42° Congresso Nazionale SIBioC

Transcript

42° Congresso Nazionale SIBioC - Riassunti Poster
001
ACCURATEZZA DELLA DETERMINAZIONE
DELL’EMOGLOBINA TOTALE IN CO-OSSIMETRIA
NELLA GESTIONE DEL PAZIENTE ANEMIZZATO
002
CLINICAL AND ANALYTICAL EVALUATION OF THE
EPOC BLOOD-GAS ANALYZER
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G. Introcaso , S. Faini , P. Rumi , M. Raggi , A.
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Cavallero
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U.O. Medicina di Laboratorio - Centro Cardiologico
Monzino, Milano
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U.O. Terapia Intensiva Post-Operatoria - Centro
Cardiologico Monzino, Milano
Introduzione: Gli emogasanalizzatori Point of Care
(POC) misurano oltre ai parametri di emogasanalisi
anche l’emoglobina totale. Scopo del presente lavoro è
stato valutare l’attendibilità della misura dell’emoglobina
effettuata con CO-ossimetro e il suo possibile utilizzo nella
valutazione dello stato di anemizzazione del paziente
nell’immediato periodo post-operatorio.
Metodi:
Sono
state
effettuate
determinazioni
dell'emoglobina totale ed ematocrito su 120 campioni
prelevati da pazienti ricoverati in Unità di Terapia
Intensiva Post-Operatoria cardiochirurgica (Tipo). I
campioni, prelevati al letto del paziente utilizzando
siringhe eparinate, sono stati analizzati utilizzando il
CO-ossimetro GEM PremierTM 4000 (Instrumentation
Laboratory). Entro 30 minuti dal test è stato eseguito un
secondo prelievo in EDTA ed inviato in laboratorio per
l’esame emocromocitometrico eseguito su sistema HMX
(Beckman Coulter). I dati complessivi sono stati analizzati
tramite regressione lineare, determinando l’accuratezza
relativa con grado di associazione e grado di accordo.
Risultati: Dal protocollo di confronto tra metodi abbiamo
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ottenuto i seguenti risultati: y=1.0604x-0.4088 r = 0.96,
r= 0.98 (p<0.0001), DS dei residui= 0.2; è stato calcolato
uno scostamento sistematico assoluto (bias) per 4 valori
di emoglobina: 7, 8, 9, 10 g/dL, bias= 0, 0, 0.1,0.2 g/dL
rispettivamente. Abbiamo ottenuto la seguente equazione
di regressione dell’ematocrito misurato: y= 1.1048x –
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2.3458, r = 0.87. Per quattro valori di ematocrito pari a 21,
24, 27, 30% il bias dell’ematocrito misurato su Gem è stato
0.2, 0.1, 0.4, 0.8% rispettivamente; il bias dell’ematocrito
calcolato è stato 1, 1, 1.6, 2% rispettivamente. Il
coefficiente di correlazione dell’ematocrito misurato è
risultato r= 0.93 e dell’ematocrito calcolato r= 0.97
(p<0.0001).
Conclusioni: La misura dell’emoglobina totale POC si
è dimostrata attendibile e con accuratezza elevata
nella gestione dei pazienti anemizzati dopo intervento
cardiochirurgico. Nella valutazione dell’anemizzazione il
dato dell’emoglobina può, quindi, essere utilizzato in
modo prioritario dai clinici.
Bibliografia: Beneteau-Burnat B et Al. Evaluation of the
Gem PremierTM 4000: a compact blood gas CO-Oximeter
and electrolyte analyzer for point-of-care and laboratory
testing. Clin Chem Lab Med 2008; 46(2):271-9.
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S. Viganò , G. Vettore , S. Spadaro , M. Zilio , N. Di
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Vitofrancesco , F. Navoni , P. Carraro
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Dip. Interaziendale Pronto Soccorso, A.O. e ULSS 16,
Padova
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Dip. Interaziendale Medicina di Laboratorio, A.O. e
ULSS 16, Padova
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Alere S.R.L., Scorzè, Venezia
The analyzer “Epoc Blood Analysis” (Alere Srl, Venice, I)
is a bedside single cartridge system for the determination
of blood gases, electrolytes and glucose. It provides
results on blood samples in 0,5-3 minutes. It consist of a
base unit for the analytical process and a handheld palm
wireless connected PC that can receive the data near the
patient. Our study assessed the analytical performance
and potential clinical efficacy of this tool.
Materials and methods: 112 consecutive patients who
accessed the accident and emergency department, were
qualified as ‘critical’ and needed arterial blood gases.
36% of these subjects were identified as red code priority
on triage and 64% as yellow code. The most common
clinical presentations were: dyspnea 36%, chest pain
20%, palpitations or arrhythmias 11%, fever or sepsis 4%;
in one case the patient had acute myocardial infarction.
The variables examined were pH, pCO2, pO2, hematocrit,
Na, K, ionized calcium, glucose. Readings from the
Epoc instrument were compared to those of a reference
Rapidpoint 405 (Siemens Healthcare Diagnostics, Milan)
instrument. Timeliness and therapeutic benefit from the
possibility to obtain the results earlier on the Epoc
instrument served as outcomes.
Results: The correlation coefficients vs. reference
instrument for pH, pCO2, pO2, K, glucose results were
higher than 0.96. The imprecision level was consistent
with the state of the art for these tests. Sigma performance
metrics provided a value above 3 for the main variables.
There was definite clinical benefit deriving from earlier
treatment in 13% of patients, probable benefit in 42%.
Conclusion: The Epoc Blood Analysis can be safely
applied within the context of critical care and results in
more timely treatment if a blood gas analyzer is not
already available.
biochimica clinica, 2010, vol. 34, n. 5
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003
IMPORTANZA DELLA PRE-ANALITICA NEL
DOSAGGIO DI ELETTROLITI ED EMOGLOBINA:
CONFRONTO TRA DIFFERENTI METODICHE ED
IMPLICAZIONI PER I POCT
004
LA GESTIONE DEI GLUCOMETRI NELL’AZIENDA
OSPEDALIERA BOLOGNINI DI SERIATE A
CONTROLLO REMOTO IN LABORATORIO
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M. Vidali , G. Tornotti , P. Zumaglini , C. Cerutti , G.
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Bellomo
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Lab. di Ricerche Chimico-Cliniche, A.O.U. Maggiore
della Carità, Novara
I sistemi del Point-Of-Care Testing (POCT) attualmente in
commercio consentono la misurazione di un ampio range
di analiti, utilizzando in molti casi gli stessi principi analitici
delle strumentazioni convenzionali di un Laboratorio
Analisi. In questo lavoro abbiamo confrontato i valori di
sodio, potassio ed emoglobina misurati tramite sistema
POCT e strumentazione automatica del Laboratorio, al
fine di valutare l’intercambiabilità dei metodi analitici
utilizzati e l’effetto di eventuali errori pre-analitici.
3719 campioni (gen-dic 2009) sono stati analizzati
per
emoglobina
(Hb)
ed
elettroliti
sia
su
strumentazione automatica (ADVIA/Sysmex), sia con
emogasanalizzatore Radiometer ABL725, entrambi
localizzati presso il Laboratorio Analisi dell’Azienda. Per
il confronto è stata utilizzata l’analisi di Bland-Altman,
la regressione parametrica di Deming e quella nonparametrica di Passing-Bablok (Linguaggio R ver. 2.10.1,
Analyse-it ver. 2.21).
Per il sodio ed il potassio l’analisi ha evidenziato
una differenza media (bias) tra i 2 metodi utilizzati
rispettivamente di 0,0 e 0,21 mmol/l con limiti di accordo
al 95% compresi tra -5,8 e 5,8 mmol/l e tra -0,37 e 0,78
mmol/l. Tale intervallo, pur compatibile con la variabilità
analitica dei due metodi in studio, risulta lievemente
maggiore di quella riportata in ambito internazionale.
Relativamente al potassio l’analisi di regressione ha
evidenziato la presenza di errore sistematico costante
e proporzionale. Per l’emoglobina è stata evidenziata la
presenza di importanti componenti di errore casuale (bias
medio 0,84 g/dl, 95% limiti di accordo da -1,41 a 3,08 g/dl)
e sistematico, come suggerito dall’analisi di regressione
(intercetta -0,70 (95%IC da 0,98 a -0,43) p<0,0001;
pendenza 1,13 (95%IC da 1,11 a 1,15) p<0,0001).
Il nostro studio mostra una buona intercambiabilità
dei metodi per il sodio e, in misura minore, per il
potassio, evidenziata da limiti di accordo entro o vicini
a valori riportati in letteratura o comunque clinicamente
accettabili. Per l’emoglobina si sono osservati, al
contrario, limiti di accordo eccessivamente estesi,
suggerendo la necessità di investigare attentamente
i possibili fattori, in particolare pre-analitici, che
contribuiscono ad aumentare l’errore casuale e quello
sistematico.
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C. Perani , A. Stoppini , L. Auriemma , G.
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Tiraboschi , A. Finazzi , A. Panna , R. Marchetti , L.
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Lorusso , P. Barboglio , A. Vender
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Medicina di Laboratorio, A.O. Bolognini di Seriate
Obiettivi: implementare un' unica tipologia di glucometri
nei reparti di degenza e negli ambulatori dell’Azienda
Ospedaliera Bolognini di Seriate con garanzia di utilizzo
secondo le specifiche di qualità del Servizio di Medicina
di Laboratorio ( DGR Regione Lombardia 3313 del
2.2.2001 ) e con controllo remoto in Laboratorio.
Dopo aver rilevato le necessità, attivato i punti rete,
espletato una gara in service, si sono implementati
nelle U.O e negli Ambulatori dei 4 Presidi Aziendali
46 glucometri identici STAT-STREP ditta GEPA. Si
è rilasciata la password di utilizzatore al personale
infermieristico formato e sono state identificate due
persone di laboratorio per ogni presidio(tecnico e biologo /
medico)a supporto per eventuali necessità e dotato ogni
presidio di uno strumento di back-up. E’stata preordinata
una procedura per l’identificazione del paziente attraverso
lettura codice nosografico/codice fiscale e per il corretto
utilizzo strumentale, con gestione su ogni strumento di
due CQI nelle 24 ore, un controllo di linearità ogni tre mesi
e adesione alla VEQ.
Risultati: unica tipologia strumentale in uso nelle 43
U.O/Ambulatori dell’Azienda , unica procedura operativa
rilasciata dalla Medicina di Laboratorio e adottata da
733 utilizzatori formati e autorizzati. Verifica giornaliera
in laboratorio dell’attività di reparto/ambulatorio con
tracciabilità sistematica dell’operatore, dei dati analitici,
del CQI ; emissione di un referto cumulativo per ogni
paziente. Il numero delle glicemie determinate in Azienda
negli ultimi 12 mesi è di 118.000 ; il Bias calcolato sulla
media dei risultati di un mese rispetto alla media di
consenso dell’intera installazione è sempre inferiore al 5%
per il livello 1 (x = 59 mg/dL) 2 ( x =107 mg/dL ) 3 (x= 288
mg/dL . L’imprecisione mostra un CV medio del 5 % per
livello 1 e un CV medio de 4.5% per livelli 2 e 3.
Bibliografia: P.Cappelletti - La logica organizzativa del
point of care testing:gli elementi per la progettazione Riv
Med Lab JLM, Vol 2,N1,2001
005
POCT: UN PROCESSO DA GOVERNARE ANCHE
CON L'INFORMATICA
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006
UN MODELLO TECNICO E ORGANIZZATIVO PER LA
GESTIONE INTEGRATA DI DIFFERENTI TIPOLOGIE
DI STRUMENTAZIONE POCT
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V. Granero , M.R. Cavallo , E. Richetta , D.
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Fortunato , M. Lasina , M. Pastorelli , G.A. Cibinel , G.
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La Valle , G.l. Crudo
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Lab. Analisi di Pinerolo ASL TO3
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Direzione sanitaria Osp. Riuniti di Pinerolo ASL TO3
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Rianimazione ASL TO3
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Medicina d'urgenza ASL TO3
Scopi e Obiettivi
Il progetto di riorganizzazione della rete dei POCT del Ns.
Ospedale ha come obiettivi: garanzia di appropriatezza,
qualità pre-analitica,identificazione e rintracciabilità
univoca nell’intero processo, dall’approvvigionamento alla
refertazione.
Metodologia
Costituita la commissione POCT ,tracciato il diagramma
di flusso per il governo del processo si sono definite le
responsabilità. Fondamentale, per gestire effettivamente
il controllo dell’intero processo, è una rete informatica di
colleghi i diversi sw.
Risultati
Abbiamo iniziato questa attività di governo del processo
POCT sperimentando le possibili soluzioni sulla rete degli
EGA
L’implementazione del sw gestionale Radiance De Mori
ha reso possibile il controllo e monitoraggio in tempo
reale, garantendo l’acquisizione e la tracciabilità dei dati
(Risultati, CQ e allarmi) mediante la sincronizzazione
continua tra i sistemi. L’accesso al sw avviene mediante
browser (Internet Explorer), pertanto da qualsiasi PC
in rete è possibile governare il POCT senza dover
necessariamente installare PC aggiuntivi.Le integrazioni
informatiche e la gestione dei vari EGA di reparto
garantiscono una corretta identificazione del paziente
nonché una appropriata archiviazione del referto prodotto
dal LA e firmato digitalmente tramite il proprio sw. È
stato possibile introdurre la gestione degli Operatori con
i relativi permessi di accesso anche in un contesto
ospedaliero di elevato turn-over.Da qualsiasi PC infatti
come Amministratore di sistema si ha la possibilità di
creare/abilitare/disabilitare ogni singolo.
Considerazioni conclusive
Tutto ciò ha permesso l’effettiva gestione della rete POCT
EGA e di:
- Gestire l’accesso all’uso dello strumento per il personale
abilitato, mediante identificazione automatica con codice
a barre;
- Identificare eventuali operazioni improprie sulla
strumentazione;
- Individuare e monitorare la corretta e periodica
formazione ed addestramento del personale;
- Individuare eventuali avventi avversi, per il
miglioramento continuo della Qualità, con l’obbiettivo della
minimizzazione del Rischio Clinico e Biologico
- Estendere questa esperienza al sistema POCT
emocromi e appena possibile a quello dei glucometri
Bibliografia: ISO 22870:2006
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A. Motta , M. Locatelli , F. Dorigatti
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Diagnostica e Ricerca San Raffaele -LABORAFIRCCS Osp. San Raffaele, Milano
Introduzione: la gestione della strumentazione POCT
rappresenta una grossa sfida organizzativa per il
laboratorio chiamato a guidare la valutazione e la
scelta della strumentazione analitica a gestirla ed ad
integrare i dati prodotti all’interno della storia clinica del
paziente. Queste attività richiedono Personale dedicato
alla gestione e al monitoraggio della strumentazione,
l'utilizzo di differenti software gestionali in ragione delle
diverse tipologie di strumenti POCT e l’implementazione
di soluzioni architetturali informatiche complesse e di non
facile manutenzione.
Obiettivo: realizzare un sistema di controllo software
indipendente dal fornitore di strumentazione POCT,
capace di gestire le problematiche strumentali
(malfunzionamenti, QC, ecc...) integrato con il sistema
gestionale del laboratorio (LIS)ed ospedaliero (HIS),
aperto a soluzioni informatiche innovative ed in grado
di misurare il numero delle prestazioni eseguite con la
strumentazione POCT.
Materiali e metodi: è stato acquisito il software
POCcelerator, middleware per l’integrazione di
strumentazione analitica, prodotto da Conworx e
distribuito da Siemens,sono stati acquisiti i seguenti
modelli di analizzatori in uso o in valutazione presso
l’IRCCS Ospedale San Raffaele: 22 emogasanalizzatori
RapidPoint 400/405, 1 analizzatore Clinitek,1 DCA 2000
Avantage,1 coagulometro ITC Haemocron Signature
Elite, 1 glucometro Accu-chek, 1 glucometro Nova StatStrip.
Risultati: tutti gli analizzatori sono stati messi in
rete e connessi al middleware POCcelerator così da
monitorarne la funzionalità(gestione controlli di qualità,
errori strumentali ecc.) ed intervenire, in caso di
malfunzionamenti, per escluderne l’utilizzo.E’ possibile
ricevere i risultati relativi ai pazienti degenti e integrarli
con il LIS e HIS. POCcelerator permette di rilasciare i
campioni che provengano da strumentazione attiva, in
regime di controllo di qualità e di tracciare tutti gli eventi
legati all’esecuzione di analisi con strumentazione POCT
(utente, analizzatore, SID/PID).
Conclusioni: il software utilizzato, configurandosi come
reale middleware soddisfa tutte le necessità previste
per la gestione integrata della strumentazione POCT,
permettendo di monitorare in modo centralizzato le
performance di ogni singolo strumento e di integrare i dati
dei pazienti con il LIS ed HIS.
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007
SENSIBILITA’ CLINICA DI DIFFERENTI
ANALIZZATORI EMATOLOGICI NELLA PATOLOGIA
LINFOPROLIFERATIVA
008
LA TECNOLOGIA WEB AL SERVIZIO DELLA
MEDICINA DI LABORATORIO
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V. Brescia , A. Mileti , E. Cleopazzo , A. Lopello , A.
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Verna , L. Cazzato , F. Di Serio
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Lab.di Patologia Clinica I, Osp. Policlinico, Bari
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Servizio Immuno Trasfusionale, Osp. Policlinico, Bari
Negli ultimi anni sono stati prodotti e commercializzati
analizzatori ematologici per l’esecuzione dell’esame
emocromocitometrico decentralizzato (POCT) in grado
di eseguire il conteggio leucocitario differenziale (LD)
completo.
Scopo del lavoro. Valutare la sensibilità clinica intesa
come generica capacità di distinguere i campioni
normali da quelli patologici, e l’attendibilità degli allarmi
nel segnalare la presenza di definite tipologie di
cellule immature o atipiche, in soggetti con patologie
linfoproliferative.
Materiali e Metodi. Sono stati valutati 20 soggetti
“normali” (utilizzati per la verifica dell’intervallo di
riferimento), 20 campioni con linfopenia non “allertata”,
20 campioni con linfocitosi “ allertata”. L’esame
emocromocitometrico è stato eseguito su analizzatori
ematologici Advia 2120 (Siemens) e Cell Dyn Sapphire
(Abbott) e su analizzatore POCT Abacus Junior. La
metodologia utilizzata per la valutazione ha seguito le
indicazioni riportate dallo standard NCCLS H20-A per la
LD (1). Il metodo di riferimento microscopico (M.O.) per il
conteggio LD ha previsto la media di 2 conte in cieco su
200 cellule. Per lo studio sono stati eseguiti test statistici
di base, studi di correlazione e comparazione (BlandAltman).
Risultati. Il metodo microscopico e gli analizzatori
ematologici hanno mostrato ottime correlazioni nel calcolo
dell’intervallo di riferimento (r > 0,83) e nella valutazione
della linfopenia “non allertata” (r > 0.95). La valutazione
dei campioni con linfocitosi “allertata” ha evidenziato
ottime correlazioni tra analizzatori (r > 0.97) relativamente
alla conta linfocitaria assoluta.
Conclusioni. Lo studio evidenzia che sui campioni
“normali”, linfopenici “non allertati” e con linfocitosi
“allertata” vi è una buona correlazione tra i metodi per la
conta linfocitaria assoluta. Il metodo POCT, non fornendo
il citogramma e gli allarmi morfologici correlati non risulta
sufficientemente utile per la corretta interpretazione dei
quadri di linfocitosi.
1.CLSI/NCCLS: Reference Leukocyte (WBC) Differential
Count (Proportional) and Evaluation of Instrumental
Methods; Approved Standard-Second Edition. H20-A2.
ISBN 1-56238-628-X. ISSN 0273-3099; 2/29/2008.
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I. Giambini , I. Vignoli , G. Federici
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Dip. Medicina di Laboratorio, Policlinico Tor Vergata,
Roma
Tecnologia WEB significa distribuzione delle informazioni
in rete geografica. Non è necessario cablare o prevedere
reti di grandi capacità. Il LIS acquisito dalla nostra struttura
usufruisce di tutte le tecnologie destinate al mondo
Internet: Cellulari, Palmari, Navigatori satellitari, PC; e
delle tecniche di interconnettività wireless: GRPS – UMTS
– HSDPA, WiFi/WiMax, Bluetooth Rev e 2.
Il LIS integra nativamente, all’interno della sua piattaforma
(Nell’Application server, più specificatamente) un Web
server sempre attivo e particolarmente adatto per la
gestione dei dati dai punti di periferia del sistema. Anche
le interfacce WEB sono più che adattabili alle esigenze
dell’Utente e sono disegnate dall’Amministratore del
sistema mediante tools visuali.
Il LIS, facendo leva sulla leggerezza del codice Java e
sulla potenza dell’ambiente stesso. Consente la gestione
totale dei dati clinici di laboratorio e la loro distribuzione
ovunque sia presente una connessione Internet.
Il sistema utilizza il protocollo [HTTPS]. Questo tipo di
comunicazione garantisce che solamente i client ed il
server siano in grado di conoscere il contenuto della
comunicazione e fornisce un’ottima protezione contro
eventuali intercettazioni dei dati in transito da e verso il
DataBase.
Il sistema è pienamente aderente agli standard IHE, i
principali protocolli supportati nativamente sono: ASTM;
HL7; CIC; DICOM; ASCII; PL/SQL.
Il sistema è una suite integrata di applicativi per
consentire la massima flessibilità e semplicità di
utilizzo: Laboratorio, Centro Prelievi, Accettazione
Richieste, Controllo di Qualità, Magazzino, Firma
Digitale, Statistiche, WEB, Sieroteca, Sistema Esperto
di Validazione, Microbiologia, Modulo Amministrativo,
Modulo di gestione dell’autoimmunità, Modulo connettività
aggiunto per la gestione dei Pazienti TAO.
Tutte queste funzionalità sono da pensarsi nello stesso
ambiente grafico. L’Amministratore del sistema ha
la possibilità di personalizzare l’ambiente di lavoro
dell’utente finale sia concedendo o negando l’accesso alle
funzioni del prodotto.
Sono presentati i notevoli vantaggi ottenuti dal
Dipartimento di Medicina di Laboratorio applicando il
nuovo LIS con tecnologia WEB.
009
IL TAT PRE E POST INFORMATIZZAZIONE:
ESPERIENZA NELLA MEDICINA DI LABORATORIO
DELLA ASL LANCIANO-VASTO CHIETI
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010
LABORATORI IN RETE, APPLICAZIONE DEI CODICI
LOINC PER UN’INFORMATICA CON LINGUAGGIO
COMUNE
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C. de Fazio , M.B. Di Sciascio , C. Di Cosmo , A.
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Rulli , A. Esposito , C. Romano
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Lab. di Patologia Clinica P.O. S.S. Annunziata Chieti
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Servizio qualità e accreditamento ex-ASL Chieti
M. Ostorero , M. Lasina , G.L. Crudo , M.R. Cavallo , E.
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Richetta , D. Fortunato , V. Granero , E. Peyronel , E.
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Magnano
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Lab. Analisi Pinerolo ASL TO3
Scopo del lavoro è quello di valutare il TAT del campione
“urgente” dopo l’attivazione del nuovo SIL che ha portato,
nella ex-ASL di Chieti, all’unificazione dei tre laboratori
appartenenti a PP.OO. diversi in un laboratorio unico
logico, al collegamento in rete dei reparti e dei DSB. Ad
oggi sono stati collegati l'80% dei reparti (n. 20) e il 100%
dei DSB (n. 8).
Il vecchio sistema gestionale permetteva di calcolare e
monitorare il TAT confrontando le fasi di accettazione e
di stampa, essendo la modalità di trasmissione dei referti
solo cartacea; il nuovo sistema prevede l’accettazione e
la disponibilità diretta del referto nei reparti e nei DSB e il
check-in in laboratorio. Considerando le seguenti fasi: T0
check-in, T1 validazione tecnica, T2 validazione medica,
T3 stampa, l’analisi del TAT può essere scomposta in:
fase 1 - validazione tecnica (T1 vs T0);
fase 2 - validazione medica (T2 vs T1);
fase 3 - stampa (T3 vs T0).
L’estrazione dei dati dal LIS è stata possibile grazie ad una
specifico software che la ditta fornitrice ha appositamente
elaborato allo scopo.
Dalla analisi dei dati è emerso che:
1.il tempo della validazione tecnica va da un minimo di 12
minuti (tra le ore 23 e l'1) ad un massimo di 55 minuti (tra
le ore 8 e le 9)
2.il tempo della validazione medica va da un minimo di 10
minuti (tra le ore 23 e l'1) ad un massimo di 60 minuti (tra
le ore 8 e le 9)
3.la stampa del referto con firma autografa va da un
minimo di 30 minuti (tra le ore 23 e l'1) ad un massimo di
120 minuti (tra le ore 8 e le 9). Questo tempo, essendo i
dati immediatamente disponibili on-line dal reparto dopo
la validazione medica, non viene sentito come prioritario
dal personale del laboratorio.
Il nuovo sistema, permettendo la suddivisione in
sottofasi, fornisce gli strumenti per analizzare più
approfonditamente il processo e per poter apportare le
relative azioni correttive.
I risultati mostrano come il TAT tra pre e post
informatizzazione non sia sensibilmente migliorato e che
ad oggi il vantaggio è dovuto alla immediata disponibilità
dei dati online ma suggerisce anche che ci sono buoni
margini di miglioramento sicuramente individuabili nella
fase 2.
Bibliografia: Esami di laboratorio in Medicina d’Urgenza
Paolo Carraro, Ivo Casagranda, Mario Plebani
Scopi e Obiettivi
Nel Laboratorio è essenziale armonizzare i SW applicativi
allo scopo di garantire identificazione univoca e
tracciabilità del dato, ma altresì è indispensabile, in ottica
di creazione di reti regionali, ragionare su interconnessioni
tra laboratori con sistemi diversi.
In Piemonte la DGR n.19-6647 ha definito i criteri
di riorganizzazione e razionalizzazione delle attività di
laboratorio, ma per realizzare gli obiettivi espressi in
questa delibera occorre implementare, oltre che progetti di
logistica avanzata, anche progetti informatici. Per creare
una rete informatica occorre usare un linguaggio comune.
Ci siamo quindi posti l’obiettivo che i dati prodotti dal ns
laboratorio siano utilizzabili nel progetto di costruzione
della cartella elettronica centralizzata come espresso dal
Progetto SIRSE redatto dall’ARESS Piemonte
Metodologia
Per raggiungere questo obiettivo abbiamo definito e
descritto il nostro processo di gestione informatica
riingenierizzandolo. Abbiamo analizzato archivi cartacei e
informatici e il processo è stato descritto in diagramma
di flusso per individuare ambiti di miglioramento anche
in ottica di rete. In gruppo regionale si sono studiati i
documenti SIRSE e LOINC forniti da ARESS per quanto
riguarda la cartella clinica elettronica.
Risultati
Si è ottenuto un notevole snellimento delle pratiche da
espletare in laboratorio per: fornire referti, elaborare dati
e produrre report di gestione.
Si sta lavorarndo alla mappatura delle analisi mediante
i codici LOINC (Logical Observation Identifiers Names
and Codes LOINC®) che consentono di aggregare
nella cartella sanitaria elettronica dati provenienti da più
laboratori evitando di perdere le informazioni fondamentali
per l’interpretazione degli stessi (unità di misura,
metodica, modalità di prelievo, materiale impiegato).
La nostra collaborazione al progetto SIRSE fa sì che ogni
aggiornamento necessario per l’evoluzione del nostro
sistema informativo tenga conto anche di questo ulteriore,
fondamentale passo nella gestione del dato di laboratorio:
solo se si riuscirà ad implementare in tutta la regione
questo linguaggio si realizzerà in pratica la rete dei
laboratori.
Bibliografia
Progetto SIRSE sito ARESS Piemonte
393
011
LA COMUNITÀ DI PRATICA ONLINE NEL
LABORATORIO CLINICO, LA NOSTRA ESPERIENZA
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C. Rumori , M. Brogi , D. Tinalli , B. Sisi , R.
1
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Palumbo , S. Salti , S. Rapi , B. Salvadori , A.
1
Ognibene
1
Lab. Generale, A.O.U. Careggi, Firenze.
Introduzione
Marshall McLuhan, uno fra i più importanti teorici
delle comunità di pratica, nel libro “Gli strumenti
del comunicare” afferma: "nel regime della tecnologia
elettrica il compito dell’uomo diventa quello di
imparare e di sapere; tutte le forme di ricchezza
derivano dallo spostamento dell’informazione". L’elevata
automazione, il turnover del personale, la creazione
di macroaree che richiedono competenze sempre
maggiori richiedono un veicolo dell’informazione e della
conoscenza veloce e dinamico. Di seguito descriviamo
l’esperienza nel settore di Chimica clinica e Immunometria
del Laboratorio Generale dell’Azienda OspedalieroUniversitaria di Careggi della Comunità di Pratica Online
(CPO).
Materiali e Metodi
Per la realizzazione della CPO abbiamo utilizzato
materiale informatico open-source. La CPO è stata
configurata utilizzando ATutor un open source web-based
Learning Content Management System (Canada), nella
piattaforma abbiamo reso disponibili alcuni strumenti
come il Forum, il Magazzino file e i Link Utili e la Posta
Elettronica.
Risultati e Conclusioni
Gli strumenti disponibili nell’area virtuale hanno permesso
ai 15 iscritti alla CPO una più pronta disponibilità di
numerose informazioni e documenti. In particolare il
magazzino file, lo strumento più utilizzato, ha dato la
possibilità di reperire facilmente: le metodiche in uso
nel settore, i manuali strumentali, i verbali delle riunioni
organizzative e le comunicazioni dei controlli di qualità,
tutto il materiale della qualità (istruzioni di lavoro e
procedure del settore e altri di pertinenza), i report del
controllo di qualità esterno e materiale bibliografico.
Tutti gli iscritti alla piattaforma (il personale del settore)
può attingere a questo materiale e può intervenire ai
forum. I forum principali riguardano i seguenti argomenti:
comunicazione al personale, turni e guardie, aiuto
tecnico. Tutti gli iscritti possono intervenire e gli interventi
vengono notificati per e-mail. Lo spazio virtuale della
CPO è risultato uno strumento valido come ausilio al
coordinamento e alla gestione del settore, offre inoltre al
nuovo personale la possibilità di reperire informazioni per
un migliore e facile inserimento.
394
012
UN PROGETTO AZIENDALE PER IL MONITORAGGIO
DELLA PERFORMANCE DEL LABORATORIO
ANALISI
1
1
1
G. Patrucco , L. Caretto , M. Cagliano
1
Lab. Analisi Chimico Cliniche e Microbiologia Osp. S.
Andrea ASL "VC" Vercelli
IntroduzioneAll’interno di un progetto aziendale teso ad
assicurare agli utenti prestazioni di qualità, si inserisce
la prima fase del progetto di laboratorio volto a valutare
la qualità tecnica ed organizzativa percepita della
propria attività a seguito dell’aggiornamento strumentale
avvenuto per l’area di chimica clinica-urgenze. L’analisi di
quest’area, conosciuta come critica per i tempi di risposta,
ha utilizzato il TAT come indicatore di efficienza della
fase analitica.Materiali e metodi Sono stati individuati DEA
ed UTIC come U.O. da cui provengono la maggior parte
delle richieste urgenti ed oncoematologia, rianimazione
e diabetologia come unità a cui si deve garantire
la risposta entro due ore. Il periodo di osservazione
di un mese, sia per gli strumenti DimensionRxLSiemens che per DimensionVista-Siemens che li
hanno sostituiti,comprende la valutazione del TAT
analitico per troponina, mioglobina, CKmassa, profilo
biochimico ed ematologico d’urgenza o concordato
con i reparti descritti, intendendo per TAT analitico
il tempo compreso tra la presa in carico della
provetta e la validazione tecnica dei dati.Per avere
tempi rappresentativi dell’intera giornata,essendo il
presidio sede DEA di I livello,i dati sono stati estratti
per le fasce orarie 7-11,14-18,18-7.Sono stati anche
raccolti dati relativi alla fase pre-preanalitica, utili
per la prosecuzione del progetto.Risultati Sono stati
valutati 268 campioni processati su Dim.RxL con TAT
di 44’per Dea,49’per UTIC,69’per diabetologia,58’per
oncologia,48’per rianimazione e 217 campioni processati
su Dim.Vista con TAT di 29’per Dea,26’per UTIC,65’per
diabetologia,38’per oncologia,37’per rianimazione.La%
di miglioramento è pari ad una riduzione del
33% del TAT in totale con valori particolarmente
interessanti per il Dea con -36% e per l’UTIC del
-47%.Conclusioni Il miglioramento della tecnologia a
seguito dell’aggiornamento strumentale ha ridotto i
tempi analitici aumentando i livelli di gradimento dei
reparti. L’obiettivo di riduzione del TAT analitico è
stato raggiunto mentre rimane da affrontare e sarà
parte dell’attuazione del progetto la problematica relativa
alla fase preanalitica.Bibliografia Plebani M,et al Lab.
network of excellence: enhancing pat safety and service
effectiveness. CCLM 2006;44:150
013
IL LABORATORIO ANALISI URGENTI IN UN
POLICLINICO UNIVERSITARIO: ATTUALITA’ E
PROSPETTIVE FUTURE
1
1
1
M. Galdiero , G. Tammaro , D. Chianese , F.
1
1
Scopacasa , E. Grimaldi
1
Dip. Assistenziale di Medicina di Laboratorio, A.O.U.
Policlinico Federico II, Napoli.
Negli ultimi anni nel Dipartimento di Medicina
di Laboratorio dell’Azienda Ospedaliera Universitaria
Federico II di Napoli, si è assistito ad un progressivo ma
inappropriato incremento dell’utilizzo del Servizio Analisi
Urgenti da parte dei Dipartimenti clinici, contestualmente
ad una riduzione delle unità di personale e del budget
economico.Lo scopo di questo lavoro è stato quello di
individuare le cause di questo fenomeno e proporre azioni
correttive atte a razionalizzare l’utilizzo del laboratorio
di urgenza e migliorarne l'efficienza.E'stata fatta una
analisi per il periodo 1982–2005 di:capacità ricettiva
della struttura ospedaliera,tipo e numero di strutture
con attività assistenziali di lunga e breve degenza
specialistiche e non,tipo,numero e distribuzione oraria
delle richieste di indagini,incidenza di campioni con
risultati patologici,analisi del processo dalla compilazione
delle richieste alla archiviazione dei risultati.
Dal 1980 nell’Azienda si sono verificati una progressiva
riduzione dei posti letto (da 1670 a 879 nel 2005) a
fronte di un aumentato numero di accessi in cicli chiusi,
nonché un incremento dell’indice di rotazione paziente/
posto letto (da 18.8 del 1980 a 37.2 del 2005) ed un
aumento del numero delle richieste di analisi urgenti sul
totale delle analisi (dal 14% del 1980 al 34% del 2005).
Si è osservato inoltre un significativo decremento delle
richieste in urgenza nei giorni di sabato e domenica in
cui rimane invariato il numero di analisi richieste per
campione ed il percento delle analisi rispetto al profilo
completo delle analisi inventariate al Servizio Analisi
Urgenti. Esaminando la distribuzione per fascia oraria
del flusso di campioni pervenuti come urgenti, si è
osservato un picco massimo nella fascia oraria 8-14
(56%) ed un minimo nella fascia 20–8 (12%). Una ulteriore
stima dell’appropriatezza è stata ottenuta osservando
la percentuale di risultati patologici: questa risulta non
così elevata come ci si potrebbe attendere da esami in
urgenza.
Dai dati ottenuti è emersa la necessità di ridisegnare
l’assetto organizzativo del Servizio e, soprattutto, di
ottimizzare l’appropriatezza degli esami richiesti, con
opportuni interventi.
Cappelletti P. La modernizzazione dei laboratori
orientata all’appropriatezza diagnostica e all’efficacia dei
trattamenti. Riv Med Lab - JML 2004;2:147-63.
014
RUOLO DEL TLB NELLA GESTIONE DEL
MAGAZZINO DEGLI ALLERGENI "SEMPRE IN
ORDINE"
1
1
1
1
L. Nota , Y. Bevini , M. Biondi , G. Montanari , P.
1
1
1
Paolini , D. Tonozzi , N. Zelioli
1
Dip. di Patologia Clinica, Lab. di Tossicologia e
Diagnostica Avanzata, Nuovo Ospedale Civile
S.Agostino Estense, Modena
Obiettivo: L’organizzazione del magazzino della
Diag.Allergologica in vitro, pone da qualche anno la
necessità di coprire tutte le casistiche (acquisti, carichi/
scarichi, statistiche) con l'obiettivo di ottenere una
razionalizzazione delle scorte.Il lab.TDA ha adottato un
modello interattivo, per ridurre gli sprechi di materiale
non utilizzato mantenendo sempre vigile una scorta
minima di reattivi/allergeni. L'integrazione dei vari supporti
derivanti dell'AUSL NOCSAE Modena e da una sezione
del programma che gestisce lo strumento ICAP1000,
ha reso possibile la gestione delle scorte fino ad allora
controllate con supporto cartaceo e visivo.
Metodologia:
•Programma IDM: sezione Stock Manager
•Modello
Centralizzato
Intraziendale:
acquisto,
stoccaggio, distribuzione del materiale per reparti e i
servizi ospedalieri
•Statistiche elaborate semestralmente sulla base
di:analisi dei consumi, giorni di copertura e stagionalità.
Stabilita la scorta minima (calcolata da IDM, sulla
base della movimentazione media per gli allergeni)
e il punto di riordino per ciascun reattivo (Wash,
Coniugato,Stop, Calibratori, Controlli) è iniziato il nostro
percorso. Giornalmente, i reattivi di cui sopra, prelevati
per il dosaggio, vengono registrati su un apposito foglio
preparato per tipologia, quantità e codice prodotto, mentre
i livelli di allergeni vengono aggiornati automaticamente
dal programma.Una volta alla settimana l’operatore, dopo
aver confrontato i propri fogli, provvede a far registrare
lo scarico dal magazzino dell’ospedale, dotato di un
programma che elabora i dati inseriti ed individua i
reattivi da riordinare. I livelli delle scorte degli allergeni,
invece, elaborati da IDM, vengono segnalati in rosso
dal sistema quando entrano in scorta minima. La
stampa dell’ordine avviene automaticamente e inviata
al responsabile del magazzino che invia la commessa
in tempo reale provvedendo all’evasione della stessa.
Stampate le liste di prelievo materiale, il programma
aggiorna automaticamente le scorte del magazzino.
Risultati e Conclusioni:A otto mesi dall’implementazione
di questo modello si è registrata una riduzione delle
giacenze del 30%, con le scorte passate da 122.000
a 85.000 Euro. L’obiettivo è arrivare ad una riduzione
delle giacenze del 50% senza pregiudicare l’attività del
laboratorio.
395
015
MANAGEMENT OF LARGE WORKLOADS IN
BACTERIOLOGY: EXPERIENCE ON COMPLETELY
AUTOMATED URINE CULTURE PROCESS
1
1
1
1
S. Oddera , S. Delfino , A. Galleano , O. Illiberi , P.
1
1
1
Piazzai , E. Schellino , L.C. Bottaro
1
Dip. di Patologia Clinica - U.O. Patologia Clinica,
Servizio di Microbiologia, P.O. San Carlo di Voltri, ASL3
Genovese
Introduction: the rationalization of the department of
clinical pathology and the consequent centralization of
bacteriology tests has greatly increased the workload
requiring the automation of certain analytical processes.
In this context, the use of an automated system for the
management of urine samples may represent an excellent
improvement because of the high number of requests
of processing these samples and the high incidence of
negative specimens.
Therefore, we employed an instrument for the screening
of urine samples , able to provide (negative) results as
quickly as possible, to ensure traceability of the sample
and to avoid errors in handling the sample.
Materials and methods: urine samples were analyzed by
Alfred60 and HB&L (Alifax). These instruments use the
light-scattering technique to detect the activity of bacterial
replication (CFU/ml). Afred60 has an "inviolable" barcode
reader: the barcode reading of the primary sample
coincides with its dispensing, ensuring the traceability of
the sample and reducing the biological hazard for the
operator.
We received the urine samples from 5 hospitals and 72
ambulatories distributed over a vast territory (away until
70km from our service).
Results: during the last year (May 2009 - April 2010) we
processed 35,926 urine samples (daily average value:165
± 18).The positive threshold was set at 50,000 CFU/
ml and was found in 33% (11,856 urine samples) of
total samples. This value rises to 58% if hospitalized
patients were considered separately. Sixty-seven percent
of the samples have a clinically non-significant bacteriuria
(negative test). In other words, 24,070 samples were
not plated with a consequent saving of material and a
reduction of personnel employed in bacteriology.
Conclusion: automated screening of urine cultures
using HB&L and Alfred60 allows optimization of the
management staff of the bacteriology, to save money, to
reduce risk exposure of the staff, and to reduce TAT (turnAround-time) providing the results of negative tests in a
few hours. Indeed the results of non-significant bacteriuria
are sent to our computer system directly and then to
medical department in online connection.
Bibliography:
D. Iverson, et all., “Detection of Bacteriuria by a Rapid,
Three hour,Automated Screening Method”, Poster,ASM,
USA, 1999.
396
016
ORGANIZZAZIONE AREA SPECIALISTICA
ED OTTIMIZZAZIONE DEI SUOI FLUSSI DI
LAVORO: L’ESPERIENZA DEL LABORATORIO
DELL’OSPEDALE DI AREZZO
1
1
1
M. Matteucci , M. Mafucci , E. Migali
1
Dip. di Diagnostica per Immagini e di Patologia Clinica,
Osp. “S.Donato”, AUSL 8, Arezzo
La riorganizzazione delle strutture di Laboratorio
dell’AUSL8 Aretina ha reso necessario una nuova
configurazione del Laboratorio Centralizzato che
consentisse una gestione ottimale dei nuovi flussi analitici
mantenendo alta la qualità del dato.
Tale organizzazione ha previsto la creazione di 3 aree
analitiche distinte: CoreLab, Ematologia/Coagulazione ed
Area Specialistica. Se da una parte l’organizzazione
del lavoro delle prime due aree presentava già
positive esperienze con soluzioni consolidate, l’Area
Specialistica non era fino ad ora mai stata affrontata
nel suo insieme, integrando nello specifico i settori di
Immunometria Specialistica, Infettivologia, AutoImmunità
ed Allergologia.
Lo scopo del presente lavoro è presentare in dettaglio
l’organizzazione legata a quest’ultima area.
L’esigenza era quella di trovare una soluzione che
consentisse il massimo dell’automazione, organizzata
con un unico gestionale e che integrasse al suo interno
anche quelle linee routinarie minori che contribuiscono
a formulare un referto completo per i profili coinvolti,
consentendo al contempo scelte di eccellenza analitica
riguardo a ciascuna specialità.
La soluzione si è ottenuta con la fornitura di un
sistema di automazione <aperto> FlexLab INPECO che
integra: tre strumenti DiaSorin LIAISON (profili TORCH,
Bone&Mineral, EBV&Infectious Disease e Specialità
varie), uno strumento Siemens ADVIA CENTAUR (profilo
Epatite/AIDS) e due strumenti Phadia UNICAP250
(profili AutoImmunità ed Allergologia), il tutto gestito dal
middleware NEMO di Linea3 a cui s'interfacciano anche
gli strumenti stand alone per la Sierologia Minore e,
tramite l’host DNLAB, per l’AutoImmunità in ELISA ed IFA.
L’attività annua del settore produce circa 350 mila esami
(46% di TORCH/EBV/Infectious Disease/Bone&Mineral/
Specialità varie, 24% di Epatite/AIDS, 28% di
AutoImmunità/Allergologia, 2% di ELISA/IFA) con circa
250 provette al giorno che arrivano tra le ore 7 e le ore
13; i tests (1200/die) per il 90% sono eseguiti in totale
automazione su Flexlab; il 95% dei campioni vengono
refertati giornalmente entro le ore 15.
Due anni di esperienza confermano la bontà della scelta
fatta che ha ridotto il TAT ed i tempi di refertazione, oltre
ad aver ottimizzato le risorse umane, garantendo massimi
livelli di qualità.
017
G6PD ENZYME ACTIVITY IN EMERGENCY: IS IT
FEASIBLE?
1
1
018
THE AUTOMATION SYSTEM IN THE LABORATORY:
A WAY TO IMPROVE EFFICIENCY AND
EFFECTIVENESS
1
M. Antenucci , A. Minucci , D. Tripodi , A.
1
1
1
1
Primerano , B. Giardina , C. Zuppi , E. Capoluongo
1
Lab. of Clinical Molecular Biology, Institute of
Biochemistry and Clinical Biochemistry, Catholic Univ. of
Rome, Italy
Background:
Glucose-6-phosphate
dehydrogenase
deficiency is the most prevalent enzyme deficiency, with
an estimated 400 million people affected worldwide. This
inherited deficiency causes neonatal hyperbilirubinemia
and chronic hemolytic anemia. Although most affected
individuals are asymptomatic, exposure to oxidative
stressors such as certain drugs or infection, can elicit
acute hemolysis.
Often rapid knowledge of the G6PD enzyme activity status
helps to guide the diagnosis especially in those patients
where the clinical picture is unclear.
The aim of this study was to make the G6PD enzyme
assay fully automated, developing a precise, reproducible
and specific biochemical assay.
Materials and Methods: The G6PD/6PDG (Nurex) was the
method chosen to be automated. This test determines the
level of G6PD activity in a cell lysate. This test doesn’t
use the red cell number and the hemoglobin value. After
sample initial manual treatment all subsequent steps have
been automated: the reagent addition, incubation, data
calculation and online of the results.
Results: The G6PD/6PDG test was successfully fully
automated on clinical chemistry analyzer Olympus AU
2700. The intra and inter series imprecision with two
controls at different concentrations showed that this test
is accurate, sensitive and reproducible.
Discussion: The laboratory tests required in emergency
are increasing and more frequently these tests are
improved according to the needs of the clinics, of the
new knowledge and of the rationalization and optimization
of laboratory procedure. The G6PD assay in emergency
could be helpful in clarifying the clinical diagnosis.
Conclusions: In an hospital where the patient number
afferent to the emergency department is increasing, also
considering the significant increase in immigrates due
to globalization, an automated and rapid G6PD enzyme
assay could be inserted in the panel of the test requires
in emergency.
1
1
1
1
A.M. Basile , P. Maselli , F. Adamo , M. Basile , S.
1
1
1
1
Capozzo , F. Giorgio , D. Nardelli , A. Pavone , S.
1
Tundo
1
Div. of Clinical Pathology “Miulli” Hospital, Acquaviva
delle Fonti (BARI)
Abstract
Job Purpose: In order to reduce cost, tat and risk
in our lab an automation system was introduced in
our lab organization, allowing complete serum assays
consolidation.
Main task of this work is to measure the variation of
analytical TAT, number of tubes and FTE between old and
new lab work process in the serum area.
Materials and methods: Automation system is the
StreamLab Analytical Workcell (Siemens) connected to:
2 Dimension Vista 1500
1 Immulite 2000 xpi
1 Advia Centaur XP
1 automatic centrifuge
1 decapper
Consolidated examinations are approximately 200. The
system allows checkin, decapping and sorting of samples.
The analytical TAT is defined as time from check in
to check out of a serum tube and data are directly
downloaded from LIS.
Results:
• The serum tubes used for a routine clinical chemistry/,
immunometria and Virology decreased by 80% (5 to 1
specimen).
• Automatic centrifugal, decapping and sorting of samples
allowed the elimination of manual steps at higher risk,
reducing 25% exposure to biological risks.
• The TAT is past: 86 to 36 m# testing routines; da72 33
m#per tests in urgency; through the interaction between
the LIS and analytical tools around 80-85% of our findings
are auto-validated and the results automatically issued,
reducing by 49.2.9 min tat for our tests more frequent
• consolidation and integration is a major benefit to
optimize current employees.
Conclusions: the use of automation proved to be a tool in
line with the objective of the lab reorganization.
Bibliografia:
• Installation of a total automation system: effect on
laboratory budget, personnel, and tat.
T.Plecko and E. Wieland. Central Institute for Clinical
Chemistry and Laboratory Medicine, Klinikum Stuttgart,
Germany. Clin Chem Lab med 2007;
• Biochemistry and immunodiagnostic consolidation:
experience from meaux hospital laboratory.
E.Plouvier, M.Bogard and F.Thuillier. Biochemistry
Laboratory, Meaux Hospital, Meaux, France
Clin Chem Lab Med 2007;
• Plebani M. Errors in clinical laboratories or errors in
laboratory medicine? Clin Chem Lab Med 2006;
397
019
iRICELL SISTEMA PER L'ANALISI COMPLETA
DELLE URINE: CONTRIBUTO DELLE MODERNE
TECNOLOGIE ALLA RIORGANIZZAZIONE DEL
SETTORE URINE
020
ATTIVITA’ DI REENGINEERING DEL LABORATORIO
ANALISI DELL’OSPEDALE “F. MIULLI” DI
ACQUAVIVA DELLE FONTI
1
1
1
1
1
E. Pinca , A. Grasso , C. Zarli , F. Pignatelli
1
Lab. Analisi cliniche Dr. Pasquale Pignatelli, Lecce
Scopo:Valutare l'impatto sui flussi operativi e sulla
produttività del settore urine attraverso l'automazione
completa dell'esame delle urine
Materiali: 1 sistema iRICELL 2000 (IL Milano) composto
da un sistema Velocity per analisi chimico fisica e da un
sistema iQElite per analisi del sedimento, collegati con un
ponte e con un software che gestisce entrambe le analisi
Risultati:A questo settore è tradizionalmente dedicato
poco personale mentre richiede un elevato impegno
manuale sia tecnico che specialistico, la scelta
dell'automazione completa è stata la soluzione a queste
problematiche.
In una prima fase abbiamo preso confidenza con il
sistema iRICELL 2000 confrontando i risultati sia con M.O.
200x che con il precedente sistema del sedimento urinario
(SediMax-Menarini).
Abbiamo anche valutato l'opportunità di refertare RBC e
WBC non più per gradiente ma per µL per allinearci con
le linee guida
Abbiamo creato regole di validazione per gli elementi
autoclassificati dal sistema iQElite, delle soglie di
normalità sotto le quali i campioni vengono validati
automaticamente.
I flussi di lavoro sono stati analizzati tenendo conto:
a)tempo d'analisi totale b)percentuale camp. da rivedere a
video c)camp. fermati per incongruenza tra le due analisi
d)eventuale revisone microscopica e)refertazione finale.
Sono stati considerati circa 100 camp/g a)tempo per
entrambe le analisi circa 60min b)15% revisione a video
del sediemnto c)5% incongruenza tra le analisi d)revisione
a M.O. inf.1% e)refertazione camp. negativi immediata
e contestuale al tempo d'analisi, camp. positivi dopo
revisone a video refertazione è istantanea
Conclusioni:L'automazione nel settore Analisi Urine
grazie al sistema iRICELL ci ha permesso di riorganizzare
ed ottimizzare tutte le fasi del processo analitico
migliorando la produttività e la qualità dei risultati
consentendo al laboratorio di essere più rispettoso verso
le raccomadazioni delle linee guida, implementando la
sicurezza degli operatori.
Bibliografia: DeRosa R., et al. Nuovo sistema di
microscopia automatizzata delle Urine, Convegno SIMeL,
2004
398
A. Pavone
1
U.O.C. Lab. di Patologia Clinica, Ente Ecclesiastico
Osp. Generale Regionale “F. MIULLI” Acquaviva delle
Fonti (BA)
L’automazione nasce con l’intento di riorganizzare i
processi operativi ed i flussi di lavoro del lab. clinico.
Diverse soluzioni di automazione sono disponibili, ma
per la loro applicazione è necessario valutare e
scegliere quella che permetta di raggiungere gli obiettivi
di qualità e di servizio identificati (1). Scopo del
lavoro è stato di valutare l’efficacia di un processo di
consolidamento/integrazione dell’area siero attuato nel
lab.analisi dell’Osp. Miulli.
Materiali e metodi. Elementi di ingresso in fase di
progettazione sono stati la situazione di partenza ed i
fattori critici della struttura, gli obbiettivi da realizzare, la
strategia di attuazione, le fasi ed i tempi di realizzazione
per l’applicazione del modello. La strategia d’intervento
attuata e stata l’utilizzo di una streamLab configurata con:
Modulo di input/output, Modulo di trasporto, Centrifuga
automatica, 2 analizzatori Dimension Vista 1500, 1 Advia
Centaur xp ed 1 Immulite 2000 xpi
Risultati. L’applicazione della workcell ha permesso
un
flusso
continuo
reale
(212
metodi
on
board contemporaneamente, distribuzione e gestione
automatica delle provette, dei rerun, decapping); un
miglioramento dell’efficienza (% impiego analizzatori
+20%, backup sempre attivo, gestione automatizzata
dei fermi macchina on line); una maggiore produttività
(abbassamento TAT analitico, capacità di carico
provette accresciuta); maggiore flessibilità (variazioni di
carico di lavoro, sorting); maggiore economicità (-35%
provette siero, riduzione degli operatori); migliore qualità
(tracciabilità della operatività).
Discussione. La proposta di automazione, nata
dall'attento esame, dalla riorganizzazione dei processi
operativi e dei flussi di lavoro, ha avuto come
obiettivo il miglioramento del tempo di risposta, della
qualità complessiva dell'informazione di laboratorio e
del contributo che questa attività deve avere nella
gestione del paziente e nel miglioramento degli esiti di
salute. L'automazione del Laboratorio, integrata nel flusso
operativo, misurata e proporzionale all'attività effettuata
potrà liberare risorse economiche ed umane.
Conclusione. L'automazione permette di migliorare la
gestione della diagnostica, tuttavia rimane uno strumento
e non una soluzione.
(1) Hawker C.D.”Laboratory Automation: total and
subtotal”. Clin Lab Med, vol27. n4. 2007, pp749-770
021
APPROPRIATEZZA: STUDIO DI IMPATTO
ECONOMICO
1
1
1
022
AUTOMAZIONE:NUOVA ORGANIZZAZIONE E
VALORIZZAZIONE DELLE PROFESSIONALITA'-LA
FORMAZIONE PER IL CAMBIAMENTO
1
R. Addobbati , G. Antonucci , E. Borin , O. Radillo
1
Dip. di Medicina Molecolare, Lab. di Immunopatologia
Clinica, IRCCS Burlo Garofolo, Trieste
Scopo della ricerca:
Da tempo esistono le linee guida regionali (FVG)
che stabiliscono in modo univoco quali siano gli
approcci più corretti per la diagnostica sierologica della
celiachia. Vengono individuati sulla base della letteratura
internazionale principalmente due test:
il dosaggio delle IgA e quello degli anticorpi antitransglutaminasi di classe A. Nel caso che il soggetto
sia deficitario di IgA, evenienza rara ma non rarissima
(1:400-700) si procede con il dosaggio degli anticorpi anti
transglutaminasi di classe IgG.
Metodologia:
Nel presente lavoro sono state analizzate le richieste
che afferiscono al nostro laboratorio per la diagnostica
sierologica della celiachia.
I dati ottenuti indicano:
A) una parziale inappropriatezza descrittiva per l'utenza
esterna
B) una marcata inappropriatezza prescrittiva per l'utenza
interna
C) un impatto economico, relativo all'inappropriatezza
(pazienti ambulatoriali esterni e pazienti interni) che è di
circa 6600 €/anno per la nostra diagnostica
Considerazioni conclusive:
I dati sopra indicati sono stati raccolti dall'elaborazione
di un anno di attività diagnostica, e inducono alla
considerazione che è essenziale un monitoraggio
costante della appropriatezza e del suo impatto
economico.
