transferrina desialata (CDT), capace di identificare
un consumo di etanolo >60-80 g/die per 10-15 giorni,
mediante elettroforesi capillare (MDQ, Beckman), in 105
campioni selezionati in modo casuale.
L’età media dei soggetti sottoposti a determinazione
dell’etanolemia (83 maschi, 27 femmine) era di 37±14
anni. I livelli medi di etanolemia erano 2±1 g/L (range:
0.5-4.5), non erano correlati all’età ma erano superiori nei
maschi (2.34±0.97 g/L) rispetto alle femmine (1.84±0.85
g/L, p=0.018). E’ stato possibile determinare la % di
CDT (mediana 1.28, range: 0.68-11.1) in 98/105 campioni
(93.3%). Dei rimanenti, 5 erano caratterizzati da varianti
genetiche della transferrina e in 2 casi era presente
un’interferenza analitica.
I valori di CDT sono risultati positivi (>2%) in 22 su
98 campioni analizzabili (22.4%; età media dei soggetti:
42.7±10.6 anni, 4 femmine, 18 maschi). I valori positivi
di CDT sono stati riscontrati in soggetti più anziani (età
media 35.4±14.0 anni, p=0.026) e con etanolemia più
elevata (2.81±0.98 contro 2.05±0.87 nei CDT negativi,
p=0.0007). I valori di etanolemia erano correlati alla %
di CDT (test di Spearman, r=0.3157, p=0.0015) e livelli
superiori a 2.65 g/L erano predittivi di CDT >2% con una
sensibilità del 68.2% e una specificità del 73.7% (AUC
0.73).
In conclusione, nella casistica esaminata l’abuso alcolico
occasionale è correlato ad uso cronico nel 22% circa
dei casi e si associa significativamente con età più
avanzata e valori elevati di etanolemia. Tale dato appare
importante per meglio discriminare i consumatori cronici
dagli occasionali e valutare l’eventuale successo di un
percorso terapeutico. Per l'identificazione dell’abitudine
etilica nel singolo soggetto e l'indirizzo all'ottimale
percorso terapeutico appare utile suggerire l’esecuzione
della CDT insieme all’alcolemia in caso di valori elevati.
P292
TOXICOLOGICAL INVESTIGATIONS FOLLOWING
BREACH OF MOTOR VEHICLES CODE.
EXPERIENCES OF A HOSPITAL LABORATORY
A. Motta, A. Soldarini, M. Trbos, M. Locatelli
Servizio di Medicina di Laboratorio, Ospedale San
Raffaele, Milano
Objective: to evaluate incidence of narcotic substances
presence in blood and urine samples delivered by the
Traffic Police our service upon breach of article 187 of
Street Code during the period 01/01/2013 -31/05/2014.
Methods: 295 requests for presence in blood and/or
urines of opiates, cocaine, methadone, amphetamines,
methoxyamphetamines, cannabinoids, buprenorphine
and metabolites thereof were received at the laboratory
in the above mentioned period. Whenever possible
for each individual 3 blood samples, (EDTAK3 and
calcium oxalate) and 3 urine samples were collected.
Urine samples were screened by immunoenzymatic
method (Cobas C501, Roche Diagnostics). In the case
of concentrations exceeding the limit of detection the
related blood samples were analysed by using a liquid
chromatography-mass spectrophotometry method (ABx
API 4000).
Results: 295 individuals undergone the controls (males
84%, females 16%), age 15-87 years (average 33 years).
In 29 cases it was not possible to collect urine samples,
whereas in 15 cases blood sample was not collected. 197
urine samples were found negative, as well as 221 blood
samples. 69 urine samples (26% of the total) were positive
with the LC-MS/MS, highlighting presence of THC-COOH
(46) cocaine and its metabolites (37), morphine (8),
methadone (3), amphetamine/metoxyamphetamine (2)
buprenorphine (1). In 22 samples presence of more
than one substance was detected. 59 blood samples
(21% of the total), were found positive with the LCMS/MS to THC or THC-COOHH (30), cocaine and
its metabolites (32), morphine and its metabolites (8),
methadone (3), amphetamine/metoxyamphetamine (2),
buprenorphine (1). In 14 samples presence of more than
one substance was detected.
A total of 23 subjects (8,2% of the investigated) reached
the status of psychological and physical deterioration due
to the presence of narcotic substances.
Conclusions: the search for the presence of narcotic
substances to identify violation of motor vehicles code
(art.187) benefits from the availability of urine samples
which give information on acute or chronic intake and help
in the interpretation of the blood samples results for which
great attention must be paid to the time lapse between
request for investigation and sample collection.
575
P293
VALUTAZIONE AUTOMATIZZATA DELL’EMOLISI
DEL CAMPIONE, LA NOSTRA ESPERIENZA
A. Motta, M. Trbos, M. Locatelli
Servizio di Medicina di Laboratorio; Ospedale San
Raffaele, Milano
La valutazione dell’entità dell’emolisi dei campioni inviati
al laboratorio rappresenta un aspetto rilevante della
qualità del dato prodotto dal Laboratorio Analisi.