Riferimento bibliografico:
1. DGR 1561 del 29.6.2007
2. Tommasini A, Not T, Martelossi S, Ventura A, et
al. Mass screening for coeliac disease using antihuman
transglutaminase antibody assay. Arch Dis Child 2004;
98:512-5
3. Lenardht A, Martelossi S et al. Role of human-tissue
transglutaminase IgG and antigliadin IgG antibodies in
the diagnosis of coeliac disease in patients with selective
immunoglobulin A deficiency. Dig Liver Disease 2004;
36:730-4
4. Baldas V, Martelossi S and SIGENP working groups.
Serological screening of coeliac disease: choosing the
best test under two years. Abstract 38 Annual Meeting of
the ESPGHAN. Porto, 2005
1
1
1
M.R. Cavallo , E. Richetta , D. Fortunato , V.
1
1
1
Granero , M. Lasina , D. Curcuruto , R.
1
1
Dispenza , M.G. Boglione
1
Lab. Analisi Pinerolo ASL TO3
Scopi e Obiettivi
Come tanti laboratori abbiamo lavorato per anni su
strumenti automatici stand alone. Nel 2006 il passaggio
all’utilizzo di una semiautomazione ha portato un grande
cambiamento con l’introduzione del concetto di provetta
condivisa, senza però cambiare il “vecchio” rapporto
operatore-strumento e le attività classiche caratterizzanti
il professionista di laboratorio.
La sfida che abbiamo lanciato, introducendo un sistema
completamente automatizzato è stata quella di passare
ad un approccio operatore sistema che permettesse la
crescita della professionalità di ognuno e lo sviluppo di
attività gestionali prima ritenute non indispensabili.
Metodologia
Il modello organizzativo implementato con l’introduzione
di un sistema full automation è quello basato sui requisiti
della norma UNI EN ISO 9001:2008 e sui principi del
Total Quality Management, in particolare sull’approccio
per processi e sul coinvolgimento del personale.
Questa riorganizzazione è stata supportata da un intenso
programma formativo, riconoscendo nella formazione lo
strumento più idoneo a vincere le naturali resistenze al
cambiamento legate all’introduzione di una nuova cultura
organizzativa Tramite la formazione è stato promosso
e sostenuto il cambiamento organizzativo, gli operatori
hanno acquisito capacità di agire in un sistema complesso
caratterizzato da interconnessioni ed interdipendenze
che richiede anche competenze di tipo gestionaleorganizzativo.
Risultati
Il singolo operatore e stato sostituito dal team; il singolo
insieme alla sua squadra si è trasformato da semplice
esecutore a gestore di un processo che controlla dalla
pianificazione al monitoraggio. La nuova organizzazione
ci ha consentito una migliore efficienza nella produzione
analitica e di creare nuove competenze: si sono
nominati i diversi process owner e referenti di POCT,
approvvigionamento, sicurezza,formazione, informatica e
logistica.
I cardini della nostra nuova cultura di organizzazione
sono:nuova visione delle professioni e del lavoro: il team
di processo, garantire più tempo per le attività di controllo
e gestione,mettersi in gioco ed assumere responsabilità.
Bibliografia
H. Kerzner Strategic Planing for Project Management
JohnWiley&Sons, 2001
399
023
URGENCIES/EMERGENCIES’ MANAGEMENT,
COMPARISON BETWEEN THE DIMENSION
SISTEM RXL AND THE STREAMLAB ANALYTICAL
WORKCELL
024
IL GRUPPO DI LAVORO COME PROTAGONISTA
DELLE SCELTE DI MIGLIORAMENTO DELLA
QUALITA’
1
1
1
A.M. Basile , P. Maselli
1
Div. of clinical pathology “Miulli” Hospital, Acquaviva
delle Fonti (BARI)
Introduction and aim of the study:The availability of the
results of the exams in emergency/urgency is decisive for
a rapid diagnosis to optimize the patients’ outcome.In the
80% of the serologic exams requests coming from the
First Aid, myoglobin and troponin tests are planned.The
aim of the research is the TAT, that characterizes
two analytic systems: Dimension RxL (Siemens) and
Dimension Vista Intelligent associated to the StreamLab
Analitical Workcell ( Siemens).
Materials and Methods:The comparison was carried out
distinguishing one-year period experience acquired by
the Clinical Pathology Lab using the Dimension RxL
(Siemens), and the activity developed during the last six
months with the new system Dimension Vista Intelligent,
linked to the StreamLab Analitical Workcell (Sistem).The
following parameters have been compared: the principle
of method used, the time of execution, the type and the
amount of sample used.
Results
The Dimension RxL (Siemens):Myoglobin -principle
of the method:enzyme immunoassay in 2 phases
( dioxide of chromium/ β galactosidase), execusion
time:16 min.,volume sample used:20µl.Troponin principle of the method: enzyme immunoassay
( dioxide of chromium/ alkalin phosphatase),execution
time : 16 min,volume sample used: 50µl.Dimension
Vista ( Siemens):Myoglobin-principle of the method:
homogeneous immunodosage chemiluminescent LOCI
technology (Oxygen channeling immunoassay in
luminescence),execution time: 10 min,volume of the
sample used: 2µl.Troponin - principle of the method:
homogeneous immunodosage chemiluminescent LOCI
technology, execution time: 10 min,volume of the sample
used: 2µl.
Conclusive consideration: An advantage of LOCI
technology applied in the system Dimension Vista
IntelligentLab is the quickness of the results; the TAT of
the analyzed tests is about 10 minutes.
This allows the TAT reduction from 72 to 33 min,
concerning the requests in urgency/emergency.
So if the Lab Medicine and the Unit Emergency cooperate,
developing a system that minimizes the preanalytic
aspects of the gathering and transport of the samples to
the analysis area.
The time for the response < 1hour is without doubts
possible, as the most ambitious aim of <30 minutes, in
line with the directives of the National Academy Chemical
Biochemistry (NACB).
400
1
1
1
P. Pezzati , O. Antelmo , A. Bandinelli , G. Carbone , L.
1
1
1
1
Centola , N. Cini , A. De Stefano , F. Luceri , V.
1
1
1
Mosconi , E. Nocita , N. Vellku
1
Lab. Generale, A.O.U. Careggi, Firenze
L’introduzione di un nuovo metodo analitico in un
laboratorio di Analisi biochimiche comporta valutazioni di
vario tipo: qualità analitica, costi, adattabilità. I primi due
parametri sono valutabili oggettivamente (accuratezza,
precisione, calcolo del costo/test), al contrario, per
l’ultimo aspetto, il coinvolgimento attivo del personale
nel processo decisionale è di fondamentale importanza.
Alla luce della rilettura critica dei i risultati della VEQ
UKNEQAS Tacrolimus, nel settore Farmacotossicologia
del Laboratorio Generale della AOU Careggi Firenze
è stato valutata la fattibilità del passaggio dal metodo
analitico ACMIA automatico Tacrolimus Dimension
(Siemens Healthcare Diagnostics) al metodo CMIA con
pretrattamento manuale Tacrolimus Architect (Abbott) al
fine di migliorare la robustezza del sistema analitico
(1). Il settore, che esegue circa 1000 determinazioni di
Tacrolimus/anno per pazienti trapiantati, si avvale di 5
tecnici sanitari biomedici a tempo pieno e 2 in partime.
Sono state condotte sedute in parallelo con le due
metodiche per un totale di 100 campioni; agli operatori
incaricati dell’esecuzione del test è stato distribuito un
questionario (scala Likert a 5 punti) in cui veniva chiesto
di esprimere un giudizio circa la percezione del carico
di lavoro del metodo con pretrattamento. La variabilità
intralaboratorio interserie, giudicata dal CV del controllo
di qualità interno (due livelli) ha evidenziato, per entrambi
i livelli, un CV notevolmente più basso del metodo CMIA
rispetto ad ACMIA; la correlazione tra i risultati dei pazienti
2
(curva Bland-Altmann: r 0.33 ) ha confermato i dati già
presenti in letteratura; il questionario ha evidenziato che
la quasi totalità del personale ha giudicato il passaggio ad
un metodo semimanuale compatibile con l’organizzazione
del settore poiché la fase di pretrattamento è di semplice e
rapida esecuzione. Il miglioramento continuo della qualità
prevede la valutazione e la implementazione di nuovi
metodi analitici o nuovi modelli organizzativi, tuttavia, per
assicurare il successo dell’iniziativa, è indispensabile che
le scelte siano condivise con il personale e tengano conto
anche dell’impatto che essa possa avere su clinici e
pazienti.
(1) Wallemacq P.et al Ther Drug Monit 2009 31 189-204
025
COME IL LABORATORIO PUÒ CONTRIBUIRE AL
MIGLIORAMENTO DELL'APPROPRIATEZZA DELLA
RICHIESTA E AD UN APPROCCIO EVIDENCE
BASED ATTRAVERSO L'USO DEI TEST RIFLESSI A
CASCATA
1
1
1
1
S. Secondini , C. Martini , A. Priori , E. Tili , F.
1
1
1
Torelli , C. Morosetti , P. Pauri
1
U.O. Patologia Clinica, Osp. di Jesi ,Jesi (AN)
L’abitudine di richiedere “tutto a tutti” dovrebbe essere
ormai tramontata, mentre è ancora ampiamente diffusa,
con la richiesta in prima battuta di “coppiette” o “triplette”
incompatibili. Un approccio evidence based, al contrario,
richiede l’uso appropriato dei test diagnostici, sulla base
delle probabilità pre-test, in un’ottica centrata sul paziente.
Fra i nuovi compiti del Laboratorio ci sono quelli di
indirizzare la richiesta, fornire consulenza, descrivere le
caratteristiche dei test utilizzati. Nell’ambito degli obiettivi
di budget stiamo lavorando con i clinici ospedalieri e i
medici di medicina generale per costruire un approccio
che prevede che il laboratorio prenda in carico il
test positivo/patologico, con approfondimento a cascata
in automazione, mediante integrazione fra software
gestionale del sistema Cobas 6000 Roche Diagnostics e
SIL.
Oltre alla famosa tripletta TSH/FT4/FT3, molti altri sono
gli esempi (PSA, bilirubina, colesterolo, marcatori di
epatite, ecc.) che comportano rischio di individuazione di
anomalie apparenti (falsi positivi) o irrilevanti ai fini clinici,
dispersione di risorse economiche, assenza di beneficio
clinico per il paziente.
Relativamente ai markers di epatite B abbiamo realizzato
numerosi interventi: abolizione della richiesta dei marker
completi e dello screening pre-chirurgico, uso del solo anti
HBs nei vaccinati, introduzione di test riflessi, in caso di
positività per HBsAg, comportando negli anni un risparmio
stimabile, a tariffa, di più di 200.000 euro.
Per quanto riguarda i marcatori tiroidei nel 2009 sono
stati eseguiti un totale di 43.983 test “combinati”,
corrispondenti ad un valore tariffario di €571.779, pari a
€13 a test (spesa reagenti €84.994). I TSH patologici sono
stati 3.417 con un valore tariffario per i test riflessi di
€237.601 (spesa reagenti €32.437).
Altro esempio è quello del PSA: su 7.317 richieste
“combinate” PSA TOTALE/PSA LIBERO, corrispondenti
ad un valore tariffario di €181.460 (spesa reagenti
€54.146), soltanto 1.199 PSA TOTALI erano patologici
con un valore tariffario per test riflessi di €105.598 (spesa
reagenti €26.492).
Questo approccio permette quindi un notevole risparmio
sia per il Laboratorio (in termini di “spesa pubblica” e di
budget) che per l’utenza (ticket).
026
VALUTAZIONE PREANALITICA DEL CAMPIONE
MEDIANTE INDICI DEL SIERO SU DIMENSION
VISTA: CONSIDERAZIONI SULL’INDICE DI LIPEMIA
1
1
1
C. Lo Cascio , A. Ariberti , M.S. Graziani
1
Lab. Analisi Chimico Cliniche ed Ematologiche, OCM,
A.O.U. Iintegrata Verona
Scopo del lavoro
Nell’ambito della valutazione degli indici del siero
sull’analizzatore Dimension Vista (Siemens), abbiamo
esaminato l’indice per la rilevazione della lipemia
(indiceL).
Materiali e metodi
L’indice L viene determinato mediante lettura fotometrica
a 700 nm del campione diluito 1:17.5 con acqua distillata,
e assume un valore da 1 a 8., essendo 1 l’indice di un
campione privo di interferenza.
Abbiamo esaminato i campioni della routine giornaliera
che presentavano un indice L significativo (>3) per
un periodo di circa 1mese, valutando in tali casi la
presenza di torbidità o lipemia visibile, la presenza di
errori strumentali, e determinando i trigliceridi, focalizzndo
poi l’attenzione sui campioni che presentavano indice L
positivo apparentemente senza motivazione e verificando
se la diluizione manuale con acqua a temperatura
ambiente determinasse l’intorbidamento del campione.
Risultati
Lo 0,59% dei campioni mostra indice L >3; in 1/3 dei
casi (24) tale indice non è spiegabile, e la diluizione con
acqua provoca torbidità. In tali campioni era presente una
anomalia proteica di varia natura:
14 componenti monoclonali IgM, 6 componenti
monoclonali IgG , 2 oligoclonalità, 2 ponti beta-gamma
Nel 12% dei casi tali campioni presentavano errori
strumentali nella determinazione di alcuni analiti.
Discussione e conclusioni
La corrispondenza tra concentrazione approssimativa
dell’interferente e indice presenta, come noto, un
comportamento molto variabile nell’indice di lipemia.
E’ altrettanto noto come la presenza di paraproteine
possa determinare varie interferenze analitiche. In
questa occasione abbiamo evidenziato come l’indice di
lipemia possa evidenziare la possibile prsenza di tale
problematica.
Nella strumentazione attualmente in uso tale interferenza
risulta particolarmente evidente sia perché l’indice L
presenta un ampio range di risposta, sia perché la
presenza di un middleware permette di selezionare
rapidamente tali campioni.
Bibliografia
Clinical and Laboratory Standards Institute/NCCLS.
Interference Testing in Clinical Chemistry; Approved
Guideline – Second Edition. CLSI/NCCLS document EP7A2 [ISBN 1-56238-584-4].
401
027
REFERENCE INTERVALS: TOWARD A NEW TOOL
FOR LABORATORISTS ?
1
2
3
G. Cevenini , A. Di Muro , L. Micheli , . Tuscany SIBioC
5
4
group , R. Leoncini
1
Dept. of Surgery and Bioengeneering, Univ. of Siena,
Siena, Italy
2
Altaquota IT S.r.l., Loc. Drove - Campomaggio, Siena,
Italy.
3
Dept. of Internal Medicine, Endocrine-Metabolic
Sciences and Biochemistry, Univ. of Siena, Siena, Italy
4
U.O.C. Lab. Analisi Cliniche, A.O.U. Senese, Siena,
Italy
5
A.O.U. “Careggi”, Firenze, Italy
Reference limits are some of the most powerful tools in the
medical decision process due to their utility in assessing
the health status of patients. Their definition can be
time consuming and expensive, because of the need of
large recruitment of reference individuals according to
estabilished criteria. Clinical laboratories have numerous
and easily available data from inpatients and outpatients,
which could be used for an estimation of reference
intervals.
The Tuscany SIBioC group decided to evaluate this
approach and developed an algorithm and a software,
based on a recent method proposed by Concordet et al.
(1). This allows the indirect reference limits estimation of
analytes through multiple aggregated or disaggregated
data originating from clinical laboratories in hospitals or
similar structures, and it takes into account the IFCC and
CLS recommendation statements for indirect sampling
processes.
We assume data as a mixture of healthy and unhealthy
populations partially overlapped, assumed to be Gaussian
with Box-Cox transformation. Their separation is obtained
with an iterative technique based on the maximum
likelihood principle. From the two populations distinction
is then possible to identify that of healthy subjects and,
through it, to estimate the reference values with the simple
statistic evaluation of 95% confidence intervals. It is also
possible to evaluate the anomalous subjects percentage
in respect to the total.
In order to verify the system reliability, we performed a
pilot study. We firstly collected and analyzed SGOT values
obtained by U.O.C Laboratorio Analisi Cliniche – Azienda
Ospedaliera Universitaria Senese, from all Units during
2009. As expected, the merging result is a different range
in respect to the current.
This finding suggests different problems currently under
evaluation:
- Accuracy. It is of paramount importance to assess the
system performance with several different populations
and to stratify data (i.e. according to gender, age, Unit, etc)
- Reliability. We are evaluating it through statistical
analysis;
- Applicability. We are discussing the potential problems
in clinical routine.
1. Concordet et al., A new approach for the determination
of reference intervals from hospital-based data, Clin.
Chim. Acta, 405, 43-48, 2009.
402
028
“ LA GESTIONE DELLE GAMMOPATIE
MONOCLONALI.PROJECT MANAGEMENT AL SAN
FILIPPO NERI “
1
1
A. Di Nicola , D. Piane
1
Lab. Patol. Clin. A.O. San Filippo Neri, Roma
La gestione per processi rappresenta il motore centrale di
un sistema che tenta di individuare i processi che risultino
critici per la soddisfazione dei fabbisogni del paziente
e comprendere come modificarli eliminando le attività
senza valore aggiunto ed è base per applicare il Project
Management.
I percorsi assistenziali danno importanza ai criteri di
appropriatezza professionale e agli esiti di salute,quindi
richiamano l’attenzione sul fatto che il vero prodotto di una
organizzazione sanitaria non sono le prestazioni, ma gli
esiti (outcome) . Anche gli accertamenti del laboratorio
analisi possono essere considerati un processo.
La somministrazione di un questionario al personale del
laboratorio di Patologia Clinica del San Filippo Neri sui
processi e percorsi assistenziali, ha evidenziato sia una
scarsa conoscenza sul significato ed importanza dei
percorsi assistenziali, sia una scarsa coscienza di far
parte di un percorso assistenziale e come il laboratorio
possa essere considerato un processo.
Partendo dall’osservazione dei flussi di lavoro della
sezione di sieroproteine, del tipo e quantità di richieste
effettuate dai reparti durante i primi sei mesi del 2009,
in modo da poter evidenziare le principali caratteristiche
e criticità, attraverso l’applicazione delle caratteristiche
processuali del Project Management, si è cercato di
costruire un percorso o processo diagnostico riguardante
la diagnostica delle Gammopatie Mnoclonali.
Questo percorso aveva, come prima conseguenza ed
obiettivo, una maggiore appropriatezza nella domanda
e richiesta di esami clinici, cosa che si concretizzava
in una sostanziale riduzione del numero di esami,
con successiva conseguenza in un risparmio in termini
economici.
Attraverso questo studio si intende, quindi, mettere in
evidenza come il Project Management possa essere un
valido strumento da utilizzare per gestire cambiamenti ed
innovazioni in sanità ed in particolare come la Medicina
di Laboratorio possa essere fulcro centrale di elaborazioni
di nuovi processi e percorsi assistenziali che mettano al
centro della sua azione il paziente e la misura e verifica
degli “outcome” degli esami di laboratorio, intendendo,
con tale termine, l’impatto che questo ha sul trattamento
e sull’esito dello stesso
029
PHENOTIPYCAL CHANGEABILITY IN BETA
– THALASSEMIAS AND POSSIBLE CLINICAL
IMPLICATION. CASE REPORT
1
1
1
2
D. Dell'Edera , G. D'Anzi , V. Falcone , E. Vutullo , A.A.
2
3
3
Epifania , G. Martelli , M.C. Padula
1
U.O.S.D. Laboratorio di citogenetica e genetica
molecolare - P.O. "Madonna delle Grazie" - Matera
2
U.O.C. di Patologia Clinica ed Analisi di laboratorio P.O. "Madonna delle Grazie" - Matera
3
Dip. di Biologia, Difesa e Biotecnologie - Università
degli Studi della Basilicata - Potenza
The term beta-thalassemia includes all those hereditary
disturbances of the hemoglobin (Hb), transferred trough
a recessive autosomal mechanism, due to a reduced or
else defective synthesis of beta globin sequences. The
aim of this paper is to highlight as sometimes the only
biochemical diagnosis is not exhaustive and a molecular
diagnostic widening is necessary to detect the genetic
deficiency that is the reason of the beta thalassemic
trait. To improve this theory the following clinical case
is reported: a 29 years old girl that was 11 weeks
pregnant addressed us to receive the prenatal screening
test related to the first three-month pregnancy period.
The biochemical and hematological tests highlighted
that Mrs. D. F. was a carrier of the beta thalassemic
trait,
(MCV63fl,MCH30pg,HbA2:4.4%,HbF:1.5%,red
corpuscles 5.92x106/ul and Hb12.4g/dl), that has
been confirmed trough our molecular analysis
(genotype: ß+IVS1.110 G>A in heterozigosys).
More difficult to be realized was the case of
Mr. B.A.: he showed an uncertain hematological
picture labeled as “compatible with a αthalassemia
picture”
(MCV63fl,MCH21.4pg,HbA2:2.7%,HbF:1.0%,
red corpuscles5.33x106/ul,Hb 11.4g/dl). This picture
revealed difficult to be understood because of the
regularity of HbA2 (2.7%) that was in contrast with
the value of the MCV (63fl). In situation like this only
the molecular diagnosis allows correctly highlighting the
specific typology of ßthalassemia the subject is carrier of.
As a matter of fact the molecular analysis excluded the
possibility that Mr. B.A. was a α thalassemia carrier and
pointed out that he was a healthy carrier of ßthalassemia
(genotype ß039C>T in heterozigosys). In the light of what
has been explained above, the couple has been informed
about risks to beget child suffering from ßthalassemia
and together with the married couple has been decided
to work out a prenatal diagnosis through a sample of
chorionic villus. The identification of these particular cases
fixes important implications about the prenatal diagnosis
approach. The correct characterization of the healthy
carrier is absolutely necessary with a subsequent study in
depth of the partner’s situation.
030
VALUTAZIONE DELLA INCIDENZA DELLE
INFEZIONI POLMONARI DA ATIPICI RESPIRATORI :
CLAMIDIA PNEUMONIAE, MICOPLASMA
PNEUMONIAE, LEGIONELLA, E VRS, CON UNA
METODICA IN BIOLOGIA MOLECOLARE IN PCR
REAL TIME
1
1
1
A. De Santis , C. Silvestri , G. Cataldi
1
Lab. di Analisi Cliniche e Microbiologiche P.O. San
Paolo - ASL Bari BARI
Obiettivi
Valutazione della incidenza delle infezioni polmonari da
microrganismi atipici respiratori Clamidia pneumoniae,
Micoplasma pneumoniae, Legionella spp e VRS (Virus
Respiratorio Sinciziale) con una metodologia in Biologia
Molecolare in PCR “Real Time” per un periodo di 5 anni
dal 2005 al 2009. I materiali biologici utilizzati per la ricerca
sono stati bronco aspirati, lavaggi bronchiali, espettorati,
tamponi nasali e faringei.
Metodologia
La metodica di biologia molecolare utilizzata per la ricerca
dei microrganismi è stata la reazione di amplificazione
NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification)
utilizzata nel sistema NucliSens EasyQ in Real Time
della Bio-Merieux. La reazione si basa sull’amplificazione
isotermica a 41°C dell’RNA del microrganismo e
sulla contemporanea rilevazione dell’amplificato mediante
l’utilizzo di sonde specifiche Molecular Beacons (MB) le
quali si legano alla sequenza target dell’RNA amplificato
e generano un segnale che viene rilevato proprio in
“real time detection”. L’avvenuta amplificazione di ciascun
microrganismo e la correttezza dell’intera metodica è stata
valutata con un controllo interno.
Risultati
La rilevazione dei microrganismi con la metodica in PCR
“Real Time” nei 5 anni ha fornito i seguenti risultati
percentuali sul totale degli isolati : anno 2005 positivi
1,85%, anno 2006 positivi 4,41%, anno 2007 positivi
21,5%, anno 2008 positivi 19,46, anno 2009 positivi
10,1%. Le percentuali di positività indicate si riferiscono
alla totalità dei microrganismi (Micoplasma, Clamidia,
Legionella e VRS) rilevati per anno e nell’ambito di
tali percentuali il VRS rappresenta la componente più
importante.
Le positività rilevanti del 2007 e del 2008 coincidono con
il picco di epidemia influenzale che si è verificato negli
stessi anni. La metodica di rilevazione dei microrganismi
in PCR “Real Time” appare essere molto più sensibile
delle metodiche immuno sierologiche.
Bibliografia
“Evaluetion of different nucleic acid amplification
techniques for the detection of M. pneumonia, C.
pneumonie and Legionella spp. In respiratory specimens
from patients with community-acquired pneumonia.” K.
Loens, T. Beck, D. Ursi, M. Overdijk, P. Sillikens, H.
Goossens, M. Ieven. Journal of Microbiological Methods
73 (2008) 257-262
403
031
DETECTION OF GENOMIC REARRANGEMENTS IN
B-CELL CHRONIC LYMPHOCITIC LEUKEMIA: MLPA
vs FISH
1
3
1
2
C. Dininno , O. Scarciolla , G. Lauria , S. Fabris , G.
4
5
5
7
Cutrona , A. Ciancio , C. Mannarella , E. Vitullo , F.
6
2
5
1
Morabito , A. Neri , A. Fragasso , R.A. Cifarelli
1
Centro Diagn. Ric. X-Life, Osp. Madonna delle Grazie,
Matera
2
Centro Ric. Studio Leucemie, Univ. Milano, Fond.
IRCCS Polic., Milano
3
U.O. Ost. e Gin., Osp. Madonna delle Grazie, Matera
4
Div. Onc. Med.-Ist. Naz. Ric. Cancro, IST, Genova
5
U.O. Emat., Osp. Madonna delle Grazie, Matera
6
U.O.C. Emat., A.O. Cosenza
7
U.O. Pat. Clin. e Lab. An., Osp. Madonna delle Grazie,
Matera
B-Chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) is characterized
by highly clinical and biological heterogeneity.
Chromosomal changes have been detected in the majority
of B-CLL samples by use of interphase FISH, showing
a clinical relevance of specific genetic abnormalities,
such as 13q14, 11q22–q23, 17p13 deletions and
trisomy12.Recently, the Multiplex Ligation-dependent
Probe Amplification (MLPA) technique, has been reported
for the evaluation of DNA copy number. We performed
MLPA assay in 79 B-CLL patients in Binet stage A
comparing the results with available FISH data. 70/79
samples investigated by FISH were also analyzed for
CD38 and ZAP-70 expression and IgVH mutational
status.MLPA assay was performed according to the
manufacturer’s recommendations. Data were analyzed
with Coffalyser Software. FISH analyses were performed
using a set of commercially available probes specific for
del11q22-23, +12, del13q14 and del17p13.A minimum of
100 interphase nuclei were evaluated. MLPA and FISH
approaches detected 13q14 deletion in 40 patients (51%),
11 of which showed biallelic deletion at MLPA analysis
and only 6 by FISH.In 3 cases FISH was unable to
detect the biallelic deletion because MLPA use several
small probes instead of one large one for the minimal
deletion region. In 2 cases MLPA was unable to detect
both monoallelic and biallelic13q deletions pattern in the
same sample. Identical results were obtained for 15 (19%)
cases with trisomy 12. 17p13 deletions were detected
by MLPA in 4 of the 6 cases detected by FISH (8%),
whereas 11q23 deletions were found by MLPA in 13
of the 14 B-CLLs detected by FISH (18%); in the 3
cases detected only by FISH, the low percentage of
cells carrying the alterations (<30%) may hamper MLPA
detection.Finally, MLPA showed in 5 patients (5%) other
chromosomal alterations: three duplication 2p24, one
deletion of 6q25-26, one deletion 9p21 and duplication
8q24. Our study showed a good correlation between the
MLPA and FISH results (96%). Moreover, MLPA and
FISH showed a comparable sensitivity. These results
suggest that MLPA may represent a useful technique for
analysis of genomic alterations in B-CLL and proven to
be rapid, cost effective and easy-performing, enabling the
simultaneous analysis of many samples.
404
032
EFFECTIVENESS OF HIGH-THROUGHPUT CYP2D6
GENOTYPING IN THE IDENTIFICATION OF THE
RESPONDER PHENOTYPE TO DONEPEZIL
TREATMENT
1
1
2
1
A.P. Gallo , M. Savino , D. Seripa , M. Garrubba , A.
2
1
Pilotto , S.A. Santini
1
Clinical Analysis Laboratory, Dept. of Clinical
Pathology,CSS Hospital, IRCCS, San Giovanni Rotondo
(FG)
2
Geriatric Unit - Gerontology-Geriatrics Research
Laboratory, Dept. of Medical Sciences, CSS Hospital,
IRCCS, San Giovanni Rotondo (FG)
Background: A recent study reported an association of
the single-nucleotide polymorphism (SNP) rs1080985 in
the promoter region of CYP2D6 with a poor response to
donepezil treatment in patients with Alzheimer’s disease
(AD). At present, however, more data can be obtained
by high-throughput genetic analysis in respect to a
single SNP analysis. Aim of this study is the analysis
of CYP2D6 in patients with AD by means of an highthroughput genetic analysis to evaluate its effectiveness
in the identification of patients responder/non-responder
to donepezil treatment.
Method: Sixty patients clinically diagnosed as AD
classified as responders (n = 37) or non-responders
(n = 23) to donepezil treatment were genotyped for
CYP2D6 clinical relevant polymorphisms by means of the
AutoGenomics INFINITITM CYP4502D6-I assay on the
AutoGenomics INFINITITM analyzer.
Results: An higher frequency of mutated alleles in
responder than in non-responder patients (75.38% vs
43.48%; p=0.015) was observed. Thus, the presence
of a mutated allele of CYP2D6 was associated with
a response to CYP2D6-metabolized drugs (OR=4.044
(1.348–12.154). No difference was observed in the
distribution of allele rs1080985 (p=0.320).
Conclusions: The high-throughput genetic analysis of the
CYP2D6 polymorphisms better discriminate responders/
non-responders in respect to the standard analysis of the
CYP2D6 polymorphysm rs1080985. Our result indicate
that an high throughput genetic assays may be useful
in clinical practice to identify subgroups of patients with
particular CYP2D6 genotypes showing different clinical
response to drug treatments.
References. Pilotto A, Franceschi M, D'Onofrio G,
Bizzarro A, Mangialasche F, Cascavilla L, Paris F,
Matera MG, Pilotto A, Daniele A, Mecocci P, Masullo
C, Dallapiccola B, Seripa D. 2009. Effect of a CYP2D6
polymorphism on the efficacy of donepezil in patients with
Alzheimer disease. Neurology 73:761-767.
033
CNP mRNA EXPRESSION IN AN EXPERIMENTAL
ANIMAL MODEL OF MYOCARDIAL INFARCTION
1
2
3
1
M. Cabiati , A. Martino , C. Caselli , M. Campan , T.
3
3
3
Prescimone , D. Giannessi , S. Del Ry
1
Sector of Medicine, Scuola Superiore Sant’Anna, Pisa,
Italy.
2
Univ. of Pisa, Department of Biology – Section Genetics
3
CNR Institute of Clinical Physiology and Fondazione G.
Monasterio, Lab of Cardiovascular Biochemistry, Pisa,
Italy
Background. In the mammalian myocardium natriuretic
peptides are regulatory autcoids whose functions
include cytoprotection against ischemia–reperfusion
injury. Recently, a great deal of interest has focused on
the relationship between ischemia and brain natriuretic
peptide (BNP) release as a potential diagnostic and
prognostic marker of acute myocardial ischemia. Studies
on CNP demonstrated that continuous administration of
CNP improved left ventricular dysfunction and attenuated
the development of cardiac remodeling after myocardial
infarct.
Aim. To determine possible myocardial alterations in the
expression of CNP in an experimental animal model of
myocardial infarction (MI).
Materials and Methods. Left ventricular (LV) tissue
was collected from male adult minipigs with MI (n=4),
induced by permanent surgical legation of the left anterior
descending coronary artery and from 5 healthy pigs.
mRNA expression of CNP was determined by Real TimePCR in LV tissue samples collected from border (BZ)
and remote zones (RZ) of infarcted area and from LV
of healthy pigs. As control, in the same samples, we
also evaluated BNP expression. Multiple reference genes
were tested and geometric mean of the four most stably
expressed genes (CYC, TBP, ACTB, GAPDH) was used
for normalization of mRNA expression of CNP and BNP
in each sample.
Results: Transmural infarction affected about 15% of
the LV wall mass. After 4 weeks, mRNA expression
was higher in infarcted regions than in controls for
CNP (controls=2.44±2.7, BZ=15.4±7.6, RZ=2.19±0.8,
p=0.03 BZ vs. RZ) and for BNP (controls=0.04±0.02,
BZ=16.2±4.6, RZ=2.2±1.3 p=0.0016, p=0.0016, controls
vs. BZ and BZ vs. RZ respectively).
Conclusion. Our results show that in addition of BNP also
CNP is overexpress in MI confirming the involvement of
this peptide in myocardial ischemia.
The vasorelaxant actions of BNP together with the
antifibrotic and antihypertrophic actions of CNP could
have an synergistic effect playing a beneficial and
protective action on the failing heart. CNP could become
an important target for the development and evaluation in
animals models of new treatments of MI which could be
transferred to clinical practice.
Ref: Burley DS et al. Cardioprotective actions of peptide
hormones in myocardial ischemia. Heart Fail Rev 2007;
12:279-91.
034
SELECTION AND VALIDATION OF REFERENCE
GENES FOR NORMALIZATION OF REAL-TIME
RT-PCR DATA IN HEART FAILURE: STUDY IN A
EXPERIMENTAL ANIMAL MODEL
1
2
1
M. Cabiati , A. Martino , M. Campan , T.
3
3
2
3
Prescimone , C. Caselli , A. Rossi , D. Giannessi , S.
3
Del Ry
1
Sector of Medicine, Scuola Superiore Sant’Anna, Pisa,
Italy
2
Univ. of Pisa, Department of Biology – Section Genetics
3
CNR Institute of Clinical Physiology, Laboratory of
Cardiovascular Biochemistry, Pisa, Italy
Background. At present, the pig represents the eligible
experimental animal model to study cardiovascular
disease and it is particularly used in heart failure
(HF). Pacing induced HF model is considered the gold
standard in HF research. In molecular biology this animal
model allows the investigation of gene-expression profile
because, being free of confounding effects, reflects the
natural history of the disease. Real-time RT-PCR (RTPCR) is the benchmark method for measuring mRNA
expression levels but accuracy and reproducibility of
RT-PCR data are reliant on appropriate normalization
strategies. The selection of most stable expressed genes
validated between a set of multiple and carefully selected
targets is considered the best approach for normalization
purpose of RT-PCR data. While in human myocardium
the selection of reference gene has been performed, to
date, no specific reference genes have been identified in
porcine myocardium.
Aim. To develop a set of reference genes to use for
normalizing mRNA expression data obtained by RT-PCR
in different cardiac chambers of normal and HF minipigs.
Methods and Results. Cardiac tissue was collected
from adult minipigs without (control, n=4) and with
pacing-induced HF (n=5). Eight candidate reference
genes (GAPDH, ACTB,B2M,TBP, HPRT-1, PPIA,
TOP2B,YWHAZ), among the most used reference in the
literature were selected and HPRT1, TBP and PPIA were
found to be the most stable in right and left atria, PPIA,
GAPDH and ACTB in the right ventricle and HPRT1,
TBP and GAPDH in the left ventricle. The normalization
strategy was tested analyzing mRNA expression of
tumor necrosis factor (TNF)-α, a classical inflammation
marker known to be up-regulated in HF by RT-PCR. The
difference of TNF-α mRNA expression between normal
and HF samples resulted more significant when data have
been normalized with the selected reference genes.
Conclusions. The finding obtained in this study underline
the importance to provide a set of reference genes to
normalize mRNA expression in HF and controls minipigs.
The use of unvalidated reference genes can generate
biased results because also their expression could be
altered by the experimental conditions.
Ref. Vandesompele J et al Accurate normalization of realtime quantitative RT-PCR data by geometric averaging
of multiple internal control genes. Genom Biol 2002; 3:
RESEARCH0034
405
035
IDENTIFICATION OF A NOVEL MUTATION IN
UDP-GLUCURONOSYLTRANSFERASE GENE IN
A PATIENT WITH NEONATAL UNCONJUGATED
HYPERBILIRUBINEMIA
1
1
1
1
D. Tripodi , A. Minucci , B. Giardina , C. Zuppi , E.
1
Capoluongo
1
Lab. of Clinical Molecular Diagnostic, Institute of
Biochemistry and Clinical Biochemistry, Catholic
University of Rome, Italy.
Background: Genetic alterations of the UGT1A1
gene result in Crigler-Najjar Syndrome (CNS) and
Gilbert’s Syndrome (GS), an autosomal recessive
conditions characterized by non-hemolytic unconjugated
hyperbilirubinemia. In according to the levels of the serum
bilirubin, CNS is classified in two types: type I and type
II. In CNS I patients, mutations in UGT1A1 determine the
about total loss of UGT1A1 enzyme activity, while in CNS
II minimal levels of UGT1A1 activity are maintained.
Aim and Methods: We report the molecular UGT1A1
gene characterization of an Italian patient presenting
hyperbilirubinemia in the neonatal period. The infant
was born at full term, weighing 3320 g, from nonconsanguineous parents and without any family history
of jaundice. Serum total bilirubin was 21 mg/dl on the
second day of life. The child was exposed to intensive
phototherapy until 15th postnatal day. After phototherapy,
plasmatic concentration of indirect birilubin dropped at 5
mg/dl only in the fourth month of life.
Results: Direct sequencing of the whole UGT1A1 gene
from the patient revealed the presence of a known deletion
(c.508_510delTTC) encompassing the exon1 and a novel
mutation in the exon4 (c.1099C>T). Mother and father
were both carriers of the deletion (mother) and the new
mutation (father), respectively, confirming the allelic in
trans transmission.
Discussion: CNS has an incidence around 1/1.000.000
births, but only few hundred cases have been described:
for these reasons the real prevalence of UGT1A1 mutation
in Italian population is not well established. Since a better
evaluation of the causes of persistent hyperbilirubinemia,
particularly in newborns suffering from haemolytic crises,
needs to be performed and planned, our intent is to
check the incidence of the UGT1A1 mutation in Italian
population. We underline that these information may be
useful also for the pharmacogenetic implications of the
UGT1A1 status for drug development and therapy. Also
considering that literature data reported a frequency of
UGT1A1 mutated heterozygotes of about 1/500.
References
Strassburg CP. Gilbert-Meulengracht's syndrome and
pharmacogenetics: is jaundice just the tip of the iceberg?
Drug Metab Rev. 2010;42:162-75.
406
036
CORRELAZIONE TRA I POLIMORFISMI DEL GENE
OLR1 E LE MUTAZIONI DEI GENI Β-FIBRINOGENO,
MTHFR, ACE, FATTORE V E PROTROMBINA IN
PAZIENTI CON MALATTIA CEREBROVASCOLARE
ISCHEMICA
1
1
1
1
M.T. Vietri , A.M. Molinari , M. Boggia , G. Porcaro , G.
1
1
1
1
Caliendo , M.L. De Paola , M. Parisi , M. Cioffi
1
Dip. di Patologia Generale Cattedra di Patologia Clinica
Facoltà di Medicina e Chirurgia Seconda Università di
Napoli
La patogenesi della malattia cerebrovascolare (MCV)
è stata associata a mutazioni dei geni ß-fibrinogeno,
MTHFR, ACE, fattore V e protrombina.
In uno studio precedente abbiamo valutato l’associazione
tra i polimorfismi del gene OLR1 (IVS4- 14 A/G e
IVS4 -73 C/T) e la MCV. OLR1 codifica per LOX-1,
recettore delle ox-LDL. I polimorfismi di OLR1, in linkage
disequilibrium, regolano l’espressione dell’isoforma di
splicing LOXINA, mancante del dominio responsabile
del legame alle ox-LDL. Gli alleli G di IVS4- 14 e
T di IVS4 -73 determinano la sintesi del recettore
LOX-1, che contiene il dominio, mentre gli alleli A
e C determinano la sintesi della LOXINA. I risultati
mostrano una differenza statisticamente significativa tra
la distribuzione del genotipo GG e TT nei pazienti rispetto
ai controlli (p=0,01).
Obiettivo di questo studio è valutare in pazienti con MCV
l’associazione tra i polimorfismi di OLR1 e le mutazioni
dei geni ß-Fibrinogeno -455G>A, MTHFR C677T, MTHFR
A1298C, ACE I/D, fattore V G1691A, fattore V H1299R,
protrombina G20201A.
Sono stati selezionati 43 pazienti (M=19; F=24; 26-65
anni) affetti da MCV ischemica e 42 soggetti di controllo.
La ricerca delle mutazioni è stata condotta con metodica
multiplex PCR/Ibridazione inversa su striscia.
Diversi studi hanno suggerito un coinvolgimento di più
mutazioni nell’insorgenza della MCV, riportando dati
controversi. I nostri risultati non hanno mostrato differenze
statisticamente significative tra i pazienti ed i controlli per
le mutazioni studiate, in accordo con i dati riportati in
letteratura.
Nei pazienti selezionati la sola correlazione significativa
è con i polimorfismi di OLR1. In essi è più frequente
l’isoforma LOX-1, che induce l’internalizzazione delle
ox-LDL ed una cascata di eventi responsabili di
disfunzione e danno endoteliale. LOX-1 potrebbe giocare
un ruolo fondamentale nell’esordio e nella progressione
dell’aterosclerosi, contribuendo alla patogenesi delle
MCV.
In conclusione le mutazioni studiate non sembrano
costituire un ulteriore fattore di rischio per stroke
ischemico, mentre l’analisi dei polimorfismi di ORL1
potrebbe rappresentare un approccio clinico utile per
valutare i fattori di rischio per le MCV.
1)Vietri MT et al, Genet Test 2010; 14:9-11
2)Streifler JY et al, Strokeb2001; 32:2753-58
037
A NEW UNIVERSAL AND SELF-CONTAINING
LYOPHILIZED PCR MIX
1
2
1
M. Gramegna , E. Castiglioni , A. Moiana , M.
3
4
Zanussi , M. Ferrari
1
Sentinel CH. SpA, Milano, Italy
2
Vita-Salute San Raffaele University, Milano, Italy
3
Diagnostica e Ricerca San Raffaele SpA, Milano, Italy
4
San Raffaele Scientific Institute, Genomic Unit for the
Diagnosis of Human Pathologies, Center for Genomics,
Bioinformatics and Biostatistics, Milan, Italy.
PCR Mixes, as well as enzymes and amplification mixes
components, are usually stored at a -20° or +2/8°C. As
a consequence, a number of freezers and fridges need
to be implemented in the laboratories. The new STATNAT patented technology, that involves a new cocktail of
preservatives and stabilizers that maintain the enzymes’
activity during freeze drying, allows the storage at
room temperature of self-containing amplification mixes,
enzymes included, for one year without any diminished
activity or performances.
The aim of this study is to show the features of the
new STAT-NAT system and its applications in the most
diffused molecular biology techniques.
The mixes are in a ready to use format. They can be
prepared without primers, mainly for the research field, or
in a complete configuration if for a diagnostic test.
In particular, to evaluate the performance of the
Universal Master Mix we considered 4 different molecular
applications: direct sequencing (3730 DNA analyser,
Applied Biosystems) following DNA amplification
(MyCycler Personal Thermal Cycler, BioRad) and PCR
purification (MultiScreen HTS Vacuum Manifold system,
Millipore), Real Time PCR in presence of a fluorescent
dye, Melting Curve Analysis and High Resolution
Melting analysis (Rotor-Gene 6000 5plex HRM, Corbett
Research). After a preliminary comparison between the
reagents currently in use in our laboratories and the ones
obtained with STAT-NAT technology we analyzed 30 DNA
samples with both the systems.
STAT-NAT mixes showed a good performance for all the 4
applications, with a perfect agreement in all the evaluated
tests. In particular, the specific composition of the freeze
dried mixes, excluding particular compounds that could
affect the purification step, yielded an high quality of
sequencing products.
We can conclude that, the ready to use format, the room
temperature storage, and the sample volume flexibility,
guarantee a simple and effective use in several molecular
biology systems, shortening the assembling time and
minimizing the contamination risk.
038
LA BIOLOGIA MOLECOLARE NELLE ßTALASSEMIE: NUOVI APPROCCI METODOLOGICI
1
1
1
1
A. Amato , M. Perri , I. Zaghis , P. Grisanti , D.
1
1
Zei , M.P. Cappabianca
1
ANMI Onlus, Centro Studi Microcitemie Roma, Roma
Negli ultimi anni, nel nostro Centro di prevenzione e
diagnosi della talassemia, è aumentato il numero di
pazienti, soprattutto a causa di una sempre maggiore
affluenza di stranieri. Ciò ha portato ad un incremento
delle mutazioni da indagare nel gene ß-globinico, la
maggior parte delle quali risulta essere di tipo non
delezionale: per questo motivo la caratterizzazione dei
difetti molecolari viene da noi effettuata mediante la
tecnica ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation
System) utilizzando primer selezionati in base alle
origini etniche dei soggetti in esame. I casi non risolti
con la tecnica sopra descritta, vengono caratterizzati
mediante l’analisi di sequenza del gene ß-globinico.
L’impiego del sequenziatore automatico (Beckman
TM
Coulter CEQ
8000 Genetic Analysis System) ha
reso possibile l’identificazione di mutazioni rare, mai
individuate precedentemente nel nostro Laboratorio. In
particolare, sono state riscontrate emoglobine varianti,
già rilevate dalla presenza di picchi anomali mediante
HPLC a scambio cationico (Variant II Bio-Rad), come
Hb Camperdown, Hb Shelby, Hb G-Copenhagen, Hb
K-Ibadan, Hb O-Arab, Hb Raleigh, Hb J-Guantanamo,
Hb Agenogi e Hb South Florida ed emoglobine varianti,
non evidenziate mediante HPLC, come Hb Ernz e Hb
Potomac. Sono state inoltre individuate delezioni che
provocano slittamenti del modulo di lettura [cd 82-83 (G), cd 51 (-CT)], delezioni e sostituzioni nucleotidiche che
determinano alterazioni dello splicing [IVS II-2 (-12bp);
IVS I-130 (G#C); IVS II-705 (T#G)], mutazioni che
provocano difetti di trascrizione [-29 (A#G)] e sostituzioni
nucleotidiche che alterano il sito di poliadenilazione del
pre-mRNA (AATAAA#AACAAA). Per quanto riguarda
la caratterizzazione delle ß-talassemie delezionali viene
utilizzata la tecnica della GAP-PCR e per le delezioni non
note si ricorre alla metodica MLPA (Multiplex Ligationdependent Probe Amplification), con la quale è stato
(1)
possibile evidenziare la nuova delezione Leiden 7,4kb .
L’utilizzo di nuove metodiche è risultato, quindi, essere
fondamentale per l’individuazione di difetti molecolari rari
o non noti e per una corretta diagnosi di ß-talassemia,
altrimenti impossibile con i consueti kit diagnostici.
(1)
Phylipsen M. et al.: “Two new beta-thalassemia
deletions .....”. Haematologica 2009 Sep;94(9):1289-92.
407
039
NT-S100A8 INHIBITS INSULIN RELEASE AND
ACTIVATES AKT AND NF-KB CELL SIGNALLING IN
PANCREATIC CANCER (PC) CELLS
1
1
1
1
S. Moz , A. Padoan , D. Bozzato , E. Fadi , P.
2
1
2
2
Fogar , E. Greco , F. Navaglia , C. Zambon , S.
3
2
4
Pedrazzoli , D. Basso , M. Plebani
1
Dip. Sc. Diagn. e Terapie Speciali, Univ. Padova
2
Dip. Medicina di Laboratorio, A.O. di Padova
3
Dip. Sc. Mediche e Chirurgiche, Univ. Padova
4
Dip. Sc. Diagn. e Terapie Speciali-Medicina di
Laboratorio, A.O.U. Padova
Objectives:to verify whether NTS100A8, a peptide
isolated from PC tissue of diabetic patients:1) alters
Akt and NFκB signalling in PC cells,2) interferes with
insulin (Ins) signalling,3) alters Ins response to glucose
stimulation.
Methods:PC cell lines (BxPC3,Capan1,MiaPaCa2)
remained unstimulated or were stimulated with 50mU
Ins for 10 min with/without 50 and 500 nM NTS100A8
for 5,10,15 and 30 min. Cell lysates immunoblots were
473
performed with pIκBα, pAkt (Ser
241
308
,Thr
), Akt, pPDK1
2448
(Ser ), p-mTOR (Ser
), ßactin antibodies. ßTC6 rat
insulinoma cells were untreated or treated 30 min daily for
1 week with 50, 200 and 500nM NTS100A8 plus 20mM
glucose or with 20mM glucose alone. Cells were then
stimulated with 20mM glucose and Ins was measured at
2,3,5,10,15,30min.
Results:both Ins and NTS100A8 independently induced
Akt Ser
473
phosphorylation in BxPC3 and MiaPaCa2,
308
not in Capan1. Akt Thr
phosphorylation in all PC cell
lines was induced by Ins, not by NTS100A8. NTS100A8
time and dose-dependently induced p-mTOR in BxPC3,
but it did not induce pPDK1. To study NFκB signalling
we assessed the phosphorylation of its cytoplasmic
inhibitor IκBα. In all cell lines IκBα was constitutively
phosphorylated. Ins determined a significant reduction of
pIκBα in Capan1 and MiaPaCa2 and an enhancement
in BxPC3, effects not counteracted by NTS100A8. In
BxPC3 and Capan1, NTS100A8 caused an increase in
pIκBα after 5min, followed by a reduction at 10 and
15min and recovery at 30min. pIκBα in MiaPaCa2 cells
was not modified. Glucose induced early (2min) and
late (15-30min) Ins release in control ßTC6 cells. The
amount of Ins release was progressively reduced when
cells were stimulated with glucose for one week and
almost completely abolished when glucose was given with
NTS100A8 (Repeated measures ANOVA:p<0.001).
Conclusions:NTS100A8 in PC cells induces Akt
phosphorylation through mTOR signalling pathway not
PDK1 pathway and activates NFkB signalling. These
findings support a possible role of NTS100A8 in promoting
PC cell survival. This peptide does not counteract Ins
signalling, but its chronic exposure abolishes Ins response
to glucose and this supports for its role as a diabetogen.
2+
Soderling TR.The Ca -calmodulin-dependent protein
kinase cascade.TIBS.1999 Jun;24(6):232-6
408
040
ALFA 1 ANTITRIPSINA ED EMOCROMATOSI IN
SARDEGNA: CASO CLINICO DI CIRROSI EPATICA
CON DOPPIA ETEROZIGOSI M-CAGLIARI/H63D
2
2
2
3
P. Coni , S. Manconi , G. Faa , G. Angioni , G.
3
3
Melis , F. Coghe
1
DSS. (DNA Sequencing Service) – Univ. degli Studi di
Cagliari
2
Anatomia Patologica A.O.U. di Cagliari
3
Lab. Analisi Chimico Cliniche e Microbiologia – A.O.U.
di Cagliari
L’alfa 1 antitripsina (AAT) è una glicoproteina plasmatica
prodotta prevalentemente dal fegato con attività
antiproteasica. Il ruolo principale dell’AAT negli alveoli
polmonari è quello di evitare la digestione di fibre elastiche
del polmone da parte di un elevata concentrazione
di elastasi alveolare, presente durante l’infiammazione.
Per questo motivo, una grave carenza serica è spesso
associata a enfisema polmonare giovanile o ad altre
patologie polmonari. La carenza congenita di AAT è
causata più che da una mancata sintesi epatica, da
un inefficace trasporto in circolo della proteina mutata
che, accumulandosi all’interno degli epatociti, induce
gravi epatopatie. L’emocromatosi (HFE) è una malattia
congenita caratterizzata da un progressivo accumulo in
diversi organi di ferro e, nel fegato è il principale fattore
genetico di rischio per epatopatie.
Queste due malattie congenite da accumulo epatiche
vengono definite come autosomiche recessive e
dovrebbero essere associate a processi patologici solo
nella forma omozigote. Il caso descritto in questo poster
dimostra invece che anche uno stato di doppia eterozigosi
AAT e HFE (M-Cagliari/H63D) può causare direttamente
una grave cirrosi epatica.
Una possibile spiegazione di questo caso clinico
deriva dal fatto che un iniziale accumulo di ferro può
inibire il sistema di degradazione Ubiquitina/Proteosoma,
che normalmente elimina l’AAT alterata; a sua volta
l’accumulo di AAT altera il normale trasporto intraepatico
del ferro aumentandone l’accumulo. Per questo motivo ci
chiediamo se in questi casi sia possibile prevenire il danno
epatico con l’uso di chelanti per il ferro.
041
LO SCREENING MUTAZIONALE MULTIGENICO
MEDIANTE APEX ARRAY PUÒ ESSERE UTILIZZATO
COME SCREENING DI SECONDO LIVELLO NELLA
DIAGNOSI MOLECOLARE DELLE IPOACUSIE
CONGENITE
042
POLYMORPHISMS OF THE INTERLEUKIN-1BETA
GENE CLUSTER IN ATHLETES: INTERLEUKIN-1
RECEPTOR ANTAGONIST POLYMORPHISM
ASSOCIATES WITH ATHLETIC PHENOTYPE
1
1
1
1
G. Sauchelli , A.A. Crispo , I.C.M. Tandurella , G.
2
1
Esposito , F. Salvatore
1
Ceinge Biotecnologie Avanzate s.c.a r.l., Napoli
2
Dip. di Biochimica e Biotecnologie Mediche, Univ. di
Napoli Federico II
L‘ipoacusia è la forma più frequente di deficit sensoriale
(1/1.000). Nella maggioranza dei casi, la sordità è
isolata (NSHL), in quanto la perdita dell'udito è l'unica
anomalia clinica. Nei paesi sviluppati, il 60-80% delle
ipoacusie ad esordio precoce sono di origine genetica
e sono trasmesse con modalità autosomica recessiva
(80% dei casi), dominante (20%), X-linked recessiva e
mitocondriale (meno dell’1%). Sono caratterizzate da una
notevole eterogeneità genetica, con 46 geni identificati.
Mutazioni diverse nello stesso gene possono essere
associate sia a forme recessive che dominanti. In alcuni
casi, il deficit uditivo può essere associato a mutazioni in
2 differenti geni dello stessa famiglia funzionale (GJB2 e
GJB6). Mutazioni nel gene GJB2 si riscontrano nel 50%
dei casi di sordità infantile; in particolare, la mutazione
prevalente nel gene GJB2 è la delezione 35delG.
Per la messa a punto della strategia diagnosticomolecolare più idonea nella nostra popolazione, abbiamo
analizzato il DNA di 20 pazienti italiani affetti da NSHL
(15 recessive, 5 dominanti), mediante Apex array. Con
questa tecnologia è possibile valutare simultaneamente la
presenza di circa 180 mutazioni note, localizzate nei geni
GJB2, GJB6, GJB3, SLC26A4, SLC26A5, e nel mtDNA.
L’analisi ha identificato 2 mutazioni in 7/15 pazienti (47%)
con forma recessiva, 1 sola mutazione in 2/15 pazienti
(13%), 0 mutazioni in 6/15 pazienti (40%). In uno di questi
pazienti, è stata trovata una mutazione in GJB2 ed una
in GJB6, ciascuna ereditata da un genitore. In uno solo
dei 5 pazienti con forma dominante, il chip ha identificato
la mutazione-malattia (1). Tutte le mutazioni identificate
sono state confermate con sequenziamento. Nei nostri
pazienti con forma recessiva, la mutazione prevalente
(37% degli alleli) è la 35delG in GJB2, in accordo con
la letteratura. In totale, 15/17 mutazioni identificate (88%)
cadono in GJB2, 1 in GJB6, 1 in SLC26A4. In conclusione,
l’analisi di GJB2 deve essere eseguita come test di primo
livello per la diagnosi molecolare delle NSHL; nei pazienti
negativi, può essere eseguita come test di secondo livello
l’analisi mediante Apex array.
(1) Feldmann, D.et al. Am. J. Med. Genet. 137A: 225-227,
2005.
Finanziato da: Regione Campania, DGRC 1901/2009.
1
1
S. Cauci , M. Di Santolo , L. Debellis , K.
3
2
4
Ryckman , S.M. Williams , G. Banfi
1
Dept of Biomedical Sciences and Technologies, School
of Medicine, University of Udine, Udine, Italy
2
Center for Human Genetics Research, Vanderbilt
University, Nashville, TN, USA
3
Department of Pediatrics, University of Iowa, Iowa City,
IA ,USA
4
IRCCS Orthopedic Hospital Galeazzi, and School of
Medicine, University of Milan, Milan, Italy
Introduction. The interleukin-1 (IL-1) family of cytokines
is involved in the inflammatory and repair reactions
of the skeletal muscle during and after exercise.
Plasma levels of the IL-1 receptor antagonist (IL-1ra)
increase dramatically soon after endurance exercise.
Factors predisposing to athletic performance are not fully
characterized. Accumulating data point to an effect of
genetic polymorphisms on the athletic phenotype. The
IL-1 genotype family may potentially affect the adaptations
to chronic resistance exercise.
Aim. We explored whether IL-1 polymorphisms are
associated with athletic phenotype in white European
subjects.
METHODS. Genomic DNA was obtained from 205
athletes, and 458 sedentary controls. Two diallelic
polymorphisms in the IL-1β gene (IL-1B) representing C/
T base transitions at –511 and +3954 positions, and a
variable number tandem repeats (VNTR) in intron 2 of the
IL-1ra gene (IL-1RN) were assessed.
Results. We found a higher frequency of the IL-1RN
1/2 genotype in athletes (41.0%, 84/205) compared
to sedentary controls (26.4%, 121/458), with an odds
ratio (OR) = 1.93 (95% CI = 1.37-2.74), and a lower
frequency of the 1/1 genotype 43.9% (90/205) versus
58.5% (268/458), OR = 0.55 (95% CI = 0.40-0.77).
However, frequency of the IL-1RN 2/2 genotype did
not differ between groups. No significant findings were
obtained by comparison of either –511 or +3954 IL-1B
polymorphisms between athletes and sedentary controls.
Conclusion. We first showed that genetic variants at
the IL-1ra locus predispose to athletic phenotype among
white European subjects. Our findings suggest that
immune genetic polymorphisms may modulate the muscle
health, performance, and recovery capacities.
Cauci S, Di Santolo M, Ryckman KK, Williams SM, Banfi
G.
BMC Med Genet. 2010 Feb 22;11:29.
409
043
STUDIO DELLA DISTRIBUZIONEDEL VIRUS
DELL'EPATITE C (HCV) NELLA PROVINCIA
DI ORISTANO (SARDEGNA) MEDIANTE
SEQUENZIAMENTO CAPILLARE
044
LABORATORY DIAGNOSIS OF H1N1 VIRUS BY
INTEGRATED MOLECULAR PROCEDURE : REAL
TIME PCR/CAPILLARY DNA SEQUENCING
1
1
2
1
1
G. Orrù , G. Sanna , M. Orgiana , D. Mandas , P.
3
4
4
4
Coni , M. Pautasso , P. Ferraguti , F. Coghe
1
DSS. (DNA Sequencing Service) – Univ. di Cagliari
2
Associazione Sarda per lo Studio delle Malattie del
Fegato; Unità Spec. Gastroenterologia & Epatologia –
Oristano
3
Anatomia Patologica A.O.U. di Cagliari
4
Lab. Analisi Chimico Cliniche e Microbiologia –A.O.U.
di Cagliari
HCV è un virus ad RNA della famiglia Flaviviridae, a
singolo filamento positivo. Il genoma, lungo circa 9600
nucleotidi, è costituito da un’unica ORF che codifica per
una poliproteina di circa 3000 aminoacidi.
HCV è caratterizzato da un alto grado di variabilità
nella sequenza nucleotidica: durante la replicazione
muta continuamente; perciò il sistema immunitario deve
costantemente identificare ed eliminare varianti di recente
formazione, spesso senza riuscirci.
Scopo dello Studio
In Sardegna, come in Italia, prevale il sottotipo 1b, ma
non esistono dati di epidemiologia molecolare completi,
in particolare per alcune aree geografiche. L’analisi
molecolare di questi campioni permette di stabilire il
grado di omologia nucleotidica tra i diversi isolati e la
correlazione filogenetica tra gli stessi per poter identificare
possibili “isole di patogenicità” o una sorgente comune di
infezione, caratterizzando i ceppi anche in base alla loro
provenienza geografica.
Materiali e Metodi
Si sono eseguite indagini molecolari su 36 sieri
provenienti da pazienti affetti da epatopatia HCV-relata,
residenti in provincia di Oristano ed afferenti all’Unità di
Epatologia di Oristano.
E’ stata progettata una RT-eminested PCR con un set di
3 primers: 2 primers esterni ed 1 interno che amplificano
un frammento di circa 1000 nucleotidi. I primers sono
disegnati in due regioni altamente conservate del genoma
di HCV: la 5’UTR e la regione del core. Gli ampliconi
sono stati successivamente sequenziati tramite sintema
ABI 310 ( Applied Biosystem) e analizzati tramite sistemi
di allineamento multiplo ( ClustalW , GenBee).
Risultati
Nei campioni analizzati e’ stata confermata la prevalenza
del genotipo 4 e dei suoi sottotipi, GenBank accession.
AY962105, AY944409.
Il genoma HCV presente nei pazienti sardi, affetti da
epatite cronica HCV-relata, risulta essere modificato nella
sua sequenza, rispetto alle sequenze genotipiche note e
pubblicate in GenBank.
Per meglio precisare gli aspetti non chiariti,
relativi al rapporto HCV-ospite nell’evoluzione cronica
dell’epatopatia HCV-relata, sono necessari ulteriori studi.
410
1
1
1
G. Orrù , F. Pilia , M. Orgiana , D. Mandas , M.
2
2
1
2
Pautasso , P. Ferraguti , V. Piras , F. Coghe
1
DSS (DNA Sequencing Service) Dip. di Chirurgia e
Scienze Odontostomatologiche Universita' degli Studi di
Cagliari
2
Lab. Analisi Chimico Cliniche e Microbiologia, P. O.
San Giovanni di Dio, A.O.U. di Cagliari
Introdution:
H1N1 virus is negative sense, single-stranded,
segmented RNA viruses, it is a subtype of Influenza A
virus, in 2009 it was signaled as the most common cause
of human influenza (flu). Normally some strains of H1N1
are endemic in humans, other strains of H1N1 have been
isolated in animals ( especially pigs and birds). In June
2009, World Health Organization (WHO) stated that a
swine origin strain ( isolated in Mexico) was involved
in Human pandemic and It moving the alert level to
phase 6. This new strain appears to be a result of genic
reassortment of human influenza and swine influenza
viruses. In this contest a specific, selective methodology
was necessary for detect this virus and distinguish it
among seasonal H1N1 and the most frequent influenza A
virus ( H3N2).
Methods:
Following a previous methodology published from CDC
( Centers for Disease Control and Prevention of Altlanta) ,
we have designed a molecular procedure by using
M2 gene encoding for viral matrix protein 2 involved
in viral drug response. In the first instance a RT-real
time PCR with Fluorescence Resonance Energy Transfer
(FRET) probes was perfomed using M2 sequence
with Gen Bank accession n. GQ377104. The PCR
primers (OGM2F and OGM2R) were designed to flank
a region of 231 bp and the FRET Probes OGM2F1
were designed on the basis of (AGT-AAT) nucleotides
mismatch differences that distinguish, the M2 fragment
of the swine H1N1 from H3N2 and seasonal H1N1 by
melting curve analysis. The RT-PCR, the generation
of melting curves, and fluorescence detection, were
all performed using the LightCycler system (Roche
Diagnostics, Mannheim, Germany). Subsequently all
positive samples was confirmed by capillary sequencing
method by using the same primers couple and the same
RT-PCR amplicon. The results were compared to the M2
sequences deposited on NCBI platform. This study has
been executed on 50 subjects that reported symptoms of
influenza .
Results:
On 51 Sardinian patients 9 were positive for swine H1N1
(18%), 4 for H3N2 (8%) subtype, and 37 were negative.
This molecular system fast and capable of detecting/
distinguish swine H1N1 on human samples, could be
of help in epidemiological studies to determine the viral
subtype with high specificity.
045
RUOLO DELL’EPIGENETICA NELLA GRAVIDANZA
DELLA DONNA OBESA
1
1
046
VANIN-1 I26T POLYMORPHISM, HYPERTENSION
AND CARDIOVASCULAR EVENTS IN TWO LARGE
URBAN-BASED PROSPECTIVE STUDIES IN
SWEDES
2
M. Ferrigno , V. Capobianco , C. Nardelli , R. Di
2
3
2
2
Noto , E. Mariotti , L. Del Vecchio , L. Pastore , L.
2
4
4
2
Iaffaldano , F. Quaglia , P. Martinelli , L. Sacchetti
1
Fondazione IRCCS SDN- Istituto di Ricerca
Diagnostica e Nucleare
2
Dip. di Biochimica e Biotecnologie Mediche, Università
di Napoli Federico II e CEINGE Biotecnologie Avanzate
S.C. a R.L.
3
CEINGE Biotecnologie Avanzate S.C. a R.L.
4
Dip. di Ginecologia, Università di Napoli Federico II
Dati sperimentali su modelli animali indicano che la
regolazione epigenetica di geni fetali potrebbe essere
un importante meccanismo della programmazione fetale
dell’obesità. Inoltre, anche nell’uomo alcune malattie
dell’adulto possono originarsi in utero, come suggeriscono
alcuni studi epidemiologici. Ciò pare sia l’esito di
modifiche dello sviluppo dovute a condizioni intrauterine
non ottimali che portano a cambiamenti permanenti
nella struttura e funzione tissutali, processo denominato
“programmazione fetale o intrauterina” (Fowden AL et al.
J Neuroendocrinol. 2008;20(4):439-50).
Lo scopo dello studio è stato valutare, nelle placente
di donne gravide obese e non obese, la presenza
di una differente regolazione miRNA-dipendente della
trascrizione genica.
2
Sono state reclutate 5 gravide non obese (BMI<60 kg/m )
2
e 10 obese (BMI>60 kg/m ), al termine della gravidanza,
afferenti al Dipartimento di Ginecologia, Università degli
Studi di Napoli Federico II. L’RNA totale è stato purificato
da sezioni di placente, raccolte al momento del parto
cesareo, utilizzando il mirVana miRNA Isolation kit
(Ambion). L’espressione dei miRNAs è stata valutata con
il sistema TaqMan Array Human MicroRNA Panel v1.0
(Applied Biosystems).
La predizione dei geni target dei miRNAs diversamente
espressi nelle obese rispetto alle non obese è
stata effettuata con il programma TargetScan mentre
il programma Gene Ontology è stato usato per
l’identificazione dei pathways metabolici in cui tali geni
è predetto siano coinvolti. I risultati hanno evidenziato
che: 1) il 78% dei miRNAs studiati è espresso nel tessuto
placentale; 2) il 48% dei miRNA espressi è diversamente
regolato nelle placente di donne gravide obese rispetto a
quelle delle donne gravide non obese; 6) alcuni geni target
dei miRNA up-espressi sono coinvolti nei pathways del
TGFß e del signalling dell’insulina.
Lavoro finanziato da Conv. CEINGE-Regione Campania
(DGRC 1901/2009), Regione Campania LR n5/2005 e
MIUR PRIN 2008.
1
1
2
3
M. Montagnana , E. Danese , C. Fava , M. Sjogren , P.
3
3
3
2
Almgren , G. Engström , B. Hedblad , P. Minuz , G.C.
1
3
Guidi , O. Melander
1
Dept. of Life and Reproduction Sciences, University
Hospital of Verona, Italy.
2
Dept. of Medicine, University Hospital of Verona, Italy.
3
Dept. of Clinical Sciences, Lund University, University
Hospital of Malmö, Sweden.
Background. Vanin-1 (gene name VNN1) is an enzyme
with pantetheinase activity generating the amino-thiol
cysteamine which is implicated in the regulation of redox
status through its effect on glutathione. We tested the
hypothesis that the rs2294757 VNN1 I26T polymorphism
could affect blood pressure (BP) levels, hypertension
prevalence, and risk of incident cardiovascular events.
Methods. The VNN1 I26T polymorphism was genotyped
in 5664 participants of the cardiovascular cohort
of the "Malmö Diet and Cancer" (MDC-CVA) study
and successively in 17874 participants of the
“Malmö Preventive project”(MPP). The incidence of
cardiovascular events was monitored for an average of
nearly 12 years of follow-up in the MDC-CVA and for 25
years in the MPP.
Results. Both before and after adjustment for sex, age
and BMI in the MDC-CVA the polymorphism had a
mild lowering effect on diastolic BP and hypertension,
especially in females. However in MPP no effect on BP
phenotypes was detectable.
Kaplan-Meier curves compared by log-rank test did not
show any statistical difference in cardiac events (n=304
in MDC-CVA and n=1290 in MPP) and cerebral ischemic
episodes (n=261 in MDC-CVA and n=855 in MPP)
in carriers of different VNN1 I26T genotypes. In Cox
regression analysis, adjusting for age and sex carriers of
at least one 26T allele were not significantly protected in
the MDC-CVA either from coronary events (H.R. 0.907,
95%C.I. 0.722-1.138; p=0.40) or stroke (H.R. 0.912,
95%C.I. 0.713-1.166; p=0.46) and in the MPP (H.R. for
coronary events 0.992, 95%C.I. 0.888-1.108; p=0.89;
H.R. for stroke 1.005, 95%C.I. 0.877-1.151; p=0.95).
Conclusions. Our data do not support a major role for the
VNN1 I26T variant in determining BP level and incident
ischemic events.
411
047
LA FARMACOGENETICA NELLA TERAPIA
ANTICOAGULANTE ORALE: DALL’ANALISI
GENETICA ALLA PRATICA CLINICA
1
1
1
C. Mazzaccara , M. Toriello , R. Liguori , R.
1
2
3
Tomaiuolo , A. Cottarelli , D.F. Vitale , P.
4
1
1
Meccariello , G. Castaldo , L. Sacchetti
1
CEINGE-Biotecnologie Avanzate S.C.aR.L., Napoli –
Dip. di Biochimica e Biotecnologie Mediche, Univ. degli
Studi di Napoli Federico II, Napoli, Italia
2
Studi di Napoli Federico II, Napoli, Italia
3
Fondazione Salvatore Maugeri IRCCS Istituto di
Campoli Telese, Benevento, Italia
4
Dip. di Medicina Interna Univ. degli Studi di Napoli
Federico II, Napoli, Italia
Il Coumadin, anche noto come Warfarin Sodium,
rappresenta il farmaco di elezione utilizzato per
la prevenzione ed il trattamento dei disordini
tromboembolici. Il suo utilizzo presenta diverse difficoltà di
applicazione e necessita di un costante follow-up clinico a
causa della ristretta finestra terapeutica, delle numerose
interazioni farmacologiche ed alimentari e dell’ampia
variabilità interindividuale nella dose richiesta. Circa il
40-60% di questa variabilità è attribuita a fattori clinici,
demografici e genetici, come sesso, età, etnia, patologie
concomitanti e presenza di polimorfismi nei principali geni
coinvolti nella farmacocinetica e nella farmacodinamica
del Warfarin, quali CYP2C9, VKORC1.
Lo scopo del nostro studio è stimare la frequenza dei
polimorfismi CYP2C9*2 (430C/T; Arg144Cys), CYP2C9*3
(1075A/C; Ile359Leu), VKORC1 -1639G/A, in 206
soggetti del Sud Italia, oltre che di valutarne l’influenza
nella determinazione della dose terapeutica di farmaco in
91 pazienti in terapia con Warfarin, insieme anche alle
caratteristiche cliniche e demografiche dei pazienti.
La tipizzazione genetica dei suddetti polimorfismi
mediante Real Time, TaqMan Method, ci ha permesso di
calcolare le seguenti frequenze genotipiche ed alleliche:
CYP2C9 *1/*1 59.2%, *1/*2 21.4%, *2/*2 1.9%, *1/*3
12.6%, *3/*3 1.9%, *2/*3 2.9% (*1: 76.2%, *2: 14.0%,
*3: 9.7%); VKORC1 -1639G/G 25.7%, -1639G/A 55.8%,
-1639A/A 18.4% (G: 53.6%, A: 46.3%). I nostri risultati
hanno mostrato un chiaro e statisticamente significativo
trend di riduzione della dose assunta dai portatori di uno o
più dei suddetti polimorfismi rispetto ai soggetti wild-type.
Inoltre, l’analisi di regressione stepwise ha evidenziato
che il maggiore contributo alla variabilità nella dose di
Warfarin è dovuto al polimorfismo VKORC1 -1639G/A,
seguito da età, polimorfismi di CYP2C9 e sesso.
In conclusione, i nostri dati permettono di conoscere
il contributo di ciascuna variabile genetica e non nella
determinazione della dose ottimale di Warfarin, al fine di
costruire algoritmi da utilizzare per impostare una terapia
personalizzata.
Acknowledgement: CEINGE Conv. Regione Campania
(DGRC 1901/2009)
Reference: Kamaly F., Wynne H. Pharmacogenetics of
Warfarin. Annu Rev Med 2010;61:63-65
412
048
STUDY OF A FAMILY OF THE PROVINCE OF
MATERA PRESENTING GLUCOSE-6-PHOSPHATE
DEHYDROGENASE(G6PD) DEFICIENCY AND
GILBERT SYNDROME
1
1
3
D. Dell'Edera , G. D'Anzi , M.C. Padula , E.
2
2
3
4
3
Vitullo , A.A. Epifania , L. Milella , L. Losco , G. Martelli
1
U.O.S.D. Lab. Cit. e Gen. Mol., Osp. Madonna delle
Grazie, Matera
2
U.O.C. Pat. Clin. ed Analisi di Lab., Osp. Madonna
delle Grazie, Matera
3
Dip. Biol., Univ. Studi della Basilicata, Potenza
4
U.O.C. Chir., Osp. Madonna delle Grazie, Matera
G6PD deficit, a recessive X-linked trait, is the most
common enzyme deficiency in the world, associated
with chronic hemolytic anemia (class 1). The most
devastating clinical consequence of this deficit can
be hyperbilirubinemia, that can be also related to
Gilberts syndrome, a condition associated with promoter
polymorphism for the uridinediphosphoglucuronate
glucuronosyltransferase 1 (UDPGT1) gene. The aim of
this work is to underline as sometimes DNA molecular
analysis is required to detect and to understand the
genetic deficiency that is the reason of the disorder
in question. The study experimental design provided:
bilirubinic dosage; electrophoresis and enzymatic activity
dosage of G6PD; molecular analysis of the UGT1A
promoter to detect a TA insertion, that leads at the
presence of [A(TA)7TAA] mutation. These methods were
applied to analyze a family, formed by four persons
(father: D.D., mother: P.M., son: D.S. and daughter: D.G.).
The results of this study are:
• D.D.: intermediate G6PD activity (0,52 – normal
range:>1,22 G6PD/6PGD), with electrophoretic migration
speed reduced of 20% than wild type, associated to
hyperbilirubinemia (indirect bilirubin: 1,7h mg/dL - normal
range: 0,2-0,8 mg/dL) and molecular evidence of mutation
in UGT1A gene in heterozygosity.
•
P.M.:
normal
G6PD
activity
(1,38),
with
electrophoretic migration speed wild type, associated
to hyperbilirubinemia (indirect bilirubin:1,3h mg/dL) and
molecular evidence of mutation in UGT1A gene in
heterozygosity.
•
D.S.:
normal
G6PD
activity
(1,42),
with
electrophoretic migration speed wild type, associated
to hyperbilirubinemia(indirect bilirubin: 2,50h mg/dL) and
Gilbert syndrome (molecular evidence of mutation in
UGT1A gene in homozygosity).
• D.G.: intermediate G6PD activity (0,63), but there’s the
Layonization responsible of the disorder manifestation.
Morever, this is a case of patient with Gilbert syndrome
(molecular evidence of mutation in UGT1A gene in
homozygosity). This study shows as there are cases in
which the presence of hyperbilirubinemia is not associated
with G6PD deficit, but, such as in the analyzed family,
is caused by the presence of mutation in the UGTA1
promoter, related to Gilbert syndrome. We emphasize that
to put a differential diagnosis is most important investigate
both UGT1A gene and G6PD activity.
049
ALTERAZIONI DEL SISTEMA BDNF/RECETTORE
TRKB NELL’AREA DI WERNICKE IN SUICIDI
1
2
1
3
S. Keller , F. Zarrilli , S. Sacchetti , M. Sarchiapone , A.
4
4
4
5
Marusic , T. Zagar , V. Carli , A. Roy , R.
6
1
6
Tomaiuolo , L. Chiariotti , G. Castaldo
1
Dip. di Biol. e Patol. Cell. e Mol., Univ. Federico II,
Napoli;CEINGE-Biotecnologie avanzate, Napoli; Italy
2
Facoltà di Scienze MFN, Univ. del Molise,
Isernia;CEINGE-Biotecnologie avanzate, Napoli; Italy
3
Dip. di Scienze per la Salute, Università del Molise,
Campobasso; Italy
4
University of Primorska, Slovenia
5
Psychiatry Service, Dept. of Veteran Affairs, New
Jersey, USA
6
Dip. di Bioch. e Biotecn. Med., Univ. Federico II,
Napoli;CEINGE-Biotecnologie Avanzate, Napoli; Italy
Il suicidio è un rilevante problema di salute pubblica:
nel 2020 si potrebbero registrare 1.5 milioni di suicidi
nel mondo. Molti geni espressi nel sistema nervoso
centrale sono candidati alla predisposizione alle condotte
suicidarie. Tra questi, abbiamo studiato il sistema
BDNF (Brain Derived Neurotrophic Factor)/recettore
TrkB. BDNF è una neurotrofina coinvolta nella crescita,
differenziamento, sopravvivenza e plasticità neuronale
già correlata con la predisposizione al suicidio. I nostri
primi risultati hanno escluso un’associazione tra varianti
polimorfiche G196A e -281 C/A del gene BDNF ed
il suicidio (Zarrilli F, et al, Am J Med Genet, 2009),
ma hanno evidenziato una riduzione dell’espressione
del messaggero in cellule di area di Wernicke da
soggetti suicidi rispetto ai controlli. Successivamente,
abbiamo dimostrato che la ridotta espressione era dovuta,
almeno in una parte dei soggetti, all’ipermetilazione del
promotore IV del gene BDNF individuando, per la prima
volta, un’associazione tra meccanismi di regolazione
epigenetica e suicidio (Keller S, et al, Arch Gen Psych,
2010). Nel presente lavoro abbiamo studiato l’altro
componente del sistema, il gene TrkB che codifica per
il recettore tirosina chinasi B di BDNF. Abbiamo studiato
60 campioni di tessuto dell’area di Wernicke analizzando
alcuni polimorfismi (PCR e sequenziamento), il profilo di
espressione dell’isoforma TrkB.T1 (RT-PCR quantitativa)
e il profilo di metilazione di 10 siti CpG del promotore
(MALDI-TOF). Non vi sono differenze significative tra le
frequenze alleliche dei polimorfismi nei soggetti suicidi
rispetto ai controlli, diversamente da quanto riportato da
Kohli et al (2010). Anche il grado di metilazione e i
livelli di espressione non mostrano differenze nell’area di
Wernike dei suicidi rispetto ai controlli contrariamente a
quanto avviene nella corteccia frontale (Ernst et al 2009).
Il presente studio escluderebbe, quindi, una correlazione
dei polimorfismi analizzati, nonché dell’espressione e
della metilazione del gene TrkB nell’area di Wernicke
con la predisposizione al suicidio indicando anche che
le diverse modificazioni epigenetiche correlate al suicidio
sono altamente specifiche di alcune aree cerebrali. Lavoro
supportato da Regione Campania (DGRC 2362/07) e
MIUR (PS-126/IND e PRIN-2007KR7PRY).
050
A MIRNA DNA METHYLATION MAP OF PROSTATE
CANCER
1
2
1
1
A. Formosa , R. Miano , S. Cortelli , M. Kalimutho , J.
3
3
4
Vandesompele , P. Mestdagh , G. Federici , S.
1
Bernardini
1
Dept. of Internal Medicine, the Univ. of Rome tor
Vergata, Roma
2
Dept. of Urology, Policlinico tor Vergata, Roma
3
Center for Medical Genetics Ghent, Ghent Univ.
Hospital, Ghent, Belgium
4
Dept. of Clinical Biochemistry, Policlinico to Vergata,
Roma
Background: Epigenetics refers to heritable changes
in gene expression not involving the DNA sequence.
Part of the epigenome involves the methylation
of cytosine in promoter regions concentrated with
CpG dinucleotides termed “CpG islands”. CpG island
methylation silences a gene’s transcription. In cancer,
aberrant promoter methylation has begun to explain
the deregulated expression of small, endogenous RNAs
called microRNAs. MicroRNAs inhibit mRNA translation
to fine tune gene networks. In prostate cancer, the
downregulation of miRNAs may contribute to cancer
initiation and development, and the cause may be
promoter hypermethylation. Here, we attempted to
decipher tumor-suppressor miRNAs whose expression is
diminished or silenced by CpG island hypermethylation in
prostate cancer to discover novel biomarkers and ideas
for therapy.
Methods: To unmask potentially silenced miRNAs, the
prostate carcinoma cell lines PC3, DU145 and LNCap
as well as the normal prostate epithelial cell line PrEC
were treated with the demethylating agent 5-aza-2’deoxycytidine. For each cell line, the expression profiles
of 650 miRNAs were analyzed by real-time quantitative
PCR (qPCR) before and after treatment. With methylation
specific PCR (MSP), those miRNAs upregulated by ≥2.5
fold only in the tumor cell lines and having CpG islands
within 10kb upstream of their 5’ end were analyzed for
methylation. The status of miRNAs methylated in tumor
cells but not in PrEC cells have begun to be evaluated
in prostate carcinoma tissues and compared to benign
prostate hyperplasia.
Results: The treatment of 5-aza-2’-deoxycytidine
upregulated, in a tumor cell line specific manner, the
expression of many miRNAs that have CpG islands in their
upstream regions. Via MSP we have isolated the following
candidates for analysis in human specimens: miR-34b/
c, miR-132, miR-450a, miR-18b, miR-627 and miR-148a.
Their status in human prostate cancer specimens has just
begun to be analyzed. Based on previous studies in other
cancers, we expect cancer-specific methylation of two to
eight miRNAs in tissues.
Sharma S, Kelly TK, Jones PA. Epigenetics in cancer.
Carcinogenesis. 2010 Jan;31(1):27-36. Epub 2009 Sep
13.
413
051
ALTERAZIONI DEL DNA MITOCONDRIALE IN
PAZIENTE CON PATOLOGIA NEUROLOGICA
COMPLESSA
052
RAPID PRENATAL DIAGNOSIS BY QF-PCR. A 3
YEARS’ EXPERIENCE
1
1
2
3
C. Mazzaccara , M. Ferrigno , F. Salvatore , M.
4
1
Masullo , L. Sacchetti
1
CEINGE Biotecnologie Avanzate S.C. a R. L., Napoli
- Dip. di Biochimica e Biotecnologie Mediche, Univ. di
Napoli Federico II
2
Fondazione IRCCS SDN, Napoli
3
CEINGE Biotecnologie Avanzate S.C. a R. L., Napoli
4
Napoli Federico II - Dip. di Studi delle Istituzioni e dei
Sistemi Territoriali, Univ. di Napoli “Parthenope”
Le malattie mitocondriali rappresentano un gruppo
eterogeneo di sindromi cliniche causate da variazioni,
principalmente eteroplasmiche, del DNA mitocondriale
(mtDNA) e/o da mutazioni di geni nucleari. Tali
patologie, caratterizzate da un deficit energetico del
metabolismo mitocondriale sono spesso multisistemiche
e coinvolgono principalmente i tessuti ad elevata richiesta
energetica quali il tessuto nervoso, muscolare, l’occhio.
Riportiamo il caso di una bambina di 9 anni affetta
da una patologia neurologica complessa, caratterizzata
da atassia cerebellare con aprassia dello sguardo,
teleangectasia, ipotonia e ipostenia.
Le indagini genetico-molecolari per la presenza di
mutazioni patogeniche per le diagnosi di Atassia con
aprassia oculomotoria e Atassia Teleangectasia (A-T),
avevano dato esito negativo.
Nel nostro laboratorio abbiamo investigato l’intero
genoma mitocondriale della paziente al fine di
evidenziare eventuali alterazioni patogeniche dell’mtDNA.
Il sequenziamento dell’ mtDNA (sia da sangue periferico
che da tampone buccale) ha evidenziato la presenza
di 12 varianti genetiche, di cui 5 presenti nella regione
codificante (geni MT-ND1, MT-ND2, MT-ND5, MTCYB, MT-ATP6) e 7 in quella non codificante (DLoop, MT-RNR1). Nell’ambito delle varianti della regione
codificante, 4 determinano un cambio aminoacidico
nelle relative proteine. Tra tutte le varianti riscontrate,
11/12 sono descritte in letteratura come polimorfismi e/o
mutazioni, anche in associazione a patologie mentre 1/12
risulta essere una nuova variante. Tale variante:12514
G/A, presente nel gene MT-ND5 (subunità proteica
del Complesso I mitocondriale), riscontrata in forma
eteroplasmica, determina la sostituzione Glu60Lys in un
sito altamente conservato. Studi bioinformatici predicono
questa sostituzione come possibilmente dannosa. Tale
variazione, assente in 80 controlli, è stata rilevata
allo stato eteroplasmico anche nel campione buccale
della nonna materna e della mamma. Il saggio
spettrofotometrico dell’attività enzimatica del Complesso
I ha evidenziato nel probando e nei familiari testati
un’attività enzimatica residua variabile dal 13% (nonna)
al 74% (probando) in associazione alla variabile genetica
mitocondriale 12514 G/A.
Acknowledgement: CEINGE Conv. Regione Campania
(DGRC 1901/2009)
Reference:
Di
Donato
S.
J
Neurol.
2009
May;256(5):693-710
414
1
1
E. Danese , E. Meneghelli , G. Chiaffoni , M.
1
1
1
Montagnana , F. Aprili , G.C. Guidi
1
Sez. di Chimica Clinica, Univ. degli Studi di Verona,
Verona
Background. Over the last four decades, prenatal
diagnoses of chromosome abnormalities have been
carried out by cytogenetic analyses. With the
aim to alleviate the anxiety of parents waiting
for conventional cytogenetic results, the Quantitative
Fluorescent Polymerase Chain Reaction (QF-PCR) has
been introduced to perform rapid prenatal diagnosis of
common chromosome aneuploidies. Aim of this study was
to review the results of our experience and to discuss
the possibility of reducing the load of prenatal cytogenetic
tests.
Methods. Between January 2007 and May 2010, 962
amniotic fluid samples were tested using both QF-PCR
and karyotype analysis. Most common indications for
invasive diagnosis were advanced maternal age (556,
57.8%), increased biochemical risk (195, 20.2%) and
ultrasound fetal abnormalities (120, 12.5%). QF-PCR was
performed using short tandem repeats markers for 21,
18, 13 and XY chromosomes as well as nonpolymorphic
markers AMEL and SRY.
Results. By using QF-PCR we have correctly identified
32 chromosome aneuploidies and 901 chromosomally
normal samples (100% specificity and sensibility for the
aneuploidies investigated). 11 cases with a normal rapidtest result have shown an abnormal karyotype. Of these,
10 have been referred for abnormal ultrasound findings,
increased biochemical risk, abnormalities previously
detected by chorionic villus sampling, or familiar autosome
rearrangements. One case has been referred for
advanced maternal age only, and the aberration identified
was paternally inherited and apparently balanced.
Conclusions. Our preliminary data confirm that QF-PCR
is a rapid, simple and accurate prenatal diagnostic test,
allowing to make a diagnosis in the great majority of
cases. Because of a residual risk, QF-PCR can be used
as a preliminary method to reduce parental anxiety,
but conventional cytogenetic analysis should still be
performed to confirm the diagnosis of normal fetuses.
However, in countries where large-scale cytogenetic tests
are not available, QF-PCR could be used as stand-alone
procedure, in those cases without other indication beyond
advanced maternal age.
Cirigliano V, et al. Rapid prenatal diagnosis of common
chromosome aneuploidies by QF-PCR, results of 9 years
of clinical experience. Prenat Diagn 2009;29:40-9.
053
CARATTERIZZAZIONE FUNZIONALE DI MUTAZIONI
NEL GENE GCK ASSOCIATE AL MODY2,
IDENTIFICATE IN PAZIENTI DELLA REGIONE
CAMPANIA
1
2
1
M. Capuano* , C. Garcia-Herrero* , N. Tinto , V.
1
3
2
1
Capobianco , A. Franzese , M.A. Navas , L. Sacchetti
1
Dip. di Biochimica e Biotecnologie Mediche, Univ.
degli Studi di Napoli Federico II, Italia.- CEINGE Biotecnologie Avanzate, Napoli, Italia
2
Dpto Bioquimica y Biologia Molecular III, Facultad de
Medicina, Universidad Complutense de Madrid, Spagna.
3
Dip. di Pediatria, Univ. degli Studi di Napoli Federico II,
Italia.
Il MODY (Maturity Onset Diabetes of the Young)
è una forma monogenica di diabete mellito non
insulino-dipendente, caratterizzato da alterazioni in
geni espressi nelle cellule β del pancreas che
determinano un deficit più o meno severo di secrezione
insulinica; le caratteristiche cliniche del MODY sono:
età d’insorgenza precoce, iperglicemia più o meno
severa, in genere assenza di auto-anticorpi pancreatici ed
obesità, ereditarietà autosomica dominante e familiarità
in almeno 2 generazioni. In particolare, mutazioni
inattivanti in eterozigosi nel gene della glucochinasi
(GCK) determinano il MODY2, che è la forma più
frequente di MODY in Italia fino al 63% (Lorini R. et
al., Diabetes Care 2009). La GCK è una fosfotrasferasi
citoplasmatica che nelle β cellule pancreatiche funge da
“sensore del glucosio” controllando il pathway glicolitico
e stimolando la secrezione di insulina. L’analisi del gene
GCK in 70 bambini diabetici della Campania con sospetto
MODY2 reclutati presso la Pediatria dell’AOU Federico
II ha permesso di identificare 22 mutazioni di cui 14
“novel” (N. Tinto et al. PlosOne, 2008). Per alcune
di esse, la cui analisi bioinformatica faceva ipotizzare
rilevanti alterazioni strutturali, sono stati eseguiti saggi
di attività enzimatica e di stabilità termica per valutarne
il possibile effetto patogenetico. Tutte le mutazioni
analizzate (E70D, R392S, H137D, G162D) determinano
una riduzione dell’attività enzimatica e della stabilità
termica (da parziale a totale) alterando differenti parametri
cinetici. Le alterazioni funzionali riscontrate correlano con
i livelli glicemici osservati nei pazienti. Il nostro studio
dimostra che differenti mutazioni nel gene GCK, associate
al MODY2, alterano la funzione dell’enzima mediante
diversi meccanismi che possono coinvolgere l’attività
enzimatica e/o la stabilità proteica. Infine, la severità della
mutazione insieme al background genetico individuale
possono avere un ruolo rilevante nel determinare i diversi
fenotipi riscontrati nel MODY2.
*Gli autori hanno contribuito in ugual misura al lavoro.
054
APPROPRIATEZZA DELLA RICHIESTA DI INDAGINE
MOLECOLARE PER IL FATTORE V DI LEIDEN
1
1
1
1
R. Rolla , S. Meola , P. Pollarolo , M. Vidali , P.
1
1
Pergolini , G. Bellomo
1
Lab. Ricerche Chimico-Cliniche, A.O.U. Maggiore della
Carità, Novara
La resistenza alla proteina C attivata (rPCA) rappresenta
una delle più frequenti cause di trombofilia, dovuta nella
maggior parte dei casi al polimorfismo di Leiden del gene
del Fattore V (Arg506Gln). In questo studio abbiamo
valutato l’appropriatezza delle richieste dell’indagine
genetico-molecolare di II livello nell’ambito della diagnosi
di trombofilia.
L’rPCA è stata valutata con il kit ProCG/FV su
strumentazione BCS XP (Dade-Behring), nel quale viene
determinato un tempo di coagulazione classico (PCAT/0)
ed un secondo tempo (PCAT) dopo aggiunta di un
reagente attivatore la proteina C e di plasma carente
di FV. Il risultato viene espresso come rapporto PCAT/
PCAT0. L’analisi genetico-molecolare per il FV Leiden
è stata condotta tramite kit AC034 NLM (Nuclear Laser
Medicine s.r.l.).
Nel periodo gen 2006 – mar 2010, il Laboratorio ha
ricevuto 4969 richieste di FV Leiden a fronte di 3010
richieste di rPCA. Il polimorfismo di Leiden era presente in
372 (7.5%) soggetti in eterozigosi e in 10 (0.2%) soggetti
in omozigosi, con una frequenza del tutto comparabile a
quella della popolazione Italiana non selezionata. Delle
3010 richieste per rPCA, 183 (6.1%) sono risultate
positive (ratio<0,7) e 2827 (93.9%) negative (ratio>0.7).
A 1468 (52%) dei 2827 soggetti negativi per rPCA è
stata comunque richiesta l’analisi genetica per Fattore V
di Leiden, che è risultata negativa in tutti. Al contrario,
soltanto a 106 (57.9%) dei 183 soggetti risultati positivi
per rPCA è stata richiesta l’analisi genetica, risultata
positiva in tutti. Per i restanti 77 soggetti positivi per
rPCA non è mai stato richiesto successivamente alcun
approfondimento molecolare.
Ad un’analisi preliminare di appropriatezza prescrittiva,
la richiesta dell’esame genetico-molecolare di II livello
in 1468 soggetti già negativi allo screening per rPCA
(I livello) ha determinato una spesa aggiuntiva di euro
38/campione (al netto della spesa reagenti senza costi
aggiuntivi ore uomo) per una spesa complessiva di euro
55784.
I dati evidenziano la necessità di interventi informativi
e formativi immediati e capillari, rivolti ai Medici
delle Unità Operative e del Territorio, relativamente
all’appropriatezza prescrittiva per la diagnosi di
trombofilia.
415
055
RAPID DETECTION OF CFH POLYMORPHISM
P.Y402H IN AGE-RELATED MACULAR
DEGENERATION USING HIGH-RESOLUTION
MELTING ANALYSIS
1
1
1
1
E. Mello , P. Concolino , B. Giardina , C. Zuppi , E.
1
Capoluongo
1
Lab. di Biologia Molecolare, Ist. di Biochimica e
Biochimica Clinica, Università Cattolica, Roma
Age-related macular degeneration (AMD) is a complex
disorder causing irreversible central vision loss in the
elderly population of the developed world.
CFH gene (chromosome 1q32, NG_007259) is now
widely accepted as an important AMD susceptibility gene.
The major CFH AMD-associated gene coding variant
is the Tyr402His (rs1061170, c.1277 T>C) one: in fact
individuals with the risk allele C exhibited an increased
risk of AMD with OR ranging between 2.4 and 4.6 for
heterozigous and 3.3–7.4 homozygous of the variant
allele.
Moreover recent studies investigated the potential
pharmacogenetic relationship between CFH p.Y402H
variant and therapeutic response in AMD, particularly
when antioxidants or intravitreal anti-VEGF therapies are
administered.
High resolution melting analysis is a rapid closed-tube
mutation scanning assay that detects sequence variation
by thermodynamic differences between DNA fragments.
Materials and Methods: To validate HRM genotyping of
CFH c.1277 T>C, we analyzed 53 DNA samples from
patients with AMD. All samples used in this study were
previously genotyped for rs1061170 by sequence analysis
and by comparison with the CFH genomic sequence
(GenBank NG_007259).
PCR amplification and melting curve analysis for
CFH single nucleotide polymorphism rs1061170 were
performed in the LightCycler® 480 Real-Time PCR
System (Roche Diagnostics, Germany).
Results: Using a curve shape-matching algorithm we
correctly genotyped 53 amples (13 homozygous TT, 21
heterozygous CT and 19 homozygous CC). All samples
corresponded to the previous genotype assignments.
Discussion: Early identification of individuals with genetic
risk variant CFH p.Y402H is clinically important for the
definition of AMD status. High-resolution DNA melting
provides a very simple fast and inexpensive solution for
CFH genotyping.
056
NEUROTROPHINS AND RECEPTORS PATTERN IN
PLACENTAS FROM PREGNANCIES COMPLICATED
BY HELLP SYNDROME AND INTRAUTERINE
GROWTH RESTRICTION (IUGR)
1
2
1
1
M. Emanuelli , S. Giannubilo , V. Pozzi , E. Renzi , D.
1
2
1
2
Sartini , P. Stortoni , F. Saccucci , A.L. Tranquilli , M.
1
Cecati
1
Dip. di Biochimica, Biologia e Genetica, Univ.
Politecnica delle Marche, Ancona
2
Dip. di Scienze Cliniche Specialistiche e
Odontostomatologiche, Univ. Politecnica delle Marche,
Ancona
Objective: The neurotrophin family comprises molecules
involved in growth, differentiation, survival, regeneration,
normal functions of the neuronal system, and in
angiogenesis. We investigate the expression pattern
of neurotrophic signaling molecules in pregnancies
complicated by HELLP (Hemolysis, Elevated Liver
enzymes and Low Platelet count) syndrome and IUGR.
Study design: Placentas from normal term pregnancies
(n=10), from pregnancies complicated by HELLP
syndrome (n=10) and intrauterine growth restriction
(IUGR) (n=10) were collected. Macroarray analyses were
performed with GEArray Q Series Human Neurotrophin
and Receptors Gene Array HS-018. The data were
confirmed by quantitative Real-Time PCR. The MannWhitney test was used for statistical analysis. Differences
were considered significant at p < 0.05.
Results: Differential gene expression measurements
(IUGR versus normal, and HELLP versus normal),
confirmed by real-time PCR technique, revealed a
significant down-regulation for IL-6 (3.9-fold and 2.7-fold
for IUGR group and HELLP group, respectively).
STAT3 a and b isoforms were reduced by 50 and
47% in HELLP group and 22 and 49% in IUGR group,
respectively.
Bcl-2 and Mcl1 were also evaluated. Differential gene
expression measurements revealed a significant downregulation for Bcl-2 (2.7-fold and 3.0-fold for IUGR and
HELLP group, respectively), while the expression of Mcl1
isoform 1 (long) was significantly increased (1.8-fold and
1.7-fold for IUGR and HELLP group, respectively, p <
0.05). The Mcl1 isoform 2 (short) expression levels did not
show statistically significant differences between normal
and pathological pregnancies.
Conclusions: Decreased expression of IL-6 could mean
that abnormalities in the immunological system function
involve inflammatory cytokines other than IL-6 in
pregnancies complicated by HELLP syndrome and IUGR.
The STAT3α and STAT3β downregulation lead to
a marked reduction of cellular transcriptional activity.
Decreased expression of IL-6 is associated with a
down-regulation of Bcl-2 but not of Mcl-1 isoform 1,
suggesting that these two anti-apoptotic proteins may
function independently and that Mcl1 may have a distinct
role in controlling apoptotic pathway.
416
057
COMMON GENETIC VARIANTS OF MUTYH ARE
NOT ASSOCIATED WITH CUTANEOUS MALIGNANT
MELANOMA: APPLICATION OF MOLECULAR
SCREENING BY MEANS OF HIGH RESOLUTION
MELTING TECHNIQUE IN A PILOT CASE-CONTROL
STUDY
1
2
2
C. Santonocito , A. Paradisi , R. Capizzi , A.
1
1
2
1
Minucci , E. Torti , S. Lanza-Silveri , C. Zuppi , E.
1
Capoluongo
1
Lab. Biologia molecolare clinica-Dip. Biochimica e
Biochimica clinica-Univ. Cattolica Sacro Cuore- Roma
2
Dip. Dermatologia-Univ. Cattolica Sacro Cuore- Roma
Background:
MutYH glycosilase is involved in recognizing the 8-oxoG:A
mismatch being capable to excise the adenine base
using proofreading mechanisms. Some papers showed
a strong association between cancer development or
aggressiveness and such mutYH gene mutations. Aim of
this paper is to verify a possible association between the
most frequent mutYH gene mutations and melanoma in
the context of a case-control pilot study.
Methods:
One hundred ninety-five melanoma patients and 195
healthy controls were matched for sex and age.
Clinical and laboratory data were collected in a specific
database and all individuals were analysed for mutYH
mutation by high-resolution-melting technique and by
direct sequencing.
Results:
Male and females had significant different distributions of
tumor sites and phototypes. No significant associations
were observed between Y165C, G382D and V479F
mutYH mutations and melanoma development risk or
aggressiveness.
Conclusions:
Our preliminary findings do not confirm a role for MutYH
gene mutations in the risk of melanoma development or
in its aggressiveness. Further studies, are necessary for
the assessment of the MutYH role not only in melanoma
disease but also in other cancer types with the same
embryonic origin, in the context of a larger pathway of
genes involved in DNA stability or integrity.
Reference:
Russo MT, De Luca G, Casorelli I, et al. Role of MUTYH
and MSH2 in the control of oxidative DNA damage,
genetic instability, and tumorigenesis. Cancer Res 2009;
15:4372-4379.
058
HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE DISTRIBUTION
AND CORRELATION WITH CYTOLOGICAL
PATTERNS IN A SALENTINIAN POPULATION
1
1
2
4
G. Leo , M. Pisanò , A. Tinelli , M. Bochicchio , M.M.
1
1
1
1
Galante , F. Storelli , S. Leo , R. Guarascio , N.
1
1
3
Quarta , L. Cavalera , V. Lorusso
1
Lab. Biol. Mol. ed Onc. Sperim. (LBMOS), Osp. Vito
Fazzi, Asl Lecce
2
U.O. Ginecol. ed Ostetricia, Osp. Vito Fazzi, Asl Lecce
3
U.O. Onc., polo Oncol. “G. Paolo II”, Osp. Vito Fazzi,
Asl Lecce
4
Dip. Ing. dell’Innovazione, Univ. del Salento, Lecce
Background: Disomogeneous data exist about human
papillomavirus (HPV) type diffusion in Salento women
diagnosed with cytological abnormalities. Aim: To
correlate HPV genotype with normal or abnormal cytology
(ASCUS, LSIL and HSIL). Methods: A random population
based sample of 1306 women aged 15-88 years from the
general population of Salento participated in a HPV study
during the period 2006-2010. Data about Papanicolaou
test, DNA detection for HPV and other clinical informations
were collected and analyzed by means of an ad
hoc developed database implemented on the MySQL
relational engine and of a Web-enabled Java application
in order to perform statistical analysis. Results: HPV DNA
was identified in 352 samples (26,95%). High Risk HPV
(HR-HPV) infection prevalence was 18,71%.The most
commonly detected HPV types were HR-HPV16 (5,82%),
LR-HPV6 (3,22%), HR-HPV31(2,45%) and HR-HPV53
(1,99%). HPV DNA detection rate had a statistically
significative increase (Chi-square trend test, P < .0001)
with age in women until 35 (P= 6,81%), caused by both
HR-HPV and LR-HPV types, though HR-HPV infections
had higher prevalence (4,90%) than LR-HPV ones (P=
1,76%). The analysis of HPV genotypes distribution in
different age groups, in addition, revealed a statistically
significative infection increase with age in young women
by HR-HPV16 (Chi-square trend test, P < .0003), HRHPV31 (Chi-square trend test, P < .007), LR-HPV6 (Chisquare trend test, P < .002), LR-HPV70 (Chi-square trend
test, P < .008) LR-HPV62 (Chi-square trend test, P < .03).
Regarding 385 patients with cytological abnormalities,
HPV DNA was found in 94 (24,42%), 26,8% of ASCUS, 26,6% of LSIL and 52% of HSIL. HR-HPV16 once
again was the most commonly detected type, followed
by 53, 31,18, 66, 33, 58, 59,45, 56,39, these types
prevalence increasing with the degree of cytological
abnormalities ASCUS-LSIL (HR-HPV16 = 28,8% and
69,2%). Discussion Besides HR-HPV16 and LR-HPV6,
which are targeted by HPV vaccines, other HR-HPV
types, such as 53, 31, 66 are diffused in general
population and seem to be associated with cytological
alterations in sexually active women.
Nicolas Wentzensen et all.Grading the severity of
cervical neoplasia based on combined histopathology,
cytopathology, and HPV genotype distribution among
1,700 women referred to colposcopy in Oklahoma. Int. J.
Cancer: 124, 964–969 (2009)
417
059
G6PD MURCIA, G6PD UBE AND G6PD ORISSA:
REPORT OF THREE G6PD MUTATIONS UNUSUAL
FOR ITALIAN POPULATION
1
1
1
1
A. Minucci , M. Antenucci , D. Tripodi , B. Giardina , C.
1
1
Zuppi , E. Capoluongo
1
Lab. of Clinical Molecular Diagnostic, Institute of
Rome, Italy.
Background: Glucose 6-phosphate dehydrogenase
(G6PD) deficiency is a common disease determined
by a large number of genetic mutations. About 400
G6PD variants have been described with distribution
and frequency that differs among various populations
depending on ethnicity and geographical areas. For
example, in Italy, the mutations more frequent are G6PD
Mediterranean, G6PD Cassano G6PD Seattle, and G6PD
A-.
Aim and Methods: We report, for the first time, three
families carrying G6PD mutations unusual for Italian
population. Genetic tests were performed by means of
whole G6PD gene sequencing, both for the first screening
and for the second level test.
Results: Family 1: The proband is an asymptomatic
29-year-old female of Abruzzo ancestry (Central Italy).
The whole G6PD genetic screening performed by direct
sequencing, revealed the presence of a mutation named
G6PD Ube / Konan.
Family 2: The proband is an asymptomatic 25-yearold male, of Sardinian ancestry referred to our hospital
for a laboratory confirmation of the G6PD deficiency,
the sequencing of the whole G6PD gene, revealed the
presence of a mutation named G6PD Murcia.
Family 3: A prolonged neonatal jaundice revealed a G6PD
deficiency in a newborn male. This deficiency was due to
the presence of a G6PD mutation named G6PD Orissa.
Discussion: G6PD Ube is the most common mutation in
Japan. The G6PD Murcia is one of the most frequent
in Spain. G6PD Orissa mutation is reported as the
major polymorphic variant in an Indian tribal population.
Our study confirms the high heterogeneity of the G6PD
mutations in Italy. We suggest to sequence the whole
G6PD gene, in symptomatic individuals resulted as
negative to the routinely first genetic screening, especially
in those patients coming from peculiar Italian regions or
immigrants.
Reference: Minucci A. et al. Description of a
novel missense mutation of glucose-6-phosphate
dehydrogenase gene associated with asymptomatic high
enzyme deficiency. Clin Biochem. 2007;40:856-8.
418
060
UN MODELLO "EX VIVO" PER LO STUDIO DEGLI
EFFETTI DELLA TERAPIA CON BUTIRRATO IN
PAZIENTI AFFETTI DA CLORIDORREA CONGENITA
1
1
1
1
A. Elce , G. Cardillo , F. Amato , G. Terrin , R. Berni
2
2
1
1
Canani , R. Troncone , G. Castaldo , R. Tomaiuolo
1
CEINGE Biotecnologie avanzate, Dip. di Biochimica
e Biotecnologie Mediche, Univ. di Napoli Federico II,
Napoli, Italy
2
Dip. di Pediatria, Univ. di Napoli Federico II, Napoli,
Italy
La Cloridorrea congenita (CLD) è una rara malattia
autosomica recessiva, caratterizzata da diarrea profusa
con perdita di cloro. La malattia è causata da mutazioni
nel gene SLC26A3, che codifica per uno scambiatore
-
-
anionico Cl /HCO3 , espresso dalle cellule intestinali.
Da alcuni anni utilizziamo una nuova terapia a base
di butirrato, capace di ridurre nettamente numero e
quantità di scariche diarroiche (Berni Canani R. et
al Gastroenterology. 2004). Scopo di questo studio è
quello di verificare il meccanismo molecolare alla base
dell’effetto correttivo del butirrato. Quattro pazienti CDL
sono stati trattati con una supplementazione orale di NaCl/
KCl e sodio butirrato (100mg/Kg/d) per una settimana.
L’efficacia della terapia è stata testata in vivo valutando il
volume fecale, il numero delle evacuazioni, la consistenza
delle feci ed il bilancio idroelettrolitico. Questi parametri
sono stati comparati con gli stessi registrati una settimana
prima del trattamento. Contemporaneamente sono state
sviluppate colture di epitelio nasale, ottenute mediante
brushing dei turbinati inferiori e, mediante Real-Time
PCR, sono stati comparati i livelli di espressione del
gene SLC26A3 in cellule trattate con butirrato 5 mM
a 24 ore dal trattamento e cellule non trattate. Nel
primo paziente la terapia ha determinato una risposta
completa (miglioramento dell’incontinenza e riduzione
delle concentrazioni fecali di sodio e cloro). Il paziente
è un eterozigote composito per 2 mutazioni missenso,
entrambe associate ad un corretto folding e topogenesi
della proteina. In cellule epiteliali nasali del paziente il
butirrato ha determinato un marcato aumento del trascritto
di SLC26A3. In altri tre pazienti la terapia sembra avere
un effetto parziale; in questi casi le mutazioni causative
determinano l’assenza della proteina in membrana. La
risposta parziale può quindi dipendere dall’attivazione
di altri canali in grado di vicariare la funzione di
SLC26A3. Abbiamo quindi avviato studi con microarray di
espressione su cellule primarie NHBE al fine di identificare
altri canali modulati dal butirrato.
Il lavoro è stato supportato dall’AIFA, dalla regione
Campania (DGRC 2362/07) e dal MIUR (PS-126 IND).
061
IL RUOLO DEL PROMOTORE DEL GENE CFTR:
DA ELEMENTO REGOLATIVO A POSSIBILE
PROTAGONISTA NELLA PATOGENESI DELLA
MALATTIA
062
ANALISI DI POLIMORFISMI NON-HLA PER LA
VALUTAZIONE DEL RISCHIO GENETICO DI
CELIACHIA IN 200 FAMIGLIE DELLA CAMPANIA
1
1
3
3
2
S. Giordano , F. Amato , A. Elce , M. Monti , C.
1
2
3
3
Iannone , P. Pucci , G. Castaldo , R. Tomaiuolo
1
CEINGE-Biotecnologie avanzate, Napoli
2
CEINGE-Biotecnologie avanzate, Napoli; Univ. di
Napoli Federico II
3
CEINGE-Biotecnologie avanzate, Napoli; Dip. di
Biochimica e Biotecnologie Mediche; Univ. di Napoli
Federico II
Ad oggi le mutazioni causative di Fibrosi Cistica (FC)
identificate sono più di 1600, ma attualmente non risulta
possibile individuare più del 94% degli alleli CF anche
attraverso il sequenziamento di tutte le regioni codificanti
del gene. Il nostro progetto è volto a studiare un’ampia
regione a monte del sito di inizio trascrizione (6000 bp) allo
scopo di individuare nuove mutazioni, chiarirne l’effetto
sull’espressione genica e migliorare la comprensione
dei meccanismi alla base della fine regolazione
temporale e tessuto-specifica del gene CFTR. Mediante
il sequenziamento abbiamo effettuato l’analisi delle 6000
bp a monte del gene CFTR in 90 pazienti affetti da
CF classica o atipica, con almeno 1 mutazione non
identificata dopo sequenziamento completo del gene; 50
soggetti della popolazione generale hanno costituito il
gruppo di controllo. L’intera regione di 6000 bp è stata
clonata in un sistema reporter (luciferasi) per valutare
l’effetto delle varianti alleliche rispetto al wild type in
sistemi cellulari esprimenti e non esprimenti CFTR.