Spesso questo parametro viene valutato sulla base
dell’esperienza dei singoli operatori che si affidano alla
valutazione visiva del campione con conseguente non
univocità della refertazione prodotta che in molti casi può
determinare errate interpretazioni del risultato analitico
quali ad es. valutazioni di normopotassiemia in campioni
emolizzati.
Nostro scopo è stato quello di adottare una procedura
automatica, indipendente dall’operatore, capace di
valutare il grado di emolisi dei campioni analizzati in modo
standardizzato e di trasferire in modo automatico questa
informazione nella refertazione del dato analitico.
Per ottenere questo risultato, su tutti gli analizzatori
in uso nel Laboratorio di Chimica Clinica (Siemens
Advia 2400, Roche Cobas C501), si è provveduto a
determinare l’indice di emolisi (SI) utilizzando diluizioni
scalari di emoglobina libera (ottenuta da emolisi forzata
di un campione). Su ogni singola diluizione si è
determinato LDH e Potassio fotografando altresì il
campione esaminato.
Questo approccio ci ha permesso di produrre un
documento per evidenziare e sensibilizzare gli operatori
su come le variazioni di questi due parametri siano
correlate alla variazione cromatica del campione, nonché
di definire, con riferimenti bibliografici la gradazione
dell’indice di emolisi (da 0 fino 4 +), così da implementare
degli algoritmi automatici sul middleware del laboratorio
(LabOnline prodotto da Omnilab) utilizzati per aggiungere
commenti standardizzati sia ai test interferiti dall’emolisi
anche lieve (es. LDH e Potassio), sia all’intero campione
in caso di emolisi marcata.
Secondo la nostra esperienza, questo tipo d’approccio,
ha permesso di standardizzare le modalità di refertazione
del campione emolizzato, eliminando il criterio di
soggettività ed assicurando al clinico, un’univoca modalità
interpretativa, evitando possibili errori di tipo diagnostico.
576
P294
POTENTIAL VALUE OF CARTILAGE AND BONE
SOLUBLE MARKERS IN EVALUATING JOINT
DEMAGE IN JUVENILE IDIOPATHIC ARTHRITIS
1
2
4
1
S. Barco , S. Pederzoli , C. Malattia , C. Gatti , I.
1
3
2
2
Gennai , A. Pistorio , G. Consiglieri , M. Dellepiane , D.
2
2
4
1
Beleva , A. Buoncompagni , A. Martini , G. Tripodi , G.
1
Cangemi
1
Gaslini, Genova
2
Pediatria II, Istituto Giannina Gaslini, Genova
3
Servizio di Epidemiologia e Biostatistica, Istituto
Giannina Gaslini, Genova
4
Dipartimento di Scienze Pediatriche, Istituto Giannina
Gaslini, Genova
The potential value of serum biomarkers of bone and
cartilage turnover in Juvenile Idiopathic Arthritis (JIA)
(a heterogeneous group of diseases characterized by
arthritis of unknown origin with onset < 16 years) has
never been explored. The objectives of this work were:
1) To examine associations between soluble biomarkers
of bone (Collagen type I C-Telopeptides, CTX-1) and
cartilage degradation (collagen type I and II cleavage,
C1, 2C and collagen type II cleavage , C2C) and joint
damage as assessed by Conventional Radiography (CR)
and Magnetic Resonance Imaging (MRI) in patients
with JIA 2) To investigate whether these biomarkers
can predict structural damage progression. The clinically
more affected wrist of 88 JIA patients was studied with
CR according to adapted Sharp/van der Heijde score
(SHS) method and MRI by using the OMERACT RAMRI-score, coupled with standard clinical assessment.
One-year CR follow-up was available in 65 patients,
whereas one-year MRI follow-up was available in 51
patients. Serum CTX-I , C1, 2C and C2C were measured
by ELISA (serum crosslaps ELISA purchased by IDS,
Technogenetics, Milano, Italy; C1, 2C and C2C ELISA
by Ibex, Medicalsystems, Genova, Italy) in all patients at
the enrolment and in gender- and age-matched healthy
controls (N= 154). Unlike adults with Rheumatoid Arthritis
(RA), CTX-I, C1,2C and C2C levels were significantly
lower in JIA patients than healthy controls (P<0.0001).
Biomarker levels did not correlate with clinical measure of
disease activity and damage, disease duration and with
Sharp/van der Heijde score (SHS), and RAMRIS bone
erosion score. Median C1,2C and C2C were significantly
higher in patients with structural damage progression
according to JSN (joint space narrowing)-SHS score
compared to patients without progression (C1,2C: 240
ng/ml vs 125 ng/mL, P=0.01; C2C: 133.7 ng/mL vs 65.7
ng/mL, P= 0.001). Unlike RA, patients with radiographic
progression showed significantly lower levels of CTXI (1.03 ng/mL) compared to patients without structural
damage progression (1.53 mg/ml P=0.03). Our results
suggest an inhibition of bone and cartilage turnover in
patients with JIA. Biomarkers of cartilage degradation are
potential predictors of structural damage progression and
severity of disease course.