L’analisi molecolare ha evidenziato la presenza di 19
varianti geniche, di cui solo 8 già descritte in letteratura,
tra sostituzioni mononucleotidiche e microdelezioni. Sei
varianti sono state riscontrate esclusivamente in pazienti
CF e non in soggetti di controllo. I primi esperimenti
col sistema reporter hanno evidenziato una significativa
riduzione dell’attività trascrizionale del costrutto recante
una microdelezione rispetto alla forma wild type in
cellule non esprimenti CFTR mentre l’attività rimane
pressochè invariata in cellule esprimenti, suggerendo che
la mutazione riduca l’espressione genica (e quindi sia
causativa di malattia) presumibilmente alterando il sito di
legame di fattori trascrizionali. Oltre alla microdelezione
stiamo testando con lo stesso sistema tutte le altre
varianti; inoltre, mediante saggi EMSA abbiamo iniziato a
studiare quali siano i fattori regolatori che interagiscono
con il sito della microdelezione, anche per valutare se la
presenza di mutazione possa alterarne il legame al DNA.
Lavoro supportato dalla Fondazione per la ricerca sulla
FC (Verona), regione Campania (DGRC 2362/07) e MIUR
(PS-126IND).
1
2
3
N. Tinto , A. Cola , M.V. Esposito , M.P. Sperandeo , V.
3
1
Izzo , L. Sacchetti
1
Dip. di Biochimica e Biotecnologie Mediche, Univ.` di
Napoli ‘‘Federico II’’ e CEINGE Biotecnologie Avanzate,
Napoli
2
Napoli ‘‘Federico II’’
3
Dip. di Pediatria Univ. di Napoli ‘‘Federico II’’ Napoli
La celiachia (CD) è una patologia indotta dall'ingestione
di glutine che si sviluppa in soggetti geneticamente
predisposti. L’unica forte correlazione genetica finora
dimostrata per la CD è quella con i geni HLA
codificanti per gli eterodimeri DQ2 e/o DQ8. Tuttavia
l’HLA è una condizione necessaria ma non sufficiente
per lo sviluppo della CD, spiegando solo il 40%
della componente genetica della malattia. Risulta
quindi evidente l’esistenza di altri geni non-HLA che
contribuiscono al rischio genetico totale di CD. Studi di
linkage e di associazione hanno permesso di identificare
diverse regioni genomiche molte delle quali contenenti
geni coinvolti nella risposta immune/infiammatoria o
nella permeabilità intestinale e che risultano associate
anche ad altre patologie autoimmuni (Romanos J.
et al Gastroenterology 2009;137:834–40). Tali dati
aggiungono un altro 3-4% alla componente genetica
della CD, dimostrando che essa rappresenta un modello
classico di malattia poligenica dove la predisposizione
genetica dipende da un singolo gene (HLA) che determina
effetti maggiori sulla risposta immune e da multipli
altri geni i quali influenzano, in misura minore, diversi
aspetti dell’immunità e dell’infiammazione. Lo scopo
del lavoro è stato quello di valutare 11 polimorfismi
presenti in regioni cromosomiche indipendenti, in 200
famiglie campane con celiachia, per una più precisa
valutazione del rischio genetico globale di sviluppare
la malattia. Studi preliminari hanno mostrato che un
marcatore nella regione 3q28, molto vicino al gene
LPP, aumenta notevolmente il rischio di sviluppare la
malattia. La proteina LPP potrebbe avere un ruolo nella
regolazione della motilità e dell’adesione cellulare; tuttavia
ulteriori analisi sono necessarie per completare lo studio
e per definire il ruolo dei loci genici significativamente
associati, nel meccanismo patogenetico della malattia.
La previsione del rischio genetico (HLA e non-HLA)
di celiachia potrebbe essere di notevole ausilio nella
diagnosi precoce e nella valutazione della prognosi nei
familiari di I grado che presentano un elevato rischio di
sviluppare la malattia e che risultano spesso asintomatici
e pertanto di difficile inquadramento clinico.
Lavoro finanziato da Conv. CEINGE Regione Campania
(DGRC 1901/2009)
419
063
MOLECULAR ANALYSIS OF HEREDITARY
HEMOCHROMATOSIS: CASE REPORT
1
2
1
D. Dell'Edera , E. Vitullo , G. D'Anzi , A.A.
2
3
3
3
Epifania , M.C. Padula , L. Milella , G. Martelli
1
U.O.S.D. Lab. di Citogenetica e Genetica Molecolare P.O. "Madonna delle Grazie" - Matera
2
U.O.C. di Patologia Clinica ed Analisi di Laboratorio P.O. "Madonna delle Grazie" - Matera
3
Dip. di Biologia - Univ. degli Studi della Basilicata Potenza
Introduction: Our previous study showed that the
hereditary hemochromatosis, a recessive disorder that
leads to iron overload, is characterized by a particular
clinical behavior in the province of Matera (Basilicata).
The aim of the present work was directed to detect
and understand, in molecular key, the peculiar clinical
appearance focusing on a particular case report.
Methods: A case report is presented for a 62-year-old
female with a pathologic value (62%) of the transferrin
saturation, a sensitive parameter of iron overload. The
genetic test for hemochromatosis was performed. The
experimental design provided: DNA extraction from whole
blood, DNA amplification by multiplex PCR, reverse dotblot on nitrocellulose strips to analyze the presence of
11 HFE gene mutations (V53M, V59M, H63D, H63H,
S65C, Q127H, E168X, E168Q, W169X, C282Y, Q283P),
4 Transferrin Receptor mutations (Y250X, E60X, M172K,
the AVA Q 594-597) and 2 Ferroportin mutations (N144H,
V162). In a second step, we made the primer design,
based on HFE gene sequences present in NCBI database
to amplify DNA and to isolate the most significant
fragments. After, HFE gene fragments sequencing was
performed. The next bioinformatics analysis allowed to
verify the homology among our obtained sequence and
known HFE gene sequences.
Results: The first step shows that the analyzed genotype
is H63D heterozygous. We found an abnormal transferrin
saturation value, as expected for the homozygous. There
aren’t additional factors that can explain this result, as
evidenced by clinical history. In addition, the sequencing
results put in evidence the presence of a genetic variation
in HFE gene, reported in SNP database as rs2858996.
Conclusions: The present study confirms the singular
clinical behavior of the disease in Matera province.
Furthermore, the polymorphic site could change a
sequence required for intron excision, resulting in
alternative splicing mechanism.
For an appropriate characterization of the disorder we
should consider and investigate both the structural and
functional gene aspects.
420
064
EXPRESSION OF INFLAMMATION-RELATED GENES
IN HUMAN ATHEROSCLEROTIC PLAQUES
1
2
3
M.D. Di Taranto , A. Morgante , U.M. Bracale , L.
3
3
4
Del Guercio , F. Carbone , F.P. D'Armiento , M.
3
2
3
2
Porcellini , G. Fortunato , G. Bracale , F. Salvatore
1
Fondazione IRCCS SDN, Napoli, Italy
2
Studi di Napoli “Federico II” Napoli, Italy e CEINGE
scarl, Napoli, Italy
3
Dip. Ass. di Chirurgia Generale Toracica, Vascolare e
Endovascolare, Univ. degli Studi di Napoli “Federico II”,
Napoli, Italy
4
Dip. di Scienze Biomorfologiche e Funzionali – Sez.
Anatomia Patologica e Citopatologica, Univ. degli Studi
di Napoli “Federico II”, Napoli, Italy
Introduction – Atherosclerosis is a chronic disease
with development of lesions protruding in the vessel
lumen. Plaque rupture and thrombosis can cause
acute events such as myocardial infarction or stroke.
Inflammation is clearly identified as a pivotal process in the
atherosclerosis development and progression, although
the molecular mechanisms have not been completely
unravelled (Libby P et al. Circ J. 2010;74:213-20).
Our aim is to perform a wide expression study of
inflammation related genes in human atherosclerotic
plaques.
Materials and Methods – The Human Inflammation Array
(Applied Biosystems) was used to perform the mRNA
quantification of 92 inflammation-related genes in 12
atherosclerotic plaques, their respective adjacent regions
(with a lower grade lesion) and 7 healthy arteries. The
principle of the array is the real-time PCR amplification
with a TaqMan probe specific for each gene. Data
analysis was performed with SDS 2.3 software with
the comparative Ct method using the gene beta-2microglobulin as housekeeping and one of analysed
samples as calibrator.
Results and conclusions – The mRNA levels of 42
genes result to be differently expressed: 13 genes
were up-regulated in atherosclerotic plaques respect to
control arteries whereas 29 were down-regulated. Their
expression levels show an increasing or a decreasing
trend from healthy arteries to plaque adjacent regions
and to advanced plaques. These genes belong to many
different functional classes. In particular, we observed the
dys-regulation of genes encoding for enzymes involved
in the arachidonic acid metabolism (eg. COX1, PTGIS,
and 5-LO) that lead to generation of prostaglandins
and leukotrienes. This dys-regulation creates a proinflammatory status in atherosclerotic vessels.
Results of the wide panel of inflammation-related genes
may contribute to unravel the mechanisms of inflammation
involvement during the atherosclerotic process and could
highlight new possible target for anti-inflammatory therapy
in cardiovascular diseases.
Acknowledgements – CEINGE Convenzione Regione
Campania, DGRC 1901/2009
065
VARIANTI GENICHE DELLA RISPOSTA IMMUNE
INNATA NELLE MALATTIE INFIAMMATORIE
CRONICHE INTESTINALI: MESSA A PUNTO E
VALIDAZIONE DI UN METODO DI ANALISI IN PCR
MULTIPLEX E MINISEQUENCING
1
2
1
2
G. Ferraguti , A. Crudeli , S.M. Bruno , P. Vernia , F.
1
1
1
Ceci , R. Strom , M. Lucarelli
1
Dip. di Biotecnologie Cellulari ed Ematologia, Sapienza
Univ. di Roma
2
Dip. di Scienze Cliniche, Sapienza Univ. di Roma
La patogenesi delle malattie infiammatorie croniche
intestinali (MICI) vede coinvolti fattori ambientali e
cause genetiche, quest’ultime determinate in primis
da polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs) valutabili
mediante tecniche rapide, affidabili e a costo contenuto:
PCR multiplex e minisequencing.
Obbiettivi di questo studio sono: mettere a punto e
validare un pannello di 10 polimorfismi per l’analisi dei
geni NOD2 (R702W, G908R, A1006R), TLR4 (D299G),
TLR2 (R753Q), CD14 (260C>T) e TLR9 (1237T>C), già
associati alle MICI, e di TOLLIP (-526 C>G; A222S) mai
studiato nei pazienti con MICI; indagare le frequenze
alleliche e genotipiche delle variazioni di sequenza e le
eventuali correlazioni tra genotipo e fenotipo clinico.
Il DNA genomico, estratto dal sangue venoso periferico
di 57 pazienti affetti da MICI e da 26 donatori di sangue
sani (controllo), è stato amplificato in PCR multiplex (2
PCR da 5 ampliconi più un controllo negativo per ogni
paziente) e, dopo controllo elettroforetico, purificato per
rimuovere primers e nucleotidi non incorporati. Il templato
purificato, utilizzato per la reazione di minisequencing
(che consiste nell’estensione di una singola base di
un primer, di lunghezza predefinita, immediatamente
adiacente alla base polimorfica, utilizzando nucleotidi
terminatori di catena marcati in fluorescenza) è stato di
nuovo purificato per rimuovere i nucleotidi fluorescenti
non incorporati prima dell’elettroforesi capillare, eseguita
su sequenziatore ABI PRISM 3100 Avant. Con il
software GENOTYPER viene quindi generato un
elettroferogramma per ciascun paziente. Ogni differenza
dall’elettroferogramma di riferimento può essere attribuita
alla presenza di una variazione di sequenza in omo o
eterozigosi.
La validazione della metodica è stata ottenuta tramite
conferma in sequenziamento dei genotipi ottenuti. Per
i geni già noti, le frequenze alleliche e genotipiche
ricavate dalla nostra popolazione concordano con quelle
descritte in letteratura. E’ ancora in corso l’analisi delle
variazioni del gene TOLLIP e la relazione genotipofenotipo relativamente agli altri marcatori.
Il saggio in minisequencing messo a punto appare
comunque un utile strumento per individuare sottogruppi
omogenei di pazienti con MICI al fine di personalizzare
prognosi e terapia.
066
ESPRESSIONE E METILAZIONE DEI GENI ENAC
1
1
1
1
M. Lucarelli , F. Ceci , G. Truglio , S. Pierandrei , F.
2
1
2
Carofiglio , G. Ferraguti , F. Ascensioni , S.
3
1
Quattrucci , R. Strom
1
Dip. di Biotecnologie Cellulari ed Ematologia, Sapienza
Univ. di Roma
2
Dip. di Biologia Cellulare e dello Sviluppo, Sapienza
Univ. di Roma
3
Dip. di Pediatria e Centro di Riferimento della Regione
Lazio per la Fibrosi Cistica, Sapienza Univ. di Roma
La secrezione di ioni Cl- da parte dell’epitelio
respiratorio avviene tramite la proteina CFTR (Cystic
Fibrosis Transmembrane conductance Regulator), il suo
malfunzionamento origina la Fibrosi Cistica (FC). Il CFTR
limita anche l’assorbimento dello ione Na+ esercitando
una parziale repressione sul canale epiteliale del Na
+ (ENaC), codificato da 3 geni (SCNN1A, SCNN1B
e SCNN1G). Questo equilibrio, che rende idratato il
liquido di superficie delle vie aeree, viene probabilmente
regolato dalla trascrizione dei geni ENaC in un modo
non completamente chiarito, soprattutto dal punto di vista
epigenetico.
Abbiamo studiato sia in vitro (linee cellulari epiteliali
umane H441, MCF10A, 16HBE, CFBE e HACAT), sia
ex vivo (epitelio nasale umano da brushing nasale,
granulociti, linfociti e monociti in soggetti con o senza
FC) la correlazione tra i livelli di metilazione delle regioni
regolatrici all’estremità 5’-flanking dei 3 geni ENaC e la
loro espressione.
Nelle linee cellulari H441, MCF10A e HACAT e
nell’epitelio nasale risulta elevata l’espressione di tutti
i geni ENaC. Nelle linee cellulari 16HBE e CFBE,
nonché nei granulociti, linfociti e monociti è stata rilevata
un’espressione bassa o assente. Confrontando i dati
sperimentali abbiamo rilevato una correlazione inversa tra
espressione e metilazione di 2 delle 3 zone analizzate
della regione 5’-flanking del gene SCNN1A. Nel gene
SCNN1B, invece, una delle 4 zone analizzate della
regione 5’-flanking è risultata costantemente non metilata,
contrariamente alle altre 3 che sono risultate sempre
metilate, indipendentemente dai livelli di espressione. Nel
gene SCNN1G una delle 2 zone analizzate del 5’-flanking
del gene è risultata sempre non metilata e l’altra sempre
ipometilata, anche in questo caso indipendentemente dai
livelli di espressione.
Dai nostri risultati, appare ipotizzabile che il gene
SCNN1A svolga un ruolo di “master regulatory gene”
regolando non solo l’espressione del gene stesso, ma
(seppure con meccanismi ancora da chiarire) anche
quella del complesso dei geni ENaC. Un ulteriore
approfondimento di questi studi potrà essere di interesse
sia per la comprensione dei meccanismi dell’interazione
CFTR – ENaC che per l’ottimizzazione di strategie
terapeutiche per la FC basate sull’inibizione dei geni
ENaC.
421
067
ENDOGENOUS MATRIX METALLOPROTEINASES
REGULATE GENERATION OF NEURONAL AND
GLIAL CELLS FROM MURINE NEURAL STEM CELLS
068
EFFECTS OF DIFFERENT STORAGE
TEMPERATURES ON HUMAN PROTEOME
1
1
1
2
1
E. Cacci , M. Sinno , G. Tonti , P. Caramanica , F.
2
1
Mannello , S. Biagioni
1
Dip. di Biologia e Biotecnologie, Sapienza Univ. di
Roma
2
Istituto di Istologia, Analisi di Laboratorio, Univ. di
Urbino
Newly formed neurons are generated from adult Neural
Stem Cells (NSC) and continuously integrated into
specific regions of the brain under both physiological and
pathological conditions (Zhao et al., 2008). The regulation
of neurogenesis involves a wide spectrum of instructive
and converging signals from the microenvironment in
which NSC reside, the so-called neurogenic niche. Among
the others, metalloproteinases (MMPs), and particularly
the gelatinases MMP-2 and MMP-9, are emerging as
important players in the modulation of the neurogenic
niche, although their role in NSC modulation has just
begun to be unraveled (Tonti et al., 2009).
One major goal of our research is to understand how
MMPs can modulate NSC properties.
In a first set of experiments we analyzed the expression
of MMP-2 and MMP-9 in NSC cultures isolated from the
embryonic (E13,5) mouse cortex. We found that MMP-2
was expressed both at mRNA (by real time RT-PCR)
and protein levels (by gel zymography of conditioned
culture media from proliferating and differentiating
NSC), whereas MMP-9 was not detectable. As the
metalloproteinase tissue inhibitor (TIMP) 2 tightly controls
MMP-2 activity, we also analyzed TIMP-2 expression
by real time RT-PCR. Our findings demonstrate that
TIMP-2 is strongly up regulated (in a time dependent
manner) during the differentiation process, suggesting the
involvement of MMP-2/TIMP-2 system in the modulation
of neurogenesis. Furthermore, treatment of NSC with a
broad-spectrum MMPs inhibitor (Marimastat) at microM
concentrations strongly increased the percentage of
cells differentiating into neurons, whereas it dramatically
abated the percentage of astrocytes.
Altogether our data indicate the involvement of MMPs in
the modulation of neuronal and glia differentiation and
suggest that MMPs contribute into NSC fate decision.
The molecular mechanisms underlying these events are
currently under investigation.
Zhao C et al., (2008). Mechanisms and functional
implications of adult neurogenesis. Cell 22;132(4):645-60
Tonti GA et al., (2009). Neural stem cells at the
crossroads: MMPs may tell the way.
Int J Dev Biol.;53(1):1-17.
422
1
1
1
S. Pasella , E. Canu , A. Baralla , S. Pinna , A.
1
1
1
1
Mannu , L. Murgia , C. Carru , L. Deiana
1
Biochimica Clinica e Biologia Molecolare Clinica, Dip.
Scienze Biomediche, Univ. di Sassari
There is a numerous list of pre-analytical variables that
can alter the analysis of blood-derived samples. Serum
and plasma are the most common specimens for various
analysis in clinical diagnostics. Different studies have
shown that plasma samples are preferable to serum for
the analysis of peptides and small proteins (1). Since
human plasma is easily accessible it is usually the
most valuable specimen for identifying biomarkers of
diseases. In this study we evaluated the effect of storage
temperature on the protein profile of human plasma.
Blood samples were collected in EDTA tubes from six
individuals (3 males and 3 females) and centrifuged to
obtain plasma. The plasma sample of each individual
was divided into 4 aliquots, one aliquot was analysed
at the moment while 3 of these were stored at different
temperatures, -80°C, -20°C, 4°C, Room Temperature
(20-25°C) and thawed and analysed 13 days later.
Proteins were extracted and separated by bidimensional
electrophoresis (2D-PAGE ), the gels were stained with
Coomassie R-250 and their images analysed using the
software PDQuest.
The Student t-test implemented for PDQuest identified
different protein spots whose relative intensities were
significantly varied (p<0.05) when comparing samples
extracted at time 0 and those under the 4 different storage
temperatures (2, 23,46 and 21 different spots at -80°C,
-20°C, 4°C, R.T. respectively). An increasing number
of spots highlighted by the t-test showed to lower their
intensities with a two-fold decrease, in particular 2 spots
at -80°C, 9 at -20°C, 38 at 4°C and 7 at R.T., while only a
few number of spots showed a two-fold increase.
This work shows how different storage temperatures can
have a significant influence on plasma protein profiles;
our results suggest that when the samples can’t be
analysed immediately the ideal storage temperature for
plasma samples, before 2D analysis, is -80°C (correlation
coefficient between fresh and stored samples: 0.81).
However further investigations will be necessary to better
understand the nature of these spots by using mass
spectrometry for protein identification.
(1) Peptidomic analyses of human blood specimens:
comparison between plasma specimens and serum by
differential peptide display. Tammen et al. , Proteomics
(2005)
069
ASPETTI BIOLOGICI E MOLECOLARI DELLA
LINFOCITOSI B MONOCLONALE
1
2
3
070
L’EMOCROMATOSI EREDITARIA, UNA MALATTIA
ETEROGENEA. ANALISI DI UNA FRATRIA
1
F. Sciarini , D. Perego , F. Rossini , S. Signorini , G.
1
1
1
4
Limonta , M. Piatti , P. Mocarelli , P. Brambilla
1
Servizio Univ. di Medicina di Laboratorio, Osp. di Desio
2
Div. di Medicina, Osp. di Desio
3
Div. di Ematologia, Osp. S.Gerardo dei Tintori di Monza
4
DIMS, Medicina e Chirurgia, Univ. Milano Bicocca
Introduzione:In presenza di un’espansione monoclonale
di cellule B, una conta linfocitaria superiore a 5000/
MMC caratterizza soggetti con leucemia linfatica cronica
(LLC), mentre una conta linfocitaria inferiore a 5000/MMC
caratterizza soggetti con linfocitosi B monoclonale (MBL).
Le MBL sono classificate o come CD5- o come CD5+
assimilabili a LLC (CLL-MBL). Recenti studi suggeriscono
che in soggetti CLL-MBL la malattia possa evolvere in
LLC.
Scopo:Valutazione retrospettiva delle caratteristiche
biologiche e molecolari del clone linfocitario in pazienti
CLL-MBL.
Materiali e metodi:Sono stati analizzati 42 soggetti CLLMBL, in cura presso le Divisioni di Medicina dei nostri
ospedali. Lo stato mutazionale di IgVH è stato valutato
tramite sequenziamento automatico (ABI PRISM 310,
Applied Biosystems) e considerato non mutato nel caso di
omologia superiore al 98%. L’espressione dei marcatori
immunofenotipici, di ZAP-70 e CD38 (considerati positivi
con espressione superiore al 20%) è stata valutata in
citofluorimetria (Beckman-Coulter Epics XL-MCL).
Risultati:Per i 42 pazienti è stato valutato
l’immunofenotipo e la restrizione delle catene leggere
dei linfociti. Lo stato mutazionale del gene IgVH è stato
determinato in 36 pazienti. Le sequenze identificate come
riarrangiamenti non produttivi (1) o biallelici (1) e a cui non
è stato possibile assegnare una percentuale di omologia
(1) sono state escluse. Dei restanti 33 pazienti, 29 (88%)
presentano il gene IgVH mutato, mentre 4 (12%) non
mutato. Le famiglie più rappresentate sono VH4-34 (21%)
e VH3-7 (9%). L’espressione di ZAP-70 è stata valutata
per 41 pazienti ed è risultata positiva in 16 casi (39%)
e negativa in 25 (61%). L’espressione di CD38 è stata
valutata in 42 soggetti e solo 1 (2%) è risultato positivo.
In 7 soggetti dei 19 a cui è stata misurata la linfocitosi per
almeno 2 anni, si è evidenziata progressione. Nel 86%
(6/7) di questi soggetti era presente almeno un fattore
prognostico negativo.
Conclusioni:Complessivamente i soggetti CLL-MBL
studiati hanno, in prevalenza, IgVH mutato e repertorio
genico simile a quello dei casi LLC mutati. Da notare che
i pazienti con linfocitosi progressiva presentano spesso
(86%) almeno un fattore prognostico negativo.
Bibliografia:Shanafelt TD, Leukemia 2010; 24: 512-520
1
1
1
M. Schioppa , G. Canzano , A. Di Tria , A.
1
1
Costanzo , A. Costanzo
1
Aornas "Sant'Anna e San Sebastiano" Caserta
2
U.O.C. Patologia Clinica
3
U.O.S.D. Genetica e Biologia Molecolare
Introduzione: Il gene HFE svolge il ruolo di controllore del
passaggio del ferro dalla cellula della mucosa intestinale
al sangue. L’identificazione della presenza delle mutazioni
nel gene HFE coinvolto nell’emocromatosi implica la
possibilità di rimuovere il ferro in eccesso prima che si
verifichi il danno tessutale.
SCOPO: Lo scopo del nostro lavoro è stato quello di
individuare la segregazione delle più frequenti mutazioni
del gene HFE in una famiglia.
Materiali e Metodi: Nel nostro studio sono state analizzate
le mutazioni del gene HFE mediante ibridazione inversa,
previa estrazione ed amplificazione del DNA, in una
paziente e successivamente sui familiari.
Risultati e Discussioni: Abbiamo riscontrato sulla nostra
paziente una doppia mutazione, la H63D e la S65C
e valori di ferritina >3000ng/ml. Il primo step è stato
quello di individuare, data la stretta vicinanza delle due
mutazioni sul gene, se queste fossero in cis o in trans.
Quindi, abbiamo esteso il test genetico anche ai figli
della paziente, rivelando, uno la mutazione H63D e l’altro
la mutazione S65C. Più sorprendentemente abbiamo
riscontrato che entrambi erano eterozigoti composti con
un’altra mutazione, la C282Y di derivazione paterna. La
nostra conclusione è stata che le mutazioni della paziente
si trovavano in trans. La mutazione C282Y è, come
noto, associata alla forma più grave di emocromatosi
ereditaria soprattutto quando è in omozigosi, mentre le
mutazioni H63D e S65C determinano forme più lievi della
malattia. Tuttavia è possibile ipotizzare che la presenza
delle mutazioni H63D e S65C nello stesso introne,
possano codificare per una proteina meno funzionale con
conseguente accumulo di ferro. I figli, essendo eterozigoti
composti presentano valori normali di ferritina. Tutto
questo può essere spiegato dal fatto che l’emocromatosi
ereditaria è una malattia eterogenea e quindi oltre ad
un’alterazione genetica principale altri geni modulatori
e fattori acquisiti possono interagire nel determinare
l’espressione della malattia.
Conclusioni: La possibilità di valutare il rischio di
malattia in soggetti asintomatici è uno degli aspetti
dell’applicazione della genetica nella pratica clinica. La
logica di fondo è che su questi individui, classificati come
soggetti a rischio si può intervenire per prevenire la
malattia e/o per evitare complicanze gravi.
423
071
SEGREGATION OF THE G3460A/ND1 mtDNA
MUTATION IN LEBER'S HEREDITARY OPTIC
NEUROPATHY (LHON) FAMILIES: IMPLICATIONS
FOR DIAGNOSIS AND PROGNOSIS
1
2
1
P. Magistroni , M.L. Valentino , S. Macchi , C. La
2
2
2
1
Morgia , L. Iommarini , A. Maresca , G. De Luca , V.
2
1
Carelli , F. Pallotti
1
Dept. of Experimental and Clinical Biomedical
Sciences, Univ. of Insubria, Varese, Italy; Circolo
Hospital-Clinical Biochemistry Laboratory, Varese
2
Dept. of Neurological Sciences, Univ. of Bologna,
Bologna, Italy.
Background. In order to shed light on the mechanisms
underlying the patterns of segregation of mtDNA
pathogenic mutations, we studied three unrelated LHON
families harbouring the G3460A/ND1 mtDNA mutation in
heteroplasmic fashion with at least one family member
affected with LHON. The segregation of heteroplasmy
was studied along the maternal lineages to assess
the modality of the mutation accumulation through
generations .
Methods. We studied total DNA from blood and we
quantified the mutational load in every family member by
a real-time PCR method, using a TaqMan MGB probe.
Results. Analysis of the three LHON families with
the G3460A/ND1 mutation showed different patterns of
transmission within the same maternal lineage: with
branches switching rapidly to homoplasmy and others
remaining heteroplasmic or reverting to wild type. Family
1 shows a rapid drift to homoplasmy in a few generations.
Family 2 shows the same pattern of rapid shift in two
branches of the family tree, whereas in other three
branches low heteroplasmic loads seems to maintain
stability through generations. Family 3 shows both
patterns as the above mentioned families.
Conclusions. The study of large pedigrees harboring
pathogenic mtDNA mutations could give valuable
information to be used both in diagnosis and prognosis
of the disease. LHON is a mitochondrial disorder
characterized by incomplete penetrance and the clinical
manifestations may be very different among families and
among subjects within the same maternal lineage. LHON
mutations are often homoplasmic, but not all homoplasmic
individuals are affected. Here we studied three different
families with different loads of heteroplasmic mutation.
The segregation of the G3460A/ND1 mutation may occur
in different ways even within the same family, as observed
in particular for family 2. These findings suggest that
the pattern of mutation segregation may be genetically
regulated, but independently from the mtDNA mutation.
In fact, this pattern of segregation along the maternal
line seems to be maintained through generations and
this might be a powerful tool in the prediction of possible
homoplasmic shifts, thus giving information on the clinical
phenotype along generations.
424
072
A COMMON POLYMORPHISM IN SCN5A GENE IS
ASSOCIATED WITH DILATED CARDIOMYOPATHY
2
2
1
1
G. Frisso , L. Forgione , G. Limongelli , G. Pacileo , S.
3
1
1
1
Zanotta , V. Maddaloni , T. Roselli , M.G. Russo , D.
4
1
5
Bonaduce , R. Calabrò , F. Salvatore
1
U.O.C. di Cardiologia AORN Monaldi, Seconda Univ.
degli Studi di Napoli,Napoli
2
CEINGE-Biotecnologie Avanzate s.c.ar.l, Napoli, Dip.di
Bioch. e Biotec. Med., Univ. Federico II,Napoli
3
Dip.di Bioch. e Biotec. Med., Univ. Federico II,Napoli
4
Dip. Med. Clin. Scienze Cardiov. Immunol., Univ.
Federico II,Napoli
5
IRCCS – Fondazione SDN, Napoli, CEINGEBiotecnologie Avanzate s.c.ar.l, Napoli
Background. Dilated cardiomyopathy (DCM) is
characterized by ventricular dilatation and impaired
systolic function. DCM is a final common pathway of
various acquired diseases, up to 50% of cases are
reported to be idiopathic and approximately 20% of DCM
cases display familial prevalence. More than 20 genes
are associated with DCM in humans. DCM associated
genes encode structural proteins of cardiomyocytes and
ion channels. The gene SCN5A, which encodes the alpha
subunit of the major Na+ channel in the heart.
We hypothesized that the p.H558R polymorphism could
be a genetic risk factor in dilated cardiomyopathy, as the R
minor allele of this polymorphism has been shown to alter
SCN5A function, by reducing depolarizing sodium current
and modulating the biological effects of concomitant
SCN5A mutations.
Methods. We recruited 134 DCM patients (50 with familial
DCM -FDCM-, 58 with idiopatic DCM and 26 patients
affected by post-ischemic DCM) and 168 age, ethnicity,
and gender matched controls. The mean age at diagnosis
was 45+12 y., with a mean follow-up of 8.2+5.5 y.
SCN5A was subject to comprehensive mutation scanning
in all cases and to targeted genotyping of a common
loss-of-function p.H558R polymorphism in controls. The
Hardy-Weinberg law was applied to analyze distribution
of SCN5A p.H558R genotypes. Association between the
three genotypes and categorical variables were tested
2
using the c test or Fisher’s exact test.
Results. The major finding of this study was a significant
difference in frequencies of the 3 p.H558R genotypes
in familial DCM compared to normal controls: HH 40 vs
49%, HR 36 vs 44%, RR 24 vs 7%; p = 0.004). 60% of
familial DCM subjects had at least one R allele compared
with 51% of controls. The minor R allele frequency was
42% in familial DCM compared with 29% in the normal
controls. Compared with the HH and HR genotype, the RR
genotype confers an OR for developing DCM in familial
cases of 4.1 (95% CI 1.7-9.9; p = 0.001).
Conclusions. Our data demonstrate that the SCN5A
p.558RR genotype is associated with dilated
cardiomyopathy in patients with familial DCM. This result
may help to early identify candidates to develop DCM
among asymptomatic relatives of FDCM patients in
families without an identified mutation.
073
XRCC1 AND RAD51 GENETIC SINGLE NUCLEOTIDE
POLYMORPHISMS MODIFY NORMAL ACUTE
TISSUE REACTIONS IN HEAD AND NECK CANCER
PATIENTS TREATED WITH RADIATION THERAPY
1
1
2
1
N. Pratesi , L. Simi , M. Mangoni , I. Mancini , G.P.
2
1
1
Biti , M. Pazzagli , C. Orlando
1
Dip. Fisiopatologia Clinica, Sez. Biochimica Clinica,
AOU Careggi, Firenze
2
Dip. Fisiopatologia Clinica, Sez. Radioterapia, AOU
Careggi, Firenze
The radiation dose necessary to achieve local tumor
control is limited by the tolerance of normal tissues
present in the irradiation field. Patients treated with the
same schedule may develop different toxicity effects.
It is assumed that SNPs can be responsible for such
cases of clinical radiosensitivity and are being sought to
individualize radiation treatment of cancer patients. We
investigate the association between XRCC1 G28152A,
XRCC3 C18067T, RAD51 G135C and GSTP1 A313G
variants and the occurrence of acute reactions in 85 head
and neck cancer patients after radiotherapy. We used
HRMA (High Resolution Melting Analysis) for the rapid
detection of SNPs.
Mucositis, xerostomy, dermatitis and dysphagia were
considered the clinical end points. Skin reaction within
the radiation field was documented during the treatment,
and severity of acute side effects was assessed using
NIH Common Toxicity Criteria. Patients with moderate
to severe toxicity (grade >2 ) were compared to those
with little or no reaction (grade ≤2). Chi-square analysis
revealed an association between XRCC1 G28152A and
higher grade of mucositis (p=0,04, OR=4.7); RAD51 135
GG/GC was associated with lower grade of dysphagia
(p=0,05, OR=2.4).
The average biologically effective radiation dose (BED)
was 58,01±1.22 Gy and it was calculated to account
for difference in fractionation and overall treatment time,
using the formula:
BED = nd[1+(dß/α)]- γ/α(T-T0),
given the number of fractions n, the fraction size of d,
an α/ß ratio of 10 Gy for acute skin reaction, a time
factor γ/α of 0,7 Gy/day, the overall treatment time T and
a starting time for compensatory proliferation T0 of 21
days. The likelihood of not developing severe acute skin
reaction (grade >2) was analyzed in relation to BED, as a
univariate survival analysis, using Kaplan-Meier methods.
The risk of acute mucositis was increased in patients
with XRCC1 G28152A (p=0.04). The probability of not
developing severe dermatitis and dysphagia was higher
in carriers of RAD51 135 GG/GC genotypes (p=O,029;
p=O,042).
Our data support the hypothesis that these SNPs may be
involved in cellular response to radiotherapy.
074
RAPID GENOTYPINGOF THE LACTASE-PHLORIZIN
HYDROLASE (LCT) GENE C/T-13910 AND G/A-22018
MUTATIONS BY HIGH-RESOLUTION MELTING
CURVE ANALISYS
1
1
1
1
C. Santonocito , E. Torti , R. Penitente , C. Zuppi , E.
1
Capoluongo
1
Lab. Biologia molecolare clinica-Dip. Biochimica e
Biochimica clinica-Univ. Cattolica Sacro Cuore- Roma
Background: Adult-type hypolactasia is a widespread
condition throughout the world, causing lactose
malabsorption. The lactose breath test is a simple
diagnostic tool, but the need for prolonged monitoring
of hydrogen excretion has led to a genetic test
proposal. A single nucleotide polymorphism, C/T#13910
co-segregates with the persistent/non-persistent trait and
it is the major factor responsible for the persistence of the
lactase-phlorizin hydrolase (LCT) gene expression. The
CC genotype indicates lactase non-persistence, the TT
genotype indicates lactase persistence and heterozygosis
(C/T) is accompanied by an intermediate defect. Another
mutation in co-segregation with C/T-13910 has recently
been discovered in the LCT gene (G/A-22018): this
determines the persistence of the enzyme’s activity. The
most common molecular test is based on RFLP method.
The aim of the present study is to describe a new
High Resolution Melting (HRM) analysis for a rapid LCT
mutation genotyping.
Methods: Analyses for C/T-13910 and G/A-22018
mutations were performed using HRM-based method.
Primers were designed for this study based on the
GenBank sequence. We screened C/T-13910 and G/
A-22018 mutations in 50 individuals attending the Hospital
premises. In order to evaluate the reliability of this
technique, we compared the results obtained by HRM,
RFLP and sequencing.
Results: We found the following genotypes: CCGG,
CTGA, CCGA, TTAA. Since the C>T and G>A
transversion modifies the derivative melting curve shape
and the melting temperature (Tm), all possible genotypes
were successfully identified.
Conclusions: HRM analysis for the C/T-13910 and G/
A-22018 mutations genotyping is a simple, rapid, sensitive
and low cost method, very useful in diagnostics.
Reference: Identification of a variant associated with
adult-type hypolactasia.
Enattah NS, Sahi T, Savilahti E, Terwilliger JD, Peltonen
L, Järvelä I.
Nat Genet. 2002 Feb;30(2):233-7.
425
075
THE NOVEL HH1 N1472DEL MUTATION IN A
LONG QT PATIENT SHOWS MIXED BIOPHYSICAL
PROPERTIES
076
DIGENIC HETEROZYGOSITY IN KCNQ1 AND KCNH2
GENES CAUSES SEVERE LONG QT PHENOTYPE
1
1
1
1
3
N. Detta , G. Frisso , A. Zullo , C. Cozzolino , B.
2
2
4
2
Sarubbi , E. Romeo , D. Wang , R. Calabrò , F.
5
4
Salvatore , A.L. George
1
CEINGE–Biotecnologie Avanzate s.c.ar.l., Napoli, Italia
2
U.O.C. Cardiologia, A.O. Monaldi, Seconda Univ. di
Napoli, Italia
3
Dip. di Biochimica e Biotecnologie Mediche, Univ.
Federico II, Napoli, Italia
4
Div. Genetic Medicine, Dept. Medicine and
Pharmacology and Institute for Integrative Genomics,
Vanderbilt University, Nashville, TN, USA
5
CEINGE–Biotecnologie Avanzate s.c.ar.l. e IRCCSFondazione SDN, Napoli, Italia
Long QT syndrome (LQTS) is a familial autosomal
dominant disease characterized by prolongation of the QT
interval on the surface ECG, syncope, torsade de pointes
and sudden cardiac death in young patients. Heritable
LQTS is classified into different types (LQTS 1-12), and
each type is linked to mutations in a specific gene.
LQTS3 is associated with gain-of-function mutations
in the SCN5A gene; the gene encodes the voltagedependent cardiac sodium channel α-subunit that allows
a large inward depolarizing current during phase 0 of
the cardiac action potential. We identified and functionally
characterized the novel SCN5A c.4416-4418delAAC
(p.N1472del) mutation associated with LQTS. This
deletion was engineered into the recombinant human
heart sodium channel (hH1) and coexpressed with the
human sodium channel ß-1 subunit (hß1) in the tsA201
cell line. The functional properties of the p.N1472del
mutation were then determined by whole-cell patch clamp
recording. The mutant channel had a decreased current
density and the potential for half-maximal activation (V1/2)
was shifted to more positive potential compared with wildtype (WT) channel; the slope factor (k) was higher in
SCN5A-p.N1472del than in the WT channel. The mutant
also exhibited a +12 mV depolarizing shift in the V1/2
of steady-state of inactivation compared with the WT,
whereas WT and SCN5A-p.N1472del had similar slope
factors. Moreover, the mutant had a slower recovery
from inactivation experiments than WT. Finally, we tested
if the mutant exhibited the increased persistent sodium
current that is typical of SCN5A mutations associated with
LQTS3. Current levels were persistently higher in SCN5Ap.N1472del than in the WT channel. In conclusion, our
results demonstrate that p.N1472del mutation causes all
the biophysical defects commonly associated with LQT
(increased persistent current and positive shift in the
voltage-dependence of inactivation) and is responsible for
other functional alterations (positive shift in the voltage
dependence of activation and a slower recovery from
inactivation) which can be related to additional clinical
defects.
426
1
1
2
A. Zullo , G. Frisso , N. Detta , B. Sarubbi , E.
2
2
3
4
Romeo , R. Calabrò , A.L. George , F. Salvatore
1
CEINGE–Biotecnologie Avanzate s.c.ar.l., Napoli, Italia
2
U.O.C. Cardiologia, A.O. Monaldi, Seconda Università
di Napoli, Italia
3
Div. Genetic Medicine, Dept. Medicine and
Pharmacology and Institute for Integrative Genomics,
Vanderbilt University, Nashville, TN, USA
4
CEINGE–Biotecnologie Avanzate s.c.ar.l. e IRCCSFondazione SDN, Napoli, Italia
Long QT syndrome (LQTS) is an inherited arrhythmic
disorder associated with QT interval prolongation on ECG,
syncope, torsade de pointes and sudden cardiac death in
young patients. Heritable LQTS is classified in 12 types
depending on mutations in a specific gene. In most cases,
the mutations involve the genes encoding α-subunits
of repolarizing K+ channels (KCNQ1 and KCNH2).
Prolongation of the QT interval and action potential
duration is associated with the decrease of outward K
+ current in cardiomyocytes. The screening for LQTScausing mutations in a family from South Italy revealed
two mutations in two genes: c.G1748A (p.R583H) in
KCNQ1 and c.G323A (p.C108Y) in KCNH2. Interestingly,
all subjects carrying just one of these two mutations did not
show the LQT phenotype, whereas the only two subjects
carrying both were clinically affected (QTc > 530ms). To
analyze the genotype-phenotype association and to shed
light on the pathogenetic defects responsible for these
LQTS cases we characterized the biophysical features
of the two mutant channels. We generated the KCNQ1
and KCNH2 mutants by site-directed mutagenesis. Each
mutant was transiently expressed in CHO cells and
functionally characterized by whole-cell patch clamp
recordings. The biophysical studies showed that in the
homozygous condition, mutation c.G323A led to a nonfunctional KCNH2 channel, whereas, in the heterozygous
condition, mutant KCNH2 had significantly reduced
current density at positive potentials and a negative shift
in the voltage dependence of activation compared to
the wild type. Furthermore, mutant KCNQ1-p.R583H had
significantly reduced tail current density compared to the
wild-type channel, but no significant changes in activating
current density and voltage-dependence of activation.
In conclusion, our results demonstrate that mutation
KCNH2-p.C108Y induced a dominant negative effect
in the heterozygous condition. Moreover, both KCNH2p.C108Y and KCNQ1-p.R583H had some biophysical
defects that could be combined and lead to the LQTS
phenotype, as observed in the pedigree of the family
reported herein.
077
LA PCR IN REAL-TIME PER Bk VIRUS NEL POSTTRAPIANTO RENALE
2
1
1
G. Canzano , M. Schioppa , R. Ferrante , .
1
1
1
Nunziante , A. Costanzo , A. Costanzo
1
AORNAS "Sant'Anna e San Sebastiano" CASERTA
2
U.O.C.di Patologia Clinica
Introduzione:Il BK virus( BKV) è un polyomavirus
umano associato a nefropatie (PVAN) e disfunsioni
renali in pazienti(Pz) trapiantati renali(TxR).Persiste
in
forma
latente
nel
tratto
urogenitale
e
nei
linfociti
B
di
soggetti
sani
e
può
riattivarsi in individui immunocompromessi.La terapia
immunosoppressiva(Tacrolimus-Micofenolato)diminuisce
il rischio di rigetto nei trapiantati ma aumenta il rischio di
patologie infettive tra cui anche la replicazione di BKV dai
siti di latenza provocando a volte nefropatia interstiziale.
Scopo:In questo studio è stata condotta un indagine per
valutare la replicazione del BKV nei Pz Tx sottoposti a
terapia antirigetto e valutare i vantaggi di una diagnosi
precoce per migliorare la prognosi del Graft.
Materiali e Metodi:I valori di viruria e viremia
sono
stati
ottenuti
secondo
un
protocollo
di biologia molecolare:estrazione DNA(tecnologia
boom),amplificazione e rivelazione mediante PCR-RealTime(CELBIO).
Risultati
e
discussioni:Nel
periodo
considerato(gennaio2009-luglio
2010)
abbiamo
analizzato un totale di 150 campioni(69 urine,81 sangue
intero)provenienti da 53 pazienti afferenti i reparti di
nefrologia ed ambulatorio esterno per Tx.Il BKV è risultato
positivo in 27/53(50,94%) Pz,di cui 18/53 urine(33,96%)
e 9/53 sangue intero(16,98%), con un aumento della
viruria che ha preceduto quello della viremia .Dei Pz
esaminati,35/53(66,04%) sono stati screenati sia per
sangue che urine.Di questi,3/35(8,57%) hanno presentato
viruria e viremia positiva.
Conclusioni:La PCR, nei pazienti monitorati, per
viruria è risultata essere un indice precoce di
replicazione virale che può consentire di attuare una
diminuzione del dosaggio del Tacrolimus come primo
intervento terapeutico per prevenire la progressione del
deterioramento della funzione renale.Per i pazienti con
contemporanea viruria e viremia,in particolare, è stato
osservato che al diminuire del tacrolimus diminuiva
la carica virale. La PCR quantitativa in associazione
con il monitoraggio del tacrolimus,in assenza di
sintomi clinici,consente di personalizzare la terapia
immunosoppressiva dei TxR.
078
DNA SEQUENCE CAPTURE ARRAY AND NEXT
GENERATION SEQUENCING TO IDENTIFY NEW
DISEASE-CAUSING GENES: THE CASE OF
HYPERTROPHIC CARDIOMYOPATHY
1
1
2
2
V. D'Argenio , G. Frisso , V. Precone , A. Boccia , G.
3
3
4
3
Limongelli , G. Pacileo , A. Fienga , R. Calabro' , G.
1
5
Paolella , F. Salvatore
1
CEINGE-Biotecnologie Avanzate s.c.a r.l., Napoli, Italia;
Dip. di Bioch. e Biotecn. Med., Univ. Federico II, Napoli
2
CEINGE-Biotecnologie Avanzate s.c.a r.l., Napoli
3
U.O.C. di Cardiologia A.O. Monaldi,Seconda Univ. degli
Studi, Napoli
4
Dip. di Bioch. e Biotecn. Med., Univ. Federico II, Napoli
5
CEINGE-Biotecnologie Avanzate s.c.a r.l., Napoli, Italia;
IRCCS – Fondazione SDN, Napoli
Hypertrophic cardiomyopathy (HCM) is the most frequent
genetic cardiovascular disease worldwide and is an
important cause of heart failure-related disability in young
1
people . To date, about 50 different genes have been
identified and the number is increasing. We evaluated a
novel approach to identify causative mutations in a large
number of HCM candidate genes. Four HCM patients
previously analysed by DHPLC/Sanger sequencing for
causative mutations in 8 sarcomeric genes were enrolled
in this study. Overall, 234 genes were selected for
array on the chip, and a custom sequence capture
array was designed for target enrichment of all coding
regions and 500 bp flanking regions at each of their two
ends. The size of our target was 3,908,196 bp. Each
DNA sample was sequenced in two independent runs
by the GS FLX System. We obtained an average of
164 Mb/sample, which is equivalent to 503,775 different
sequencing reads/sample with an average read length of
325.6 bp. Sequence and data analysis were performed
using the Roche/454 gsMapper software. High confidence
variants were blasted against the SNP database to
distinguish between known and unknown variants. We
found 7864 different variants, of which 6725 were intronic,
424 intergenic and 715 exonic. About 31% of the last
ones were novel and 56 novel variants were in 35 HCM
related genes. In all patients, we confirmed the mutations
and polymorphisms previously identified in them with the
DHPLC/Sanger approach. The simultaneous analysis of
a vocabulary of genes so to increase sensitivity for the
molecular diagnosis may in turn increase the information
for those patients in whom traditional screening was
not adequate. With this new technology it may be
possible to identify mutations in genes that, also acting
as phenotype modifiers, could be responsible for clinical
variability thereby contributing to explain the pathogenetic
mechanism underlying HCM development. Consequently,
by reducing time and costs and increasing the sensitivity
of molecular testing, routine HCM molecular diagnostics
could be implemented also to obtain a model readily
applicable to other genetic diseases.
1
Frisso G et al. Clin Genet 2009; 76:91-101
Acknowledgments
This study was supported by grant from Regione
Campania, MIUR PS35-126/IND and PRIN.
427
079
DE NOVO SEQUENCING AND ASSEMBLY OF
THE WHOLE GENOME OF NOVOSPHINGOBIUM
PUTEOLANUM PP1Y: A PUTATIVE
BIOTECHNOLOGY ENGINE
1
2
1
1
V. D'Argenio , P. Cantiello , B. Naso , M. Petrillo , L.
2
3
1
3
Cozzuto , E. Notomista , G. Paolella , A. Di Donato , F.
1
Salvatore
1
CEINGE - Biotecnologie Avanzate, Napoli --- Dip. di
Biochimica e Biotecnologie Mediche, Univ. degli Studi di
Napoli Federico II
2
CEINGE - Biotecnologie Avanzate, Napoli
3
Dip. di Biologia Strutturale e Funzionale, Univ. di Napoli
Federico II
Novosphingobium sp. PP1Y, isolated from seawater
of the harbor of Pozzuoli (Naples, Italy), is able to
grow on a wide range of aromatic compounds including
mono, bi, tri and tetracyclic aromatic hydrocarbons
1
and heterocyclic compounds . These peculiar features
suggest that PP1Y has adapted to grow efficiently at
the water/fuel oil interface using the aromatic fraction
of the fuel oils as carbon and energy source(1). The
whole PP1Y genome sequence could provide important
clues about the metabolism of this species and about
the possibility of manipulating it for bioremediation
purposes. In this context, we carried out the highthroughput de novo sequencing and assembly of
the whole Novosphingobium genome using the GS20
System. The genomic DNA was randomly sheared
into small fragments, purified and assessed for quality.
The library obtained was hybridized on the surface of
microscopic beads, clonally amplified within the droplets
of a water-in-oil emulsion (emPCR), and bi-directionally
sequenced using a modified pyrosequencing protocol.
The resulting sequencing reads were analyzed and
processed into contigs generating a consensus sequence.
PCR amplifications were performed to fill in gaps
generated by contigs assembly. Four sequencing runs
were performed, which yielded more than 120 Mb, being
equivalent to 1,224,396 sequencing reads. Because the
PP1Y genome is about 5.2 Mb, we obtained a coverage
of 22.6X. The average read length was 101.8 bp and
average GC content 63.2%. The 98.8% of the sequencing
reads was used for the assembly, obtaining 286 contigs,
108 of which were larger than 500 bp, the largest contig
was 368,742 bp. We used two PCR strategies to complete
the assembly. The results were assembled with the GS
data so that the entire genome sequence was obtained.
The final PP1Y genome is comprised of a single 3.9
Mb circular chromosome. We also identified the DNA
sequence of 3 plasmids, one megaplasmid of 1.16 Mb
and two plasmids of 192 and 48 kb respectively. Our
results will help to clarify the molecular basis of the
unusual features of this strain and to engineer strains with
enhanced abilities.
1
Notomista E et al, 2010. Submitted.
Acknowledgments
This study was supported by grant from Regione
Campania, MIUR PS35-126/IND and PRIN.
428
080
RAPID AND SENSITIVE ASSESSMENT OF PAH
MUTATION STATUS IN HYPERPHENYLALANINEMIA
ITALIAN PATIENTS BASED ON DNA HIGH
THROUGHPUT SEQUENCING
1
2
1
1
A. Palmieri , V. D'Argenio , G. Guerri , V. Sanna , A.
3
4
Daniele , F. Salvatore
1
CEINGE-Biotecnologie Avanzate Sca rl, Napoli
2
CEINGE-Biotecnologie Avanzate Sca rl, Napoli --- Dip.
di Biochimica e Biotecnologie Mediche, Univ.' degli Studi
di Napoli Federico II
3
di Scienze Ambientali, Seconda Univ. degli Studi di
Napoli
4
di Biochimica e Biotecnologie Mediche, Univ. degli Studi
di Napoli Federico II --- IRCCS-Fondazione SDN, Napoli
Phenylketonuria (OMIM database: 261600) and its
Hyperphenylalaninemia (HPA) variants are the most
important disorders of amino acid metabolism caused
by a deficiency of phenylalanine hydroxylase (PAH:
EC 1.14.16.1), which metabolizes phenylalanine (Phe)
to tyrosine. Phe causes severe brain damage but
an early Phe-restricted diet prevents neurocognitive
and developmental damage. In most HPA forms,
defective PAH activity results from mutations in the
PAH gene. To date, more than 500 mutations, scattered
throughout the gene, have been identified (http://
www.pahdb.mcgill.ca). Mutation analysis is important to
obtain information both about the expected phenotype
and for counseling in the affected families. In our
lab, we perform the molecular diagnosis of HPA with
a detection rate of #90% [1, 2]. We have set-up
a competitive strategy based on the high-throughput
sequencing approach. From a control population and HPA
patients identified from neonatal screening, we collected
a blood sample (3 mL) in EDTA and extracted DNA
using a standard protocol. Using the Primer3 software
(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/), we designed specific
primers encompassing about 100 kb including 20 kb
of the promoter region, all exons and introns, and 5
kb of the 3’ UTR region of PAH gene. Subsequently,
overlapping long-PCR amplicons, ranging in size between
8-12 kb, were generated using a touch-down protocol.
Each amplicon was individually amplified and purified.
After appropriate quality assessment (2100 BioAnalyzer,
Agilent) and quantification (Picogreen assay, Invitrogen),
the amplification products from the same DNA sample
are sequenced. The PCR amplification/high throughput
sequencing approach detects both single-nucleotide
polymorphisms and CNVs in target genes thereby
increasing the spectrum of detected variations within the
analyzed gene.
1. Daniele A et al. (2008) BBA, 1782, 378
2. Daniele A et al. (2009) FEBS Journal 276, 2048
Acknowledgments
This study was supported by Regione Campania
(Convenzione CEINGE_Regione Campania, G.R.
27/12/2007), by IRCCS-Fondazione SDN, and by
Ministero Salute, Rome, Italy
081
ANALISI MOLECOLARE DEL GENE TP63 IN
PAZIENTI AFFETTI DA SINDROME EEC
1
1
2
082
DIAGNOSI DI SINDROME DI SHWACHMANDIAMOND MEDIANTE ANALISI MOLECOLARE DEL
GENE SBDS
1
P. Nardiello , R. Miceli , E. Di Iorio , C. Missero , G.
1
Castaldo
1
CEINGE-Biotecnologie Avanzate, Napoli - Dip. di
Biochimica e Biotecnologie Mediche Univ. di Napoli
Federico II
2
Fondazione Banca degli Occhi del Veneto-Onlus,
Zelarino (Mestre), Italy
Le sindromi EEC (Ectrodactyly-ectodermal dysplasiaclefting syndrome) sono disordini caratterizzati da
ectrodattilia, displasia ectodermica e labiopalatoschisi;
sono noti due tipi di sindrome EEC, correlate a diversi
loci genici: tipo 1 (locus in 7q11.2-q21.3) e tipo 3 (locus
in 3q27-29). La EEC3 è una malattia rara, autosomica
dominante, a penetranza incompleta ed espressività
variabile, causata prevalentemente da mutazioni nel gene
TP63 localizzato sul cromosoma 3 (3q27-29), e costituito
da 16 esoni. La sua espressione è regolata da due
promotori che danno origine a due gruppi di isoforme:
quelle contenenti un dominio N teminale con attività di
transattivazione (TA) e quelle che non contengono tale
dominio (∆N); uno splicing alternativo al C terminale
genera ulteriori isoforme. TP63 codifica per p63, un
fattore di trascrizione coinvolto nello sviluppo degli epiteli
stratificati; la maggior parte delle mutazioni causative
di EEC3 cade nel dominio di legame al DNA (DBD).
Abbiamo sviluppato l’analisi in sequenziamento diretto dei
16 esoni di TP63, con cui abbiamo analizzato 44 campioni
di DNA (21 pazienti affetti o sospetti per EEC e 23 familiari
sani); il totale di soggetti analizzati comprendeva 10 nuclei
familiari e 6 casi singoli. Mutazioni in TP63 sono state
identificate in 14/21 pazienti; 7 sono di tipo missense
e riportate in letteratura; è stata inoltre identificata una
nuova missense in due pazienti non imparentati. In
2 dei 10 nuclei familiari la mutazione identificata era
trasmessa da un genitore al figlio affetto ed in entrambi
i casi l’espressione della malattia era estremamente
variabile; in 8 famiglie le mutazioni identificate erano
invece presenti nei pazienti affetti ma non nei genitori,
pertanto, sembrerebbero insorte a causa di un evento
de novo nel paziente affetto. Nonostante ad oggi siano
stati pubblicati rarissimi casi di mosaicismo germinale
per la sindrome EEC, l’analisi molecolare del gene TP63
nelle cellule germinali dei genitori dei pazienti in cui sono
state identificate mutazioni de novo, consentirebbe una
determinazione del rischio per la coppia di avere altri figli
affetti.
Lavoro supportato da regione Campania (DGRC 2362/07)
e MIUR (PS 35-126/Ind).
1
1
2
P. Nardiello , A.L. Galiero , V. Raia , R. Berni
2
2
Canani , A. Passariello
1
CEINGE-Biotecnologie avanzate, Napoli, Italy - Dip.
di Biochimica e Biotecnologie Mediche Univ. di Napoli
Federico II
2
Dip. di Pediatria, Univ. di Napoli Federico II, Napoli,
Italy
La Sindrome di Shwachman-Diamond (SDS) è un
disordine genetico a trasmissione autosomica recessiva,
la cui incidenza varia da 1:10.000 a 1:200.000 nati vivi.
La malattia presenta un quadro clinico estremamente
complesso, caratterizzato da insufficienza del pancreas
esocrino che si manifesta nei primi anni di vita
con malassorbimento e scarsa crescita, da alterazioni
ematologiche quali neutropenia costante o intermittente,
anemia, meno frequentemente piastrinopenia e leucemia.
A queste anomalie si possono associare una bassa
statura, alterazioni scheletriche, infezioni ricorrenti, ritardo
psicomotorio e deficit intellettivo. La SDS è causata da
mutazioni nel gene SBDS, localizzato sul cromosoma
7 in posizione q11; esso è costituito da 5 esoni e
codifica per una proteina di 250 aminoacidi coinvolta
nel processo di sintesi dell’rRNA. In posizione q11.23
è localizzato il suo pseudogene (SBDSP), che ha una
omologia di frequenza del 97% e che si ritiene implicato
in fenomeni di ricombinazione e conversione genica,
responsabili dell’insorgenza di mutazioni a carico del gene
SBDS. E’ stato eseguito uno studio di genotipizzazione
molecolare mediante sequenziamento diretto dei 5 esoni
di SBDS, su 42 campioni di DNA, di cui 41 estratti da
sangue periferico ed 1 da cellule di mucosa buccale. E’
stata posta diagnosi di SDS in 4 soggetti, e diagnosi
di 7 portatori appartenenti ai nuclei familiari di 3 affetti.
Le mutazioni identificate nel gene SBDS negli 11/42
soggetti analizzati sono le 2 mutazioni riportate in
letteratura come le più frequenti ed entrambe associate
a SDS: mutazione non-sense (c.183-184TA>CT, p.K62X)
ed una mutazione di splicing (c.258+2T>C, p.C84fsX3).
I 4 soggetti, nonostante avessero lo stesso genotipo,
presentavano una differente espressione clinica della
malattia. Probabilmente l'ampia variabilità del fenotipo e
l’evoluzione del quadro clinico con l'età sono alla base
delle difficoltà diagnostiche che possono provocare una
sottostima della reale incidenza della malattia; questo
è uno dei principali motivi che rendono di particolare
importanza l’esecuzione dell’indagine molecolare nei
primi anni di vita.
Lavoro supportato da regione Campania (DGRC 2362/07)
e MIUR (PS 35-126/Ind).
429
083
SPLENECTOMY AFTER A TRAFFIC ACCIDENT
HIDES A NEW PK-LR GENE MUTATION
1
1
1
084
MARCATORI GENETICI EMERGENTI DEL RISCHIO
DI OSTEOPOROSI:RUOLO DELLE VARIANTI DEL
GENE ESR2
1
A. Minucci , D. Tripodi , C. Santonocito , C. Zuppi , B.
1
1
Giardina , E. Capoluongo
1
Rome, Italy.
Background. Pyruvate Kinase (PK) deficiency is one of
the most common causes of nonspherocytic hemolytic
anemia. The degree of anemia varies widely, ranging
from very mild or fully compensated anemia to lifethreatening neonatal anemia and pronounced jaundice
necessitating exchange transfusions and subsequent
continuous transfusion therapy.
Methods. We report a case of a splenectomized patient
after traffic accident, with clinical history characterized
by a chronic mild hemolytic anemia due to unknown
cause and no familiar history of PK deficiency. While
the activities of the some investigated red cell enzymes
were normal or increased in relation to reticulocytosis,
PK activity was tending to the lower limit of the value
reference. For this reason we decided to analyze the PKLR gene by direct sequencing.
Results. The PK activity of the patient was 100 mU/
GR (normal values: 80-200). The patient shown mild
hyperbilirubinemia (2.7 mg/dl), reticulocytosis (5.8%) and
normal hemoglobin (13.1g/dl).
The sequence of PK-LR gene revealed the presence of
novel genotype: c.661G>T (exon 6) and c.1178A>G (exon
9) in trans allelic position as confirmed by parent’s genetic
analysis.
Discussion. Although in some cases there is a clear and
direct correlation between the patient’s genotype and
phenotype, caution is needed in predicting the clinical
consequences of molecular PK-LR gene abnormalities.
Moreover, in presence of PK deficiency the splenectomy
usually results in the PK activity normalization, in an
increase of 1–3 g/dl in hemoglobin, often reduces or
even eliminates the transfusion requirement in most
transfusion-dependent cases, but it does not arrest
hemolysis.
In our patient the splenectomy hides a novel PK-LR gene
mutation, masking the effects of this mutation on the
protein.
Conclusions. Functional studies of the mutant enzyme are
needed to understand the real effects of this mutation on
the enzyme activity.
Reference. Zanella A, Bianchi P, Fermo E. Pyruvate
kinase deficiency. Haematologica. 2007;92:721-3
430
1
1
2
2
M. Currò , N. Ferlazzo , A. Bitto , F. Squadrito , H.
1
1
1
1
Marini , S. Condello , R. Ientile , D. Caccamo
1
Dip. Scienze Biochimiche Fisiologiche e della
Nutrizione, Univ. di Messina, Messina
2
Dip. di Medicina e Farmacologia, Univ. di Messina,
Messina
L’analisi dei determinanti genetici del rischio di
osteoporosi ha assunto da tempo un ruolo molto
importante nello studio sui meccanismi patogenetici
dell’osteoporosi. Infatti è stato evidenziato come
caratteristiche scheletriche, quali l’altezza e la densità
minerale ossea (BMD), o gli stessi marcatori biochimici
tipici del turnover osseo abbiano una componente
fortemente ereditaria.
I marcatori tradizionali di rischio di osteoporosi
annoverano le varianti geniche del recettore della vitamina
D (VDR), della catena α1 del collagene I (COL1A1), del
recettore alfa degli estrogeni (ESR1), della calcitonina
(CTR), e dell’osteoprotegerina (OPG).
Altri polimorfismi genici, tra cui le varianti del gene del
recettore beta degli estrogeni (ESR2), sono stati proposti
come possibili nuovi candidati per la determinazione del
rischio di malattia osteoporotica (1).
La distribuzione prevalente del recettore ESR2 nel
tessuto osseo, differentemente dal recettore ESR1 che è
maggiormente ubiquitario, rende l’uso diagnostico delle
varianti del gene ESR2 più specifico allo scopo di
determinare l’influenza di fattori locali sul fenotipo osseo
nella popolazione generale.
In 90 soggetti di sesso femminile in pre-menopausa (età
media 45 ± 5 anni) abbiamo analizzato la distribuzione del
polimorfismo AluI (1730G>A) del gene ESR2 mediante
discriminazione allelica in Real-time PCR. Inoltre è stata
determinata la densità minerale ossea (BMD) e marcatori
biochimici del turnover osseo, quali fosfatasi alcalina
(ALP), osteoprotegerina (OPG), peptide C-terminale del
collagene (CTx), RANK e RANKL.
Il genotipo eterozigote GA (49%) è risultato prevalente
nella popolazione esaminata, seguito dal genotipo
omozigote GG (35%) e da quello omozigote AA (14%).
I risultati dell’indagine statitistica, mediante ANOVA oneway, mostrano una influenza del genotipo AA sulla BMD
e su alcuni dei marcatori del turnover osseo come ALP e
OPG.
La caratterizzazione dei marcatori genetici legati
all’ereditarietà di una bassa densità minerale ossea
potrebbe permettere di identificare precocemente
gli individui suscettibili a sviluppare osteoporosi,
consentendo una prevenzione mirata basata sull’uso di
terapie specifiche e adeguate modificazioni dello stile di
vita.
1. Rivadeneira et al., J Bone Miner Res. 21:1443-56,
2006.
085
INCREASED PLASMA LEVELS OF SOLUBLE CD40
LIGAND CORRELATE WITH PLATELET ACTIVATION
MARKERS AND UNDERLINE THE NEED FOR
STANDARDIZED PRE-ANALYTICAL CONDITIONS
1
1
1
1
F. Martini , S. Riondino , F. La Farina , A. Spila , M.
1
1
1
Semeraro , P. Ferroni , F. Guadagni
1
Dip. di Medicina di Laboratorio e Biotecnologie
Avanzate , IRCCS San Raffaele, Roma
Background It is well established that soluble CD40 ligand
(sCD40L) plays various physiological roles, mainly the
modulation of proinflammatory and immune responses.
The inflammatory network and the coagulation cascade
are strictly correlated biological systems, in a way that
atherosclerosis is considered to be an inflammatory
disease. Thus, CD40-CD40L interaction represents a
trigger for the initiation and perpetuation of chronic
inflammatory disorders actively involved in atherogenic
and thrombotic mechanisms and may serve as a link
between inflammation and atherothrombosis (Ferroni P et
al. Curr Med Chem 2007;14:2170).
Objectives To investigate whether sCD40L dosage might
represent a useful tool to explore in vivo platelet function.
Design and methods sCD40L and sP-selectin (marker of
in vivo platelet activation) levels and light transmission
aggregometry (LTA) were analyzed in 69 aged healthy
donors in whom baseline levels of sCD40L were
supposedly not affected by underlying pathologies.
Immunoassays were performed on platelet-depleted
citrate plasma samples. The effects of in vitro aspirin
treatment on the release of sCD40L were investigated
in 15 subjects following in vitro platelet stimulation by
exogenous agonists. The effects of a 1-month therapeutic
course of low-dose aspirin (100 mg/day) on sP-selectin
and sCD40L levels were also investigated.
Results A significant correlation was observed between
sCD40L and sP-selectin (p<0.01). In vitro aspirin
treatment remarkably decreased sCD40L levels following
platelet activation by exogenous agonists. sCD40L
directly correlated with LTA (p<0.0001). In vivo aspirin
treatment significantly reduced both sP-selectin and
sCD40L levels (both p<0.01) in a direct correlation
(p<0.05).
Conclusions Citrated plasma samples reflect sCD40L
released from platelets and, thus, physiological levels of
this marker in vivo. While further underlining the need
for standardization of pre-analytic conditions, including
the sample type, we may conclude that citrated plasma
samples, handled to minimize ex vivo release of sCD40L
from platelets, probably yield one of the most valid
estimates of in vivo circulating levels of soluble platelet
activation markers.
Partially supported by Italian Ministry of Health, Grant
RFIN06-PMS/40/06.
086
EFFICACY OF A QUALITY CONTROL SYSTEM FOR
THE USE OF INR PORTABLE MONITORS
1
1
1
1
L. Bassi , S. Testa , O. Paoletti , A. Alatri , A.
1
1
1
Zimmerman , N. Delpero , E. Spotti
1
A.O.Istituti Ospitalieri - Clinical Pathology Division ,
Haemostasis and Thrombosis Center - Cremona
Itroduction
Since 2002 the Hemostasis and Thrombosis Center
of Cremona decentralized the management of Vitam
K Antagonist patients in peripheral health units (PHU),
through using portable monitors (PM) .
Objectives
We defined a quality control (QC) analytical system to
ensure accuracy and efficacy.
Methods
Central laboratory coagulometer (STA-R; Roche) was
considered as reference system. In PHU were used
Coaguchek XS (Roche). Based on current guidelines for
laboratory QC, the following criteria were defined:
1. PM suitabily: a) precision calculated on normal plasmas
pool, repeated 10 times, acceptable if CV < 5%; b)
accuracy, evaluated on 10 pathological specimens with
INR < 4.0, accettable if INR differences < ± 0.5.
2. Intra-assay precision: each PHU elaborates monthly
the Lewej-Jennings cards. Internal QC, provided by the
company, was performed at the beginning of each session
and every 20 samples. A CV between ± 20% was
considered acceptable.
3. Quaterly accuracy to assess the agreement between
analytical instruments: 3 samples at different therapeutic
range were analyzed in duplicate. Differences £ 0.5 INR
was considered acceptable.
4. External quality assessment (NEQAS): it considers
both laboratory data and clinical treatment, to assess the
accuracy of the global therapeutic management.
Results
In the 9 PHU 18 portable monitors were used to perform
18210 test/year. Analytical precision was very good with
a CV always < 5%. Control system showed 2 cases
out of range (on 360 total controls = 0.55%), giving
practical indication for immediate instrument replacement.
The external QC was optimal.
Conclusions
The adopted QC protocol make an accurate and precise
control of PM in use, ensuring the quality of analytical
data and, by consequence, optimal patient therapeutic
management. QC is a mean to ensure good results and
we think that national authorities should garantee the
application of correct protocols to allow PM use.
431
087
CARBETOCIN INCREASE THROMBIN GENERATION
AFTER CESAREAN SECTION
1
1
1
1
L. Bassi , S. Testa , O. Paoletti , A. Alatri , A.
1
1
1
Zimmermann , A. Cogrossi , M. Stramezzi , M.T.
2
2
Davico , A. Riccardi
1
Haemostasis and Thrombosis Center, AO Istituti
Ospitalieri, Cremona , Italy
2
Obstetrics and Gynaecology Division, AO Istituti
Ospitalieri , Cremona, Italy
Background: To prevent post partum haemorrhage
uterotonic prophylactic drugs are commonly used after
caesarean section.
Aim of the present pilot study is to evaluate thrombin
generation(TG) after caesarean section (CS) in women
treated with carbetocin and oxitocin, two different
uterotonic agents.
Materials and Methods
We enrolled 28 women, undergoing cesaren section, 14
treated with oxytocin and 14 treated with carbetocin .
Patients, without previous bleeding or thrombotic events,
were matched for age, weight , parity and race.
Blood samples for TG study and blood cell count were
collected before delivery (T0), 1 hour (T1) and 24 hour
(T2) after drug infusion .
Blood samples were immediate centrifuged and poor
platelet plasma (PPP) stored at -80°. Thrombin
generation was performed with a commercial assay
( Technothrombin TGA, Technoclone). TG measured
lag time, peak, velocity, endogenous thrombin potential
(ETP). The activation of coagulation was obtained with
adding small amounts of tissue Factor and phospholipid.
ETP results was expressed as nM-Thrombin/min.
Results
No differences were observed in TG between two groups
at T0. A significant increase in ETP at T1 was observed in
the carbetocin group (ETP mean ± DS= 3810.8 ± 661.95),
than oxitocin treated patients (ETP mean ± DS= 3588.7
± 711.36) with p<0.05. T2 showed the persistent ETP
increase in carbetocin group even if it didn’t reach the
statistical significance. Also other parameters like peak
and velocity were significantly increased in the carbetocin
compared with oxitocin group both at T1 and T2. No
differences in bleeding were observed in the two groups.
Conclusions
Our pilot study show a major ETP increase in patients
treated with carbetocin, probably reflecting an important
uterotonic action and its longer half-life in comparison
with oxitocin. These properties, as recently reported,
may support carbetocin use during delivery to prevent
postpartum blood loss.
432
088
IL DOSAGGIO DEL D-DIMERO
SULL’ANALIZZATORE ACL ADVANCE (I.L.) E
SUL CA1500 SYSMEX (SIEMENS) NEI PAZIENTI
CON DIAGNOSI CERTA DI TOMBOSI VENOSA
PROFONDA (TVP). NOSTRA ESPERIENZA
1
2
1
1
R. Lovero , M. Pepe , A. Carucci , A. Legrottaglie , M.
1
1
1
1
Vasciaveo , S. Lovero , F. Epicoco , P. Ciola , A.
1
1
Ostuni , E. Vinci
1
U.O.C. Lab. analisi Fasano-Cisternino-Ostuni
2
U.O. Lab. analisi Canosa-Minervino Spinazzola
La TVP è definita come l'ostruzione, parziale o completa,
di una o più vene del circolo profondo degli arti inferiori
o superiori. Le linee guida vigenti, nel sospetto di
una TVP, indicano come prime indagini da eseguire
l’ultrasonografia seguita dal test ematico del D-Dimero.
Il D-dimero è un frammento proteico prodotto dalla
degradazione del coagulo che si forma quando la
plasmina dissolve i filamenti di fibrina stabilizzata dal
fattore XIIIa.
Scopo del lavoro è stato quello di valutare la correlazione
tra due sistemi analitici quali il CA1500 e l’ACL ADVANCE
per il dosaggio del D-dimero in pazienti con diagnosi
di TVP confermata da ultrasonografia significativa per
l’occlusione di una vena del circolo profondo degli arti
inferiori.
Materiali e metodi: per tale studio sono stati arruolati
50 soggetti che non presentavano segni clinici di TVP
ed erano negativi all’indagine con ultrasonografia, 35
pazienti con diagnosi certa di TVP. I campioni di plasma
sono stati analizzati su entrambi gli analizzatori per
la valutazione della correlazione trai due strumenti.
Inoltre gli stessi campioni sono stati analizzati per la
determinazione del CV. I risultati sono stati espressi
come coefficiente di Pearson; i valori con p< 0.05 sono
stati considerati significativi. Risultati: Il CV ottenuto per
l’analizzatore CA1500 è stato pari a 3.15% nei soggetti
sani mentre in quelli con TVP è stato pari a 3,55%;
per l’analizzatore ACL il CV è stato pari a 2.57% per
i soggetti sani mentre nei pazienti con TVP è stato
pari 3,32%. I risultati ottenuti mostrano che il D-Dimero
eseguito sull’analizzatore CA1500 correla con i risultati del
D-Dimero eseguito sull’ACL sia per i soggetti sani (r=0,54
p<0,05) sia per i pazienti con TVP (r=0,73 p<0,05).
Conclusioni. L’ultrasonografia e la misurazione del Ddimero sono entrambi test utili ai pazienti con TVP. ll
test D-dimero è comunemente impiegato in diagnostica
per ridurre il ricorso all'ultrasonografia nei pazienti in cui
si sospetta la presenza di una TVP. I risultati ottenuti
dal nostro studio mostrano che entrambi gli analizzatori
possono essere utilizzati al fine di una precoce diagnosi
di TVP.
Bibliography: Wells P, et al. Evaluation of D-dimer in the
diagnosis of suspected deep-vein thrombosis. N Eng J
Med 2003;349(13):1227-35
089
THE INTERFERENCE OF HYPOFIBRINOGENEMIA
IN COAGULATION TEST: COMPARISON BETWEEN
MAGNETO-MECHANICAL VERSUS PHOTO-OPTICAL
METHODS
1
1
1
1
R. Volpi , G. Martini , R. Del Bono , R. Morandini , F.
1
1
Brognoli , L. Caimi
1
U.O. Lab. Analisi, A.O. Spedali Civili di Brescia, Brescia
(Italy)
Test for routine haemostatic evaluations, such as PT and
aPTT, are extremely sensitive to hypofibrinogenemia.
The aim of the study is to assess the reliability of
coagulation test in patients with hypofibrinogenemia,
defined as less than 150 mg/dl of plasma fibrinogen levels,
comparing two different methods: magneto-mechanical
versus photo-optical.
Eighty-four consecutive plasma samples with fibrinogen
below 150 mg/dl, detected with the photo-optical analyzer
BCS-Dade Behring using Dade Behring’s reagent
Multifibren R (Clauss method), were tested for PTINR and
aPTTratio using Dade Behring’s reagents: Thromborel S
and Pathromtin SL. After testing, plasmas were frozen and
stored at -80°C.
They were then thawed at 37°C and re-tested for
PTINR and aPTTratio on the magneto-mechanical Roche
STA Rack Evolution Coagulation Analyser using Roche
reagents: STA Neoplastin R and STA Cephascreen.
On both coagulation analysers were also tested 50
consecutive normal fibrinogen level plasmas.
We applied the Bland&Altman method to assess the
interchangeability of the two methods after pre-setting
clinical acceptance limits of concordance for PT-INR and
aPTTratio at 0.5.
Upper and lower concordance limits for PTINR were
0.46 and 0.65 respectively. Upper and lower concordance
limits for aPTTratio were 1.03 and 0.53: these ranges were
clinically relevant. Upper and lower concordance limits
for PT-INR on normal plasma were 0.31 and 0.52 and
for aPTT ratio were 0.44 and 0.24 respectively; therefore
the photo-optical method compared to the magnetomechanical gave clinically acceptable difference between
the two methods.
When fibrinogen is below 150 mg/dL, results of routine
coagulation tests become totally method-dependent,
therefore they do not provide reliable assessment of
patient’s haemostatic status. We found no significant intermethod differences of clinical relevance for normal level
fibrinogen samples, therefore influences due to the type
of reagent or to the type of Analyser can be excluded. On
the basis of this study, we urgently need more accurate
and reliable results of routine coagulation tests for safely
monitoring haemostasis in our patients.
Bibliography. Lefkowitz JB et al. Fibrinogen Longmont:
a dysfibrinogenemias that causes prolonged clot-based
test results only when using an optical detection method.
American J of Hematol 2000;63:149-155
090
ITALIAN EQA SCHEME FOR COAGULATION TESTS:
STATE OF THE ART
1
1
1
L. Zardo , L. Sciacovelli , S. Secchiero , M. Plebani
1
Centro di Ricerca Biomedica, Castelfranco Veneto
(TV), Italy
1
The “Centro di Ricerca Biomedica” implemented in 2007
an EQA Scheme for Coagulation (PT, aPTT, FBG, ATIII e
D-D) and the number of Italian participants is about 400. In
2009 a scheme for Special Coagulation (protein C, protein
S, Factors) has been implemented too, including a specific
sample for APC resistance.
The aim of this study is to analyse the state-ofthe-art concerning coagulation tests evaluating the
standardisation level among different diagnostic systems
used by participants and interlaboratory variability (CV%).
PT: the time values, in seconds, obtained using
recombinant thromboplastins are shorter than those
obtained using non-recombinant thromboplastins. When
INR is calculated, these differences are deleted if
INR <2, while are maintained if INR>2. Increasing
the PT values, the linear correlation among different
thromboplastins decreases and, consequently, the CV%
increases (INR<1.7 CV= 6%, INR>1.7 CV=14%).
APTT: the time values, in seconds, are different according
to the diagnostic systems. When ratio is calculated, these
differences diminish, but are not deleted and can give
different clinical interpretations of sample (pathological/
normal) for values near the cut-off.
FBG: values obtained with several diagnostic systems are
different in a significant way, although all of them use the
Clauss method. However the peer group CV% is better
with Clauss method (CV=7-8%) than derived method ones
(CV=14-15%).
ATIII: the standardisation between different chromogenic
methods used by participants is good.
D-Dimer: the peer group interlaboratory variability in
positive samples results good (CV<10%) although the
standardisation between diagnostic systems is low. Two
ways of data reporting (ng/mL and ng/mL FEU) are used
by participant laboratories, that provide values about half
one of the other. It is highlighted a clear tendency towards
the data reporting using FEU unit.
The EQA programs can point out the great variety
of analytical systems on the market, their level of
standardisation and the interlaboratory variability. The
improvement of these parameters can be achieved with
the collaboration among laboratories, diagnostic systems
manufacturers and EQA organizers.
[Quality Specifications in EQA schemes: from theory to
practice
Chim Clin Acta 346 (2004) 87-97]
433
091
VALUTAZIONE DI LABORATORIO DI APTT CON
TEMPI ACCORCIATI
1
1
1
G. Andreani , R. Antonucci , S. Lorenzini , L.
1
1
Fantoni , M. Panichi
1
Lab. Analisi Biochimico-cliniche e microbiologiche , ASL
1, Massa e Carrara
Il tempo di tromboplastina parziale attivato (APTT) e il
tempo di protrombina(PT) sono gli esami più richiesti
per lo screening dei disturbi emostatici.L'APTT viene
utilizzato per identificare anomalie nella via intrinseca
e comune della coagulazione, per il monitoraggio della
terapia anticoagulante con eparina non frazionata e per
il rilevamento di inibitori della coagulazione. Studi recenti
hanno dimostrato che i valori di APTT accorciati riflettono
uno stato di ipercoagulabilità associato ad un aumentato
rischio di tromboembolismo venoso.
Scopo.E' stato quello di verificare se valori di APTT
accorciati (ratio<0.76) ottenuti nel nostro Laboratorio
potevano dipendere dalla modalità di raccolta dei
campioni o se invece venivano confermati in prelievi
eseguiti nei giorni successivi.
Materiali e metodi. Abbiamo esaminato prospetticamente
i valori di APTT di pazienti interni pervenuti nel nostro
Laboratorio dal 1 Dicembre 2009 all'1 Marzo 2010.Per
l'analisi abbiamo utilizzato il Kit APTT Synthasil (Ditta
IL). Di 10.382 campioni analizzati, 325 (3.1%) avevano
una ratio <0.76:150 provenivano dal Pronto Soccorso
(46%), 46 dalle Medicine(14%), 30 dall'Oncologia (9.2%),
30 dalle Chirurgie (9.2%), 21 dall'Ortopedia (6.4%), e
48 (14.7%) da altri Reparti.Abbiamo poi verificato se
i valori di APTT dei 325 pazienti selezionati venivano
confermati nei prelievi eseguiti nei giorni successivi. In
43 pazienti (13.2%)i valori di APTT sono stati confermati,
ma nessuno di loro è stato sottoposto allo screening della
trombofilia;63 pazienti sono stati dimessi e quindi non è
stato più possibile rianalizzarli.Infine 219(67%) avevano
valori di ratio compresi tra 0.8 e 1.2.
Conclusioni. Dai dati ottenuti risulta evidente che nella
maggior parte dei casi l'accorciamento dell'APTT sia
dovuto ad errori durante la fase preanalitica.Dato che la
qualità totale nella diagnostica coagulativa rappresenta
un requisito necessario per il conseguimento di risultati
clinicamente attendibili, risulta necessario informare
periodicamente il personale che esegue i prelievi
nei Pronto Soccorsi circa l'esistenza di linee guida
specifiche sulla gestione della fase preanalitica dei test
coagulativi.Inoltre va sottolineata l'importanza di valutare
i pazienti con APTT accorciato per un eventuale rischio
trombotico.
Bibliografia.Mina A. et Al.Blood Coagul Fibrinolysis 2010
Mar;21(2):152-7.
434
092
FIBRIN BETA CHAIN IS RESISTANT TO PLASMIN
DIGESTION IN CORONARY ARTERY DISEASE
PATIENS: A NEW PATHOPHYSIOLOGICAL
MECHANISM UNDERLYNG THROMBUS FORMATION
1
1
1
2
B. Olimpieri , C. Fiorillo , M. Becatti , A.M. Gori , R.
2
2
1
2
Marcucci , C. Giglioli , P.A. Nassi , D. Prisco , R.
2
3
Abbate , G.F. Gensini
1
Dept. of Biochemical Sciences, Univ. of Florence,
Florence, Italy
2
Dept. of Medical and Surgical Care and Thrombosis
Centre, A.O.U. Careggi, Florence, Italy
3
Dept. of Medical and Surgical Care and Dep. of Heart
and Vessels, A.O.U. Careggi, Florence, Italy
Coronary artery disease (CAD) patients display altered
properties of plasma clot architecture but no information is
available on their fibrin resistance to lysis. Platelet hyperreactivity in patients on dual antiplatelet treatment (DAT)
represents a risk factor for the occurrence of adverse
cardiovascular events. Aim of the present study was to
ascertain whether fibrin resistance to lysis occurs in CAD
patients on DAT and its relationship with platelet hyperreactivity. Residual platelet reactivity (RPR-aggregation
by collagen ≥56%) was assessed in platelet-rich plasma
stimulated by 2 µg/ml collagen. We evaluated in vitro
degradation of fibrin clots from 57 patients (18F/39M) on
DAT 6 months after percutaneous coronary intervention
(PCI) and 33 controls (10F/23M). Fibrinogen was purified
from citrated plasma and exposed to thrombin (1,2 U/mL)
(1). Plasmin was then added (4,17 µg/mL), and the fibrin
clots were digested over a period of 6 hours at 37 ºC.
The digestion reaction ended by adding 10µL of LDS gel
electrophoresis sample buffer. Samples were heated at 90
ºC for 5 min under reducing condition then, aliquots from
each digest (12 µg of fibrin) were loaded onto 4-12% Bis–
Tris gels and further stained with Bio–safe Coomassie.
Band intensities were quantified by densitometry and
data obtained were expressed as the ratio between the
densitometry reading of the purified protein at a given
time of digestion and that of the undigested protein.
After 6 hours in all controls degradation of the fibrin
beta chain occurred, whereas it was not observed in
27 (48%) CAD patients. A significant decline in fibrin
band intensity was observed in 29 (52%) CAD patients.
Degradation of the fibrin beta chain was not significantly
different between patients with ST segment elevation
myocardial infarction (STEMI) (50%) and non-STEMI
(52%) patients and between patients with and without
traditional risk factors. The decline of beta chain was
significantly (p<0.05) different between patients with and
without residual platelet reactivity (RPR) by collagen.
Persistence of fibrin beta chain occurs in CAD patients
and is related to platelet hyper-reactivity, suggesting a
new pathophysiological mechanism underlying thrombus
formation.
1. Miniati et al. Am J Respir Crit Care Med, 2010
093
IL LABORATORIO DI PRIMO LIVELLO NELLA
DIAGNOSI DI CARENZA DI PRE-CALLICREINA:
DESCRIZIONE DI UN CASO
1
2
3
094
UTILIZZO DELL'ANALIZZATORE QUANTA
LYZER PER L'AUTOMATIZZAZIONE DI
TEST IMMUNOENZIMATICI PER LO STUDIO
DELL'EMOSTASI
3
G. Andreani , E. Paladino , A. Liotta , A. Cellai , A.
3
3
4
4
Rogolino , S. Fedi , D. Lazzini , F. Pecori
1
Lab. Analisi chimico-cliniche microbiologiche, Azienda
USL n°1 di Massa e Carrara
2
Lab. Agenzia Emofilia A.O.U. Careggi, Firenze
3
Lab. Malattie Aterotrombotiche A.O.U. Careggi, Firenze
4
U.O. Medicina Trasfusionale Azienda USL n°1 di
Massa e Carrara
Introduzione.La attuale visione della cascata coagulatoria
non distingue più tra via intrinseca ed estrinseca e
nega il contributo dei fattori della fase di contatto nella
generazione della trombina in vivo.Questa visione spiega
pertanto il riscontro di un prolungamento del tempo di
tromboplastina parziale attivato(APTT) nei soggetti con
carenza di fattori della fase di contatto(fattore XII, precallicreina e chininogeno ad alto peso molecolare)in
assenza di storia clinica per pregresse emorragie.
Scopo del lavoro.E' stato sottoposto alla nostra attenzione
per lo screening dell'emostasi un paziente maschio di 66
anni. L'anamnesi per storia emorragica era negativa e il
paziente riferiva di essere stato sottoposto in precedenza
ad interventi chirurgici senza riscontro di sanguinamenti.
Materiali e metodi.Il tempo di protrombina(PT),l'APTT
e il dosaggio di alcuni fattori sono stati eseguiti
con reattivi della Ditta IL.Il PT era normale(0.91
INR) mentre l'APTT è risultato prolungato con tempi
decisamente variabili(56sec.,80sec.,150 sec.;v.n.<37
sec).L'APTT eseguito su una miscela 1:1 (plasma
normale:plasma paziente) era normale (29 sec) e
questo risultato ci ha suggerito che si trattasse della
carenza di uno o più fattori di pertinenza dell'APTT.I
fattori interessati sono risultati nella norma:VIII 85%,IX
110%,XI 124%,XII 73%.La storia clinica e i risultati
ottenuti ci hanno fatto ipotizzare una carenza di
uno dei fattori della fase di contatto(pre-callicreina o
chininogeno ad alto peso molecolare).Abbiamo pertanto
eseguito l'APTT allungando progressivamente i tempi di
incubazione.Dopo 20 minuti di incubazione l'APTT si è
normalizzato a 35.1 sec.Per avere la conferma che si
trattasse di un deficit di pre-callicreina abbiamo inviato il
campione in un Laboratoro di secondo livello. Il dosaggio
eseguito con metodo cromogenico ha confermato una
carenza del 12.5% (v.n.:60-160).
Conclusioni.I dati riportati in letteratura sottolineano
l'importanza della scelta del tipo di reattivo per la
determinazione dell'APTT, poichè il deficit di precallicreina non viene evidenziato da tutti i reagenti
APTT.Inoltre la nostra esperienza suggerisce che anche
un Laboratorio di primo livello è in grado di risolvere
problemi diagnostici relativamente complessi,in tempi
brevi,con metodi di indagine semplici e costi contenuti.
Bibliografia.Asmis LM, Thromb Res.2002;105:463-70.
1
1
1
1
C. Novelli , B. Morelli , C. Stefanin , M.G. Cozzi , M.L.
1
1
1
2
Duca , G. Garavaglia , F. Rampinini , S. Castagni
1
U.O. Trasfusionale - Ematologia, Osp. di Legnano
2
Instrumentation Laboratory - Milano
Premessa: Le nuove strategie aziendali degli ospedali
pubblici orientate alla riduzione dei costi globali
(anche attraverso la mancata sostituzione del
personale tecnico e laureato) rendono problematica
la implementazione di alcuni parametri per lo studio
dell’emostasi. L’automazione di questi test rappresenta
una esigenza importante per ridurre il tempo impiegato
dal personale tecnico nell’esecuzione di queste
metodiche e per garantire un miglioramento significativo
delle performances analitiche. Scopo: Valutare le
performances analitiche dello strumento Quanta Lyzer
prodotto dalla GSG Robotix e distribuito in Italia dalla
INOVA (ora acquisita dalla Instrumentation Laboratory)
nell’esecuzione di test di secondo livello nello studio
dell’emostasi. Materiali e metodi: Per il nostro studio sono
stati utilizzati i seguenti kit commerciali: Imuclone TAFI,
Imubind TF, Imubind Total TFPI, Imubind Plasma PAI-1 e
t-PA Imubind della American Diagnostica, Zymutest HIA
IgGAM, Zymutest Protein Z e Zymuphen MP-Activity della
Hyphen, Technozym ADAMTS-13 Activity, Antigen and
INH della Technoclone, Enzygnost F1 +2 e Enzygnost
TAT della Siemens, sICAM-1, CD62, sVCAM-1 e Human
VEGF della DiaClone. Risultati: Le metodiche sono
state eseguite sia singolarmente sia abbinate ad altre
nell’ambito di profili creati in laboratorio per: 1) diagnosi
di specifiche patologie (ad es. HIT e PTT), 2) esami di
secondo livello per lo studio delle trombofilie (TAFI, PZ,
PAI-1, t-PA), 3) studi di ricerca su parametri specifici
(microparticelle, sICAM-1, CD62, VEGF e sVCAM-1).
Per il calcolo del CV intra- e inter-assay sono stati
utilizzati sia i controlli normali e patologici dei kit che un
pool di plasmi preparato in laboratorio. Risultati: I CV
delle metodiche eseguite su Quanta Lyzer sono risultati
compresi tra il 4,8 e l’8,3%; i CV delle stesse metodiche
eseguite manualmente erano, invece, compresi tra 6,5
e 11,8%. Conclusioni: L’esecuzione delle metodiche
suindicate con lo strumento Quanta Lyzer ha portato
significativi miglioramenti nel nostro laboratorio sia per
quello che riguarda il risparmio di tempo dedicato a
queste dal personale tecnico che, soprattutto, ad un
miglioramento delle performances analitiche con una
significativa riduzione dei CV intra- e inter-assay.
435
095
VON WILLEBRAND FACTOR MULTIMER ANALYSIS
IN A SEMI-AUTOMATED SYSTEM
1
1
1
1
F. Pasotti , I. Zanella , L. Caimi , D. Ricotta
1
Lab. di Biochimica Clinica, A. O. Spedali Civili, Brescia,
Cattedra di Biochimica Clinica.
Von Willebrand factor (vWF) is a high molecular weight
glycoprotein that plays an important role in hemostasis.
The von Willebrand disease (vWD) is the most common
inherited bleeding disorder with a worldwide prevalence
of 1-2 %. The vWD reflectsdeficiency or disfunction of
vWF. Persons with vWD may experience easy bruising,
nose-bleeds, or other mucosal bleeding and symptoms
can range from mild bleeding in type 1 vWD to severe, lifethreatening bleeding in type 3vWD.
The laboratory tests for the initial evaluation of vWD
include the measurements of vWF antigen, vWF ristocetin
cofactor activity and factor VIII coagulant activity.
Multimer analysis (1) visualizes the distribution of plasma
vWF multimers and is used to help in the vWF subtype
determination. This procedure is technically complex and
irreproducible (this is due to the extreme range of protein
size from 556 kDa homodimer to over 10-20000 kDa
multimers, that need a high time-consuming procedure
and present many technical difficulties), and only few
laboratories are skilled to perform the analysis of the
multimeric structures of the vWF for clinical diagnosis.
Our work focuses on the establishment of a more
reproducible and semi-automated method that performs
the electrophoresis of vWD patient’s plasma with sodium
dodecyl sulphate (SDS) agarose gel in a horizontal, semiautomated, electrophoresis system (Interlab G26). The
agarose gel concentration ranged from 1.2 to 2% and the
gel size was maximal 10 x 10 x 0.1 cm. The analysis
was performed at 15°C, at different times (30’-120’)
and with different volt settings. Afterwards the different
gels were transferred onto a polyvinylidine fluoride
membrane and subsequently the blots were probed with
an horseradish peroxidise (HRP) conjugated rabbit antivWF antibodie. There are several major advantages to
perform this method including rapid processing, simplicity
of the instrument management, and good sensitivity and
resolution of multimer’s bands.
(1) Marlies R. Ledford-Kraemer. Analysis of von
Willebrand factor structure by multimer analysis.
American Journal of Hematology 2010, 510-514.
436
096
L’ITER PREOPERATORIO PER PAZIENTI ADULTI
CANDIDATI AD INTERVENTI CHIRURGICI IN
ELEZIONE: ADERENZA ALLE LINEE GUIDA ED
ANALISI DEI COSTI NELLA REGIONE LIGURIA
1
3
4
5
G. Devoto , R. Delfino , P. Fuccaro , F. Giacomelli , L.
6
7
6
Mantero , M. Medica , G. Panataleoni , P.
8
9
10
1
Rubartelli , G. Vallerino , S. Voltolini , C. Devoto
1
Lab. Analisi, ASL 4 Chiavarese, Lavagna
2
Day Surgery, Asl 3 Genovese, Genova
3
Anestesia e Rianimazione, Asl 4 Chiavarese, Lavagna
4
Anestesia e Rianimazione, Ospedale Evangelico,
Genova
5
Oculistica, Asl 3 Genovese, Genova
6
Anestesia e Rianimazione, Asl 3 Genovese, Genova
7
Urologia, Asl 4 Chiavarese, Lavagna
8
Cardiologia, Ospedale Villa Scassi, ASL3 Genovese,
Genova
9
Ostetricia e Ginecologia, Ospedale Villa Scassi, ASL3
Genovese, Genova
10
Farmacoallergia, Ospedale San Martino, Genova
Scopi del presente lavoro sono stati quelli di valutare
le linee guida disponibili nazionali ed internazionali
in tema di esami pre operatori, confrontarle con la
realtà organizzativa di alcune aziende ospedaliere della
Regione Liguria e simulare l’andamento dei costi qualora
fossero introdotti i comportamenti suggeriti da tali linee
guida.
Materiali e Metodi: Sono state confrontate con quattro tra
le più importanti Linee Guida al riguardo: NICE 2003, ICSI
2006, ACC/AHA 2007, ESC/ESA 2009. Abbiamo limitato
la nostra analisi ai pazienti adulti candidati ad interventi
chirurgici in elezione ad eccezione della cardiochirurgia,
la chirurgia vascolare e la neurochirurgia. Il confronto è
avvenuto con le diverse unità operative della Regione
Liguria operanti nelle seguenti specialità:chirurgia
generale, ortopedia, ginecologia, urologia, oculistica,
cardiologia interventistica. Abbiamo valutato le SDO
prodotte nel 2009, i protocolli preoperatori delle U.O. per
confrontare la richiesta di esami, ed i relativi costi. A tale
scopo sono stati quindi utilizzati i costi dei reagenti e
del personale riferiti al Laboratorio di Analisi dell’ASL 4,
ottenendo un costo a Paziente di € 26,24. L'esecuzione
di tali accertamenti preoperatori applicati agli interventi
presi a considerazione, Numero 39.688, generavano un
costo di € 1.048.822. Abbiamo quindi ricalcolato i costi se
fossero state applicate le linee guide del NICE in tutti i
pazienti operati ottenendo un risparmio di € 627.573.
Conclusioni:il numero degli esami preoperatori può
essere drasticamente ridotto solo modificando i percorsi
assistenziali. Ovvero la loro esecuzione deve essere
successiva ad un’approfondita valutazione chirurgica
ed anestesiologica del Paziente. Una corretta raccolta
dell’anamnesi ed un accurato esame obiettivo sono
la migliore sicurezza per il paziente candidato ad
intervento chirurgico. Inoltre i nostri dati dimostrano
chiaramente quali sono i risultati in termini economici
che si otterrebbero dalla modifica dell'attuale pratica
assistenziale pre operatoria.
097
VALUTAZIONE ESTERNA DI QUALITA' (VEQ) PER
L'ESAME MICROSCOPICO DELLE URINE: STUDIO
DI CASI CLINICI
1
2
1
S. Secchiero , G.B. Fogazzi , L. Sciacovelli , L.
1
1
Zardo , M. Plebani
1
Centro di Ricerca Biomedica, Castelfranco Veneto, TV
2
U.O. di Nefrologia, Fondazione IRCCS Cà Granda,
Osp. Maggiore Policlinico, Milano
Il Programma di VEQ per l'esame microscopico delle
urine, gestito dal Centro di Ricerca Biomedica (CRB), è
nato nel 2000 come una delle due parti del programma
“Urinalysis Performance” (l'altra è relativa all'esame
chimico fisico). Dal ciclo di VEQ 2007, nell’obiettivo di
fornire ai partecipanti un supporto formativo sempre più
efficace, è stato introdotto lo studio di casi clinici: 2
esercizi all'anno prevedono l’invio di 4 immagini ciascuno,
relative ad un caso clinico, accompagnate da una breve
descrizione con l’indicazione degli esami di laboratorio
effettuati. I partecipanti devono identificare e descrivere
i 4 elementi rappresentati nelle foto e formulare una
diagnosi clinica tra le 4 o 5 proposte. Le risposte vengono
valutate da uno specialista Nefrologo e a ciascun tipo
di valutazione viene associato un punteggio. La risposta
relativa alla diagnosi viene valutata solo se tutti i 4
elementi presentati sono stati identificati in modo corretto.
Scopo: Valutare l'impatto dello studio di casi clinici
nell'ambito di una VEQ.
Materiali: Sono state analizzate le risposte relative ai 6
casi clinici presentati negli ultimi 3 cicli di VEQ.
Risultati (= n. di partecipanti con accesso alla diagnosi
sul totale, % di risposte corrette, % di risposte scorrette):
Sindrome nefritica acuta: 168/325, 86,9%, 12,5%; Litiasi
ureterale: 125/310, 95.2%, 4.8%; Contaminazione delle
urine da parte delle secrezioni vaginali: 251/326, 77.3%;
21.5%; Sindrome nefrosica: 257/310, 93,4%, 5.4%;
Necrosi tubulare acuta da nefropatia uratica: 175/284,
73.7%, 25.7%; Microematuria isolata di probabile origine
glomerulare: 113/285, 97.3%, 0%).
Discussione: L'elevata percentuale di risposte corrette
indica una buona conoscenza delle associazioni cliniche
relative alle immagini presentate nell'ambito di 4 su
6 casi clinici. Per 2 casi invece più del 20% dei
partecipanti ha fornito una diagnosi scorretta: un valido
aiuto al miglioramento può essere offerto dal commento
dell'esperto, a corredo del rapporto periodico fornito dal
CRB.
L'introduzione dello studio di casi clinici nel Programma
VEQ può incoraggiare i partecipanti ad esprimere
commenti interpretativi sui referti i quali contribuiscono a
migliorare la collaborazione tra specialisti del laboratorio
e clinici a beneficio del paziente.
098
PROGETTARE AZIONI PREVENTIVE PER GESTIRE
IL RISCHIO IN FASE PREANALITICA: FMECA DI
PROCESSO E PROGETTO
1
2
3
D. Rovella , M.R. Cavallo , D. Curcuruto , E.
1
1
2
Richetta , D. Fortunato , P. Reinaudo , L.
2
2
3
Coucourde , E. Bivi , M. Condò
1
SC Lab. Analisi Pinerolo ASL TO3
2
SC Servizio Immuno Trasfusionale ASL TO3
3
SS Area Qualità Pinerolo ASL TO3
Scopi e Obiettivi
La fase più critica del processo di lab., in ottica di Risk
Management, è quella preanalitica extra ed intra lab.
Utilizzando la tecnica FMECA di processo e progetto
ci si è posti l'obiettivo di identificare i possibili errori e
individuare ed attivare adeguate azioni preventive (AP).
Metodologia: Dopo formazione mirata sulla tecnica con
definizione di scale di valutazione condivise e descrizione
dei processi di laboratorio e trasfusionale si è ritenuto
che l'applicazione della FMECA ci avrebbe permesso,
insieme ai tradizionali metodi e strumenti per la Qualità, di
migliorare le fasi più critiche del processo in modo tale da
assicurare un outcome sicuro e clinicamente desiderabile.
Descritto con diagramma di flusso il processo produttivo,
si è valutata come più critica la fase preanalitica. Si è
costituito un gruppo di lavoro multidisciplinare che ha
analizzato tale fase con tecnica FMECA, individuando
alcune AP. Dall'analisi degli IPR (indici priorità rischio) si
sono individuate specifiche AP, si è valutato il loro impatto
con FMECA di progetto e, successivamente, verificato al
termine delle AP.
Risultati
Le AP individuate sono state:
1 utilizzo di braccialetto identificativo
2 informatizzazione richieste per emocomponenti
3 automazione identificazione campione
4 cambio contenitori per tutti gli es. urine
5 team building laboratoristi-infermieri di reparto e
territorio.
Si è sperimentato con successo, l'utilizzo del braccialetto
identificativo e si è acquisita specifica automazione in fase
di preparazione delle provette. La comparazione degli IPR
tra FMECA di processo e di progetto con l'attuazione delle
AP, dimostra:
-IPR NULLI/QUASI NULLI aumento del 51,3%
-IPR BASSI calo del 66,6%
-IPR MODERATI calo del 90%
-IPR MEDIO ALTRI decremento del 10%
Ma è stata l'attività di team building che ci ha permesso di
costruire un'alleanza per la sicurezza, confermando che la
comunicazione e la multidisciplinarietà sono i veri cardini
del miglioramento.
Considerazioni Conclusive
Il metodo utilizzato risulta idoneo non solo
all'identificazione dei possibili errori, ma dai primi risultati
ottenuti e dal progetto formulato, emerge la sua efficacia
nell'assicurazione di un outcome sicuro e clinicamente
desiderabile.
Bibliografia
Dossier 75-2002 (ISSN 1591-223X)
437
099
STATO DELL’ARTE DELLA MISURA DEGLI
ORMONI TIROIDEI LIBERI: RISULTATI DEL
PROGRAMMA DI VALUTAZIONE ESTERNA DI
QUALITÀ IMMUNOCHECK
100
LA QUALITÀ DEL PERCORSO FORMATIVO POSTLAUREA IN BIOCHIMICA CLINICA: CONFRONTO
FRA PERCEZIONE ED EVIDENZA
1
4
3
4
S. Giovannini , M.R. Chiesa , A. Renieri , A.
3
4
1
3
Mercuri , A. Pilo , C. Prontera , M. Scarlattini , R.
3
2
3
Conte , A. Cerico , G. Zucchelli
1
Fondazione CNR Regione Toscana G. Monasterio,
Pisa
2
Scuola Superiore Sant'Anna, Pisa
3
Istituto di Fisiologia Clinica CNR, Pisa
4
QualiMedLab s.r.l., Pisa
La misura della frazione libera degli ormoni tiroidei fT3 e
fT3 presenta notevoli difficoltà teoriche e metodologiche.
Allo scopo di valutare se esistono differenze significative
nelle performance analitiche e nelle concentrazioni
misurate dai vari metodi utilizzati dai laboratori, abbiamo
analizzato i risultati degli ultimi tre cicli annuali del
programma di Valutazione Esterna di Qualità (VEQ)
Immunocheck organizzato da QualiMedLab/CNR. Nei
tre cicli, sono stati distribuiti e misurati dai partecipanti
(circa 1000 laboratori francesi e italiani) 54 campioni di
controllo. La variabilità totale media (CVt) delle misure di
fT3 ottenute dai laboratori nei 54 campioni di controllo è
risultata 14.7% per i campioni a concentrazione inferiore
a 3 pg/mL, 13.9% per i campioni a concentrazione 3-4 pg/
mL e 15.8% per i campioni a concentrazione superiore a
4 pg/mL. Per le misure di fT4 la variabilità totale CVt è
risultata 22.3% per i campioni inferiori a 7 pg/mL, 15.4%
per i campioni a concentrazione 7–12 pg/mL e 15.7%
per i campioni superiori a 14 pg/mL. CVt riflette sia la
precisione dei metodi sia le differenze sistematiche tra
metodi.
La precisione media dei metodi (variabilità entro-metodo,
tra-laboratori) è risultata per fT3 11.5 CV% per i campioni
inferiori a 3 pg/mL, 7.1 CV% per i campioni 3 – 4 pg/mL e
6.6 CV% per i campioni superiori a 4 pg/mL; per fT4 12.0
CV% per i campioni a concentrazione inferiore a 7 pg/mL,
7.1 CV% per i campioni 7 – 12 pg/mL e 6.1 CV% per i
campioni superiori a 12 pg/mL.
Per la misura di fT3 e fT4, i metodi più usati dai
partecipanti sono: Centaur e Immulite Siemens, Architect
e Axsym Abbott , Modular e Elecsys Roche, Access e
DxI Beckman, AIA Tosoh e Vidas Biomerieux; questi 10
metodi producono circa il 90% dei risultati raccolti nella
VEQ. Per valutare l’accordo dei risultati prodotti dai vari
metodi, sono state calcolate le differenze percentuali tra i
valori ottenuti dal metodo più diffuso (Centaur, Siemens)
e gli altri metodi. Per fT3 le differenze sistematiche sono
generalmente inferiori a ±15%; fa eccezione il metodo
Immulite Siemens che produce risultati più bassi (da
15 a 40% a seconda della concentrazione). Per fT4
le differenze sono generalmente inferiori a ±10% ad
eccezione del metodo Vidas Biomerieux che misura più
basso (20-30%) e del metodo AIA Tosoh che produce
risultati più elevati (25-30%).
438
2
1
I. Pascucci , . Specializzandi , L. Sacchetti
1
Dip. DBBM & CEINGE Biotecnologie Avanzate e
Scuola di Specializz. in Biochimica Clinica Ateneo
“Federico II” Napoli
2
Scuola di Specializz. in Igiene e Medicina Preventiva
Ateneo “Federico II” Napoli
Il presente lavoro propone la valutazione della percezione
della qualità del percorso formativo, da parte degli iscritti
alla Scuola di Specializzazione in Biochimica Clinica
dell’ Ateneo Federico II di Napoli, per verificare se
questa si discosta dagli obiettivi prefissati dalla Scuola.
È stato svolto dagli iscritti alla Scuola di Specializzazione
in Igiene e Medicina Preventiva dello stesso Ateneo
(Dott.: Amato Antonella, Buonocore Raffaella, Diana
Maria Veronica, Germano Annunziata, Granata Annalisa,
Marsilia Antonella, Mattiacci Dario Maria, Mazza Chiara,
Ottaiano Edoardo, Passaro Maria, Savoia Fabio, Silvestro
Tiziana, Sorrentino Laura, Spagnuolo Danilo, Zingone
Letizia), nell’ambito dell’ attività professionalizzante. Allo
scopo è stato redatto un questionario, modulato su
schemi presenti in letteratura, di 36 quesiti relativi a 4
macroaree: Organizzazione, Didattica, Attività innovative,
Competenze acquisite, che è stato somministrato agli
iscritti alla Scuola in Biochimica Clinica in occasione
dell’incontro settimanale di Journal Club. I presenti (n.58)
rappresentavano il 78% degli iscritti ed hanno risposto tutti
al questionario. Sono stati analizzati i dati ed i risultati
sono stati confrontati con le evidenze oggettive verificate
nel corso degli Audit interni. È evidente un buon livello
di soddisfazione globale da parte degli iscritti (il 60%
degli intervistati è soddisfatto); in particolare le attività
di tipo innovativo (Journal Club e presentazione di un
seminario in lingua inglese) soddisfano il 65% degli iscritti.
Le principali criticità emerse sono:
-comunicazione carente con i rappresentanti degli
specializzandi (43%)
-limitata possibilità di periodi formativi presso laboratori
esteri (44%)
-insufficiente insegnamento della lingua inglese (34%).
Le azioni correttive/di miglioramento intraprese dal
Consiglio della Scuola sono state:
-discussione con i rappresentanti degli specializzandi al
fine di favorire la comunicazione,
-sensibilizzazione dei Docenti/Tutori al fine di promuovere
brevi periodi di perfezionamento
all’estero
-implementazione di un corso di inglese audio/video
guidato da un Tutore esperto anziano a cadenza
settimanale.