P295
URINARY HOMOVANILLIC AND
VANILLYLMANDELIC ACID IN HPLC: AGERELATED REFERENCE INTERVALS AND
DIAGNOSTIC PERFORMANCE. REPORT FROM THE
ITALIAN REFERENCE LABORATORY FOR THE
BIOCHEMISTRY OF NEUROBLASTOMA
G. Cangemi, S. Barco, I. Gennai, A. Maffia, L.
Barbagallo, D. Bugnone, P. Bonifazio, M. Talio, G.
Bazurro, G. Tripodi
Laboratorio Centrale di Analisi, Istituto Giannina Gaslini,
Genova
Neuroblastoma (NB) is the most common extracranial
solid cancer in childhood and the most common cancer
in infancy, with an incidence of about 120 cases per
year in Italy. The great majority of NB produces high
levels of homovanillic acid (HVA) and vanillylmandelic
acid (VMA), two catecholamine metabolites derived from
dopamine and norepinephrine respectively. We reviewed
the results of HVA and VMA obtained by the reference
laboratory of the Italian Cooperative Group for NB (Clinical
Pathology Laboratory, Istituto Giannina Gaslini) within
a 7-year period. HVA and VMA were measured by
High Performance Liquid Chromatography coupled to
Electrochemical Detection (HPLC-EC) by using “HVAVMA by HPLC” kit (Bio Rad Laboratories, Milan, Italy).
Internal quality controls (IQCs) were assayed at each
analytical session by using two levels of Lyphocheck
controls (Biorad Laboratories, Milan, Italy). Updated
reference intervals based on age as a continuous variable
were calculated by using a multivariate statistical analysis
from 648 HVA and 671 VMA results from patients in which
the diagnosis of neuroendocrine tumors was excluded.
The diagnostic performance has been established by
calculating their specificity and sensitivity and by receiver
operating characteristics (ROC) curves for different ages
and stages of disease from 169 HVA and 179 VMA
results from confirmed NB patients at the onset of
disease. An optimal threshold was obtained for each
analyte according to the Youden’s index and AUCs were
used to analyse their global performances. The best
diagnostic performance was obtained in stage 4s tumors
and in children < 18 months. By combination of the
two biomarkers the AUCs considerably improved for all
stages, in particular reaching the highest value (AUC=1) in
stage 4s. The AUCs were significantly different in patients
< or > 18 months (0.963 vs 0.923) (P <0.0001) with higher
values for younger patients.
This report provides some useful indications: it confirms
the efficacy of HVA and VMA as diagnostic biomarkers for
NB, it highlights the importance to consider appropriate
age-related reference values and it underlines the
importance to measure both HVA and VMA to improve the
diagnostic performance in NB.
P296
AN USEFUL METHOD FOR UREA NITROGEN
ASSAY IN BRONCHOALVEOLAR LAVAGE FLUID OF
NEONATES
1
1
1
2
K. Pocino , A. Minucci , R. Manieri , G. Conti , D. De
3
1
1
Luca , C. Zuppi , E. Capoluongo
1
Institute of Biochemistry and Clinical Biochemistry,
Catholic University of the Sacred Heart, Rome
2
Pediatric Intensive Care Unit, Department of Critical
Care University Hospital “A. Gemelli”, Catholic University
of the Sacred Heart, Rome
3
Division of Pediatrics and Neonatal Critical Care, South
Paris University Hospitals medical Center “A. Beclere”,
Paris
Background: Bronchoalveolar lavage (BAL) consists
of the infusion of a definite volume of saline and
the subsequent aspiration from a specific lung area.
Aspiration will partially recover both the instilled saline and
the epithelial lining fluid (ELF), which is the component
of interest for the analysis, but a correction for a stable
analyte is needed in order to know the amount of ELF
recovered. In this regard, urea nitrogen is really useful
and it has been proposed to calculate ELF. Currently,
no official analytical method for analyzing urea nitrogen
in BAL fluid has been narrowly described. The goal of
the present study was to develop and validate a new
spectrophotometric method to detect urea nitrogen in
BALF.
Methods: Study included 19 BALF samples obtained from
neonates with different respiratory conditions. Samples
were centrifuged and cell-free supernatants frozen at –
80°C and thawed only once for the experiments. The urea
nitrogen assay was carried out on Cobas c311 analyzer
(Roche Diagnostics).
Results: Validation study shows that the method is
2
perfectly linear (R = 0.999), sensitive (LoD= 0.055 mg/dL;
LoQ= 0.16 mg/dL), repeatable (Low= 0.15±0.02, 13.3%;
High=1.80±0.02, 1.1%), reproducible (Low= 0.14 ± 0.02,
14.2 %; High= 1.76 ± 0.04, 2.2 %) with accuracy ranging
between 93-96%.
Conclusion: Our results support the robustness of
validated procedure since the described method appears
simple, precise, rapid and suitable for routine analysis,
as required in pediatric clinical practice. Moreover, it
can be implemented on other automated instruments for
clinical biochemistry. The use of micro-volumes required
by the method stand for a faultless characteristic to
assay neonatal samples. Thus, it may be used to correct
concentration of various non-cellular BAL component and
calculate their ELF amounts.
577
P297
PEDIATRIC REFERENCE INTERVALS FOR SERUM
COLLAGEN TYPE I C-TELOPEPTIDES (CTX-1) AND
BONE ALKALINE PHOSPHATASE (BAP)
1
2
3
1
I. Gennai , N. Di Iorgi , G. Reggiardo , C. Gatti , E.
2
1
1
1
Bertelli , S. Barco , M. Maghnie , G. Tripodi , G.
1
Cangemi
1
Gaslini, Genova
2
Dipartimento di Scienze Pediatriche, Istituto Giannina
Gaslini, Genova
3
Mediservice, Genova
Bone markers reflect bone remodelling activity. Bone
alkaline phosphatase (BAP) is produced by osteoblasts
and released into the circulation. Serum Collagen Type
I C-Telopeptides (CTX-1) are short fragments of Cterminal domains of collagen cleaved by osteoclasts.
BAP and CTX-1 are specific and sensitive markers of
bone formation and resorption respectively. The changes
in bone markers are influenced by many physiological
factors thus in children they are expected to have higher
values due to high skeletal growth velocity and rapid
bone turnover. The availability of age and sex matched
reference intervals is an unmet need. To date, very few
reports are available and they all suffer from heterogeneity
of analytical methods or pre-analytical factors or consider
very limited age ranges. Establishing reference intervals
in children is challenging as it requires the collection of
large numbers of samples from healthy individuals. To
overcome this limitation we calculated age and sex related
reference intervals by using the large cohort of laboratory
results obtained in a 5-year period in a single centre
obtained from the unselected population of patients. After
accurate outlier selection the results were compared to
those obtained from a population of normal subjects (86
M, 69 F) accurately selected for BMI and any absence
of diseases or therapies that could interfere with bone
resorption. Cases and controls were compared by using
the General Linear Model (GLM) univariate procedure.
Adjusting for age no significant difference exists between
case and control groups in respect to the CTX-1or BAP
both in M and in F. By using this approach we were able
to find accurate reference intervals from a great number
of subjects (2738 CTX-1: 1489 M, 1249 F; 3004 BAP,
1608 M, 1396 F) in children from 6 m to 14 y based
on age as a continuous variable by using a multivariate
statistical analysis. CTX-1 and BAP were measured by
using the Serum Crosslaps and the Microvue BAP ELISA
kit automated on a DSX system (Technogenetics- Bouty,
Milano, Italy). In addition, the results obtained were
validated on different classes of disease where bone
mineralization is impaired.
578
P298
VALUTAZIONE DEL VALORE PREDITTIVO DELLA
MISURA DEL PROGESTERONE SIERICO IN CORSO
DI STIMOLAZIONE OVARICA PER ICSI/FIVET
1
2
1
1
G. Grandi , L. Conti , A. Terreni , A. Ognibene , A.
1
2
Caldini , I. Noci
1
Lab. Generale, Dip. Diagnostica di Laboratorio, AOU
Careggi, Firenze
2
Dip. Fisiopatologia della Riproduzione Umana, AOU
Careggi, Firenze
La principale tecnica di fecondazione assistita è l’Iniezione
Intracitoplasmatica di Spermatozoi/Fertilizzazione In Vitro
con Embryo Transfer (ICSI/FIVET). L’analisi della
letteratura evidenzia dati contrastanti circa la possibile
associazione tra i livelli di progesterone (P) in fase
follicolare tardiva e la probabilità di gravidanza clinica.
Scopo del presente lavoro è quello di valutare
retrospettivamente, in base all’esito della procedura
(gravidanza/non gravidanza) in 434 cicli ICSI/FIVET, il
valore predittivo della misura del P sierico (metodica
ECLIA su Cobas 6000,Roche, Germany) effettuata il
giorno di somministrazione dell’HCG (hCG-day).
Dei 434 cicli, 91 hanno dato origine a gravidanze cliniche
(21%). L’analisi delle caratteristiche dei due gruppi
(rispettivamente gravidanze/non gravidanze), espresse
come media±ds e significatività del t-test, è risultata:
età della donna (aa) 35.2±4.1 e 36,4 ±4,7, p=0,006;
P hCG day (nmol/L) 2.3 ±0.9, 2.3 ±1.1, p=0.365;
embrioni trasferiti (n.) 2.3 ±0.8 e 1.9 ±0.8, p=0,001;
età uomo (anni) 38.5 ±7.1 e 39.6 ±5,7, p=0.025;
indice di massa corporea (Kg/m²) 22.4±3.4 e 22 ±3.9,
p=0.253; spessore dell’ endometrio hCG day (mm) 10.4
±1.9 e 10.5 ±1.9, p=0.495; ovociti ottenuti (n.) 7.5 ±4
e 6.5 ±4.2, p=0.015. Le percentuali delle cause di
infertilità erano sovrapponibili nei due gruppi. La qualità
degli embrioni trasferiti era così distribuita tra i due
gruppi: qualità A 77% e 64.4%, qualità B 20.2% e
26.2%, qualità C 6% e 9.2%, qualità D 0% e 1%.
L’analisi multivariata (Anova, SPSS), in base all’evento
gravidanza/non gravidanza, ha mostrato i seguenti valori
di significatività: età della donna p=0.031, qualità degli
embrioni p=0,034, P hCG day p=0.420. La curva ROC
relativa al P hCG day versus l’evento gravidanza/non
gravidanza, ha evidenziato un’area sottesa di 0.53.