Rif:
Osservatorio Nazionale della formazione medica
specialistica seduta del 30/6/08 prot. 3521 del 9/9/09
MIUR
101
IL PERCORSO DI MIGLIORAMENTO CONTINUO
ATTRAVERSO LA GESTIONE DEL RISCHIO CLINICO
E LA COMUNICAZIONE CON GLI UTENTI E GLI
OPERATORI
102
IL WEB PER LA GESTIONE DEI DOCUMENTI DEL
SISTEMA QUALITÀ IN UNA GRANDE AZIENDA
OSPEDALIERA
1
1
1
1
1
S. Secondini , C. Martini , A. Priori , E. Tili , F.
1
1
Torelli , P. Pauri
1
U.O. Patologia Clinica, Osp. Civile di Jesi, Jesi (AN)
La nostra U.O. pone particolare attenzione al dialogo
con utenti ed operatori, per continuare a migliorare il
servizio fornito, certificato ISO 9001:2000 dal 2006 e ISO
9001:2008 dal 2009. In quest’ottica sono state intraprese
diverse iniziative di comunicazione ed innovazione.
Viene regolarmente aggiornata la Carta dei Servizi nei
suoi diversi formati: versione completa, versione ridotta
per esterni ed interni, tabelle prestazioni con modalità di
invio e raccolta materiale biologico, e in diversi supporti:
cartaceo ed informatico intranet e internet.
Sono state prodotte brochure informative disponibili in
sala d’attesa e distribuite a Distretti e Medici di Medicina
Generale per sensibilizzare l’utenza su vari argomenti:
infezioni da citomegalovirus e toxoplasma in gravidanza,
consigli per il prelievo dei bambini, test HIV, infezioni
sessualmente trasmesse.
Nell’ambito della gestione del rischio clinico, è in fase
di sperimentazione un sistema tecnologico innovativo
(“Patient kit & Label” fornito dalla Ditta Becton Dickinson
a costo zero) che permette, dopo l’accettazione
software, la produzione in automazione totale di
un kit utente contenente provette già etichettate e
barcodate, con lo scopo di migliorare l’efficacia (riduzione
dell’errore) e di accrescere l’efficienza (ottimizzazione
dell’uso delle risorse disponibili) del processo di
produzione delle informazioni necessarie ad identificare
inequivocabilmente ed immediatamente il paziente lungo
l’iter diagnostico. Stiamo effettuando, attraverso un
questionario, un’indagine di gradimento, che dimostra un
elevato apprezzamento negli aspetti che riguardano il
rispetto della privacy, la sicurezza nell’identificazione e la
riduzione dei tempi infermieristici.
Per quanto riguarda gli operatori del laboratorio, allo
scopo di analizzare l’efficacia della formazione ECM
svolta nell’anno precedente e le esigenze formative
espresse per il futuro, è stata effettuata, mediante
questionario, un’indagine che ha permesso di redigere il
Piano Formativo di U.O. e di Dipartimento per il 2010, che
è in corso di attuazione.
Infine, nell’ambito dei progetti di budget, è stato
aumentato l’uso di un commento interpretativo al test
patologico: da 186 nel 2008 a 1.223 nel 2009, molto
apprezzato sia dai clinici ospedalieri che dai MMG.
2
3
1
M. Nicoli , F. Fabris , G. Pirana , M.S. Graziani
1
Lab. Analisi dO, Osp. Civile Maggiore, A.O.U. Integrata,
Verona
2
Servizio Miglioramento Qualità e Accreditamento,
A.O.U. Integrata, Verona
3
Uff. per l'Informazione Interna, A.O.U. Integrata, Verona
Scopo/Obbiettivo:
La Azienda Ospedaliera Universitaria Integrata di Verona
(AOUI) è costituita da 90 Unità Operative 377 ambulatori
e 22 Unità Amministrative/Sanitarie. E’ certificata ISO
9001:2008 dal 2002.
Il volume della documentazione del Sistema Qualità
gestita nella nostra AOUI cresce esponenzialmente a
causa della molteplicità di prestazioni, servizi, progetti che
vengono gestiti.
Reperire con rapidità le informazioni, controllare che
vengano rispettate le autorizzazioni e le gerarchie,
diffondere automaticamente i documenti e permettere la
collaborazione di più utenze contemporaneamente su dati
comuni è ciò che serve oggi.
Metodi:
La AOUI, al fine di centralizzare ed unificare la Gestione
Sistema Qualità, ha incaricato il Servizio Miglioramento
Qualità e Accreditamento e l’Ufficio per l’Informazione
Interna di utilizzare una Piattaforma Documentale
denominata “Alfresco” accessibile nell’Intranet Aziendale
su applicazione web.
Alfresco è una soluzione open source web based
integrata, innovativa e semplice da utilizzare. Tramite
siti di nuova generazione e note tecnologie open source
(Java, JSF,ecc.), consente una facile integrazione tra le
informazioni.
Le principali funzionalità sono:
- sistema basato su applicazione web
- accesso al repository
- permessi su cartelle e documenti
- conversione documenti tra diversi formati
- notifiche tramite email
- ricerche alla Google sui contenuti
- accesso al sistema tramite web services
- integrazione Office tramite SharePoint.
Risultati:
La semplicità di configurazione e di utilizzo lo rendono
uno degli applicativi più utilizzati per la gestione
documentale. Si possono ottenere documenti unificati
per tutta l’Azienda, eliminazione del cartaceo, facile
accessibilità a tutti gli utenti tramite l’intranet aziendale,
tenuta sotto controllo di tutta la documentazione.
Considerazioni Conclusive:
La completezza, la validità, la tracciabilità e l'inalterabilità
della documentazione possono essere garantite. Le
funzioni di gestione del ciclo di vita dei documenti offerte
da Alfresco assicurano che le persone afferenti possano
lavorare assieme per svolgere tutte le attività collegate
alla formalizzazione di un processo/prodotto, dalla
descrizione del progetto attraverso la sua compilazione e
modifica, fino alla emissione.
439
103
IS THE DETERMINATION OF TCF7L2
POLYMORPHISM A USEFUL MARKER IN
THE PREDICTION OF IMPAIRED GLUCOSE
METABOLISM?
1
1
1
104
ACCURACY OF A PORTABLE METER TO MONITOR
GLYCEMIA
1
1
R. Gambino , S. Bo , N. Alemanno , M. Cassader , P.
1
1
Cavallo-Perin , G. Pagano
1
Dept. of Internal Medicine, Univ. of Turin, Torino
Background: TCF7L2 is a nuclear receptor for CTNNB1
known as ß-catenin. This receptor is the last step of the
Wnt signaling pathway which regulates embryogenesis,
cell proliferation and motility other than cell fate
determination. Some polymorphisms of the TCF7L2 gene
were associated with Type 2 diabetes since the Wnt
signaling pathway is linked to glucose homeostasis.
Methods: 1,877 Caucasian subjects aged 45-64 years
were invited to participate in a metabolic screening in
2001-2003. Diabetes was diagnosed when 2 fasting
glucose values were >126 mg/dL or if known diabetes
was recorded by the family physician, while those with
blood glucose levels between 100 and 125 mg/dL were
classified as having impaired fasting glucose. Genotyping
for TCF7L2 SNPs rs7903146 utilized the real-time allele
discrimination method.
Results: homozygous carriers of TT genotype
(rs7903146) had significantly higher glucose levels
(<0.001) in the fasting state and lower HOMA-B values
(<0.001). After six-year follow-up type 2 diabetes and IFG
reached the highest prevalence in the homozygous T
carriers (<0.001)). HOMA-B values, are lower in subjects
carrying the minor T allele (<0.001).
After adjustment for age, sex, BMI, waist circumference
and familial diabetes, the T allele confers an increased
risk for IGF and diabetes both in heterozygous and
homozygous carriers either at baseline and at follow-up.
The AUCs of the ROC curves for the TT genotype were
0.56 for incident IFG and 0.54 for incident diabetes.
Conclusion: The prevalence of MS in subjects carrying
the TT genotype was about 2-fold higher at follow-up,
when compared to the prevalence at baseline. This
increment was almost exclusively due to the significantly
higher prevalence of hyperglycemia in this subgroup. Our
study confirms an effect of the TCF7L2 polymorphism
on hyperglycemia in an adult Italian population-based
cohort both in cross-sectional and longitudinal evaluation.
The independent association of TCF7L2 polymorphism
with increasing fasting glucose values in the follow-up
may represent a marker for higher metabolic risk, useful
for developing more closely tailored lifestyle preventive
approaches.
Reference: da Silva Xavier G et al: TCF7L2 regulates late
events in insulin secretion from pancreatic islet ß-cells.
Diabetes 2009,58:894–905.
440
1
2
1
S. Cauci , M. Geat , G. Stel , M.P. Francescato
1
Dip. Scienze e Tecnologie Biomediche, Facoltà di
Medicina, Università di Udine
2
Dip. Patologia Medicina Sperimentale e Clinica, Facoltà
di Medicina, Università di Udine
Diabetes is a chronic illness that requires continuing
medical care. It is well established that reduction of
glycemic fluctuations over time prevents or delays
complications in both type 1 and type 2 diabetes.
Thus, self-monitoring of blood glucose (SMBG) is highly
recommended to assess whether glycemic targets are
being achieved. Results of SMBG can be useful to monitor
for asymptomatic hypoglycemia and hyperglycemia and
to adjust medications (particularly prandial insulin doses).
Accordingly, there is a need for precise and accurate
portable glucose meters. The accuracy of a commercial
portable glucose meter was tested by analysing 301
differences between glucose values obtained with a
standard laboratory reference method and contemporarily
obtained fingerstick values determined by a commercial
glucose meter. Venous blood samples were collected
in fluoride containing tubes; plasma samples were
analysed by the laboratory applying a hexokinase based
methodology (Olympus Diagnostic Systems AU2700)
using Olympus reagents. The ContourLink blood glucose
meter (Bayer Healthcare) was used for the fingerstick
blood samples.
Overall, the laboratory values did not differ statistically
from the fingerstick glucose levels (paired t-test, n=301,
p=NS). The bias (average fingerstick – laboratory
values) was -0.05 mM (2.9%), the limits of agreement
ranging from -2.2 to 2.2 mM. Similar results were
obtained grouping together the values lying within the
recommended glucose level for diabetic patients (i.e.
4.4 - 10 mM), the bias being still -0.05 mM (0.6%),
the limits of agreement being narrower (-1.8 to 1.7
mM). Nevertheless, above the hyperglycemic threshold
(i.e. 10 mM), the fingerstick values were significantly
lower than the laboratory values (paired t-test, n=30,
p<0.001) the error amounting to 10.5 ± 12.6%. Below
the hypoglycaemic threshold (i.e. 4.4 mM) the values
of the portable meter were significantly higher than the
laboratory values (paired t-test, n=42, p<0.001), the error
amounting to 25.3 ± 22.3%. The large difference observed
in the extreme glycemic values between the portable
meter and the laboratory is of concern and underscores
the need of caution when using the fingerstick values to
guide diabetic patients in evaluating their glycemic status.
105
VARIAZIONI DEI LIVELLI PLASMATICI DI
OMOCISTEINA NELLA PATOLOGIA DIABETICA
1
1
1
106
CONFRONTO DEI VALORI DI HbA1C TRA
SOGGETTI DIABETICI BETA TALESSEMICI E NON
TALASSEMICI: NOSTRA ESPERIENZA
2
A. Peruzzini , G. Pegoretti , A. Sicà , A. Valentini
1
Lab. di Patologia Clinica Osp. S.Chiara ,Trento
2
Servizio di Fisica Sanitaria Osp. S.Chiara Trento
Sono stati valutati i livelli plasmatici di HYC in tre
gruppi distinti di pazienti diabetici. Il primo gruppo di
256 pazienti comprendeva: A. diabetici di tipo 1 e
2, B. diabetici con cardiopatia (28%) e senza(72%)
C. diabetici con retinopatia (39%) e senza(61%). Il
secondo gruppo comprendeva 323 pazienti con HCY
positiva di cui 162(59%)casualmente associati ad Hb
glic. positiva (>5,9%). Il terzo gruppo comprendeva 100
pazienti selezionati fra diabetici con HYC positiva con
valore noto di Hb glic. Oltre all'HCY per tutti i pazienti
sono anche stati esaminati i corrispondenti valori di
GLUC, COL Tot., COL HDL, COL LDL, TRIGL,l'età dei
pazienti,la P sist.,la P diast.e il BMI. E' stato utilizzato
il test del t di Student per decidere se le differenze
fra le medie fossero da considerare indicative di una
effettiva differenza tra le popolazioni da cui i campioni
provengono. Si è evidenziata una differenza significativa
fra pazienti diabetici di tipo 1 e 2 a livello di tutti i parametri
esaminati ad eccezione del GLUC e HB glic. L'HCY risulta
discriminante anche fra diabetici con e senza cardiopatia
(t=3.92, df=254, p=0.01) e fra diabetici di tipo 1 con
e senza cardiopatia (t=3.65, df=133, p=0.01). Lo studio
delle differenze fra diabetici con e senza retinopatia non
ha presentato esiti significativi ad eccezione del GLUC e
dell HB glic., l'HCY risulta discriminante solo fra soggetti
diabetici di tipo 1 e 2 con retinopatia(t=2.60 df=100
p=0.01). Non risulta significativa la differenza fra il gruppo
di diabetici con HCY positiva aventi associati casualmente
il corrispondente valore di HB glic. e il gruppo di diabetici
selezionato con HCY positiva e HB glic. Risulta anche non
significativa la differenza fra diabetici con HCY positiva
casualmente associati ad HB glic positiva e diabetici
con HCY positiva già selezionati con HB glic positiva.
I campioni devono essere considerati appartenenti alla
stessa popolazione e pertanto riconoscere non casuale
la relazione di positività dell'HCY e la corrispondente
positività dell'HB glic e quindi con la malattia diabetica.
In definitiva è ipotizzabile una relazione di dipendenza
fra lo sviluppo della malattia diabetica ed il conseguente
aumento dei livelli plasmatici di HCY.
1
1
1
I. Cataldo , C. D'Ortona , P. Peca
1
Lab. di Patologia Clinica,Osp. SS. Annunziata,Chieti
La misura dell’emoglobina glicata HbA1C è molto utile
in pazienti diabetici per monitorare il controllo glicometabolico a medio lungo termine.Nei pazienti diabetici il
glucosio, presente nel sangue ad alte concentrazioni, si
lega alle catene beta del’emoglobina A1(α2β2) mediante
una reazione non enzimatica irreversibile formando
l’emoglobina glicata la quale non trasporta l’ossigeno con
la stessa efficacia dell’emoglobina A1 causando danni ai
vari organi.Inoltre nei soggetti portatori di beta talassemia
la ridotta o assente sintesi di beta catene condiziona il
processo di glicazione dell’Hb e ciò può determinare una
diminuizione della misura della HbA1C .
Scopo:valutare l’interferenza della beta talassemia
eterozigote sulla misura della HbA1c confrontando i
valori riscontrati in un gruppo di soggetti diabetici beta
talassemici con quello di diabetici non beta talassemici.
Materiale e Metodi:abbiamo esaminato circa 795 soggetti
e di questi 40 (età media 58 aa) presentavano una
eterozigosi per la beta talassemia.Il dosaggio della
HbA1C è stato eseguito con il metodo della cromatografia
ad alta pressione (HPLC Variant II Biorad).
Risultati:abbiamo eseguito un’analisi statistica dei dati ,i
valori medi della HbA1c dei soggetti beta talassemici (7,6
%) sono risultati inferiori al valore medio dei soggetti
diabetici non talassemici (8,4 %).
Conclusioni:il nostro studio dimostra che il dosaggio
dell’ HbA1C risulta sottostimato nei soggetti diabetici
beta talassemici rispetto a diabetici non portatori ed è
necessario tenerne conto nel monitoraggio del paziente
diabetico.Alla luce di questi risultati abbiamo avviato
nel nostro laboratorio uno studio in collaborazione con
il diabetologo sulla valutazione dell’interferenza della
beta talassemia sul dosaggio dell’ HbA1C nei soggetti
diabetici al fine di valutare quanto la sottostima del valore
dell’analita possa comportare un errore terapeutico in
questa categoria di pazienti.
Biobliografia:American Diabetes Association.Standards
of medical care in diabetes.Diabetes Care 2004 ;27( suppl
1) :S 15-35.
441
107
DETECTION OF SICKLE CELL DISEASE IN THE
NEONATAL PERIOD BY A NEW IMMUNOMETRIC
METHOD (PERKINELMER) RUNNING ON THE
AUTODELPHIA PLATFORM
1
1
1
1
P. Ialongo , R. Colletti , C. Ialongo , L. Vestri , I.
1
Antonozzi
1
Dip. Medicina Sperimentale e Patologia - Univ. di Roma
-Sapienza
The first aim of the neonatal screening for
haemoglobinopathies is to identify neonates with sickle
cell disease (SCD), to whom an early penicillin prophylaxis
and vaccines are vital. As a result of recent migratory
fluxes involving distant areas of the globe, the genetic
structure of populations residing in the Southern
Europe respect to haemoglobin disorders prevalence
is dramatically changing. Thus, despite some logistic
problems and economic constraints respect to the settingup of neonatal screening for hemoglobinopathies, a need
for inexpensive and easy-to-use screening assays is
getting real. Methods: We have started a pilot program
based on the AutoDELFIA Hb Immunoassay, which
employs antibodies recognizing different Hb subunits for
capturing, and HbS and HbA specific ones for detection.
AutoDELFIA provides a easy-to-interpret result, based
on the HbS/HbA ratio to which correspond a 3-letter
code. Such test can be performed on Dried Blood Sposts
(DBS) in a 96-well microplate, giving the possibility to run
as much as 700 tests in about 5 hours. Materials: We
have screened 5090 peripheral blood specimens (20,8%
of the total live births),collected as dried blood spots,
randomly and anonymously selected among Latium
newborns, testing with Perkin Elmer AutoDELFIA Hb
Immunoassay, with Biorad HPLC BioRad NBS Variant
assays and with PerkinElmer IEF Resolve (PerkinElmer
Life Sciences, Zaventem, Belgium). Results: AutoDELFIA
Hb Immunoassay correctly identified 16 newborns (0.31%
of the total) with Hb FAS phenotype (0.31% incidence),
respect to both HPLC and IEF analysis; no false negatives
were shown to occur. Conclusions In our opinion, respect
to the merely recognition of S-phenotypes (namely FAS
or FSS) PerkinElmer’s immunometric assay has shown
the best performance in terms of throughput (DBS x time),
quality (no false negatives) and easiness, thus being an
ideal candidate for a newborns screening planning.
108
RELEVANCE OF FLOW CYTOMETRY FOR THE
DIAGNOSIS AND MONITORING OF TREATMENT
IN T-CELL LARGE GRANULAR LYMPHOCYTES
LEUKEMIA (T-LGL) PATIENTS
1
1
2
1
B. Peruzzi , A.M.G. Gelli , A. Bosi , G. Messeri , S.
2
1
Ciolli , R. Caporale
1
Lab. Generale, Sez. Ematologia, Coagulazione e
Citometria, AOU Careggi, Firenze
2
U.O. Ematologia, AOU Careggi, Firenze
Introduction: T-LGL is a clonal proliferation of cytotoxic
CD3+ T-lymphocytes accompanied by lineage-restricted
cytopenias (i.e neutropenia or pure red cell aplasia),
rarely lymphocytosis. It may be indolent but there are
patients complaining about symptoms due to severe
neutropenia or pure red cell aplasia (PRCA). A peripheral
blood smear, BM biopsy and karyotype are necessary to
exclude other cause of cytopenias (i.e. aplastic anemia,
hypoplastic myelodisplastic syndrome or paroxysmal
noctunarl hemoglobinuria) but immunophenotyping by
flow cytometry (FC) of peripheral blood cells is
necessary to establish T-LGL diagnosis. Alemtuzumab,
an anti-CD52 humanized MoAb, may be used as
target therapy for T-LGL patients unresponsive to
standard immunosuppressive treatment. FC evaluation of
variable CD52 expressions is mandatory before starting
alemtuzumab. The aim of the study is to demonstrate
that FC method is a main diagnostic approach for the
diagnosis of T-LGL and that CD52 expression studied by
FC is useful for the sensitivity to the treatment.
Materials and methods: The FC analysis was performed
using mouse MoAb (Becton Dickinson, USA; Serotec,
USA). The evaluation of the clonality was studied by PCR
(Applied Biosystems, USA).
Results: 5 patients of T-LGL were diagnosed and
monitored by FC. All those cases showed a clonal
cell population with an aberrant bimodal distribution
expression or lack of a T cell marker. One case was CD8+/
CD4+, 3 were CD8+/CD4- and 1 was CD4-/CD8-. They
all were CD16-/CD56-, CD57+/CD52+ with an αß clonal
rearrangement of T-cell receptor (TCR). All patients had
been previously treated with various immunosuppressive
treatments (i.e. steroids, cyclosporine, fludarabine and
high dose intravenous human immunoglobulins) without
satisfactory results. Thus, since CD52 was highly
expressed all 5 patients were treated with Alemtuzumab.
Cytopenias recovered in all patients in the first month of
therapy and, at the end of treatment, all of them were in
complete remission (CR) with a median time to recovery
of T CD4+ ≥200/mm3 of 12 months.
Conclusion: In conclusion FC is a technology with
decisional impact in T-LGL diagnosis. Monitoring of
phenotype during treatment by FC allows clinicians to
evaluate results and immunological recover.
442
109
PRELIMINARY DATA ON A RARE CASE OF
FECHTNER’S SYNDROME. THE ADDED VALUE OF
THE MORPHOLOGICAL STUDY OF PERIPHERAL
BLOOD IN THE ETIOLOGICAL DIAGNOSIS OF
THROMBOCYTOPENIA
1
2
3
M. Sindona , E. Caramanna , F. Sorrentino , G.
4
5
Conte , M. D'Amora
1
UOC Lab. Patologia Clinica Osp. S.M.d.P. Incurabili
ASL Napoli 1 Centro
2
ASL Napoli 1 Centro
3
UOC Nefrologia e Emodialisi Seconda Università degli
Studi di Napoli
4
UOC Nefrologia e Emodialisi Seconda Università degli
Studi di Napoli
5
ASL Napoli 1 Centro
The Fechtner’s syndrome is a rare human disorder
(a disease which generally occurs in less than
200,000 people in the US) characterized by giant
platelets, thrombocytopenia and characteristic Dohle
body-lyke cytoplasmic inclusions in granulocytes. It is
an autosomal dominant disease and the patients show
thrombocytopenia associated with chronic interstitial
nephropathy, which progresses often into an end-stage
renal disease along with sensorineural hearing loss and
presenile cataract. The MYH9 gene is mutated in patients
affected by the Fechtner’s syndrome; the gene maps
on the long arm of chromosome 22, and encodes the
non-muscle myosin heavy chain IIA (NMMHC-IIA). It is a
ubiquitous expressed cytoplasmic myosin and it controls
cytokinesis, cell motility, cell recognition and maintenance
of cell shape. The diagnostic process includes the
integration of clinical and laboratory data, which only if
are properly integrated can allow the detection of suspect
cases, while the diagnosis of certainty is given to genetic
analysis. At present, the currently available instrumental
methods can detect low thrombocytopenia, any change
in platelet volume, and in some cases they can also
detect the leukocyte inclusions. The morphological study
of peripheral blood and immunofluorescence analysis
of NMMHCA in the neutrophils can often bring to the
suspected diagnosis, while the molecular biology analysis
defines the type of gene alteration, giving prognostic
information essential for the good management of such
patients. A protocol for investigation of thrombocytopenia
is therefore essential for the correct diagnosis of the
disease, whose incidence is underestimated on account
of errors occurring in the diagnostic evaluation at the first
level of diagnosis.
110
THE GLUCOSE-6-PHOSFATE DEHYDROGENASE
(G6PD) DEFICIENCY: CLINICAL, BIOCHEMICAL AND
MOLECULAR FEATURES
1
1
1
D. Maffi , M.T. Pasquino , M.P. Caforio , L.
1
2
2
3
Mandarino , F. Sorrentino , P. Cianciulli , G. Girelli , P.
1
Caprari
1
Dip. Ematologia, Oncologia e Medicina Molecolare,
Istituto Superiore di Sanità, Roma
2
DH Talassemici, Osp. S. Eugenio, Roma
3
UOC Immunoematologia e Medicina Trasfusionale,
Policlinico Umberto I, Sapienza Univ. di Roma
The aim of this work was to evaluate the presence of
G6PD deficiency in healthy blood donor population and
to study G6PD-patients as regards clinical, biochemical
and molecular features. Methods: 1900 blood donors of
Policlinico Umberto I were screened for G6PD deficiency
by differential pH-metry (CL-10 PLUS, Biocontrol). 1032
patients from S. Eugenio Hospital were studied for
diagnosis of G6PD deficiency. The definitive diagnosis
of G6PD deficiency was achieved by a diagnostic
protocol including family study and both enzymatic
and molecular test. G6PD and PK activities and GSH
concentration were determined by spectrophotometric
methods; hematological parameters were determined by
ADVIA 120 (Siemens). The molecular characterization
of G6PD variants was performed by ARMS, RFLP
and DNA sequence analysis. Results: 21/1900 blood
donors were G6PD deficient and the main Italian G6PD
variants G6PD Seattle 844C, Mediterranean 563T and A376G,202A were found. 507/1032 patients were G6PD
deficient and the DNA analysis confirmed the frequency
distribution of G6PD variants in Central Italy: 63% G6PD
Mediterranean, 15% G6PD Seattle, 5% G6PD A-, 3%
G6PD Chatam 1003G,and 1% for G6PD Union 1360T,
Cassano 1347C, and Sibari 634G. Moreover single cases
of G6PD Ube 241T and G6PD Radlowo 679T were
detected and three novel mutations were characterized: nt
130 GCC-ACC; nt 1021 GTC-TTC, and nt 751 GAT-AAT.
The results of biochemical and hematological analyses
showed significant differences between normal and
Mediterranean patients. No difference between Seattle
subjects and normal ones was found. Nevertheless in
hemizigous A- subjects a significantly lower GSH content
than normal one was observed. The acute hemolytic
anemia occurred in 63/328 patients with Mediterranean
variant, in 2/80 patients with Seattle variant, and in
13/25 A- patients. The hemolytic attack was triggered
mainly by drugs.Conclusions: Though the A- variant is
considered milder than Mediterranean variant, the Agroup shows lowered GSH concentration comparable
to the Mediterranean group and many A- people
showed hemolytic attack. The evaluation of blood donors
population evidenced that G6PD deficiency is not a rare
event among periodic donors, so the performance of the
G6PD screening on all blood donors might be suggested.
443
111
LA DIAGNOSTICA DELLA LEUCEMIA
PLASMACELLULARE IN CITOLOGIA
AUTOMATIZZATA
112
ERYTHROCYTE MEMBRANE PROTEINS
ELECTROPHORESIS: A NEW QUICK APPROACH
1
1
1
1
1
G. Barbina , S. Mazzolini , A. Colatutto , C. Toso , C.
1
1
1
Feruglio , B. Marcon , P. Sala
1
Lab. Analisi d’Elezione A.O.U. S. Maria della
Misericordia, Udine.
Introduzione: La diagnostica in citologia automatizzata
della leucemia plasmacellulare è particolarmente
complessa per la rarità di tale affezione, per la difficile
interpretazione morfologica degli elementi cellulari e
per la relativa incapacità strumentale degli analizzatori
automatici ad effettuare lo screening delle plasmacellule.
La strumentazione ematologica di ultima generazione in
realtà può indirizzare il patologo clinico verso la diagnosi
di sospetto facilitando così il necessario approfondimento
microscopico e/o citofluorimetrico.
Scopo del lavoro: Abbiamo analizzato un caso di
Leucemia plasmacellulare con diverse strumentazioni
citologiche automatizzate per valutare in quale misura le
strumentazioni citologiche di ultima generazione siano in
grado di confermare la diagnosi.
Materiali e metodi: Il campione di sangue periferico in
EDTA di un paziente con leucemia plasmacellulare è stato
processato con le seguenti strumentazioni: Abbott CellDyn Sapphire, Coulter LH 750 e Sysmex XE-2100 per
confermare il sospetto di leucemia plasmacellulare, in
seguito è stata effettuata l’analisi citofluorimetrica (con BD
FACSCalibur ) mediante i seguenti anticorpi monoclonali:
CD45, CD3, CD19, CD10, CD22, CD56, CD20, CD38,
HLA-DR, CD138,CyIg Lambda/Kappa, SmIg Lambda/
Kappa.
Risultati: Le strumentazioni sono state in grado di
segnalare la presenza di plasmacellule neoplastiche
indirizzando il patologo verso l’approfondimento
diagnostico. Per le caratteristiche morfologiche e
dimensionali, le plasmacellule sono segnalate come
elementi linfomonocitoidi, linfociti atipici, o blasti, con degli
scattergram altamente evocativi.
Discussione e conclusioni: In un adeguato setting clinico
si può affermare che tutta la strumentazione ematologica
automatizzata presa in considerazione è in grado di
indurre il sospetto della presenza di plasmacellule. Per
la nostra esperienza abbiamo notato che lo scattergram
fornito dalla strumentazione Sysmex è molto sensibile
ed è in grado di indirizzare il laboratorista verso la
patologia della serie plasmacellulare. Il sospetto clinico e
la diagnosi citologica automatizzata devono però essere
sempre affiancati dalla valutazione microscopica e da
quella citofluorimetrica.
444
1
1
1
A. Amato , O. Sarra , F. Lama , P. Di Biagio , D.
1
1
1
Gianni , L. Masi , R. Piscitelli
1
ANMI Onlus, Centro Studi Microcitemie Roma, Roma
The red blood cell membrane is a multi-component
structure that is responsible for many of the physiological
functions and mechanical properties of the cell. The
red cell membrane comprises a lipid bilayer, integral
membrane proteins and a membrane skeleton. Integral
membrane proteins include glycophorins and transport
protein such as band 3. The red cell membrane skeleton
is a multi-protein complex formed by structural proteins
including α and ß spectrin, ankyrin, protein 4.1 and
actin. The membrane skeleton proteins interact with
the bilayer and transmembrane proteins and they are
responsible for maintaining the shape and deformability of
the erythrocyte. Defects in any of these components can
manifest as a clinical disorders involving the erythrocytes.
Analysis of erythrocyte membrane proteins by sodium
dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis
(SDS-PAGE) remains an unmatched element of
orientation toward the primarily mutated protein (and
gene). Two different electrophoretic systems have to
be perfomed. They are the continuos buffer system of
Fairbanks with an exponential gradient of acrylamide
concentration from 3.5% to 17% and the discontinuous
buffer system of Laemmli with a linear gradient
of acrylamide concentration from 5% to 15%. We
adapted Laemmli model to generate a minimum and a
maximum estimation of erythrocyte membrane proteins
concentration, producing a range of normality.
Fresh human blood samples were collected from 180
healthy subjects. Erythrocyte membrane proteins were
prepared by hypotonic lysis, and fractionated by SDSPAGE using a 4% to 20% linear gradient of acrylamide.
The amount of the different protein were quantitated by
a quick and innovative stain free method that allows
direct visualization, analysis and documentation of protein
samples in SDS-PAGE gels without staing, destaing,
or gel drying procedures (Criterion Stain Free System,
BioRad).
We established reference ranges for each protein using
the measurement of band’s relative quantity to the total
of the lane. Statistical procedure were performed by R
software.
113
SIX-COLOR FLOW CYTOMETRY ANALYSIS
OF CD34+ HEMATOPOIETIC STEM CELLS IN
CRYOPRESERVED EARLY PRE-TERM HUMAN
CORD BLOOD SAMPLES
114
VALUTAZIONE DEI LEUCOCITI IN CORSO DI SEPSI
CON DUE ANALIZZATORI EMATOLOGICI: COULTER
LH750 ED HORIBA ABX
1
1
1
1
1
F. D'Alessio , P. Mirabelli , M. Gorrese , G. Scalia , M.
2
1
1
1
Gemei , E. Mariotti , R. Di Noto , A. Scotto Di Frega , P.
3
1
3
1
Martinelli , G. Fortunato , D. Paladini , L. Del Vecchio
1
CEINGE-Biot.. Avanz., Dip. Bioch. e Biot. Med., Univ.
Fed. II, Napoli
2
CEINGE-Biot. Avanz., Europ. School Mol. Med., Napoli
3
Dip. Sc. Ost.-Gin, Urol. e Med. Ripr., Univ. Fed. II,
Napoli
During the last decades, extended characterizations were
performed about human full-term cord blood (hTCB)
hematopoietic cell populations, but little information
is available on human early pre-term cord blood
(hEPCB) hematopoietic stem cells (HSCs) [Cervera
et al, American Jour. of Hemat.,2006;vol. 81]. In our
study, we analyzed by six-color flow cytometry 19
th
th
hEPCB (16 -24 weeks) and 17 hTCB samples. Firstly,
Pos
Dim
we observed that the percentage of CD34 CD45
cells was higher in hEPCB compared to hTCB and
that it decreased during pregnancy. After enumerating
Pos
Dim
CD34 CD45
fraction, we examined the expression,
in terms of mean fluorescence intensity (MFI) and
percent of positive cells, of CD29, CD31, CD38, CD90,
CD117, CD133, CD135, CD200, CD243 and CD338. We
found that MFI value of CD135 was lower in hEPCB,
Pos
Dim
Pos
while the percentage of CD34 CD45 CD243
cells
was higher in hTCB. As to CD38, we evidenced
that hEPCB samples were considerably richer in
Pos
Dim
Neg
undifferentiated CD34 CD45 CD38
HSCs respect
to the hTCB counterparts. We also compared
the expression of the above-mentioned molecules
in
undifferentiated
(CD34
Pos
Dim
Pos
Dim
CD45
Neg
CD38
)and
Pos
committed (CD34 CD45 CD38 ) HSCs residing
in
hEPCB
and
hTCB.
In
particular,
while
Pos
Dim
Pos
CD34 CD45 CD38
HSCs from both hEPCB
and hTCB were clearly positive for CD29, CD71
and CD135, a marked expression of CD31 and
Pos
Dim
Pos
CD117 was restricted to CD34 CD45 CD38
hEPCB and hTCB cells, respectively. Moreover,
our data showed that hEPCB were also enriched
Pos
Dim
Neg
Pos
for undifferentiated CD34 CD45 CD38 CD133
HSCs.Finally, analyzing the percentages of monocytes,
NK-, T- and B-lymphocytes within the two samples, we
observed that T- and B-cells were in higher number in
hTCB and hEPCB, respectively. We therefore studied the
B-cell lineage maturation and we found a higher quantity
Pos
Pos
Pos
2
1
1
R. Lovero , M. Pepe , A. Carucci , A. Legrottaglie , L.
1
1
1
1
Barletta , S. Tundo , C. Curigliano , S. Stallone , E.
1
Vinci
1
U.O.C. Lab. analisi Fasano-Cisternino-Ostuni
2
U.O. Lab. analisi Canosa-Minervino Spinazzola
La sepsi o setticemia è una sindrome clinica caratterizzata
da un'abnorme Risposta Infiammatoria Sistemica (SIRS),
conseguente alla presenza nel sangue di microrganismi
patogeni provenienti da un focolaio sepsigeno. L’esame
emocromocitometrico fornisce informazioni sul numero
totale e sulle diverse popolazioni dei leucociti
permettendo, insieme all’emocoltura, la diagnosi di sepsi.
Scopo del lavoro è stato quello di confrontare i due
analizzatori ematologici presenti nel nostro laboratorio
Coulter LH750 ed Horiba ABX che utilizzano metodologie
differenti per la identificazione delle popolazioni
leucocitarie.
Materiali e metodi: per tale studio sono stati arruolati 100
soggetti sani e 25 pazienti con diagnosi certa di sepsi
(emocolture positive e/o segni clinici di sepsi). I campioni
di sangue intero sono stati analizzati su entrambi gli
analizzatori per la valutazione della correlazione tra i due
strumenti prendendo in esame i seguenti parametri: WBC,
RBC, HB, PLT,NE#, LI#, EO#, MO#, BA#. Inoltre gli stessi
campioni sono stati utilizzati anche per la determinazione
del CV. I risultati sono stati espressi come coefficiente
di Pearson; i valori con p< 0.05 sono stati considerati
significativi.
Risultati: I CV forniti sia dall’analizzatore LH 750 e che
dall’HORIBA ABX sono risultati sovrapponibili con quelli
riportati nella scheda tecnica degli strumenti. I risultati
ottenuti indicano che i parametri, presi in considerazione
in questo studio, forniti dall’analizzatore LH 750 correlano
con quelli dell’analizzatore HORIBA ABX sia per i soggetti
sani (WBC r=0,21 p<0,05; RBC r=0.12, p<0.05; HB
r=0.09, p<0.05; PLT r=0.08, p<0.05; NE# r=0,34, p<0,05;
LI# r=0,24, p<0,05; EO# r=0,61, p<0,05; MO# r=0,42,
p<0,05; BA# r=0,52, p<0,05) che per i pazienti con
infezione acuta (WBC r=0,34, p<0,05; RBC r=0.22,
p<0.05; HB r=0.19, p<0.05; PLT r=0.28, p<0.05; NE#
r=0,27, p<0,05; LI# r=0,14, p<0,05; EO# r=0,57, p<0,05;
MO# r=0,62, p<0,05; BA# r=0,67, p<0,05).
Conclusioni: La sepsi è una condizione potenzialmente
molto grave. La diagnosi precoce di tale sindrome è
importante per il management del paziente. La buona
correlazione ottenuta tra i due analizzatori indica che
entrambi possono essere utilizzati per la diagnosi di sepsi.
Pos
of immature CD45 CD19 CD20 CD10
B-cells
in hEPCB respect to hTCB samples. Taken together,
these results evidence the potential usefulness of hEPCB
for highlighting early steps of human immune system
as well as for developing novel strategies of stem cellbased therapy. Acknowledgements: CEINGE Convenz.
Reg. Campania, DGRC 1901/2009.
445
115
CLINICAL, HEMATOLOGICAL AND BIOCHEMICAL
FEATURES OF 90 PATIENTS AFFECTED BY
HEREDITARY SPHEROCYTOSIS AND HEREDITARY
ELLIPTOCYTOSIS
116
THE ROLE OF DIFFERENT TESTS FOR THE
LABORATORY DIAGNOSIS OF HEREDITARY
SPHEROCYTOSIS
1
1
1
1
1
P. Caprari , A. Tarzia , M.P. Caforio , M.G. Paolizzi
1
Rep. Biochimica e Biologia Molecolare Clinica, Dip.
Ematologia, Oncologia e Medicina Molecolare, Istituto
Superiore di Sanità, Roma
Aim-Disorders of the erythrocyte membrane comprise
an important group of inherited hemolytic anemias,
including Hereditary Spherocytosis (HS) and Hereditary
Elliptocytosis (HE).These syndromes are characterized
by marked clinical and laboratory heterogeneity.
Morphology, osmotic fragility test and reticulocyte count
are the key diagnostic features of these disorders
and membrane protein analysis is needed to identify
the membrane protein defects. In this work clinical,
hematological and biochemical features of 46 patients
with HS and 44 patients with HE were reported.
Methods - Diagnosis and characterization of patients were
performed by applying a diagnostic protocol including
family history, clinical signs (anemia, splenomegaly,
jaundice), hematological parameters (red cell indices and
morphology, reticulocyte count) and biochemical features
(osmotic fragility, G6PD and PK activities, ATP and
GSH concentrations and membrane proteins).Membrane
proteins defects were characterized by SDS-PAGE of
erythrocyte ghosts; moreover the evaluation of spectrin
dysfunction was performed on spectrin extracts by SDSPAGE and non denaturing electhrophoresis. Results and
Discussion – HS patients showed more relevant clinical
signs: anemia, splenomegaly (5 splenectomized subjects)
and hemolysis (increase in RDW values, reticulocyte
counts, PK activity, and unconjugated bilirubin. HE
patients were divided into three defined groups: common
HE (14/44), spherocytic HE (20/44) and HE combined
with other hereditary defects (10/44): thalassemia (7),
G6PD deficiency (1) and PK deficiency (2).Spherocytic
HE patients showed clinical manifestation comparable
with HS subjects. Osmotic fragility was increased in
89% HS, 64% common HE, and 70% spherocytic HE
subjects. G6PD and PK activities and GSH concentration
were particularly increased in HE-Thal patients. The main
membrane protein defects were: spectrin deficiency and/
or dysfunction (80%), Band 3 and protein 4.2 (15%),
ankyrin (11%) in HS patients and spectrin deficiency
and/or dysfunction (73%), protein 4.1 (9%), protein 4.2
(7%)deficiency and Band 3 (9%) in HE patients.The
cytoskeletal spectrin organization was altered in 67% and
79% HS and HE patients respectively. The analysis of
spectrin extracts allowed to identify additional spectrin
alterations (44/90) that resulted to be a very common
feature in these disorders.
446
1
3
4
P. Ialongo , R. Colletti , C. Ialongo , J. Alessandroni , A.
2
2
1
Testi , F. Giona , I. Antonozzi
1
Dip. Medicina Sperimentale, Univ. Sapienza di Roma
2
Dip. Biotecnologie Cellulari ed Ematologia, Univ.
Sapienza di Roma
3
Dip. Medicina di Laboratorio, Univ. Tor Vergata di
Roma
4
IRCCS San Raffaele Pisana, Roma
Hereditary Spherocytosis (HS) is an inherited
hematological disorder caused by different defects in
1
membrane-associated cytoskeletal network , which leads
to a reduced resistance of red blood cells (RBCs) to
mechanical stress, causing auto-hemolysis with severe
anemia. To date three different methods are available
to assay low-resistant RBCs, two of them based on
osmotic resistance assaying (the Acidified Glycerol Lysis
test (AGLT50) and the Eurospital’s Osmored test), and
the resting on the automated count of hyperchromic
microcytes (ADVIA 120, Siemens).
From January 2009 to June 2010 we tested 60 blood
samples from pediatric patients (median age 7 years,
range 1-15 years) suspected for HS on the basis of clinical
signs (splenomegaly with hemolytic anemia), and in a
1/3 of cases with a familiarity for HS too. A set of 100
samples from non-HS patients matched for age and sex
was assayed as control.
By the ADVIA 120 automated cytometer, 11 samples
resulted negatives for HS as stated by a percentage of
hyperchromic microcytes <8.5%, similarly to the Osmored
test, which resulted in 11 negatives on the basis of
a percentage hemolysis <28%. On the contrary, the
AGLT50 test resulted in just 23 positive samples (at a cutoff time of 1860 seconds), of which 5 positives to Osmored
test too, and 2 of them further positives to the ADVIA
210 cytometry. For each different kind of test all control
samples assayed resulted negatives.
After a 24 hours incubation at 37°C, the retesting of
all samples with both AGLT50 and Osmored gave a
positive outcome for HS. Interestingly, of the 11 previously
negatives at ADVIA 120 testing, 8 became positive for HS
with a percentage of hyperchromic RBCs >24% (p<0.05).
Our results are suggestive for a substantial biochemical
and hematological heterogeneity in HS, which
corresponds to the need of a structured approach that in
our opinion shouldn’t prescind from the osmotic resistance
assaying. Particularly, the role of such tests should be
as of successive steps, from hematological (ADVIA 120)
to biochemical’s (Osmored, AGLT50), toward a clear and
complete laboratory diagnosis.
Ref.1: The molecular basis of hereditary red cell
membrane disorders. Delaunay J. Blood Rev. 2007
Jan;21(1):1-20.
117
EMOGLOBINOPATIE: APPROPRIATEZZA
PRESCRITTIVA E QUESITO DIAGNOSTICO
1
1
118
RESISTENZE OSMOTICHE ERITROCITARIE:
RILEVANZA CLINICA
1
1
1
1
M. Mercadanti , A. Caleffi , A. Romero Alvares , G.
1
Lippi
1
U.O. Diagnostica Ematochimica, Dip. Patologia e
Medicina di Laboratorio, A.O.U. Parma
M. Mercadanti , A. Romero Alvarez , A. Caleffi , S.
1
1
Pipitone , G. Lippi
1
U.O. Diagnostica Ematochimica, Dip. Patologia e
Medicina di Laboratorio, A.O.U. di Parma
Introduzione
La presenza del quesito diagnostico o della motivazione
clinica nelle richieste di prestazioni laboratoristiche si
intreccia con il tema dell’appropriatezza prescrittiva
delle indagini ematochimiche. Lo scopo della ricerca
è di valutare la ricorrenza del quesito diagnostico e
l’appropriatezza prescrittiva nelle indagini di screening
per emoglobinopatie, patologie monogeniche più diffuse
al mondo, caratterizzate da costante incremento in aree
geografiche non tradizionalmente endemiche.
Materiali e metodi
Sono state esaminate le richieste di 481 pazienti
ambulatoriali inviati al nostro laboratorio per determinare
l’assetto emoglobinico, nel periodo novembre 2009–
febbraio 2010. E’ stata valutata la ricorrenza del
quesito diagnostico, le motivazioni cliniche sono state
raggruppate in sette ambiti clinici.
Risultati
Il 31% delle richieste non riportava il quesito diagnostico. Il
27% delle indagini era richiesto per gravidanza, il 23% per
indagini preconcezionali, l’8.5% nella diagnostica delle
microcitosi/anemie microcitiche. Le restanti motivazioni
erano così distribuite: infertilità (2.3%), procreazione
assistita (2.1%), controllo/accertamenti/astenia (2.1%),
richiesta specialistica (1.0%). Il quesito non era coerente
nel 2.9%. Le terminologie utilizzate per definire il quesito
diagnostico erano variegate, in gran parte coerenti.
Discussione
I dati mostrano che la maggioranza degli accertamenti
per emoglobinopatie vengono richiesti in età fertile,
correlati al concepimento, e secondariamente nell’ambito
della diagnostica delle microcitosi/anemie microcitiche.
Emerge tuttavia una quota rilevante di richieste
che non riportano il quesito diagnostico, nonostante
l’obbligatorietà dello stesso. La conoscenza del quesito
clinico può fornire elementi utili sia per l’interpretazione
dei risultati, sia per il criterio decisionale in relazione
ad eventuali approfondimenti diagnostici specialistici, di
quale tipo e con quale tempestività, dovendo coinvolgere
più specialisti (ginecologo, genetista, ematologo), ed
anche considerando il rapporto costo/beneficio. La
valutazione della tipologia dei prescrittori potrà fornire
suggerimenti per la promozione di audit clinici
multidisciplinari al fine di migliorare l’adesione a percorsi
di appropriatezza prescrittiva.
Scopo
Il test delle resistenze osmotiche eritrocitarie (ROE)
misura il grado di resistenza delle emazie a condizioni
di iper o ipoosmolarità.Le condizioni caratterizzate da
iperresistenza sono riferibili a due entità nosologiche,
sindromi talassemiche e stati ferrocarenziali, mentre
quelle con iporesistenza comprendono patologie
genetiche come la sferocitosi o rientrano nella diagnostica
delle anemie emolitiche.Il lavoro si prefigge di valutare
la rilevanza diagnostica delle richieste per ROE giunte al
laboratorio negli ultimi 8 anni.
Materiali e metodi
Sono stati esaminati i referti per ROE forniti dal laboratorio
dal 2002 al 2009.Per le ROE
è stato utilizzato il test al glicerolo con lettura nefeloturbiminimetrica (Osmored, Eurospital, Trieste).I risultati
sono stati comparati con gli indici eritrocitari classificati
in normali, anemia microcitica, normocitica, macrocitica,
eseguiti con contaglobuli Sysmex (Japan).
Risultati
Dal 2002 al 2009 sono state eseguite 382 determinazioni
di ROE così ripartite, a partire dal 2002: 39, 31, 34, 50,
46, 61, 45, 76. Le ROE erano normali in 152 casi con
emocromo normale (incluso un caso di Hb S eterozigote),
in 38 soggetti con microcitosi/anemia microcitica (di cui
5 di grave entità), in 47 con anemia normocitica, in
37 con macrocitosi/anemia macrocitica.La iper-resistenza
era aumentata in 74 casi di cui 40 con microcitosi/anemia
microcitica, 10 soggetti con emocromo normale, 18 con
anemia normocitica (di cui 4 portatori di Hb S eterozigote),
6 con macroctosi/anemia macrocitica. La iporesistenza
era alterata in 34 casi corrispondenti a 25 pazienti.
Discussione
I nostri dati rilevano un netto incremento delle richieste
per ROE nel corso degli anni.La iper-resistenza è risultata
aumentata in 30 casi con indici eritrocitari non coerenti
per sindromi talassemiche/sideropenie.Nei portatori di
eterozigosi S il solo test delle ROE avrebbe comportato
la misconoscenza della variante strutturale.La diagnostica
delle talassemie si avvale di tecniche specifiche quali
la HPLC, così come il bilancio marziale viene indagato
con parametri biochimici diretti.Si evince che il test delle
ROE possa ritenersi inappropriato per la diagnostica delle
talassemie/sideropenie, riservandolo esclusivamente ai
casi con fondato sospetto di sferocitosi.
447
119
REGULATORY T-CELL NUMBER IS CORRELATED
TO PROGRESSIVE FEATURES OF DISEASE IN
CHRONIC LYMPHOCYTIC
1
1
1
G. D'Arena , M.M. Minervini , N.P. Sinisi , N.
1
2
3
3
Cascavilla , G. D'Auria , D. Veltri , N. Del Prete , A.
3
3
3
Paradiso , A. Doddato , G. Grande
1
Ematologia e Uni. Trap Cel.Stam., IRCCS “Casa
Sollievo della Sofferenza”
2
Osp. S.Giuliano-Giugliano-ASL Napoli 2 Nord
3
Lab. Pat. Clin. Osp.dell’Immacolata, Sapri-ASL Salerno
Introduction: Naturally arising CD4+CD25+ regulatory
T-cells (Treg) actively maintain immunological selftolerance. A reduction in the number or function of these
cells can also elicit tumour immunity. Several studies
evidenced that the immune system in patients with chronic
lymphocytic leukemia (CLL) is deficient.
Patients and methods:In the current study we have
evaluated, by means of a multiparametric flow cytometric
approach, the circulating Treg cell number in 80 patients
with previously untreated CLL and in 40 normal subjects.
CD4+CD25+high density cells were gated and evaluated
for CD127 expression at low or undetectable levels to
analyze only Treg cells.
Results :A lower percentage number of Treg cells was
detected in CLL patients (mean number 0.43%, range
0.02-1.2%) than in controls (1.13%, range 0.2-2.1%). On
the contrary, when evaluated as absolute number, CLL
patients showed a higher number of Treg cells (mean
number 70.8/µL, range 3-880/µL) compared to controls
(mean number 23.2/µL, range 4.4-41/µL). A correlation
of Treg cell absolute number was also found with more
advanced Rai clinical stage (p<0.0001), absolute CD38
positive B-cell number (p <0.02), and more elevated LDH
levels (p< 0.037). No correlation, however, were found
with ZAP-70 expression, IgVH mutational status and
cytogenetic abnormalities. Only in 2 patients Treg cells
were found at very low levels. These patients suffered
from a concomitant autoimmune disorder (autoimmune
haemolytic anaemia and idiopathic thrombocytopenic
purpura) at the moment of analysis.
Conclusion: Finally, our data showed that Treg cells are
higher in CLL patients and correlate with disease status
rather than prognostic factors themselves. This subset of
T-cells is probably involved in the crucial mechanism of
pathogenesis and progression of CLL and a therapeutic
intervention targeting these cells need to be explored.
448
120
VALUTAZIONE PRELIMINARE DELL'ANALIZZATORE
COULTER UNICEL DXH 800: IMPATTO SUL FLUSSO
DI VALIDAZIONE
1
1
1
1
B. Morelli , R. Scalvini , C. Gatti , S. Latella , C.
1
2
Novelli , N. Di Gaetano
1
2
Premessa: Il nostro laboratorio sta affrontando una
fase di cambiamento organizzativo che porterà ad un
forte incremento del carico di lavoro sia in termini
quantitativi che in termini qualitativi: infatti nel giro di
pochi mesi l’Ospedale verrà dotato di numerose nuove
sale operatorie e verrà introdotta la terapia con le cellule
staminali. Per questi motivi abbiamo ritenuto opportuno
valutare le performances del nuovo analizzatore Coulter
Unicel DxH 800 e il suo impatto nella gestione del
carico di lavoro afferente al nostro laboratorio. Scopo:
Oggetto della valutazione sono stati 426 campioni di
pazienti provenienti dai reparti di ematologia, oncologia e
pediatria. I campioni sono stati processati entro 6 ore dal
prelievo su Coulter LH 750, attualmente in uso nel nostro
laboratorio, e successivamente su UniCel DXH 800. Il
sistema di validazione esperta (Modulab) ha permesso
di identificare 197 campioni patologici per la presenza di
anomalie quantitative e/o qualitative; questi sono stati poi
analizzati su DxH 800 e osservati al M.O. secondo i criteri
CLSI. Le segnalazioni strumentali qualitative a carico della
serie leucocitaria studiate sono state presenza di blasti,
presenza di immaturità mieloide (mielociti e pro mielociti)
differenziata dalla presenza di soli metamielociti, e linfociti
varianti. Risultati: le anomalie morfologiche riscontrate su
DxH 800 (Blasti, Imm Gran, Left Shift e Var Lymph) hanno
mostrato rispettivamente le seguenti sensibilità (0.889,
0.800, 0.745, 0.571) e specificità (0.981, 0.929, 0.810,
0.982). L’analisi su LH 750 per le suddette segnalazioni
avevano riportato le seguenti sensibilità (0.998, 0.714,
0.605, 0.517) e specificità (0.981, 0.947, 0.895, 0.997).
Conclusioni: la valutazione effettuata ha permesso di
riscontrare ottime performance analitiche di DxH 800 con
significativa riduzione delle flag morfologiche leucocitarie
e del numero dei falsi negativi. L’analizzatore è in
possesso delle potenzialità per incrementare l’efficienza
del laboratorio in termini di produzione del dato certo e
riduzione del tempo-uomo al rilascio dei risultati. Ref.: P.
Barnes et al. “Performance of Beckman Coulter Unicel
DxH800 Cellular Analysis System in a tertiary Hospital
Hematology Laboratory”, Int. Jnl. Lab. Hem. 2010 32
(Suppl.1)
121
ABNORMAL EXPRESSION OF THE WAP FAMILY
SLPI GENE IN PATIENTS WITH CHRONIC
MYELOPROLIFERATIVE NEOPLASMS
1
1
1
122
DIAGNOSTICA DELLE EMOGLOBINOPATIE:
ESPERIENZA DI SUPPORTO AD UN LABORATORIO
DI 1° LIVELLO
1
2
2
A. Pancrazzi , E. Antonioli , P. Guglielmelli , C.
1
1
1
1
Bogani , L. Pieri , L. Tozzi , N. Bartalucci , A.
1
1
1
1
Spolverini , F. Biamonte , A. Bosi , A. Vannucchi
1
Sez. di Ematologia, Dip. Area Critica Medico
Chirurgica, Univ. degli studi di Firenze, Firenze
M. Carta , D. Leone , G. Ivaldi
1
Lab. di Chimica Clinica ed Ematologia, Osp. S.Bortolo,
Vicenza
2
Lab. di Genetica-Settore Microcitemia, Osp. Galliera,
Genova
Background: Abnormal expression of several protease
inhibitors has been demonstrated to occur in granulocytes
from patients with polycythemia vera using gene
expression profiling. Among these, SLPI, a member
of the WAP family, that is involved in cell cycle and
apoptosis regulation. Overexpression of SLPI is described
as neoplastic phenotype in several solid tumors. AIMS
The aim of the study was to evaluate whether abnormal
expression of SLPI characterizes patients with MPN
METHODS We studied 130 patients with MPN and
45 healthy controls. Expression levels of SLPI were
determined by a quantitative TaqMan RT-PCR using
granulocyte RNA and GAPDH as the housekeeping gene.