Nella casistica studiata la misura del P hCG day non
ha dimostrato avere un valore predittivo sull’evento
gravidanza, al contrario dell’età della donna e della qualità
degli embrioni trasferiti.
Alla luce di questi risultati, la misura del P hCG day non è
risultata appropriata nel monitoraggio di ICSI/FIVET ed è
quindi stata eliminata dal pannello degli esami richiesti.
Kolibianakis EM, Venetis CA, Bontis J, et al. Curr Pharm
Biotechnol 2012;13:464-70.
P299
ASSETTO EMOGLOBINICO SU SANGUE
CORDONALE IN EMILIA ROMAGNA:POSSIBILI
RIFLESSIONI PER FUTURE APPLICAZIONI
1
2
2
1
M. Sarma , A. Ravani , B. Dolcini , P. Parisi , V.
1
3
1
1
Cerreta , M. Buzzi , R. Mancini , R. Motta
1
U.O., Lab.Centralizzato, Osp. S.Orsola Malpighi,
Bologna
2
U.O., Genetica Medica, Azienda Ospedaliera
Universitaria S Anna, Ferrara
3
U.O., Immunoematologia e Trasfusionale, Osp.
Universitario S. Orsola Malpighi, Bologna
L'analisi dell'assetto emoglobinico è inclusa tra i test
indispensabili all'idoneità al bancaggio del sangue
cordonale Il nostro centro, in collaborazione con la
banca dei tessuti, è il laboratorio di riferimento in Emilia
Romagna dove viene effettuata tale determinazione
Dal 2009 al gennaio 2014 sono stati esaminati 1385
cordoni con la tecnica diagnostica HPLC. La metodologia
permette di rilevare le HbF,HbA2,HbA,HbS HbC e altre
varianti in modo da identificare gli individui omozigoti o
doppi eterozigoti per alcuni tipi di difetto emogloninico
poiché tali cordoni non risultano idonei al bancaggio. La
raccolta del sangue cordonale è sempre associata alla
compilazione di informazioni anamnestiche sui genitori
e sulla gravidanza. Dopo aver studiato 450 cordoni
negativi, sono stati stabiliti intervalli di riferimento interni
per identificare i possibili eterozigoti per alfa e beta
talassemia. In particolare i criteri usati sono:HbA ≤10% e
Hb Barts ≥1% che differiscono lievemente dagli intervalli
di riferimento in uso nella maggior parte dei laboratori. Dei
1385 cordoni esaminati 151 (10,9% dei campioni totali)
sono stati segnalati per effettuare l'esame di II livello di
conferma molecolare. Di questi, 111 sono risultati negativi
(73,5% dei campioni pari al 8% del numero totale di
cordoni esaminati) e 40 positivi per mutazioni dei geni
alfa e beta di cui 3HbS eterozigoti ed 1 HbS omozigote
(rispettivamente il 26,5% dei campioni inviati e il 2,9% dei
campioni totali).
Questi risultati possono dare spunto di riflessione sulla
necessità di istituire tale indagine in età neonatale.
La percentuale di cordoni positivi rilevati nonostante
l'anamnesi di coppia negativa indica che lo screening
in età fertile non garantisce ancora una completa
prevenzione per scarsa sensibilità a questo tipo di
P300
MTHFR C677T ALLELIC VARIANT IS NOT
ASSOCIATED TO PLASMA AND CEREBROSPINAL
FLUID HOMOCYSTEINE IN AMYOTROPHIC
LATERAL SCLEROSIS
1
1
1
1
C. Bellia , G. Bivona , B. Lo Sasso , A. Caruso , F.
1
1
1
2
Bazza , A. Pivetti , C. Scazzone , V. La Bella , M.
1
Ciaccio
1
Dip. Biopatologia e Biotecnologie Mediche e Forensi,
Sez. Biochimica Clinica, Università degli Studi di
Palermo
2
Dip. Biomedicina Sperimentale e Neuroscienze
Cliniche, Università degli Studi di Palermo
Aim: Cerebrospinal fluid (CSF) and plasma Homocysteine
(Hcy) are higher in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS)
patients and they are linked to neurotoxicity by several
mechanisms. The present study aims to evaluate the
impact of MTHFR C677T variant on CSF and plasma Hcy
levels, and investigate the potential association between
MTHFR and ALS clinical variables.
Methods: the study included 69 sporadic ALS patients and
79 neurological controls. CSF and plasma homocysteine
were determined using HPLC; MTHFR C677T genotyping
was performed by Real Time-PCR.
Results: In ALS patients neither plasma nor CSF Hcy
levels were different among CC, CT and TT MTHFR
C677T genotypes (plasma: 11.3 [8.5-15.0], 9.8 [7.1-16.9]
and 8.9 [7.0-12.0], respectively; P=0.36; CSF: 0.4
[0.3-0.6], 0.5 [0.4-0.8] and 0.5 [0.4-0.6], respectively;
P=0.18). Plasma and CSF Hcy levels were correlated
(r= 0.34, P=0.004). No association between MTHFR
C677T and rate of progression, diagnosis according to ElEscorial/WFN criteria, site of onset, and severity of the
disease was reported.