In healthy blood donors the mean delta Ct value for
SLPI was 7.1±1.7 RESULTS The mean expression level
of SLPI in the whole MPN population (3.7±1.7) was
significantly higher than in healthy subjects (p <0.0001).
There was a progressive increase in SLPI overexpression
in patients with ET (4.4±1.6) to PMF (3.6±1.8), PPVMF (3.1±1.6), PV (2.9±1.2), and to PET-MF (1.5±1.3).
By using the 5.83 cut-off, 113/130 patients had SLPI
overexpression (87%), accounting for 100%, 100%, 85%,
94%, 81% of PET-MF, PPV-MF, PMF, PV, TE patients,
respectively. The abnormal expression of SLPI correlated
with the JAK2 mutational status: SLPI ratio was 2.6±1.5
in homozygotes, 3.8±1.5 in heterozygotes and 4.5±1.7
in wild-type patients; the difference between homozygote
and heterozygote patients was statistically significant
(p=0.004). To evaluate whether SLPI expression was
modulated by cytokine exposure, we measured changes
in SLPI mRNA levels after in vitro granulocyte activation
with different cytokines such as G-CSF, IL8, IL3, IL11,
La necessità di poter individuare e diagnosticare i difetti
dell’emoglobina rappresenta oggi una crescente esigenza
per il laboratorio di analisi chimico-cliniche. I mutamenti
della popolazione, la complessità dei difetti e la varietà
dei composti Hb e delle opzioni diagnostiche oggi a
disposizione sono tutti elementi che possono in parte
agevolare ma talvolta anche rendere più complessa
la comunicazione del risultato al medico prescrittore
e rendere necessaria una conferma con un approccio
diagnostico più raffinato.
Il presente lavoro vuole riferire sull’esperienza di un
laboratorio di 1° livello che ha potuto trovare un
supporto alla conclusione diagnostica utilizzando “un
parere a distanza” ponendo un quesito diagnostico sulla
base dei risultati ottenuti principalmente dal sistema
cromatografico in uso (HA8160 Menarini), dai valori
emocromocitometrici, conoscendo in molti casi lo stato
marziale ma disponendo solo sporadicamente dei dati
anamnestici. Inoltre il laboratorio di 1°livello esegue il test
di sickling nei casi in cui viene segnalata dal sistema
cromatografico la presenza di una variante simile all’Hb
S e l’elettroforesi a pH alcalino o acido quando il test di
sickling risulta negativo.
Nel corso degli ultimi quattro anni sono stati esaminati
circa 8000 soggetti: in 150 casi per poter esprimere
una conclusione diagnostica di laboratorio è stato
necessario ricorrere ad un approfondimento con indagini
molecolari, ripetere l’esame a distanza di tempo oppure
giungere ad una conclusione più articolata condividendola
con un laboratorio di riferimento di 2°livello (Second
Opinion). L’esperienza di questi anni ha dimostrato
che la conclusione diagnostica può certamente risultare
maggiormente appropriata, e quindi sostanzialmente più
utile al clinico, quando viene integrata dall'esperienza di
un laboratorio di riferimento: quest’ultimo si affianca al 1°
livello nel percorso interpretativo senza sostituirlo. Inoltre
si è potuto constatare che questo “parere a distanza”
in molti casi ha potuto produrre un effetto virtuoso
consentendo di limitare sia il numero di approfondimenti
molecolari costosi che la ripetizione non giustificata degli
esami di 1°livello.
IFN-α and TNF. There was no significant modulation of
SLPI by above cytokines, a part for G-CSF exposure. SLPI
plasma levels were measured by an ELISA assay; the
mean plasma levels in MPN patients were significantly
higher than in controls (37 ng/mL and 22 ng/mL,
respectively (p=0.006)). Among different disease ET
patients showed higher SLPI plasma levels (65 ng/ml)
Conclusions We have identified abnormal expression of
SLPI gene as a novel molecular marker of MPN, that is
also associated with raised plasma protein levels; there
was also a disease-specific pattern of overexpression
among TE, PMF, PV, PPV and PET patients.
449
123
VALUTAZIONE DELLA SENSIBILITA' CLINICA
DELLA FORMULA LEUCOCITARIA ELABORATA
SUL NUOVO ANALIZZATORE EMATOLOGICO
COULTER UNICEL DXH 800
1
1
1
1
124
CONTRIBUTO ALLA DIAGNOSI DELLE MDS
FORNITO DALL’ANALIZZATORE SYSMEX XE-2100
CON IL PARAMETRO STRUTTURALE NEUT-X E
CON GLI INDICI ERITROCITARI E RETICOLOCITARI
2
2
1
1
B. Morelli , R. Scalvini , C. Gatti , S. Latella , C.
1
2
Novelli , N. Di Gaetano
1
2
T. Catalano , M. Fumi , D. Martins , Y. Pancione , S.
1
1
Sale , V. Rocco
1
A.O. Rummo Benevento Lab. Patologia Clinica
2
AIL Benevento sezione Stefania Mottola
Premessa: L’analizzatore ematologico Coulter Unicel
DxH800, recentemente introdotto in commercio, presenta
numerose interessanti novità tecnologiche tra le quali
la possibilità di Re-run automatico e di Reflex Testing
e soprattutto un “Core Analitico” ottico che permette
7 distinte misurazioni su ogni popolazione leucocitaria
sfruttando la nuova “Flow Cytometric Digital Morphology”
allo scopo di migliorare la sensibilità clinica della formula
leucocitaria elaborata dal contaglobuli. Scopo del lavoro:
Valutare le performances del Coulter DxH 800 nei
confronti del Coulter LH 750 in dotazione nel nostro
laboratorio in relazione a: 1) parametri assoluti misurati
(WBC, RBC. HHGB, MCV, PLT, MPV, RET), 2) sensibilità
clinica della formula leucocitaria determinata sul nuovo
analizzatore. Materiali e metodi: Sono stati selezionati
426 campioni di pazienti ricoverati o in regime di
D.H. presso i reparti di Medicina, di Oncologia e di
Pediatria dell’Ospedale di Legnano. I campioni sono stati
processati sia su LH 750 che su DxH 800 entro 6 ore
dal prelievo. Gli strisci di sangue periferico sono stati
eseguiti manualmente e poi fissati e colorati sul coloratore
Aerospray della Delcon. La osservazione al M.O. (200
elementi per campione) è stata eseguita da due operatori
esperti secondo i criteri della CLSI. L’elaborazione
statistica dei risultati è stata eseguita mediante l’analisi di
regressione con il calcolo dei coefficienti di correlazione
utilizzando il software Excel. Risultati: I coefficienti di
correlazione tra i due contaglobuli sono risultati pari a
0.993 (WBC), 0.932 (RBC), 0.917 (HGB), 0.964 (PLT),
0.707 (MPV) e a 0.843 (RET). Per quello che riguarda
i parametri della formula leucocitaria i coefficienti di
correlazione sono risultati pari a 0.946 (Ne), 0.945 (Ly),
0.844 (Mo) e a 0.788 (Eo). Conclusioni: 1) I parametri
misurati direttamente sui due contaglobuli correlano in
maniera ottimale, 2) I nuovi parametri introdotti sul
nuovo analizzatore ematologico DxH 800 consentono
un miglioramento della sensibilità clinica della formula
leucocitaria rispetto a quella elaborata su Coulter LH 750.
Rif. Bibl.: P. Barnes et al. “Performance of Beckman
Coulter Unicel DxH 800 Cellular Analysis in A Tertiary
Hospital Hematology” – Int. Jnl. Lab. Hem. 2010, 32
(Suppl 1).
Le MDS sono un gruppo eterogeneo dei disordini maligni
del midollo con una cattiva prognosi. Fino a qualche
tempo fa le MDS erano trattate solo con terapia di
supporto, come le trasfusioni di sangue, ma ci sono
stati dei miglioramenti nella terapia delle MDS ad alto
rischio e questo rende cruciale una diagnosi precoce e
corretta del tipo di MDS. In accordo a Cymbalista F. (2007)
che ha riportato il valore del parametro strutturale NeutX fornito dall’analizzatore Sysmex XE-2100, correlato
alla granularità dei neutrofili, nella diagnosi delle MDS,
abbiamo analizzato 150 campioni di donatori sani, 3000
campioni della routine ematologica, 120 campioni di
MDS, 34 campioni di CMML e 4 campioni di ARSA-t
diagnosticate secondo i criteri WHO 2008.
Il valore di cut-off calcolato sul nostro analizzatore per il
NEUT-X è lievemente inferiore rispetto a quello riportato
da Cembalista (1320 vs 1330, con CV del 2%). Una
riduzione di questo parametro nella routine ematologica
è stato rilevato nel 4,7%. Nei 158 campioni di MDS
e MPD/MDS una riduzione di questo parametro sotto
il valore di 1320 è stato rilevato in 104 casi (65,8%).
L’analisi dei campioni con NEUT-X <1320 in rapporto alla
classificazione WHO 2008 ha fornito i seguenti risultati:
sindrome 5q- (2/2); AR (3/6); AREB-1 e 2 (20/22); ARSA
(13/34) ; ARSA-t (2/4); CMML (22/30); RCMD (14/21);
RCMD-RS (12/18); MDS-U (16/20). Se vengono isolati i
campioni delle categorie MDS dove la probabilità delle
alterazioni della granularità dei neutrofili sono più probabili
(111), viene rilevato un NEUT-X <1320 in 88 campioni
(79,3%). Il rilievo di un consistente numero di casi di
MDS con NEUT-X <1320 nelle quali la classificazione non
prevede una displasia granulocitaria (20/46; 43,5%) può
orientare per un bias nella classificazione morfologica, ma
anche per una sensibilità più elevata dell’indice strutturale
nell’individuare le alterazioni dei granuli dei neutrofili.
Ulteriori studi sugli indici reticolocitari, sugli indici di
fluorescenza e sugli indici strutturali dei monociti potranno
portare ad un miglioramento della sensibilità diagnostica
dell’analizzatore per le MDS e per le MDS/MPD.
450
125
COMPARISON BETWEEN TWO AUTOMATED
CALCITONIN IMMUNOASSAYS IN PATIENTS
SCREENED FOR MEDULLARY THYROID CANCER
1
1
1
1
C. Carrozza , F. Annunziata , G. Canu , S. Di Leva , R.
1
1
1
Lapolla , E. Torti , C. Zuppi
1
Lab. Analisi 1, Policlinico Universitario "A.Gemelli",
Roma
Background: Calcitonin (CT), a 32-aa polypeptide
hormone produced by parafollicular thyroid cells (C-cells),
is used as marker for the diagnosis of medullary thyroid
cancer (MTC) along as in post-surgery follow-up. In
these patients, CT detectable level suggests recurrence
of disease. Moreover, this test is used for the screening
of relatives of patients with multiple endocrine neoplasia
(MEN 2). In the presence of a strong clinical suspicion
of C-cell hyperplasia with normal CT basal levels, CT
determination following pentagastrin stimulus (Pg test)
may be a useful tool.
Aim of the study: The evaluation of the performance of two
automated CT immunoassays so as to have a CT method
with a higher sensitivity to be employed in our laboratory.
Methods: CT values obtained with IMMULITE®2000,
Siemens, (analytical sensitivity=2pg/ml; functional
sensitivity=n.a.) by chemiluminescence immunoassay
were compared with those from LIAISON®, DiaSorin
(analytical sensitivity<1pg/ml; functional sensitivity<2pg/
ml). The study was performed using 75 samples from
patients screened for MTC, of which 36 samples from
patients submitted to Pg testing.
Results: Comparison between the two assays for all
samples shows a good correlation (y=1,0475x+20,671;
2
R =0,97) in the total selected population. Moreover, we
divided the results on the basis of a 10 pg/ml cut-off value.
Out of 75 analyzed assays, we found 39 CT values 10 pg/
ml (basal) and 36 above cut-off (basal and after Pg). For
values below 10 pg/ml, the correlation between the two
2
methods is not statistically significant (R =0,54, p=0,42).
Conclusion: The good correlation obtained between the
two methods in all samples collected from both normal
and pathological subjects, ensures a good reliability of
both methods, allowing a comparison of results obtained
between these different instruments in clinical practice.
However, LIAISON CT results show a better assay
sensitivity, confirmed by a lower functional sensitivity
2
along with non-remarkable R for values above 10 pg/ml.
To conclude, we suggest that the LIAISON method allows
to carefully study thyroidectomized patients in which slight
serum CT changes may imply residual disease.
Bieglmayer C et al, Measurement of calcitonin by
immunoassay analyzer Clin Chem Lab Med 2007 45:662
126
A TWELVE YEAR LONG FOLLOW UP OF A MEN2A
PATIENT HARBOURING THREE "DE NOVO"
MUTATIONS OF THE RET PROTO-ONCOGENE
1
3
3
3
L. Circelli , G. Conzo , D. Pasquali , G. Accardo , V.
3
3
3
3
Sacco , D. Esposito , A. Renzullo , A. Sinisi , V.
2
Colantuoni
1
Ceinge, biotecnologie avanzate, Napoli
2
Ceinge, biotecnologie avanzate, Napoli; Dip.Scienze
Biol e Amb, Università degli Studi del Sannio, BN
3
Dip.Medico-Chirurgico di Internistica Clinica e
Sperimentale, Seconda Università di Napoli, Napoli
Multiple Endocrine Neoplasia type 2A (MEN2A) is
an autosomal dominant hereditary disorder, associated
with a cluster of germline gain-of-function mutations
of the RET proto-oncogene (RET). It encodes for a
membrane tyrosine-kinase receptor expressed in neuralcrest derived cells. Genotype-phenotype correlation
studies have shown that specific RET mutations are
associated with tumor aggressiveness. We report the
clinical evolution of a 36 year-old MEN2A patient
bearing three independent “de novo” RET mutations
at codons 634, 640 and 700 in exon 11. The clinical
phenotype is characterized by medullary thyroid cancer
(MTC) and bilateral pheochromocytoma (Pheo) without
hyperparathyroidism. We already reported this case as
a MEN2A associated with two RET mutations at codons
634 and 640 (1). Subsequently, we identified the third
mutation at codon 700 in the same exon 11. The patient
underwent thyroidectomy and removal of all nodes of the
region for MTC and left adrenalectomy for Pheo, followed
six years later by a right adrenalectomy for recurrence.
Three years later, the patient was subjected to removal
of more enlarged latero-cervical nodes, positive for MTC
infiltration. None of the parents and relatives investigated
bear RET mutations. During the follow-up, in spite of a
constantly elevated serum calcitonin (CT) level and in the
absence of detectable secondary metastases, the patient
gave birth to an healthy daughter in good health, without
RET mutations. The analysis of this twelve years long
follow-up shows that the patient with three “de novo”
RET mutations, despite the persistence of elevated serum
calcitonin levels, has a more favourable prognosis.
(1) Tessitore A. et al. (1999) A novel case of Multiple
Endocrine Neoplasia Type 2A associated with two de
novo mutations of the RET Proto-oncogene. J Clin
Endocrinol Metab. 89:3522-27.
451
127
L’APPROPRIATEZZA NELLA RICHIESTA DEGLI
ESAMI DI LABORATORIO: L’ESPERIENZA
NOVARESE DEL TSH-RIFLESSO
1
1
1
1
128
APPROPRIATEZZA PRESCRITTIVA DI
CATECOLAMINE E RELATIVI METABOLITI IN UNA
POPOLAZIONE AMBULATORIALE
1
1
1
N. Atzeni , M. Vidali , E. Mairate , L. Ciardi , G.
1
Bellomo
1
A. Romero Alvarez , M. Mercadanti , A. Caleffi , G.
1
Lippi
1
U.O. Diagnostica Ematochimica, Dip. di Patologia e
In questo lavoro abbiamo valutato l’appropriatezza delle
richieste di screening della funzione tiroidea esaminando
quelle afferenti al Laboratorio Analisi dell’Azienda prima e
successivamente all’introduzione del test del TSH-riflesso
e alla formazione degli operatori sanitari del territorio.
Periodo utilizzato per il confronto: luglio-dicembre 2008 vs
luglio-dicembre 2009.
Provenienza delle richieste: Centro Prelievi (CP) e Unità
Operative dell’Azienda (UO).
Nei due periodi considerati non ci sono differenze
significative nel numero delle richieste per TSH, FT3,
FT4 o anticorpi (AbTPO, AbTG). Nella seconda metà del
2009, a fronte delle 9987 (5385 CP, 4602 UO) richieste
di TSH (singolo o in varia combinazione), sono pervenute
1845 (373 CP, 1472 UO) richieste di TSH-riflesso, con
un incremento mensile progressivo. Le richieste improprie
doppie di TSH e TSH-riflesso per i CP e le UO sono state
rispettivamente 2 (0,5%) e 129 (8,7%).
Le richieste combinate di TSH+FT3+FT4 hanno
presentato una riduzione del 22% (da 2668 a 2082)
per i Medici Ospedalieri e del 6% (da 2947 a 2766)
per i Medici del territorio (CP). Delle 2766 (di cui 1041
a carico di pazienti mai valutati per funzione tiroidea
nei 18 mesi precedenti) e 2082 richieste combinate per
TSH+FT3+FT4, rispettivamente da parte dei Medici del
territorio e Ospedalieri, ben 1814 (65,6%) e 1140 (54,6%)
erano negative per tutti e tre gli analiti. Per i 1814
pazienti non ricoverati, a cui il proprio medico avesse
richiesto il solo TSH-riflesso, ci sarebbe stato un risparmio
di euro 18,25 (14,25 vs 32,50 euro). Nel complesso si
osserva un trend di diminuzione dei rapporti FT3/TSH e
FT4/TSH, più marcato per gli operatori dell’Azienda. In
particolare, mentre per gli operatori delle UO i rapporti
FT3/TSH e FT4/TSH sono rispettivamente 57,5% (70,4%
nel 2008) e 62,2% (83,1% nel 2008), vicini all’obiettivo del
50% indicato dalla Regione, per i medici del territorio si
registrano ancora percentuali elevate (68,7% e 73,6%).
I dati suggeriscono che il nuovo test del TSH-riflesso sia
molto più diffuso, forse per una maggior informazione e/
o formazione, tra i medici Ospedalieri che tra quelli del
territorio. Tuttavia, l’analisi non ha evidenziato un radicale
cambiamento nelle modalità prescrittive degli operatori.
Scopo: il laboratorio è direttamente coinvolto nel percorso
di miglioramento dell’appropriatezza prescrittiva delle
indagini laboratoristiche. Nella diagnostica delle patologie
del sistema cromaffine, numerosi studi hanno investigato
l’efficienza diagnostica del dosaggio delle catecolamine
e dei relativi metaboliti. Il dosaggio delle metanefrine
è ritenuto il marker diagnostico più sensibile per la
diagnosi di feocromocitoma. La determinazione del solo
acido vanilmandelico è considerata obsoleta per la scarsa
sensibilità diagnostica. Lo scopo del nostro studio è quello
di valutare l’aderenza delle prescrizioni ambulatoriali per
il dosaggio di catecolamine e relativi metaboliti urinari a
queste indicazioni.
Materiali e metodi: è stata valutata la numerosità e la
sequenza temporale delle determinazioni di epinefrina,
norepinefrina, metanefrine, acido vanilmandelico (VMA)
nella popolazione ambulatoriale afferente al laboratorio
dell’Azienda Ospedaliera di Parma nell’anno 2009. Le
indagini sono state condotte su campioni di urine, raccolte
nell’arco di 24 ore, mediante tecnica HPLC (Bio-Rad,
Milano).
Risultati: Nel 2009 sono state eseguiti 356 dosaggi per
catecolamine, 274 per VMA, 186 per metanefrine. In
ottantanove casi erano richiesti contemporaneamente
catecolamine e VMA, in 75 catecolamine e metanefrine,
in 10 metanefrine e VMA, in 7 catecolamine, metanefrine
e VMA. Tre pazienti avevano richieste per catecolamine
e metanefrine cronologicamente disgiunte. I dosaggi del
singolo analita sono stati 131 per catecolamine, 168 per
VMA e 26 per metanefrine.
Discussione: I dati evidenziano che le richieste per
metanefrine sono inferiori a quelle per catecolamine
e VMA. La prescrizione associata di catecolamine e
metanefrine (che insieme forniscono la migliore efficienza
diagnostica) è presente solo nel 24% delle richieste di
catecolamine e nel 46% di metanefrine. La difformità di
comportamento prescrittivo rispetto alle indicazioni della
letteratura è ragionevolmente imputabile ad una scarsa
conoscenza dell’offerta diagnostica del laboratorio,
considerando l’introduzione relativamente recente del
dosaggio delle metanefrine. Audit clinici multidisciplinari
potrebbero migliorare i percorsi diagnostici di patologie
complesse ma relativamente rare.
452
129
HUMAN GROWTH HORMONE (GH) ASSAY:
STANDARDISATION AND CLINICAL IMPLICATIONS
1
1
1
130
DETERMINAZIONE DEL CORTISOLO LIBERO
URINARIO MEDIANTE LC-MS/MS IN UNA PAZIENTE
IN TERAPIA CON MITOTANE
1
C. Carrozza , R. Lapolla , G. Canu , F. Annunziata , S.
1
1
Baroni , C. Zuppi
1
Lab Analisi 1, Policlinico Universitario “A.Gemelli”,
Roma
Background: GH is a 191 aa heterogeneous peptide,
of pituitary production. The GH isoforms are: 22K(85%),
20K(10%) and post-translation GH forms. About 40-60%
of blood GH is complexed with GH-binding proteins. The
poor comparability of GH results, obtained by several
methods, is partly due to the standard preparation
used for calibration. Indeed, the international reference
preparation (IRP), IS 80/505, is of human pituitary origin
nd
and contains all GH isoforms. However, the new IRP 2
IS 98/574 is a 22K recombinant GH isoform.
Aim of the study: To compare the results obtained by
ECLIA method on IMMULITE Siemens, calibrated with
two different IRPs: IS 80/505and IS 98/574.
Methods: GH was measured in 42 samples from
children submitted to GHRH+Arg stimulus,using the
ECLIA method calibrated with the IS 80/505 and the
recently introduced IS 98/574. Siemens suggests a cut-off
of 10 ng/ml using IS 80/505 and of 8 ng/ml with IS 98/574;
therefore the percentage variation (var%) on patients’
results is 20%.
Results:. The comparison between the two calibrators for
all selected samples shows a good correlation (y=0.6617x
+0,0691, R2=0,98). Moreover, we divided the results in
values raging from 0-10; 10-20; 20-40ng/ml. The total
mean var% was 32 and the mean var% among different
range is not significantly changed.
Conclusion: The GH assay is influenced by binding
proteins, isoforms, standardization problems, conversion
factors. Therefore, there is a notorious difficulty in
accurately measuring plasma GH and a disparity of
GH results obtained across assays and laboratories.
The discrepancies cause confusion and can have
serious implications for the management of patients
with GH-related disorders; so it is to be hoped that
there is a consensus on the standardization of GH
assays. According to the most recent international
recommendations, the IS 98/574 calibrator, the mass
measurement unit (µg/L) and conversion factor (3UI
=1mg) should be used. The AIFA note 39 provides
specific laboratory parameters for GH prescription in Italy.
However, our results suggest that values reported by the
note should be adjourned to those obtained by means of
recombinant GH calibration.
P.J Trainer et al,Consensus statement on the
standardization of GH assays, Eur J Endocrinol
2006;155(1):1-2
1
1
1
C. Carrozza , J. Gervasoni , S. Persichilli , A.
2
2
1
Prioletta , S. Della Casa , C. Zuppi
1
Lab. Analisi I, Policlinico Univ. "A. Gemelli" ,Roma
2
Divi. di Endocrinologia, Policlinico Univ. "A.
Gemelli" ,Roma
Introduzione Il mitotane è un inibitore della steroidogenesi
surrenalica utilizzato nel trattamento del carcinoma del
surrene. Come tutti gli inibitori della steroidogenesi, il
mitotane può provocare insufficienza surrenalica e il
clinico deve valutare l’adeguatezza della funzionalità del
surrene per decidere l’inizio della terapia sostitutiva.
Per monitorare l’efficacia del trattamento, il dosaggio del
cortisolo sierico risulta inattendibile perché il mitotane,
aumentando i livelli di cortisol-binding-globulin, porta
ad un aumento fittizio della cortisolemia totale. Questi
pazienti andrebbero monitorati ricorrendo al dosaggio del
cortisolo libero urinario (CLU). I metodi immunometrici
diretti o estrattivi utilizzati per il dosaggio del CLU e
ampiamente diffusi in routine, risultano poco specifici
perché i precursori del cortisolo e i loro metaboliti che si
accumulano durante tale trattamento, cross- reagiscono
nell’immunodosaggio portando a valori falsamente elevati
di cortisoluria. L’analisi del CLU mediante spettrometria di
massa tandem, grazie all’elevata selettività permette una
misura del cortisolo accurata e libera da interferenze.
Scopo del lavoro Monitorare la steroidogenesi surrenalica
in una paziente in terapia con mitotane dosando il CLU
mediante LC-MS/MS e mediante metodo immunometrico
ECLIA.
Metodi La misura del CLU è stata eseguita mediante
HPLC accoppiata a spettrometria di massa tandem
utilizzando una sorgente APCI operante in modalità
positiva. Il cortisolo sierico e il CLU (previa estrazione con
diclorometano) sono stati inoltre dosati con metodo ECLIA
usando un kit Roche su Modular E.
Riultati Il cortisolo sierico era pari a a 128 ng/ml (v.n.
35-210 ng/ml), il CLU con metodo ECLIA era uguale a 135
µg/24h (v.n. 36-137 µg/24h) mentre è risultato inferiore a
1 µg/L quando misurato in LC-MS/MS (v.n. 11-70 µg/24h)
Conclusioni I valori del cortisolo sierico e del CLU dosati
con metodo ECLIA, invalidati dall’uso del mitotane, sono
risultati ai limiti superiori della norma e non avrebbero
permesso di riconoscere l’inadeguata funzionalità del
surrene. Il CLU dosato in LC-MS/MS, metodo altamente
specifico e libero da interferenze, ha evidenziato
l’insufficienza surrenalica indicando cosi’ al clinico la
necessità di iniziare la terapia sostitutiva.
453
131
PROTOCOLLO PER LA RAZIONALIZZAZIONE
DELL'UTILIZZO E DELLA SPESA DELLA
DIAGNOSTICA DI LABORATORIO TIROIDEA
1
1
1
1
M. Panichi , M. Mosti , R. Bruzzi , B. Danesi , G. Del
1
1
1
1
1
Frate , G. Fontani , P. Guelfi , E. Mangia , C. Menconi
1
Lab Analisi Chimico Cliniche e Microbiologiche, Osp.
Carrara, USL1, Massa e Carrara
Al fine di una razionalizzazione dell'utilizzo e della
spesa nella diagnostica di laboratorio tiroidea, presso il
Laboratorio Analisi Chimico Cliniche e Microbiologia di
Carrara, dall'anno 2010 si è deciso di introdurre il test
“TSH REFLEX”.
Il tutto è stato preceduto da una campagna di
informazione e sensibilizzazione sul territorio che ha visto
coinvolti i medici di famiglia, il personale del laboratorio,
Endocrinologia e Medicina Nucleare.
Una consuetudine ormai radicata nella pratica clinica,
vede la richiesta del TSH sempre affiancata al dosaggio
di FT3 ed FT4, quando non anche agli anticorpi Anti-Tg
e anti-TPO.
La letteratura ha ormai ampiamente dimostrato che
questo pannello di esami, si rivela, in una grande
percentuale di casi, inutile. Infatti, il solo TSH è in grado
di evidenziare tutti i casi di disfunzione tiroidea, spesso
anticipando la comparsa dei sintomi. Soltanto dopo aver
valutato il valore di TSH, può risultare utile il dosaggio
degli altri ormoni tiroidei.
I notevoli miglioramenti nel campo informatico e
l'automazione ad oggi in uso presso il nostro laboratorio,
hanno permesso di poter operare durante la sessione
analitica una selezione dei campioni che necessitano
ulteriori dosaggi.
Il “TEST TSH REFLEX” opera secondo il seguente
algoritmo:
- 0,3 <TSH < 4 µUI\ml: STOP o approfondimento solo se
persiste un fondato sospetto clinico;
- TSH <0,3 µUI\ml: Eseguire FT4: Se FT4> limite
superiore di normalità: STOP
Se FT4< limite superiore di normalità eseguire FT3;
TSH > 4 µUI\ml: Eseguire FT4 e Ab TPO:
Se Ab TPO sono “normali”: dosare AbTG
Se Ab TPO sono “elevati”: STOP
Nel nostro laboratorio nel periodo compreso dal 01/01/
20009 al 31/12 2009 sono pervenute 48406 richieste per
TSH, 34198 per FT3 e 35156 per FT4.
Di questi circa il 60% avevano un TSH compreso 0,3 – 4
µUI\ml per cui non avrebbero avuto necessità di ulteriori
approfondimenti. Il TSH REFLEX oltre ad un risparmio
economico, che stiamo quantificando, si associa ad una
più veloce refertazione e soprattutto ad una maggiore
appropriatezza nel pannello di screening tiroideo.In tutti
i casi tale algoritmo non sostituisce la possibilità di
richiedere comunque gli esami tiroidei.
454
132
ALDOSTERONE: LIKELY LINK BETWEEN
POLYCYSTIC OVARIAN SYNDROME (PCOS) AND
CARDIOMETABOLIC SYNDROME IN YOUNG
WOMEN
1
2
1
1
R. Lovero , M. Pepe , A. Carucci , S. Tundo , G.
3
1
1
Saltarelli , A. Legrottaglie , L. Barletta , I.
4
1
1
1
Carbonara , S. Lovero , C. Curigliano , E. Vinci
1
U.O.C. Lab. analisi Fasano-Cisternino-Ostuni (BR)
2
U.O. Lab. analisi Canosa-Minervino Spinazzola (BAT)
3
U.O. di Medicina Legale servizio Igiene e Sanità
Pubblica ASL BR (BR)
4
U.O. Ostetricia e Ginecologia Ospedale Civile Fasano
(BR)
Context: The polycystic ovarian syndrome is the most
common endocrine disorders in young women. Recently,
an expert conference (Rotterdam 2003) recommended
that PCOS be defined when at least two of the following
three features were present: oligo-and/or anovulation;
clinical and/or biochemical signs of hyperandrogenism;
polycystic ovaries. In the last years, it has become
apparent that the PCOS not only is a reproductive
endocrinopathy but is also associated with characteristic
metabolic disturbance comprise insulin resistance (IR),
a features of the cardiometabolic syndrome. Emerging
evidence supports that aldosterone excess is involved in
the pathogenesis of IR. Aldosterone enhances oxidative
stress and inflammation, in turn, contributes to impaired
insulin metabolic signalling.
Objective: Our objective was to test the hypothesis that
increased aldosterone production was associated with IR
in PCOS and healthy subjects.
Patients and Methods: twenty-five patients with PCOS
were compared with thirty healthy subjects at day
7°-14°-21° of human menstrual cycle. FSH, LH, DHEAS, E2, PGR, PRL, testosterone, cortisol, CRP, total
cholesterol, LDL, HDL, triglycerides, aldosterone levels
and homeostasis model assessment (HOMA) score
for estimation of IR were measured in each subject.
Results, analyzed with unpaired t test, were expressed
as mean±SD; correlations were expressed as Pearson’s
coefficient; p<0,05 was considered significant.
Results: Fertility and lipid profile were similar in PCOS
and controls except for LH and triglycerides values
(p<0,05). All subjects had aldosterone levels within the
normal range. Only in PCOS women aldosterone was
slightly above the upper limit of the normal range at day
14°. Besides, aldosterone, HOMA and CRP values were
significantly (p<0,001) increased in PCOS compared with
controls at every time considered. A significant (p<0,05)
direct correlation between aldosterone and HOMA and
CRP values was observed only in PCOS.
Conclusion: A putative cause of the increased aldosterone
levels, even if within normal range, observed in
PCOS could be the IR. Recent studies support
hyperaldosteronism as a cause of impaired glucose
metabolism. Clearly, additional studies are needed to
determine the role of aldosterone in causing metabolic
dysfunction.
133
“LA TIROIDE SCENDE IN PIAZZA”:
MANIFESTAZIONE DI SENSIBILIZZAZIONE SULLA
TIROIDE NELLA POPOLAZIONE DI VERONA E
PROVINCIA. UTILIZZO DI UN DATABASE
134
LA CONCENTRAZIONE DI ANTICORPI ANTITIROIDE:
UTILITA' NELLA VALUTAZIONE DELLA FUNZIONE
D'ORGANO
1
1
2
1
1
A. Ferrari , R. Castello , C. Cocco , B. Caruso , A.
1
1
1
1
Cremon , L. Lippa , A. Massocco , N. Melloni , D.
1
1
1
1
Nicolis , M. Nundini , S. Ugolini , M.S. Graziani
1
Lab. di Analisi Chimico Cliniche ed Ematologiche, Osp.
Civile Maggiore, A.O.U. Integrata di Verona
2
U.O. Medicina Generale/Endocrinologia, Osp. Civile
Maggiore, A.O.U. Integrata di Verona
Introduzione. Tra il 2008 e il 2010 l’Associazione
Medici Endocrinologi, l’Azienda Ospedaliera di Verona e
l’Ospedale di Negrar hanno organizzato 4 manifestazioni
denominate “La tiroide scende in piazza” per
sensibilizzare la popolazione di Verona e provincia sulle
patologie tiroidee. Il laboratorio è stato coinvolto nella
gestione informatica dei dati anagrafici, anamnestici e
diagnostici e nell’esecuzione dei test di funzionalità
tiroidea.
Scopo del lavoro. Utilizzare i risultati ottenuti per produrre
algoritmi diagnostici applicabili alla popolazione generale,
attraverso una gestione informatizzata e rigorosa dei dati.
Materiali e Metodi. Ai partecipanti alle manifestazioni
venivano effettuati: accettazione anagrafica, anamnesi
e visita endocrinologica, prelievo ematico ed ecografia
del collo. Tutti cittadini esaminati non dovevano avere
precedenti patologie tiroidee. Il laboratorio ha eseguito
TSH reflex, fT4 ed Ab TPO, utilizzando il sistema Advia
Centaur XP (Siemens). Per il TSH è stato utilizzato
l’IR 0,15-3,00 mU/L, introdotto recentemente nel nostro
laboratorio.
®
Tutti i dati sono stati inseriti in un database di MS Access ,
allestito dal personale del laboratorio.
Risultati. Sono stati valutati complessivamente 2916
cittadini, dei quali il 31% maschi e il 69% femmine. L’età
mediana era di 51 anni. L’8,5% dei cittadini è risultato
avere un’alterata funzionalità tiroidea, mentre l’8,4% dei
pazienti eutiroidei aveva positività agli Ab TPO. In 1293
cittadini (44,3%) è stata rilevata la presenza di almeno
un nodulo al riscontro ecografico ed è stata indicata
l’esecuzione di agoaspirato a 775 di questi (26,6%), agli
altri 480 è stato consigliato un follow-up ecografico.
Conclusioni. Il database ha consentito di confrontare i dati
raccolti, permettendo una valutazione complessiva dello
stato di salute della tiroide dei partecipanti e di aggiornare
l’algoritmo diagnostico del TSH reflex.
Dall’analisi dei risultati è possibile ricavare le seguenti
valutazioni:
- il TSH reflex è sufficiente per valutare la funzionalità
tiroidea come test iniziale nella popolazione generale;
- AbTPO sono presenti nel 10% dei soggetti eutiroidei
a suggerire un patologia autoimmune non “ancora”
clinicamente espressa;
- La patologia tiroidea è presente in almeno il 35% della
popolazione.
1
1
1
V. Brescia , A. Mileti , M. Tampoia , A. Losito , C.
1
1
1
Capobianco , M. Varone , F. Di Serio
1
Patologia Clinica I, Osp. Policlinico, Bari
La presenza di anticorpi anti tireoperossidasi (TPOAb) ed
anti tireoglobulina (TGAb) è uno dei fattori di rischio per
lo sviluppo di ipotiroidismo (1). Scopo del nostro lavoro è
stato valutare la frequenza di alterazioni della funzionalità
tiroidea in rapporto al titolo anticorpale.
Materiali e Metodi. Sono state valutati 2151 richieste
di ricerca di anticorpi anti tiroide, pervenute presso
l’ambulatorio della Patologia Clinica I da gennaio a giugno
2010. 301 (14%) soggetti, 103 maschi (età media 38 anni,
range 21-55) e 198 femmine (età media 32 anni, range
18-49), sono risultati positivi alla presenza di anticorpi
anti tiroide, all’esordio di malattia. A tutti i pazienti è stato
eseguito il dosaggio di TSH e fT4. Tutti i test sono stati
eseguiti su sistema automatizzato Centaur (Siemens),
con metodologia CLIA. L’analisi statistica ha previsto
l’utilizzo del Chi-square test.
Risultati. 169 soggetti (56%) sono risultati TPOAb e
TGAb positivi; 120 soggetti (40%) sono risultati solo
TPOAb positivi e 12 soggetti (4%) solo TGAb positivi.
La valutazione dei valori del TSH eseguita nei 301
soggetti stratificati per differenti livelli di concentrazione
anticorpale, ha evidenziato ipotiroidismo subclinico in 4
(5%) degli 80 soggetti con valori di TPOAb compresi tra
60-90 U/mL, in 3 (4.9%) dei 61 soggetti con valori di
TPOAb tra 91-180 U/mL, in 14 (12.3 %) di 113 soggetti
con valori di TPOAb tra 181-500 U/mL, in 4 (14.2%) di
28 soggetti con valori di TPOAb tra 501-1000 U/mL, in
1(14.2%) dei 7 soggetti con valori di TPOAb >1000 U/
mL e nessun caso nei 12 soggetti con positività isolata
per TGAb. La differenza percentuale non è risultata
statisticamente significativa (P value =0.13)
Conclusioni. I dati da noi ottenuti hanno evidenziato che
gli TPOAb sono un marker più sensibile degli TGAb
nella diagnosi di AITD. Il titolo anticorpale non è utile nel
predire lo stato di ipotiroidismo conclamato o subclinico.
Si conferma la necessità alla diagnosi e nel monitoraggio
della patologia autoimmune tiroidea del dosaggio del TSH
e della ricerca di anticorpi anti tiroide per la valutazione
eziologica dell’ipotiroidismo.
1.Sinclair D. Clinical and laboratory aspects of thyroid
autoantbodies. Ann Clin Biochem 2006;43:173-83
455
135
VALUTAZIONE DEL CORTISOLO SALIVARE IN
PAZIENTI PEDIATRICI CON DISTURBI PSICHIATRICI
ASSOCIATI A STRESS
136
TSH REFLEX ALGORITHM REVISION UPON
POPULATION-BASED THYROID SCREENING
1
1
1
1
2
R. Luciano , E. Misirocchi , F. Colistro , S. Vicari , S.
2
1
Gaudio , M. Muraca
1
Lab. Analisi, Osp. Pediatrico Bambino Gesù, Roma
2
Neurops. Infantile,Osp. Pediatrico Bambino Gesù,
Roma
La produzione di cortisolo aumenta in condizioni di stress
psico-fisico severo, compresi gli stati depressivi o i disturbi
d’ansia (1, 2). Scopo del nostro lavoro è stato valutare la
concentrazione mattutina di cortisolo salivare come indice
di stress in una popolazione pediatrica. Sono stati studiati
15 soggetti con Disturbi Psichiatrici di Asse I secondo i
criteri del DSM-IV (9 maschi e 6 femmine, di età media
15.6 anni, range 11-17) e un gruppo di controllo senza
Disturbi Psichiatrici (17 maschi e 4 femmine, età media
10.2 anni, range 5-14).
Il cortisolo salivare è stato determinato utilizzando
un metodo competitivo Immunoenzimatico colorimetrico
(Diametra).
L’analisi statistica è stata eseguita utilizzando il T- test e
il test del χ². I risultati sono espressi come Medie ± ES.
Non sono state riscontrate differenze significative nel
rapporto maschi/femmine tra i due gruppi di soggetti.
All’interno di ciascun gruppo, non sono state riscontrate
differenze significative nella concentrazione salivare di
cortisolo tra i due sessi.
La concentrazione di cortisolo salivare è risultata
significativamente superiore nel gruppo con Disturbi
Psichiatrici (8.093 ng/mL ± 1.204 ng/mL; range 0.8-3.3)
rispetto al gruppo di controllo (2.143 ± 0.148 ng/mL; range
3.2-19.0; p <0.001). L’analisi di distribuzione dei valori
dimostra che, nel gruppo con Disturbi Psichiatrici, solo un
caso aveva un valore di cortisolo salivare ( 3.2 ng/mL) che
si sovrapponeva con il limite superiore di valori del gruppo
di controllo.
Questi risultati suggeriscono che la valutazione del
cortisolo salivare potrebbe essere usata nelle screening
delle condizioni di stress in età pediatrica, quali la
sindrome da abuso e/o gli altri disturbi psichiatrici di Asse
I.
(1) Knorr et all, Psychoneuroendocrinology (2010).
(2) Vreeburg et all, Psychosom Med. 2010
May;72(4):340-7.
456
1
1
2
C. Cocco , A. Ferrari , B. Caruso , R. Castello , L.
3
1
1
1
Furlani , A. Cremon , L. Lippa , A. Massocco , N.
1
1
1
1
Melloni , D. Nicolis , S. Ugolini , M.S. Graziani
1
Lab. di Analisi Chimico Cliniche ed Ematologiche, Osp.
Civile Maggiore, A.O.U. Integrata di Verona
2
U.O. di Medicina Generale/Endocrinologia, Osp. Civile
Maggiore, A.O.U. Integrata di Verona
3
Servizio di Endocrinologia, Osp. Sacro Cuore, Negrar
(VR)
Introduction. For diagnostic purposes, free thyroid
hormones (fT4 and fT3) and thyroid peroxidase antibodies
(AbTPO) are performed on the basis of TSH cut-off values
(TSH reflex, TSHr). These values should be monitored
and could be modified according to demographic and
clinical conditions able to influence the TSH concentration.
Aim. Define cut-off values for TSHr by re-calculating TSH
Reference Intervals (RI) in individuals enrolled in thyroid
screening initiatives carried on in the general population.
Materials and methods. RI of TSH have been calculated
in a sample population of 646 individuals from the
geographic area of Verona. Thyroid dysfunction has been
excluded on the basis of familiarity, clinical examination,
echography and ongoing therapy. Algorithm for TSHr
has been re-calculated in 3,874 patients from the
Laboratory database: TSH 4.3÷10 mU/L (n=2,834), TSH
>10 mU/L (n=654), TSH 0.15÷0.35 mU/L (n=386). TSH,
®
fT4 and AbTPO have been measured with Advia
CentaurXP (Siemens). Percentiles (2.5 and 97.5) and
99% confidence intervals (99% CI) have been calculated
®
with STATA (STATA Corp LP – USA).
Results. RI of TSH was 0.45÷3.02 mU/L (99% CI
0.42-0.52 and 2.70-3.29, respectively). Cut-off threshold
for AbTPO analysis was modified from 3.7 to 3.0 mU/L.
The range of fT4 for TSH 4.3÷10 mU/L was 9÷20 pmol/L
(99% CI 9-9 and 20-21, respectively), comparable with the
RI (10÷23 pmol/L). The fT4 range for TSH >10 mU/L was
3.4÷19 pmol/L (99% CI 3-4 and 17.0-19.5, respectively).
Both fT4 and AbTPO could thus be measured for TSH
>10 mU/L (previously >4.3 mU/L). Subjects with TSH
0.15÷0.35 mU/L, always showed fT4 values within the RI;
as a consequence, the lower cut-off level could be 0.15,
instead of 0.35 mU/L.
Conclusion. Testing TSHr in a healthy sample population
from our geographic area led us to update the diagnostic
algorithm, resulting in improvement of the Laboratory
management of tests for thyroid dysfunction.
1. J Clin Endocrinol Metab 2010;95:1095-104
137
LEVEL OF CIRCULATING 25-HYDROXYVITAMIN D:
NORMAL RANGE OR OPTIMAL VALUES?
1
1
1
S. Valaperta , M. Monari , R. Assandri , V. Lo
1
1
2
1
Cicero , E. Baldassarre , S. Garbelli , A. Montanelli
1
Lab. Clinical Investigation , IRCCS Istituto Clinico
Humanitas , Rozzano, Milano
2
Information Technology, IRCCS Istituto Clinico
Humanitas , Rozzano, Milano
Background Vitamin D has a wide variety of physiological
functions in the human body. There is increasing evidence
that low serum levels of this vitamin have an important role
in the pathogenesis of different skeletal and extra-skeletal
diseases(1).
Several studies have defined vitamin D deficiency as
circulating levels of 25 hydroxyvitamin D ≤ 32 µg/L.
Where is the “normal” level of circulating 25(OH)D in
humans? Sampling human subjects, who appear to be
free from disease, and assessing “normal” circulating
25(OH)D levels based on a Gaussian distribution of these
values is now considered to be a grossly inaccurate
method of identifying the normal range.We have analyzed
the data collected in our laboratory in six months of 2010
year by biochemistry chemical approach.
Materials, Methods and Results We have measured 1469
non selected serum samples by a competitive assay:
25(OH) Vitamin D TOTAL, Liaison ®, Diasorin (linearity
4-150 µg/L; CV intra-series 5% and inter-series 10%;
normal range 10-55 µg/L). We have classified the results
as follows: between 1469 tested, we evidence a deficiency
of vitamin D in 975 samples (65.1%) by the set point 32
µg/L but in only 197 (13%) by the normal range (10 – 55
µg/L).
In particularly the deficiency is present in age classes:
- under 40y (85 samples): 69.4% <32 µg/L but only 7.1%
out of normal range
- between 41y and 60y (510 samples): 70.0% <32 µg/L
but only 19.8% out of normal range
- over 60y (874 samples): 61.9% <32µg/L but only 10.3%
out of normal range.
Conclusions The value of 32 µg/L proposed as deficiency
set point is higher than the 10 µg/L value recognized by
assay manufactures and chemical chemistry laboratories.
In our study the normal range gives an underestimation
of vitamin D deficiency in 53% of cases with important
implications in therapeutic treatment.
Therefore we believe that, in the report of the clinical
laboratory, the “normal range” is insufficient and must
be involved also by the “optimal value” that could alert
physicians to obtained an early detection of vitamin D
deficiency.
Reference
1. Seasonal variance of 25-(OH) vitamin D in the general
population of Estonia, a Northern European country
Mart Kull Jr,Riina Kallikorm, Anu Tamm and Margus
Lember.
138
p.S904F: A RARE RET GENE MUTATION PRESENT
IN THE ITALIAN POPULATION
1
1
1
A. Minucci , E. Lucci Cordisco , D. Tripodi , C.
1
1
1
Zuppi , B. Giardina , E. Capoluongo
1
Rome, Italy.
Background: Germline RET gene mutations are
causative of multiple endocrine neoplasia (MEN)
and may be identified by genetic screening. Three
different syndromes are distinguished: MEN 2A, when
medullary thyroid carcinoma (MTC) is associated with
pheochromocytoma and/or parathyroid adenomas; MEN
2B, when accompanied by a marfanoid habitus and/
or pheochromocytoma; and familial medullary thyroid
carcinoma (FMTC), when only MTC is present.
Materials and methods. We report the results of the
molecular analysis of the RET gene in an Italian
family. The proband, a 57 years old man, underwent
thyroidectomy for MTC at 51 years. His father showed
raised calcitonin level at 86 years. There was no
evidence of phaeochromocytoma or parathyroid disease
on screening in both. The RET gene was analyzed by
direct DNA sequencing.
Results. The proband was found to have the c.2071G>A
and c.2712C>G variants. Interestingly, he showed at
position 904 a C to T transition (c.2711C>T) leading a
serine to leucine or phenylalanine aminoacid change (if
the c.2711C>T occurs in cis or in trans with c.2712C>G,
respectively). By analysis of the RET gene of the father
we confirm the trans distribution of the two substitutions.
Discussion. The hereditary form of MTC represents
only 20–25% of all MTC whose prevalence of thyroid
cancer varies from 5–10%. With the introduction of RET
genetic screening, the finding of a germline RET mutation
became sufficient to define the “hereditary” nature of the
syndrome. This family represents the second Italian family
with p.S904F mutation. The relatively low aggressiveness
of this FMTC form can be explained by the absence
of a positive familial history and by the involvement of
noncsyteine RET mutations.
Reference. Elisei R, Romei C, Cosci B, Agate L, Bottici V,
Molinaro E, Sculli M, Miccoli P, Basolo F, Grasso L, Pacini
F, Pinchera A RET genetic screening in patients with
medullary thyroid cancer and their relatives: experience
with 807 individuals at one center.J Clin Endocrinol Metab.
2007;92:4725-9.
457
139
MATRICI CONVENZIONALI E CHERATINICHE
PER ESAMI TOSSICOLOGICI NEI LAVORATORI A
RISCHIO DL 81
1
1
1
1
M. Scoditti , T. Voi , P. Robert , R. Incalza , A. Sanasi
1
Lab. di Patologia Clinica Distrettuale e Tossicologia
ASLl BR, Brindisi
1
Nel
primo
semestre
del
2009,
presso
il
Laboratorio,abbiamo effettuato test tossicologici su
lavoratori di aziende locali.Il nostro lavoro si
propone di confrontare gli accertamenti su urina e
capello,al fine di confermare l’attendibilità della matrice
cheratinica,sottolineando la facilità di prelievo,la non
invasività e la stabilità degli analiti e dei relativi metaboliti
rilevabili anche a distanza di mesi.I test sono stati
realizzati con metodiche di I livello e di II livello,
utilizzando per lo screening il test Emit II plus (di tipo
immunoenzimatico)che effettua una stima qualitativa.Il
campione cheratinico o urinario correttamente processato
è stato sottoposto all’eventuale fase successiva di
conferma con HPLC Biorad® e/o GC/MS Varian®.In
totale sono stati esaminati 415 lavoratori, eseguendo i
test in parallelo sia su matrice urinaria che cheratinica,
definendo così in percentuale il numero di soggetti positivi
ai test di conferma relativi alle tre classi più rilevanti di
sostanze d’abuso riscontrate.Dei 415 lavoratori sottoposti
agli accertamenti 306 sono risultati negativi mentre i
restanti 85 sono risultati positivi, di questi ultimi: 46 sono
risultati positivi per i cannabinoidi, 28 per la cocaina e
11 per gli oppiacei.I risultati ottenuti dal nostro studio di
comparazione,ha dimostrato come le positività riscontrate
nei test su matrice cheratinica siano più alte di circa il 10%
rispetto a quelle su urine,confermando l’enorme vantaggio
offerto dall’impiego della matrice cheratinica nelle indagini
tossicologiche sui lavoratori.Nonostante il test sul capello
risulti più costoso,esso garantisce maggiore sensibilità e
specificità per accertamenti di valenza medico-legale.
Bibliografia: 1.S. Pichini, I. Altieri, P. Zuccaro, R.
Pacifici. Drug monitoring in nonconventional biological
fluid and matrices. Clin. Pharmacokinet 30(3); 211-28
(1996) 2.Accordo, ai sensi dellárticolo 8, comma 2
dellÍntesa in materia di accertamento di assenza di
tossicodipendenza,30 ottobre 2007 (Rep. Atti n. 99/CU)
3.P. Klintz, A. Tracqui, P. Mangin. Detection of drugs in
human hair for clinical and forensic application. Int. J. Leg.
Med. 105: 1-4 (1992).
458
140
VALUTAZIONE AI SENSI DELLA D.G. REGIONE
LOMBARDIA N°9097/2009 DEL DOSAGGIO DELLE
SOSTANZE D'ABUSO PRESENTI NELLE URINE DI
SOGGETTI PROVENIENTI DAI SERT DELL'ASL DI
BRESCIA
2
1
1
F. Vassallo , E. Grassi , R. Patelli , F. Speziani
1
Lab. di Sanità Pubblica ASL Brescia
2
Dir.Sanitaria ASL Brescia
1
Con la D.G.R. n°9097 del 13/03/09 sono stati stabiliti
i requisiti da adottarsi dagli SMeL e dai Laboratori
di Sanità Pubblica (LSP) ai fini dell’autorizzazione alla
ricerca nei materiali biologici di sostanze stupefacenti,
anche con valenza medico legale. L’LSP dell’ASL di
Brescia ha analizzato, dall’ottobre 2009 al maggio 2010,
3189 campioni di urina provenienti dai SERT dell’ASL di
Brescia, di questi, 191 appartenenti al monitoraggio dei
lavoratori impiegati in particolari mansioni a rischio per la
sicurezza e quindi sottoposti periodicamente alla verifica
di assenza d’assunzione di sostanze stupefacenti.
Per le analisi di screening è stato adottato un
metodo immunochimico, mentre per quelle di conferma
è stata applicata la gas-cromatografia associata alla
spettrometria di massa.
Dopo lo screening, sono stati rilevati 180 positivi ai
cannabinoidi, 126 alla cocaina, 70 agli oppiacei e 5 al
metadone.
Nei soggetti provenienti dai SERT (non lavoratori) i
cannabinoidi sono le droghe maggiormente presenti
(40%), seguiti dalla cocaina (29%) e, in misura nettamente
inferiore, dagli oppiacei (17%). In 53 campioni è stata
inoltre individuata la concomitante presenza di più
sostanze d’abuso (13%).
Anche nelle urine dei lavoratori sottoposti a verifica di
assenza d’assunzione di stupefacenti i cannabinoidi sono
la prima droga (61%) presente nei campioni, seguiti dalla
cocaina (26%), che supera il metadone come positività
(9%). Gli oppiacei rappresentano invece solo il 4% dei
positivi.
Le analisi di conferma hanno convalidato la presenza
delle medesime classi di sostanze rilevate nello screening
con il 46% di cannabinoidi ed il 31% di benzoilecgonina,
metabolita della cocaina. In tutti i campioni risultati positivi
agli oppiacei è stata rilevata morfina (18%) e nel 3% anche
codeina.
In conclusione, esiste perfetta concordanza tra i risultati
ottenuti con lo screening e le analisi di conferma.
I cannabinoidi, sono nettamente la prima droga presente
nei campioni di urina analizzati negli ultimi 8 mesi, segue
la cocaina, che supera gli oppiacei come positività.
Da tutte le analisi effettuate si evince inoltre che la
poliassunzione è tipica solamente del gruppo di soggetti
non appartenenti al monitoraggio dei lavoratori impiegati
in particolari mansioni a rischio.
141
MATRICI BIOLOGICHE PER LA VERIFICA DI
ASSENZA STABILE DI USO DI SOSTANZE
STUPEFACENTI NEL RILASCIO E NELLA
CONFERMA DELLA PATENTE DI GUIDA
1
1
1
F. Svaizer , A. Lotti , M. Gottardi , M.P. Miozzo
1
Lab. Sanità Pubblica, APSS di Trento
142
A RAPID HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY-TANDEM MASS
SPECTROMETRY FOR THE SIMULTANEOUS
QUANTIFICATION OF SIROLIMUS AND
EVEROLIMUS IN HUMAN BLOOD SAMPLES
1
La disciplina sulle patenti di guida è contenuta negli
articoli del CdS.Particolare attenzione viene posta alla
verifica dell’idoneità alla guida in sicurezza,soprattutto
nei confronti dei soggetti che abbiano evidenziato
contatto con sostanze stupefacenti e dei giovani candidati
all’abilitazione alla guida.In base al disposto dell’art.320
del CdS,"la patente di guida non deve essere rilasciata
o confermata ai candidati o conducenti che si trovino in
stato di dipendenza attuale da sostanze stupefacenti,né
a persone che comunque consumino abitualmente
sostanze capaci di compromettere la loro idoneità a
guidare senza pericoli".L’accertamento dei requisiti,prima
del rilascio o per il rinnovo dopo sospensione,è effettuato
da Commissioni Medico Legali costituite presso le
USL territorialmente competenti.La CML ha facoltà
di predisporre un proprio protocollo per accertamenti
atti a documentare la situazione tossicologica del
soggetto:assenza di tossicodipendenza e assenza stabile
di uso di sostanze stupefacenti.