Discussion: Although MTHFR C677T is a well-known
genetic determinant of hyperhomocysteinemia, it is not
associated to the high levels found in ALS, suggesting the
existence of other mechanisms underlying increased Hcy
levels.
Valentino F, Bivona G, Butera D, et al. Elevated
cerebrospinal fluid and plasma homocysteine levels in
ALS. Eur J Neurol 2010;17:84-9.
1
patologia . Recentemente sono emerse anche indicazioni
dalla AIEOP sulla necessità di istituire uno screening
alla nascita orientato ad identificare individui con malattie
ad HbS; le indagini potrebbero essere rivolte anche
a tutti i bambini sotto l'anno di età mai esaminati
precedentemente.
1. Giordano P. Prospective and retrospective primary
prevention of Hemoglobinopathies in multiethnic
societies. Clin Biochem 2009;42:1757-66.
579
P301
SERUM LIPID AND ANTIPHOSPHOLIPID
ANTIBODIES PROFILES IN DIFFERENT PHASES OF
MULTIPLE SCLEROSIS
1
2
1
C. Mandoj , T. Koudriavtseva , G. Cigliana , E. De
1
3
3
1
Santis , G. D’Agosto , P. Cordiali-Fei , L. Conti
1
Clinical Pathology, Regina Elena National Cancer
Institute, IFO, Rome
2
Multiple Sclerosis Center, Neurology Unit, Regina
Elena National Cancer Institute, IFO, Rome
3
Clinical Pathology and Microbiology, San Gallicano
Dermatology Institute, IFO, Rome
Background: Multiple sclerosis (MS) is an inflammatory
demyelinating disease of the central nervous system.
Cholesterol homeostasis is important for formation and
maintenance of myelin and axonal membranes in
the CNS. Emerging evidence indicates that there is
an association between lipoproteins and cholesterol
metabolism and MS disease progression. An increased
frequency of immunological abnormalities including
presence of antiphospholipid antibodies have shown in
MS patients, nevertheless the pathogenic role of these
antibodies remains not fully clarified.
Objective: We aimed to investigate serum lipid profile
and rate of positivity for anti-phospholipid antibodies
in different MS phases, as well as to explore their
relationships.
Methods: We included 100 consecutive MS patients
which were assigned to three groups: 16 secondaryprogressive patients (SPMS), 58 relapsing-remitting
patients in remission (REM) and 26 patients in relapse
(REL). Their sera were tested for total cholesterol
(TC), high and low density lipoproteins (HDL, LDL),
triglyceride (TG) and Lipoprotein(a) levels as well as for
antibodies anti-cardiolipin, anti-beta2-glycoprotein-I, antiprothrombin, anti-annexinV (IgG and IgM) by enzyme
immunoassays. SPSS software was used for all statistical
evaluations.
Results: High TC levels were more prevalent in SPMS
patients than other patient groups (p=0.05). The REL
group had significantly higher rates of positivity for aβ2GPI
IgM (p<0.0001), aPT IgG and IgM (for both p=0.05)
than the other patient groups. A significant positive
correlation was found between age and both TC (p=0.006)
and LDL-C (p=0.0001) levels, between EDSS and both
TC (p=0.01) and LDL-C (p=0.007) levels, and between
disease duration and LDL-C (p=0.024) levels. We found
the presence of aAnV IgG to be significantly associated
with high levels of TC (p=0.002) and LDL-C (p=0.03).
Conclusions: Our results together with those of other
studies support the working hypothesis that the
thrombogenic mechanisms associated with an abnormal
lipid pro#le could contribute to MS progression through
diverse processes at vascular endothelium of the
blood brain barrier. However, further studies with larger
populations are needed to confirm our data.
580
P302
ABNORMAL CYTOKINES LEVELS ARE RELATED TO
VITAMIN D DEFICIENCY IN MYOTONIC DYSTROPHY
TYPE 1
1
1
1
C. Terracciano , M. Nuccetelli , C. Russo , E. Rastelli
2
2
1
1
2
, M. Gibellini , M. Morello , R. Zenobi , R. Massa , S.
1
Bernardini
1
Dip. di Medicina Sperimentale e Chirurgia, Università di
Tor Vergata, Roma
2
Dip. di Medicina dei Sistemi, Università di Tor Vergata,
Roma
Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is the most common
adult form of muscular dystrophy. DM1 is an inherited,
multi-systemic disorder affecting skeletal muscle as well
as eye, heart, central nervous and endocrine systems.
We recently demonstrated a reduction of circulating 25hydroxyvitamin D (25(OH)D) in DM1 patients, which
1
correlates with genotype and proximal muscle strength .
In vitro and animal studies suggest that vitamin D has
modulating effects on pro-inflammatory cytokines; median
circulating 24h levels of interleukin-6 (IL-6) and TNF-alpha
(TNFα) has been found increased in DM1.
To verify a relationship between vitamin D and proinflammatory cytokines in DM1, we measured serum
levels of 25(OH)D, IL-6 and TNFα in 12 patients with
DM1, at baseline and after 6 months of treatment with
high doses (100.000 UI per month) of cholecalciferol, and
in 10 healthy age-matched controls. A chemiluminescent
immunoassay was used to assess 25(OH)D levels,
while commercially available sandwich enzyme-linked
immunosorbent assays (ELISA) were used to evaluate
IL-6 and TNFα serum levels.
In DM1 patients, levels of IL-6 and TNFα showed a
significant increase compared to controls (p values <0.05)
and when DM1 and controls groups were combined,
there was a significant inverse correlation between vitamin
D and both IL-6 and TNFα levels (r=-0.45 and -0.55,
respectively, p values <0.05). The 6-month vitamin D
supplementation did not modified IL-6 and TNFα levels in
DM1 patients.
In conclusion, in DM1 patients there is an increase of
circulating pro-inflammatory cytokines and it seems to
be related to vitamin D deficiency. A longer therapy
with cholecalciferol need to be administrated to DM1
patients to verify a potential beneficial effect of vitamin D
supplementation on pro-inflammatory cytokines levels.
IL-6 and TNFα have been also linked to metabolic
disorders (including obesity and insulin-resistance), so
further studies are necessary to ascertain whether the
high levels of IL-6 and TNFα might contribute to the
metabolic-endocrine dysfunctions typical of the DM1
pathology.
1. Terracciano C, Rastelli E, Morello M, et al. Vitamin
D deficiency in myotonic dystrophy type 1. J Neurol
2013;260:2330-4.
P303
TAU AND pTAU ASSAY IN NASAL SECRET FROM
PATIENTS WITH HYPOSMIA AND ANOSMIA
1
1
P304
GENDER-RELATED ASSOCIATION OF FOKI
POLYMORPHISM IN THE VITAMIN D RECEPTOR
GENE AND CONVENTIONAL RISK FACTORS WITH
LUMBAR SPINE PATHOLOGIES
1
M. Nuccetelli , A. Crisanti , G. Sancesario , V.
1
1
1
2
Botteri , C. Terracciano , E. Xhemalaj , D. Passali , S.
1
Bernardini
1
2
3
A. Colombini , M. Brayda-Bruno , L. Ferino , G.
1
3
4
3
Lombardi , V. Maione , G. Banfi , S. Cauci
1
Dip. di Medicina Sperimentale e Chirurgia, Università di
Tor Vergata, Roma
2
Dip. ENT, Università di Siena, Siena
Hyposmia and anosmia are, respectively, partial and total
affections of the olfactory tract related to neuronal damage
and often associated to neurodegenerative diseases
1
such as Parkinson Disease and Alzheimer Disease .
Tau protein and phosphoTau protein assays in Cerebro
Spinal Fluid (CSF) are used as routine tests at Tor
Vergata University Hospital for the diagnosis of Alzheimer
Disease. Due to the difficulty and to the risk involved in the
lumbar puncture, we tried to assay Tau and pTau levels
from an easily available biologic fluid: nasal secret.
Twenty-one patients with hypo/anosmia were enrolled
by “Azienda Ospedaliera Universitaria Senese” (10 posttraumatic, 7 post-viral, 2 post-chemicals exposition, 2
Parkinson Disease) together with 13 sex and agematched healthy controls.
Bilateral nasal wash was obtained by 5 ml phosphate
buffer saline solution (PBS) nebulization through
a Rinowash device. Samples were then analyzed
with commercially available sandwich enzyme-linked
immunosorbent assays (ELISA)(Innotest, Innogenetics,
Ghent, Belgium).
Results show that Tau and pTau levels in nasal wash
were not detectable, except for a sample with a pTau
concentration of 16 pg/mL that was surprisingly a control.
These data could be explained by a total absence of the
protein in the samples or by protein concentrations below
the kit analytical limit (pTau: 15 pg/mL; Tau: 87 pg/mL).
On the basis of one positive result, our future perspectives
will be focused on the improvement of the samples
suitability. For example we suggest to use smaller PBS
solution volumes and to separate the nasal wash from
each naris. Moreover, kit sensitivity could be increased
by loading a higher quantity of samples on the Elisa plate
and, above all, samples number should be increased
especially with patients affected by neurodegenerative
diseases.
In conclusion, we can hypothesize that Tau and pTau
protein Elisa assays on nasal washing solutions could be
used as an early biomarker for the neurodegenerative
diseases diagnosis and to evaluate the pharmacological
therapy efficacy. Moreover, it is interesting to monitor the
only sample with a detectable pTau value, to verify if it will
develop a Tau-related pathology.
1. Albers MW, Tabert MH, Devanand DP. Olfactory
dysfunction as a predictor of neurodegenerative disease.
Curr Neurol Neurosci Rep 2006;6:379-86.
1
Lab. Experimental Biochemistry and Molecular Biology,
I.R.C.C.S. Istituto Ortopedico Galeazzi, Milano, Italy
2
Dept. Orthopedics and Traumatology – Vertebral
surgery III – Scoliosis, I.R.C.C.S. Istituto Ortopedico
Galeazzi, Milano, Italy
3
Dept. Medical and Biological Sciences, University of
Udine, Udine, Italy
4
Dept. Biomedical Sciences for Health, University of
Milano, Milano, Italy
Alterations in vitamin D homeostasis, mainly involving
its nuclear receptor (VDR), could have a role in the
pathophysiology of the spine. FokI polymorphism in
the vitamin D receptor gene (VDR) and conventional
behavioral and environmental risk factors were associated
with spinal disorders in the Italian population, but,
to our knowledge, no study explored the association
of VDR-FokI polymorphism (rs2228570, wild F allele,
C nucleotide; mutated f allele, T nucleotide) and
conventional non-genetic risk factors predisposing to
lumbar spine pathologies according to gender. The aim
of this study was to evaluate in Italian males and females
the VDR FokI polymorphism frequencies distribution in
subjects with clearly defined lumbar spinal pathologies
compared to asymptomatic controls and to analyze the
interplay of genetic and conventional risk factors. 267
(149 males, 118 females) patients with lumbar spinal
disorders assessed by Magnetic Resonance Imaging and
254 (127 males, 127 females) asymptomatic controls
were enrolled. The exposition to putative risk factors was
evaluated and FokI polymorphism was detected by PCRRFLP. In male patients only we observed an association
between the pathological phenotype and higher age,
overweight, family history, lower leisure physical activity,
smoking habit, higher number of hours/day exposure to
vibration and physical job demand more than sedentary
or intense. Contrariwise in females only higher age,
overweight, family history and lower leisure physical
activity were risk factors. A major gender-related effect
was evidenced also regarding VDR-FokI polymorphism.
The FF genotype was a 2-fold risk factor to develop
discopathies and/or osteochondrosis concomitant with
disc herniation for both gender patients, while the
heterozygous Ff was protective for females only. In males
only, the ff genotype was protective for discopathies
and/or osteochondrosis and the F allele was a 2-fold
risk factor for hernia, discopathies, discopathies and/or
osteochondrosis.
In conclusion, the sex-related differences in voluntary
behaviors, exposure to environmental risks and genetic
background could be crucial for a gender differentiated
management of patients with spine disorders.
581
P305
UN CASO “INDIMENTICABILE” DI
AVVELENAMENTO TRANSCUTANEO DA
SUPERWARFARINA: RUOLO E RESPONSABILITÀ
DEL LABORATORIO
Y. Pancione, M. Fumi, S. Sale, V. Rocco
UOC Patologia Clinica, A.O.R.N. G. Rummo di
Benevento
Introduzione: I rodenticidi più usati sono le Superwarfarine
che hanno potenza 100 volte superiore alla warfarina
ed emivita plasmatica variabile da 20 a 60 giorni.
La coagulopatia che deriva dall’avvelenamento con tali
sostanze può essere prolungata per la lenta dismissione
epatica. Negli adulti, le esposizioni possono essere
intenzionali, accidentali o sconosciute.
Scopo del lavoro: Corretto inquadramento di un paziente
di 37a giunto in PS alle h 01.45 per gengivorragia ed
ematuria.
Metodologia: L’anamnesi non rilevava diatesi emorragica.
I dati di laboratorio fornivano: PLT=228.000/mmc, PT
INR >10.0; aPTT Ratio 2.38; Fibrinogeno 275 mg%
(150-400mg%); AT III 98% (80-120%;D-Dimeri 61ng/
mL (<400 ng/mL). Alla luce di questi risultati, in PS
veniva somministrata 1 fiala di vit. K (Konakion) e
acido tranexamico. Alle h 7.00 un successivo controllo
evidenziava un miglioramento dei parametri coagulativi
(PT INR 1,5; aPTT ratio 1,29) che faceva supporre che
la terapia era stata efficace e quindi il paziente fosse
in TAO non riferita. Un controllo eseguito alle h 17.00
faceva rilevare un peggioramento dei tempi (PT INR 3,2;
aPTT ratio 1,5) che non correlava con l’attesa correzione
da vit. K. La responsabilità ed il ruolo del patologo
clinico imponevano l’esecuzione del Test di Miscela che
confermava il deficit di Fattore/i con successivo rilievo di
un deficit dei Fattori Vit. K-dipendenti (FIX10%; FX5%;
FII5%; FVII <1%). Veniva suggerita una più approfondita
anamnesi per sospetto di ingestione(casuale?)di “veleno
per topi”.
Risultati: Mentre il paziente negava l’assunzione
volontaria o accidentale del prodotto (Broditop:
Brodifacoum 0,005%), rivelava che tuta e guanti con
cui era stato sparso erano stati più volte usati senza
essere lavati. Con il sospetto clinico e con la certezza
del patologo della intossicazione, veniva instaurata una
terapia quotidiana con Vit. K che portava alla correzione
della coagulopatia. La interruzione graduale dopo 3 mesi
confermava la guarigione con normalizzazione del PT.
Conclusioni: In pazienti emorragici è importante
considerare la possibilità di coagulopatie secondarie
alla tossicità da superwarfarine, anche senza una nota
esposizione o ingestione orale, anche in virtù di rarissimi
casi riportati in letteratura.
Bibl.
Chua JD, Friedenberg WR. Superwarfarin poisoning. Arch
Intern Med 1998;158:1929-32.

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