Le matrici utilizzate sono urina e capello.L’esperienza
maturata nel corso di oltre un decennio presso la
APSS di TN,sulla base di un protocollo che prevede
un esame su capello e otto esami su urina con
cadenza bisettimanale,consente di sostenere che esiste
sostanziale differenza nelle informazioni fornite dalle
due matrici,soprattutto per evidenziare l’allontanamento
stabile dall’uso di droghe.Il pannello di indagini prevede
ricerca di Opp,Coc,Amf,XTC,Met su capello e in più THC
in urina.
Analizzando i dati dal 2005 al 2009 per i parametri
ricercati,con esclusione di Met(e THC nel capello),si
osserva che per i 589 soggetti sottoposti ad accertamento
sono state eseguite le analisi su 589 campioni cheratinici
e su 4712 campioni urinari.In matrice cheratinica sono
state riscontrate 86 positività(14,6%)e in quella urinaria 34
positività(0,72%),che si elevano a 163(3,46%)includendo
i THC.Nel 2009 è stata inserita la ricerca di THC anche
nel capello e notiamo che globalmente i campioni positivi
in tale matrice sono stati il 36,55%, mentre in urina sono
stati il 4,48%.
Da questi dati si evince come gli esami condotti su matrice
cheratinica abbiano una capacità analitica maggiore
rispetto a quelli effettuati su urina e che quindi il
ricorso all’utilizzo di tale matrice favorisca una migliore
valutazione tossicologica dei soggetti.
1
1
1
1
C. Artusi , M. Ivanova , A. Liverani , G. Polo , M.
1
1
Zaninotto , M. Plebani
1
Dept. of Laboratory Medicine, University-Hospital,
Padova, Italy
Background: Therapeutic drug monitoring (TDM) of
immunosuppressants is critical to carrying out optimal
patient care after organ transplantation. In the past
few years, high performance liquid chromatography
coupled with tandem mass spectrometry (HPLC-MS/
MS) has evolved to a true alternative to antibody-based
immunoassays in routine TDM due to its high specificity
and sensitivity. Aim of the present study was to set up
a fast, robust, and high-throughput LC-MS/MS method
for the simultaneous determination of Sirolimus (SIR) and
Everolimus (EVE) in whole blood which enabled us to
replace immunoassays in routinary practice.
Materials and Methods: Six-level blood calibrators for
SIR (range 2.9–51.2 µg/L) and EVE (range 2.2–43.7
µg/L) were adopted for the assay development, while
three materials with different concentrations were used
for the internal quality control. Ascomycin was used as
an internal standard (IS). Sample preparation was based
on precipitation of 50 µL of sample using zinc sulphate
and methanol containing IS, followed by centrifugation.
HPLC analysis was performed on Agilent 1200 binary
system with a Agilent Zorbax XDB-C18 and a C18 guard
column maintained at 70 °C. The injection volume was
20 µL. Mobile phases A and B were methanol and water,
respectively, both containing 0.1% formic acid in 2 mmol/
L ammonium formate. Using appropriate gradient elution
profile and SPE on-line, elution times for all compounds
analyzed were 3.5 minutes. ESI–MS/MS (MRM) was done
on Agilent 6430 Triple Quadrupole Mass Spectrometer
with ESI source in positive ion mode. Ammoniated
adducts of molecules were used as precursor ions for all
analytes.
Results: Calibration curves were linear throughout the
selected ranges. The intra- and inter-assay CVs (<10%)
and the recovery (>90%) were highly satisfactory. The
functional analytical sensitivity was found to be 0.3
µg/L for EVE and SIR. A good performance in an
international proficiency testing scheme (UK NEQAS) has
been documented. In daily routine, of about 40 patient
samples, a typical total turnaround time is less than 2.5
hours.
Conclusions: The proposed validated method is simple,
rapid and accurate. Therefore, it is suitable for the
routinary use in clinical laboratories.
459
143
RALTREGRAVIR AND DARUNAVIR:
SIMULTANEOUS DETERMINATION IN HUMAN
PLASMA BY HIGH-PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY WITH FLUORESCENCE
DETECTION
1
2
2
1
A. Barassi , P. Villani , M. Cusato , R. Pacciolla , M.
2
1
Regazzi , G.V. Melzi d'Eril
1
Dept. of Medicine, Surgery and Dentistry, Univ. of
Milan, Milan
2
Lab. of Clinical Pharmacokinetics, Foundation IRCCS
Policlinico San Matteo, Pavia
Background. Raltegravir (RAL) belongs to the class
of drugs known as integrase inhibitors that suppress
HIV replication. Darunavir (DRV) is a protease inhibitor
used to treat HIV type-1 that is often administered in
combination with RAL. Our aim was to develop an
accurate and sensitive HPLC method with fluorescence
detection to quantify simultaneously plasma DRV and
RAL concentrations. Methods. The HPLC analysis
used a reverse-phase C18 column; a mobile phase
of acetonitrile and 0.01% TEA in water (pH=3). An
extraction with hexane/hethylacetate (1:1,v/v) procedure
was used to separate RAL, DRV and internal standard
from the plasma fractions in samples, standards and
quality controls. The organic layer was evaporated to
dryness, reconstituted with mobile phase and analyzed by
fluorescence detection (ex. 299 nm; em. 396 nm). The
standard curves are prepared using RAL and DRV added
to human free plasma to give plasma concentrations from
0.04 to 6.0 and from 0.2 to 20.0 mg/L for RAL and DRV,
respectively. Three quality control samples were prepared
for each curve by spiking plasma at concentrations of
0.12, 1.2 and 5.0 mg/L for RAL and 0.8, 1.6 and 6.0 mg/L
for DRV, respectively. Results. The linear regression data
for the calibration curves of RAL and DRV consistently
demonstrated coefficients of determination > 0.998 and
> 0.999, respectively. The limit of quantification was 0.02
and 0.2 mg/L for RAL and DRV, respectively. The interand intra-assay CVs of the quality control samples for both
drugs were always <10%. The assay was successfully
applied during routine TDM to evaluate plasma samples
from 20 experienced HIV+ outpatients treated with a
HAART regimen containing RAL, DRV and two NNRTIs
and/or TDF. The mean±SD [median] DRV and RAL
plasma concentration were 3.14±1.5 [2.72] mg/L and
0.25±0.53 [0.11] mg/L, respectively. Conclusions. The
proposed method is specific, precise, very cheap and
the limits of quantification are consistent with trough
plasma concentrations. Reference. Baroncelli S, et al. Ann
Pharmacother. 2010;44:838-43.
460
144
A PROPOSAL FOR SYSTEMATIC TOXICOLOGICAL
ANALYSIS OF NON–ALLOWED SUBSTANCES IN
SEIZED PHARMACEUTICALS AND COSMETICS
1
1
1
1
E. Marchei , M. Pellegrini , M.C. Rotolo , R. Pacifici , S.
1
Pichini
1
Dept. of Therapeutic Reserch and Medicine EvaluationIstituto Superiore di Sanità-Roma
Systematic toxicological analysis (STA) of non allowed
substances in pharmaceutical and cosmetic products,
sold through internet web sites or illegal circuits, is
an important tool to disclose the eventual presence of
pharmacologically active substances could be illegally
employed in these preparations. The first important point
is that the compounds that have to be looked for are often
unknown.
Whenever
in
analytical
chemistry
unknown
compounds
must
be
screened
and
reliably
identified,mass
spectrometric
techniques
with
hyphenated chromatographic systems are required. Gas
chromatography- mass spectrometry (GC-MS) is still the
gold standard for STA in all samples, combining the
separation power of GC with the high selectivity of electron
ionization MS, preceding the analytical step with some
form of isolation procedure to separate the drugs from the
matrix.
The “Drug abuse and doping” Unit of the National Institute
of Health in Rome has developed and validated a
methodology for analysis of non–allowed substances in
pharmaceutical and cosmetic products (drugs , drugs of
abuse, cosmetic products, doping agents) seized by the
Italian anti-adulteration and safety bureau (NAS).
These procedures can be separated into two distinct
types:
(a) liquid–liquid extraction, and (b) solid-phase extraction,
at a acid (pH=2,5) basic (pH=10-12) and neutral (pH=7)
pH.
The GC conditions were as follows: splitless injection
mode; 1 DB-MS capillary (30 m x0.25 mm x 0,25 µm .)
GC column; injection port temperature at 260 °C; helium
carrier gas flow-rate at 1 mL/min; column temperature
programmed from 100–290 °C at 30°/min, with an initial
time of 2 min and a final time of 5 min.
The MS conditions were as follows:
electron ionization mode; ionization energy at 70 eV; ion
source temperature at 220 °C; capillary direct interface at
280 °C; full-scan mode from m/z 50–to m/z 550, 1 scan/s.
An efficient toxicological analysis is the basis of
a competent toxicological judgment, consultation and
expertise.
Up to now, we analized 65 pharmaceutical products
(14,7%) , 30 cosmetic products (6,8%) and 168 (38%)
doping agent finding . Also we analized 72 hamp food
products (16,3%) , 6 dietary supplements containing Ma
Huang or/and Sida Cordifolia (1,3%) and 100 capsules of
various colors without labeling (22,6%)
145
LC-MS/MS ASSAY FOR THE SIMULTANEOUS
QUANTIFICATION OF LICIT AND ILLICIT DRUGS IN
BREAST MILK
1
1
1
146
TOSSICODIPENDENZA E LAVORO: L'ATTIVITA'
DEL LABORATORIO DI TOSSICOLOGIA
DELL'OSPEDALE DI DESIO
1
1
1
E. Marchei , M. Pellegrini , M.C. Rotolo , O. Garcia2
1
1
Algar , S. Pichini , R. Pacifici
1
Dept of Drug Research and Medicine Evaluation,
Istituto Superiore di Sanitá, Roma, Italy
2
Unitat de Recerca Infància i Entorn (URIE), Paediatric
Service, IMIM-Hospital del Mar, Barcelona, Spain
L. D'Amato , M. Brambilla , A. Szudlo , M.
1
2
1
1
Bertona , P.M. Gerthoux , P. Mocarelli , P. Brambilla
1
Dip. Universitario di Medicina di Laboratorio, Osp.di
Desio, Desio, Monza e Brianza
2
Lab. di Biochimica Clinica, Osp. di Vimercate,
Vimercate, Monza e Brianza
Breastfeeding is an essential physiologic process that
provides nutrition and protects a child against infection
and immunologic disorders. When drugs are administered
to a nursing mother, a small part of them may appear
in her milk. Most of the licit and illicit drugs consumed
by the breastfeeding woman pass into the milk and can
hypothetically have short- and long-term harmful effects
on the infant. The ability to predict the approximate
amount of drug that might be present in milk from the drug
structure would be very useful in the clinical setting.
We describe the development and validation of a
method for the quantification of licit (caffeine and
tobacco) and illicit drugs (opiates, cocaine, cannabinoids
and amphetamines), using liquid chromatography-mass
tandem spectrometry (LC-MS/MS). Chromatography was
performed on a C18 reversed-phase column using a
gradient of 2 mM ammonium acetate, pH 6.6 and
methanol as a mobile phase at a flow rate of 0.35 mL/
min. Separated analytes were determined by electrospray
ionization tandem mass spectrometry in the positive ion
mode using multiple reaction monitoring.
Milk samples were kept at -30 degrees C until analysis and
the analytes were extracted from the matrix by solid phase
extraction. Concentration range covered were 5-1000 ng/
mL for all drugs under investigation. Intra-assay and interassay imprecision were less than 15.7% for lower quality
control samples and less than 14.9% for medium and high
quality control samples. Recovery range was 36.2-83.7%.
Analytes were stable after three freeze-thaw cycles.
This method was applied to the analysis breast milk
from human milk banks from Barcelona, Spain, to
assess substance exposure in breast-fed infants in
relation to eventual clinical outcomes. Preliminary results
showed a prevalence of caffeine consumption (50%) and
tobacco use (30%). Cannabis consumption was detected
in 3% of samples. This LC/MS/MS assay provides
adequate sensitivity and performance characteristics for
the simultaneous quantification of biomarkers of licit and
illicit most commonly used worldwide.
Introduzione.
In attuazione del D.L.9/4/08 n.81 recante disposizioni
sulla sorveglianza sanitaria e della conferenza StatoRegioni del 18/09/2008, il laboratorio di Tossicologia
dell’ospedale di Desio ha effettuato dosaggi di screening e
di conferma in spettrometria di massa, per l’accertamento
di assunzione di sostanze stupefacenti/psicotrope in
lavoratori addetti a mansioni che comportano particolari
rischi per terzi.
Meteriali e Metodi.
Dal 1/1/09 al 31/3/10 sono state analizzate con test di
screening EMIT le urine di 8292 lavoratori e di 159 sono
stati eseguiti i test di conferma.
Su tutti i campioni veniva garantita la catena di custodia
con la tracciabilità di tutto il percorso.
Test di Screening:
Tecnologia Enzyme-Multiplied Immunoassay Technology
(EMIT).
Test di Conferma:
Gas Cromatografia accoppiata a Spettrometria di Massa,
Agilent HP 6890N, HP 5973 e Cromatografia Liquida
accoppiata a Spettrometria di Massa, Thermo LC-TSQ
Vantage.
Risultati.
Su 8292 campioni dosati nel nostro laboratorio con
tecnologia EMIT, 159 sono risultati positivi.
Le positività confermate sono state 148, il 93.1%. I falsi
positivi sono stati 11, il 6.9%.
Per un totale di 148 positivi ai test di conferma,
risulta che le sostanze più assunte sono state:
cannabinoidi(63.5%), cocaina(28.3%), morfina(3.4%),
buprenorfina(3.4%), metadone (1.4%). Nessuna positività
è stata riscontrata per le amfetamine.
Su 8292 campioni di urina è stato effettuato il dosaggio
della creatininuria. 63 campioni (0.76%) presentavano
creatinine urinarie <0.2 g/l. Questi campioni non sono stati
considerati idonei per l’analisi.
Conclusioni.
Dei lavoratori sottoposti a test di screening nel nostro
laboratorio, l’1.78% è risultato positivo ai test di conferma,
con assunzione prevalente di cannabinoidi.
Dai nostri dati risulta che i test di screening basati su
tecnologia EMIT presentano una buona specificità di
analisi, riducendo il numero di falsi positivi.
461
147
ROUTINE ASSESSMENT OF
IMMUNOSUPPRESSANT DRUG LEVELS THROUGH
LC-MS/MS
1
1
1
M. Isabello , F. Martinelli , S. Vitali , C.
1
1
1
1
Boccadoro , M.T. Barba , A. Nonnato , A. Caropreso
1
Clinical Biochemistry Laboratory, San Giovanni Battista
Hospital, Torino
Since November 2009, LC-MS/MS was adopted in our
laboratory for the routine assessment of three among
immunosuppressant drugs, Tacrolimus, Everolimus and
Syrolimus. First we compared results of the new method
(Waters Mass Trak System) with those obtained with
previously used immunochemical assays (ACMIA and
MEIA). Our results show a good correlation among
methods, except for unpredictable discrepancies in
Tacrolimus values between ACMIA and LC-MS/MS
occurring in some samples. Besides problems arising
from between-method variability, relevant aspects to
be considered concern the organization model for the
implementation of LC/MS-MS method in the laboratory
routine.
According to the novel approach, samples are processed
daily at three time intervals: those from in-hospital
divisions (a mean of 30 Tacrolimus and 5 each for
Everolimus and Syrolimus a day), between 7 and 10 am,
from ambulatorial patiens (30 Tacrolimus and 5 each for
Everolimus and Syrolimus a day) between 10 and 12 am,
and from other hospitals (20 Tacrolimus, 15 Everolimus
and 10 Syrolimus a day) between 1 and 3 pm. Overall, on
average 80 Tacrolimus, 25 Everolimus and 20 Syrolimus
are tested on a daily basis.
When taking into account TAT calculation, LC-MS/MS
routine could be managed by a single technician, even if
an higher workload has to be considered on Monday and
Friday, the main limitation being represented by specimen
pre-treatment procedures, requiring about 20 minutes for
each 20-sample batch of analysis. The choice of LC-MS/
MS as a routine approach is feasible even in a laboratory
with an high volume of tests. The availability of a second
instrument may serve as back-up and could provide the
tools to lower TAT and widening the panel of tests. A
team of five technicians have been trained so far to run
the instrument during the working days. In the near future
we are trying to involve more operators with the aim of
covering holidays also.
Immunosuppresant drug monitoring through LC-MS/MS is
an innovative step to optimize the management of patient
therapeutic regimen; it may help providing a better quality
of life for transplanted patients by reducing drug exposition
and minimizing toxicicity and side effects.
462
148
VALUTAZIONE DI DUE METODICHE ANALITICHE
PER LA DETERMINAZIONE DELL’EVEROLIMUS SU
SANGUE INTERO MEDIANTE LC-MS/MS E FPIA
1
1
1
1
A. Nonnato , A. Mussa , M. Isabello , S. Vitali , F.
1
1
1
Martinelli , C. Boccadoro , M.R. Adamo , M.
1
1
1
Vancheri , M.T. Barba , A. Caropreso
1
Lab. Baldi e Riberi, settore Farmaco-tossicologia,
A.O.U. San Giovanni Battista di Torino sede
MOLINETTE
Scopo. Nel presente lavoro vengono valutati il limite
inferiore di quantificazione, la linearità, la ripetibilità
e la riproducibilità di un metodo HPLC-MS/MS per
la quantificazione dell’Everolimus nel sangue intero e
comparati i risultati ottenuti tra la tecnica LC-MS/MS e la
tecnica FPIA su una popolazione di 170 pazienti per un
totale di 640 campioni provenienti da soggetti trapiantati
di rene, fegato, cuore e midollo.
Introduzione. I recenti studi farmacologici hanno portato
alla scoperta di nuove molecole antirigetto tra cui
l’Everolimus, oggetto del nostro studio. A causa del
ristretto range terapeutico diviene fondamentale il suo
monitoraggio. Il dato analitico da fornire al clinico deve
essere accurato e preciso per evitare sottodosaggi o
sovradosaggi. A questo scopo sono stati sviluppati
metodi analitici appropriati essenzialmente di tipo
immunochimico (FPIA) e di tipo cromatografico (LC-MS/
MS).
Materiali e Metodi. Il presente lavoro è stato realizzato
utilizzando il kit XE RUO della Waters su HPLC WATERS
2695 e spettrometro di massa QUATTRO MICROTM API
®
Waters ed il kit diagnostico INNOFLUOR CERTICAN
®
®
della Seradyn su strumentazione TDx .
Risultati. Per il metodo LC-MS/MS il limite di
quantificazione (LOQ) è stato posto pari a 1.0 µg/L con un
CV% ≤ 15%; la linearità tra 1,0 e 25,9 µg/L; la ripetibilità
intraserie, 20 prove condotte su 3 pool contenenti tra 2 –
3, 4 – 6 e 7 – 10 µg/L hanno dato rispettivamente un CV%
di 10.1, 6.7 e 7.3 %. Le 14 prove interserie (riprod.) hanno
dato un CV% di 9.7, 9.2 e 7.7 %. La correlazione secondo
Passing Bablok fornisce l’equazione [Ev-FPIA] = 1.5[EvLCMS] – 1.0. La differenza media delle concentrazioni tra
i due metodi, secondo Bland Altman, è di 1,5 µg/L con un
bias pari al 23.9 %.
Discussione e Conclusione. I risultati evidenziano una
maggiore sensibilità e specificità della LC-MS/MS rispetto
alla tecnica FPIA. Inoltre il metodo FPIA sovrastima
l’Everolimus per valori > di 2.0 µg/L a causa della
cross-reattività che dipende dalla scarsa specificità
dell’anticorpo monoclonale utilizzato. La tecnologia LCMS/MS diventa perciò un importante supporto analitico
per una determinazione più accurata e routinaria
dell’Everolimus.
Bibliografia.
Streit F., Armstrong V.W., Oellerich M., et al. Clin Chem
2002; 48(6):955-8.
149
IL MONITORAGGIO TERAPEUTICO DEL SIROLIMUS
SU SANGUE INTERO: CONFRONTO TRA IL
METODO ANALITICO HPLC-MS/MS ED IL METODO
MEIA
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Vancheri , M.T. Barba , F. Ranieri , A. Caropreso
1
Lab. Baldi e Riberi - settore Farmaco-tossicologia
- A.O.U. San Giovanni Battista di Torino - sede
MOLINETTE
®
Waters ed il kit diagnostico SIROLIMUS della Abbott su
®
LC-MS/MS
il
limite
1
1
1
I. Pavan , L. Marchioro , A. Daniele , L. D'Aprile , M.
1
Plebani
1
Dip. di Medicina di Laboratorio, Ospedale-Università,
Padova
Scopo. Lo studio valuta il limite inferiore di quantificazione,
la linearità, la ripetibilità e la riproducibilità di un metodo
LC-MS/MS per la quantificazione del Sirolimus nel sangue
intero e comparati i risultati ottenuti tra la tecnica LC-MS/
MS e la tecnica MEIA su una popolazione di 141 pazienti
per un totale di 411 campioni provenienti da soggetti
variamente trapiantati.
Introduzione. Il Sirolimus, o rapamicina, è un lattone
macrociclico prodotto dallo Streptomyces Hygroscopicus
inizialmente utilizzato per le malattie dermatologiche
e poi utilizzato anche come immunosoppressore. Il
dato analitico da refertare deve essere accurato e
preciso per evitare sottodosaggi o sovradosaggi, poichè
il range terapeutico è particolarmente ristretto. A questo
scopo sono stati sviluppati metodi analitici appropriati
essenzialmente di tipo immunochimico (MEIA) e di tipo
cromatografico (LC-MS/MS).
Materiali e Metodi. Il presente lavoro è stato realizzato
utilizzando il kit XE RUO della Waters su HPLC WATERS
2695 e spettrometro di massa QUATTRO MICROTM API
strumentazione IMx .
Risultati. Per il metodo
150
DETERMINAZIONE IMMUNOENZIMATICA DELLA 6MONOACETILMORFINA URINARIA: VALUTAZIONE
DELLA SUA UTILITÀ DIAGNOSTICA COME
INDICATORE DI ASSUNZIONE DI EROINA
di
quantificazione (LOQ) è stato posto pari a 1.5 µg/L con un
CV% ≤ 20%; la linearità tra 1,5 e 24.3 µg/L; la ripetibilità
intraserie, 20 prove condotte su 2 pool contenenti tra 9 –
10, 20 – 21 µg/L hanno dato rispettivamente un CV% di
10.3, 8.6 %. Le 38 prove interserie (riprod.) condotte su 2
pool contenenti tra 5 – 6, 9 – 10 µg/L hanno dato un CV%
di 16.0, 11.2 %. La correlazione secondo Passing Bablok
fornisce l’equazione [Ev-MEIA] = 1.12[Ev-LCMS] – 1.45.
La differenza media delle concentrazioni tra i due metodi,
secondo Bland Altman, è di 1,12 µg/L con un bias pari al
14.0 %.
Discussione e Conclusione. I risultati evidenziano una
maggiore sensibilità e specificità della LC-MS/MS rispetto
alla tecnica FPIA. Inoltre il metodo FPIA sovrastima
il Sirolimus per valori > di 1.3 µg/L a causa della
cross-reattività che dipende dalla scarsa specificità
dell’anticorpo monoclonale utilizzato. La tecnologia LCMS/MS diventa perciò un importante supporto analitico
per una determinazione più accurata e routinaria del
Sirolimus.
Bibliografia.
Kahan BD, Keown P. Levy G A, Johnson A. Clin Ther
2002, n.24, pagg 330-50.
Una sfida quotidiana alla quale si sottopongono i
laboratori che eseguono test di screening per le sostanze
d’abuso è la determinazione dell’eventuale assunzione
di eroina. Come è noto, i test immunometrici sono
soggetti a dare risultati falsi positivi in quanto tutte le
sostanze oppioidi, anche quelle non derivanti dall’eroina,
vengono convertite a morfina. Dopo l’assunzione, l'eroina
è rapidamente metabolizzata e trasformata in morfina e
6-monoacetilmorfina (6-AM). Quest’ultima viene in parte
metabolizzata in morfina e in parte escreta non modificata
(circa 1%) con le urine.
La presenza di 6-AM indica inequivocabilmente l’avvenuta
assunzione di eroina nelle ultime 24 ore, mentre è noto
che la presenza di morfina potrebbe indicare l’assunzione
di preparati farmacologici antitosse a base di codeina. La
codeina, infatti, viene demetilata a morfina da parte del
citocromo P450 2D6.
Alla luce della recente introduzione nel mercato di un
kit diagnostico per la 6-AM, si è voluto rivalutare la
determinazione di questo metabolita pur consapevoli della
sua ridotta emivita (30’ circa, con una finestra di rilevabilità
di 2-8 h).
Allo scopo sono stati selezionati 226 campioni
di urina positivi per gli oppiacei applicando, su
strumentazione Cobas 6000 v. c510, la metodologia
CEDIA® (Microgenics).
223-255037 µg/L è il range di concentrazione di oppiacei
riscontrato nei campioni, mentre per la 6-AM il range
rilevato è stato: 0-27 ng/mL. Solamente il 44% dei
campioni è risultato positivo per la 6-AM nonostante il 93%
delle concentrazioni di oppiacei fosse di molto superiore
al cut-off di 300 µg/L.
I risultati ottenuti mostrano come non sia scontato trovare
una corrispondenza tra la concentrazione di oppiacei e
6-AM. Il test 6-AM è lineare solamente entro la curva
di calibrazione: l’estrapolazione strumentale non fornisce
informazioni utili o orientative sulla concentrazione reale
di metabolita, al contrario di quanto accade invece per gli
oppiacei.
La ridotta finestra di rilevabilità della 6-AM, anche per
elevate dosi di oppiacei, ne limita l’efficacia e l’utilità
diagnostica nella determinazione dell’uso illecito di eroina.
(Bibliografia: “Disposition of Toxic Drugs and Chemicals
in Man”, 7th ed., Baselt R.C. et al. Chemical Toxicology
Institute, 2005)
463
151
VALUTAZIONE DI UN METODO CON TECNOLOGIA
BIOCHIP VERSUS IL METODO DI RIFERMENTO
IMMUNOMETRICO PER LA DIAGNOSTICA
TOSSICOLOGICA SU URINE IN URGENZA
1
1
1
1
S. Mazzolini , G. Barbina , A. Colatutto , R. Zaglia , L.
1
1
1
1
1
Isola , N. Pradal , A. Lerussi , B. Marcon , P. Sala
1
Lab. Analisi d’Elezione A.O.U. S. Maria della
Misericordia Udine
Introduzione: Negli ultimi anni la richiesta di
determinazioni di droghe d’abuso su matrice urinaria
ha subito un incremento esponenziale, determinando
un aumento del carico di lavoro per i laboratori che si
occupano di tossicologia di 1° e 2° livello. La necessità
di fornire referti con ricaduta di natura medico-legale in
tempi ragionevolmente rapidi ha spinto le case produttrici
a sviluppare nuove metodiche.
Scopo del lavoro: Abbiamo preso in considerazione un
metodo innovativo che sfrutta il sistema di Biochip Array
Technology (Evidence Investigator Randox Laboratories)
vs il metodo immunometrico DRI in uso nel nostro Istituto,
(ILab 650 Instrumentation Laboratory).
Materiali e metodi: Nei mesi di novembre/dicembre 2009
abbiamo analizzato 57 campioni di urine di soggetti
afferenti alla Sezione di Tossicologia, positivi verso
differenti specificità. I campioni sono stati processati con
ILab-650 e contemporaneamente con il sistema Biochip
Array. Tutti i campioni di urina sono stati sottoposti a
conferma con metodo gas cromatografico con rilevazione
a spettrometria di massa. (Varian 4000 GC/MS/MS).
Risultati: I risultati della ricerca degli Oppiacei, delle
Amfetamine e della Cocaina sono sovrapponibili con
i 2 metodi presi in considerazione (Sensibilità: 1,00
Specificità: 0,91) mentre per i Cannabinoidi si è
evidenziata una discrepanza tra le due metodiche di
difficile interpretazione anche per la bassa numerosità
dei campioni e ciò non ha consentito un’analisi statistica
affidabile.
Discussione e conclusioni: Dall’analisi dei nostri dati,
pur tenendo conto della citata bassa numerosità del
campione, emerge una lieve superiorità del metodo DRI
immunometrico vs il metodo Biochip Array in termini di
operatività e facilità d’interpretazione dei risultati. Inoltre
va rilevata la maggior sensibilità del metodo DRI che
consente di operare in sicurezza nei laboratori che
effettuano lo screening tossicologico. Non si esclude
peraltro che il metodo Biopchip Array possa avere uno
sviluppo per la diagnostica su matrici alternative quali
saliva, sudore e capello consentendo l’acquisizione di
risultati semiquantitativi.
464
152
DETERMINAZIONE DEI LIVELLI PLASMATICI DI
FLECAINIDE, PROPAFENONE, VERAPAMILE
1
1
1
1
P. Pigini , A. Calcinari , A.M. Gambini , S. Marinelli , G.
1
1
Scarpini , M. Tocchini
1
Lab.Analisi, A.O.U. Ospedali Riuniti, Ancona
La Flecainide e il Propafenone appartengono al gruppo
di farmaci antiaritmici di classe I,che agiscono bloccando
i canali del sodio sensibili al voltaggio. La Flecainide
ha biodisponibilità elevata. Le concentrazioni plasmatiche
ottimali sono comprese tra 0,2-0,4mcg/ml.Il suo effetto
proaritmico a concentrazioni plasmatiche maggiori di
1,5mcg/ml ne rendono necessario il monitoraggio.
Il
Propafenone
presenta
spiccate
variazioni
interindividuali nel metabolismo;inoltre le sue proprietà
farmacocinetiche e farmacodinamiche possono essere
modificate da concomitante somministrazione di induttori
enzimatici e la sua affinità alle proteine plasmatiche
potrebbe dar luogo ad interazioni per spiazzamento di
legame.
Il Verapamile appartiene agli antiaritmici di classe IV ed è
un bloccante dei canali del calcio.
Il farmaco,in seguito a somministrazione orale,è
assorbito quasi completamente,ma viene estesamente
metabolizzato al “primo passaggio”attraverso il fegato.
I pazienti da noi monitorati sono prevalentemente
bambini in terapia intensiva e pazienti sottoposti a
trapianto d’organo;si è quindi provveduto a mettere a
punto un metodo idoneo a rispondere alle esigenze
di rapidità,sensibilità e accuratezza di esecuzione. Il
metodo da noi studiato prevede la determinazione
contemporanea dei tre farmaci dopo estrazione in SPE
(colonnine CN) dalla matrice plasmatica.
L’analisi è condotta in HPLC utilizzando una
colonna analitica CN,5µm,4,6x250mm alle seguenti
condizioni:fase mobile costituita da 700ml di tampone
fosfato 12mM(pH3), 200ml di acetonitrile,100ml di
metanolo; flusso 1ml/min. L’eluato è monitorato a 215nm.
Per ogni analita sono stati determinati rispettivamente
gli intervalli di linearità,i limiti di sensibilità(CV%<5%),il
recupero medio % e la precisione valutata in 15 serie di
determinazioni a 0,1-0,25-0,5mcg/ml:
FLECAINIDE:0.04-10mcg/ml(R2=0.999);0.02mcg/
ml;105%;CV:3.9%,1.4%,2%
PROPAFENONE:0.03-10mcg/ml(R2=0.999);0.01mcg/
ml;99%;CV:4.4%,3.9%,1.7%
VERAPAMILE:0.04-10mcg/ml(R2=0.999);
0.03mcg/
ml;110%;CV:2.9%,2.4%,0.9%
Il metodo descritto è sensibile ,accurato e la possibilità
di determinare con un’unica estrazione e corsa
cromatografica i tre analiti lo rende idoneo a soddisfare le
esigenze della routine
Riferimento:Wilson K.M.et al.Therapeutic Drug Monitoring
20:435-438,1998
153
FALSI VALORI ELEVATI DI FK506 UTILIZZANDO LA
METODICA ACMIA: COME RICONOSCERLI E COME
RISOLVERLI
1
2
M. Tempestilli , U. Visco Comandini , M.D.
3
3
1
D'alessandro , A. Bachetoni , L.P. Pucillo
1
Lab.di Biochimica Clinica e Farmacologia, I.N.M.I
“L.Spallazani”, Roma.
2
U.O.S. Trapianti, I.N.M.I “L.Spallazani” Roma.
3
U.O.C. Patologia Clinica Generale e dei Trapianti,
Policl. Umberto I, Roma.
Introduzione:il Tacrolimus (FK506)è un potente
immunosoppressore utilizzato per evitare il rigetto in
pazienti sottoposti a trapianto d’organo. La finestra
terapeutica del farmaco è molto ristretta richiedendo
un continuo monitoraggio delle concentrazioni ematiche.
Gli effetti tossici del FK506 sono stati correlati alle
concentrazioni ottenute sulle emazie poiché la quantità
di farmaco presente negli eritrociti è circa l’80-90% del
totale. Oltre spettrometria di massa (gold standard), sono
stati sviluppati metodi automatizzati per il dosaggio del
FK506 in MEIA e ACMIA.
Descrizione del caso:qui riportiamo il caso di un uomo
di 48 anni trapiantato di fegato nel 2006 in terapia con
FK506, con valori stabili nel range terapeutico(4-20ng/
mL)che,utilizzando il metodo ACMIA, nel dicembre 2009
ha presentato un improvviso picco della concentrazione
del farmaco a 105ng/mL e confermato da prelievi
successivi, senza alcuna manifestazione clinica di
tossicità e valori ematochimici normali. Allo scopo di
verificare la presenza di una possibile interferenza
del metodo con fattori plasmatici il dosaggio del
FK506 è stato eseguito utilizzando il metodo ACMIA
su plasma(191ng/mL) e su emazie lavate(12.7ng/mL)e
MEIA su sangue intero(6.4ng/mL).I risultati dimostrano
la presenza di un interferente plasmatico.Inoltre, tale
interferenza con il metodo ACMIA è stata confermata
da valori di ciclosporina(232ng/mL), mai assunta dal
paziente.Il metodo ACMIA rispetto al MEIA ha mostrato
una sostanziale concordanza sulle emazie lavate quando
è stata applicata la formula:FK506 su emazie lavate X
HT/100.
Conclusioni:la metodica ACMIA è riproducibile e
automatizzata, ma non deve essere sottovalutata la
possibilità di interferenze da fattori plasmatici. Il dosaggio
differenziato su plasma ed emazie lavate permette di
evidenziare tale anomalia. Per ottenere valori accurati
in pazienti critici, è necessario utilizzare altri metodi che
non risentono della presenza di interferenti(HPLC-MS,
MEIA), alternativamente è possibile utilizzare una formula
correttiva delle concentrazioni nelle emazie lavate.
Hermida J, Tutor JC. Falsely increased blood tacrolimus
concentrations using the ACMIA assay due to circulating
endogenous antibodies in a liver transplant recipient:a
tentative approach to obtaining reliable results. Ther Drug
Monit.2009 Apr;31:269-72.
154
COMPARAZIONE TRA METODO DI SCREENING
E DI CONFERMA NELLA DETERMINAZIONE DI
SOSTANZE D'ABUSO SU URINE
1
1
1
M.L. Capuano , R. Colelli , C. Di Dio , L.
1
1
1
1
Lombardelli , A. Cundari , A. Neri , R. Carrozza
1
Lab. Analisi Cliniche e Microbiologiche Osp. Viterbo
Scopo. Questo lavoro ha lo scopo di valutare la validità
e l’efficacia delle tecniche utilizzate in laboratorio per il
dosaggio di sostanze d’abuso quali oppiacei, cocaina
e cannabinoidi. Per la determinazione di questi analiti
su campioni di urina a scopo medico legale, le linee
guida dell’ ISS sostengono la necessità di effettuare
analisi di screening di primo livello attraverso metodiche
immunochimiche e analisi di conferma utilizzando
tecniche cromatografiche che risultano essere specifiche
e selettive per singole sostanze.
Materiali e metodi. Nel lavoro come test immunochimico
è stata utilizzata una metodica semi-quantitativa FPIA
della Axsym ditta Abbott Laboratories. Come test di
conferma è stata utilizzata la metodica GC-MS tramite
apparecchiatura Clarus 500 della Perkin-elmer. Durante
l’esecuzione del test iniziale sono stai esaminati tutti i livelli
di concentrazione vicini al cut-off fino ad oltre il limite.
Questo vuol dire che sono stati considerati solo i risultati
positivi prodotti dal test di screening in quanto sono quei
valori che devono essere sottoposti a test di conferma per
valutare la reale positività del dato ottenuto.
Risultati. Nel 2009, anno di sperimentazione della
procedura, dei 50 campioni presi in considerazione 18
sono risultati positivi al test FPIA per gli oppiacei e
confermati al 100% in GC-MS; 17 risultati positivi per la
cocaina al test immunochimico sono stati confermati al
100% in GC-MS; gli unici valori che risultano discordanti
tra le tecniche utilizzate sono quelli relativi alla ricerca
dei cannabinoidi perché dei 15 campioni risultati positivi
in Axsym solo 10 sono confermati in GC-MS con una
concordanza del 67% tra le metodiche utilizzate.
Conclusioni. Si può concludere che la tecnica GC-MS
utilizzata per la conferma si è rivelata estremamente
valida e versatile. Si è ottenuta una concordanza quasi
unanime tra la tecnica di conferma e la metodica FPIA
nella ricerca dei metaboliti della cocaina e degli oppiacei.
Unica difficoltà rimane la determinazione dei cannabinoidi
in particolare vicino al cut-off.
Bibliografia:Zuccaro, Pichini, Altieri, Pacifici Proposta di
linee guida per l’analisi delle sostanze d’abuso nei liquidi
biologici, Rapporti ISTISAN 99/24
465
155
IODURIA – VALUTAZIONE DELL’ESCREZIONE
URINARIA DI IODIO IN ALUNNI DI SCUOLA
SECONDARIA DI PRIMO GRADO DELLA PROVINCIA
DI BRINDISI
156
VALUTAZIONE DEI RISULTATI DI UN ANNO DI
ANALISI DI ETANOLO E SOSTANZE D'ABUSO IN
LIQUIDI BIOLOGI
1
1
1
1
1
1
M. Scoditti , T. Voi , A. Sanasi , P. Robert , S. Lofino
1
Lab. di Patologia Clinica Distrettuale e Tossicologia P.O
"A. Di Summa"
L’importanza dello iodio per l’uomo si deve al ruolo
fondamentale che tale oligoelemento svolge nella sintesi
degli ormoni tiroidei,intervenendo così in tutti i processi
metabolici in cui essi sono coinvolti. Senza dubbio la
disponibilità di iodio dovrebbe essere maggiore nelle aree
costiere,ed è questo il punto di partenza del nostro lavoro.
La ioduria è stata misurata su urine del mattino raccolte
da 250 alunni di diverse scuole secondarie di primo grado
della provincia di Brindisi nel bimestre aprile-maggio 2010.
Per l’analisi è stato utilizzato un metodo colorimetrico
della Celltech® il quale effettua una stima quantitativa
espressa in µg/dl della concentrazione urinaria di iodio
basato sulla reazione di Sandell-Kolthoff. Lo iodio infatti,
risulta essere catalizzatore di una reazione di ossidoriduzione in cui uno ione cerico di colore giallo viene ridotto
a ione ceroso praticamente incolore,parallelamente
all’ossidazione dello ione arsenioso a ione arsenico.Pur
essendo una metodica molto sensibile, la determinazione
della ioduria presenta alcune problematiche: le urine
contengono grosse quantità di sostanze interferenti con
la reazione di ossido-riduzione (nitrati,tiocianati e ioni
ferrosi) ed è per questo che i campioni vengono pre-trattati
ed in seguito incubati per 90 minuti a 105 °C per inibire tali
interferenti. Terminato il tempo di incubazione si procede
con la valutazione colorimetrica.
Nel nostro studio i risultati ottenuti sono i seguenti:107
dei campioni esaminati presentavano una normoioduria
(valori normali 16-30 ug/dl),78 mostravano una
concentrazione di lieve ipoioduria(lieve carenza 8-15
ug/dl),24 una iperioduria(iperioduria >30 ug/dl)e 41
presentavano una grave carenza di iodio(grave carenza
<8 ug/dl).
Possiamo per tanto affermare che nonostante lo studio
sia stato effettuato in una zona costiera, la percentuale
di bambini presentanti una lieve/grave carenza di iodio
all’interno delle urine risulti significativa.
World Health Organization. United Nations Children’s
Fund & International Council for the Control of
Iodine Deficiency Disorders.Assessment of iodine
deficiency disorders and monitoring their elimination. 2nd
ed.Geneva, Switzerland: WHO; 2007.
Trimboli T, Marchioni E. Le malattie da deficit dell’apporto
iodico e le metodiche di determinazione della ioduria.
RIMeL/IJLaM 2009.
466
1
1
M.L. Capuano , M. Fabretti , G. Ranungolo , A.
1
1
1
Cundari , A. Neri , R. Carrozza
1
Lab. Analisi Cliniche e Microbiologiche Osp. Viterbo
Scopo del presente lavoro è quello di valutare
l’andamento dei risultati di etanolemie e sostanze d’abuso
(oppiacei, cannabinoidi e cocaina) dei campioni richiesti
dall’Autorità Giudiziaria attraverso il Pronto Soccorso
delle ASL di Viterbo, secondo quanto definito dalla
normativa vigente, permettendoci di avere un’indicazione
della situazione locale, attraverso il monitoraggio della
popolazione e le situazioni a rischio.
Materiali e Metodi. La determinazione dell’etanolemia
viene eseguita su campioni di sangue intero, prelevato
secondo il protocollo specifico, con GC CLARUS 500
Pelkin Elmer, munito di spazio di testa TURBOMATRIX 40
e rivelatore a ionizzazione di fiamma. La matrice utilizzata
per la ricerca delle sostanze d’abuso è l’urina. I test di
‘screening’ iniziali sono stati effettuati tramite analizzatore
AxSYM per dosaggi immunologici a fluorescenza a luce
polarizzata (FPIA Abbott). Nel caso di positività ad una
classe di sostanze risulta necessario, per poter agire ai fini
legislativi, avere un riscontro con un metodo di conferma
in grado di identificare in maniera inequivocabile gli analiti
in esame e di ottenere dati quantitativi con un livello di
confidenza ben definito. Il test di secondo livello per le
sostanze d’abuso è la gas-cromatografia con rilevatore di
massa e lo strumento è il GC-MS CLARUS 500 Pelkin
Elmer.
Risultati. Nel periodo compreso tra il 1/4/2009 e il 1/4/2010
sono pervenuti nel nostro laboratorio 177 campioni per la
ricerca di etanolemie di cui 51 superiori a 0.5 g/l (29%),
dei positivi il 18% con un valore compreso tra 0.5 e 1 g/l,
il 61% tra 1 e 2 g/l e 21% maggiori di 2 g/l. I test analizzati
per la determinazione delle sostanze d’abuso sono stati
357 di cui il 12% positivo . Di questi il 12% positivi per
cocaina, il 58% per cannabinoidi e il 30% per oppiacei.
Conclusioni. Dall’analisi dei campioni positivi alle
alcolemie il 78% sono maschi. Per le sostanze d’abuso
si è verificata una positività maggiore per i cannabinoidi
seguita dagli oppiacei e cocaina con una poliassunzione
del 2.5%. La procedura adottata nel nostro laboratorio
garantisce l’affidabilità del dato dal punto di vista medico
legale.
Bibliografia. Bertol E., Mari F., Lodi F., Marozzi E., Trattato
di tossicologia Forense, Ed. Cedam, Firenze 2000.
157
L'ETANOLO NON HA ETÀ?
1
1
1
1
A. D'Andrea , G. D'Amico , L. Leotta , R. La Brasca , A.
1
1
1
1
Mastrone , A. Salomone , M. Vincenti , R.A. Salvo
1
Centro Regionale Antidoping, Orbassano (TO)
Il modo in cui si beve è radicalmente cambiato da un
consumo di tipo mediterraneo a comportamenti a rischio
(abuso e binge drinking). Recentemente alcuni autori
hanno annoverato tra gli indicatori di uso/abuso di etanolo
la valutazione della percentuale di soggetti che risultano
positivi ai test per la ricerca di etanolo ai sensi dell’art. 186
del CdS.
Lo scopo del lavoro è valutare l’incidenza dell’uso/
abuso di etanolo negli automobilisti di Torino e provincia
stratificando i risultati per età e/o sesso. Le fasce d’età
considerate sono: inferiore ai 24 (A), 25-35 (B), 36-46 (C),
47-57 (D), maggiore ai 58 anni (E). Lo studio ha, inoltre,
voluto indagare per i 5 gruppi se esistevano differenze
significative anche nell’etanolemia. I campioni positivi
allo screening eseguito con principio enzimatico sono
stati sottoposti a conferma con HS-GC-MS. Sono stati
analizzati 992 campioni (761 maschi; 229 femmine) per
un periodo di un anno. I risultati ottenuti nei 5 gruppi hanno
messo in luce che non esistono differenze significative
nell’incidenza di positività tra i diversi gruppi con una
percentuale media del 21.1 ± 2.6. La percentuale più
alta di soggetti positivi è stata riscontrata nel gruppo D
(23,9%) e più bassa nel gruppo E (17,1%). Considerando
i risultati ottenuti nei due sessi si evidenzia, invece, una
differenza significativa (incidenza di positività nei maschi
28% contro 9,6% delle femmine). I dati riscontrati sono
leggermente superiori ai risultati ottenuti da uno studio
epidemiologico del 2008 (Osservatorio Nazionale Alcol
CNESPS) che aveva individuato un’incidenza del 26,4%
nei maschi e del 7,8% nelle femmine. Stratificando i
risultati per sesso ed età si riscontra che, mentre per le
femmine non esiste nessuna differenza fra i 5 gruppi per i
maschi è possibile evidenziare una differenza significativa
fra il gruppo D (33%) e il gruppo E (18,9%). La valutazione
dell’etanolemia ha dato i seguenti risultati: A: 1,61 ±0,54;
B: 1,75±0,85; C: 1,99±0,80; D: 2,15±0,85; E: 2,10±0,85.
Si evidenzia una differenza significativa tra A e C,D,E. Dai
dati risulta i fattori di rischio sono il sesso maschile e l’età
fra i 47-57 anni.
158
SVILUPPO DI UN METODO IN LC/MS/MS PER LA
DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE
PLASMATICA DI SORAFENIB
1
1
1
1
M. Vidali , M. Bagnati , M. Albertario , N. Atzeni , D.
1
1
1
2
Scarano , V. Castellina , G. Muscarello , I. Viano , D.
2
1
Colangelo , G. Bellomo
1
2
Lab. di Farmacologia, Univ. del Piemonte Orientale
“Amedeo Avogadro”, Novara
Introduzione e scopo. Il sorafenib è un inibitore
multichinasi utilizzato nel trattamento del carcinoma
epatocellulare e renale. La somministrazione orale
per periodi prolungati, tipica di questi nuovi farmaci
chemioterapici, la grande variabilità interindividuale,
l’influenza di fattori ambientali, il rischio di tossicità,
in particolare nei pazienti con alterazioni epatiche e
renali ed i costi rendono indispensabile il monitoraggio
della concentrazione plasmatica del farmaco, utile nella
definizione di protocolli terapeutici personalizzati.
Materiali e metodi. 50µl di plasma, diluiti con 100µl di una
soluzione acqua:acetonitrile (60:40) contenente 500ng/ml
di standard interno ([2H3, 15N] sorafenib tosilato), sono
miscelati con 700µl di acetonitrile. Dopo centrifugazione a
10800 rpm per 10 min, l’analisi cromatografica è eseguita
mediante HPLC Agilent 1290 Infinity LC (colonna: Zorbax
Eclipse XDB-C18, 2.1mm x 50mm, 1.8µm; fase mobile:
formiato d’ammonio 5mM + acido formico 0,01% in
acqua (tampone A) e acido formico 0,01% in acetonitrile
(tampone B); gradiente: 50% B per 2 min, 50-90% B
in 1 min, 90% B per 1 min, 80-50% B in 0,1 min,
post-time 2 min; temperatura 50°C, flusso 0.35ml/min,
volume iniezione 0.5µl). L’eluente è monitorato mediante
un triplo-quadrupolo Agilent 6410 (ionizzazione ESI+ con
delta EMV 400V; transizione sorafenib: 465.1>252.1;
transizione SI: 469.1>256; fragmentor 130; CE 34).
Risultati. Il recupero e la ripetibilità stretta a 50, 500 e
5000ng/ml erano rispettivamente 99.9%, 95.3%, 93.7%
e 5.8%, 1.1% e 1.8%. La curva di calibrazione (24 punti
indipendenti: 8 livelli con 3 replicati) era lineare tra 50 e
10000ng/ml (pesata 1/x; R2=0,9998) con LOQ (CV<6%) a
50ng/ml. Nessun picco interferente è stato evidenziato nel
plasma di campioni bianchi. L’analisi ha evidenziato livelli
comparabili di SI lungo tutto l’intervallo di concentrazione
(area picco SI: media 3617, sd 89).
Conclusioni. Il metodo presentato risulta essere veloce
e facilmente applicabile nel monitoraggio terapeutico di
pazienti con somministrazione continuativa di sorafenib.
Bibliografia: Haouala E. et al. J Chromatogr B 2009;
877(22):1982-96
467
159
ANALISI QUANTITATIVA DI CONFERMA CON LC/
MS/MS DI DROGHE D’ABUSO NEL PLASMA
1
1
1
1
M. Bagnati , M. Vidali , M. Albertario , D. Scarano , N.
1
1
1
1
Atzeni , C. Luna , G. Muscarello , G. Bellomo
1
Ad oggi, la maggior parte dei test di screening e di
conferma per droghe d’abuso con valenza giudiziaria
sono effettuati su matrice urinaria. Tuttavia, la diagnosi
di attualità d’uso di sostanze illecite, e la conseguente
applicazione di sanzioni amministrative o penali, richiede
la dimostrazione dei metaboliti attivi della sostanza
nel sangue del soggetto in esame. A questo scopo
il laboratorio ha sviluppato un metodo quantitativo di
conferma in LC/MS/MS su matrice plasmatica.
Cannabinoidi (THC e THC-COOH): 500µl di plasma
sono miscelati con 20µl di THC-COOH-d3 500ng/ml in
metanolo, 1ml di acqua e 200µl di ac. acetico 10%.
Dopo l’aggiunta di 5ml di esano:acetato di etile (90:10),
agitazione e centrifugazione, 3ml del surnatante sono
evaporati a 55°C e ripresi con 300µl di acqua:acetonitrile
(1:1).
Oppiacei (morfina, codeina, 6-MAM) e cocaina (cocaina,
BEG): 500µl di plasma sono miscelati con 50µl di
morfina-d3 o BEG-d3 500ng/ml in acqua e 400µl di
acetonitrile. Dopo SPE il campione evaporato viene
ripreso inizialmente con 200µl di acetonitrile:tampone A
(formiato d’ammonio 5mM, acido formico 0.01% in acqua)
(1:9), e successivamente con 200µl di tampone A.
L’analisi cromatografica in gradiente è eseguita mediante
HPLC Agilent 1290 Infinity LC (colonna: Zorbax Eclipse
XDB-C18, 2.1mm x 50mm, 1.8µm; fase mobile: tampone
A e tampone B (acido formico 0,01% in acetonitrile);
temperatura 50°C, flusso 0.35ml/min, volume iniezione
5µl). L’eluato è monitorato mediante un triplo-quadrupolo
Agilent 6410 in modalità ESI. Le curve di calibrazione
per cannabinoidi o oppiacei/cocaina sono state costruite
utilizzando rispettivamente 18 (6 livelli con 3 replicati) e 24
punti indipendenti (8 livelli con 3 replicati).
Gli intervalli di linearità (ng/ml) del metodo sono: THC
(1-50, r2=0.991), THC-COOH (1-50, r2=0.998), morfina
(1-500, r2=0.999), codeina (1-500, r2=0.998), 6-MAM
(1-500, r2=0.998), cocaina (1-500, r2=0.996), BEG
(1-500, r2=0.999). Il limite di quantificazione (LOQ),
calcolato con 6 replicati indipendenti, è di 1ng/ml per tutti
gli analiti investigati, con un CV%<15%.
La metodica LC/MS/MS descritta consente di eseguire
il test di conferma nel plasma, ed è quindi utile
nell’identificazione di soggetti sotto l’effetto di sostanze
stupefacenti.
468
160
ANALISI QUANTITATIVA DI CONFERMA CON
LC/MS/MS DI DROGHE D’ABUSO IN MATRICE
URINARIA: COME CAMBIA IL LABORATORIO
1
1
1
1
M. Bagnati , M. Vidali , M. Albertario , D. Scarano , N.
1
1
1
1
Atzeni , C. Luna , V. Castellina , G. Bellomo
1
Introduzione e scopo. Il progressivo incremento delle
richieste di analisi di conferma per oppiacei e cocaina
evidenzia la necessità di una gestione ottimizzata dei
carichi di lavoro e delle risorse del Laboratorio. A questo
scopo abbiamo sviluppato un metodo quantitativo di
conferma in LC/MS/MS su matrice urinaria in alternativa
al metodo GC/MS precedentemente in uso.
Metodi. 200µl di urina sono miscelati con 200µl di
morfina-d3 o BEG-d3 500ng/ml in acqua e 400µl
di acqua. Dopo agitazione su vortex il campione è
centrifugato a 10000rpm per 7min. I campioni positivi
agli oppiacei (1ml) con concentrazione <20000ng/ml
all’analisi di screening sono precedentemente idrolizzati
a pH 5 con 20µl di enzima β-glucuronidasi-arisulfatasi
a 55°C per 2 ore. L’analisi cromatografica è eseguita
mediante HPLC Agilent 1290 Infinity LC (colonna: Zorbax
Eclipse XDB-C18, 2.1mm x 50mm, 1.8µm; fase mobile:
formiato d’ammonio 5mM + acido formico 0,01% in
acqua (tampone A) e acido formico 0,01% in acetonitrile
(tampone B); temperatura 50°C, flusso 0.35ml/min,
volume iniezione 0.5µl). L’eluato è monitorato mediante
un triplo-quadrupolo Agilent 6410 (ionizzazione ESI+ con
delta EMV 400V).
Le curve di calibrazione per oppiacei e cocaina sono state
costruite utilizzando rispettivamente 27 punti indipendenti
(9 livelli con 3 replicati) con regressione pesata 1/x.
Risultati. Gli intervalli di linearità (ng/ml) del metodo sono:
morfina (5-5000, r2=0.999), codeina (5-5000, r2=0.999),
6-MAM (5-5000, r2=0.999), cocaina (5-5000, r2=0.999),
BEG (5-5000, r2=0.999). Il limite di quantificazione (LOQ),
calcolato con 6 replicati indipendenti, è di 5ng/ml per tutti
gli analiti investigati, con un CV%<15%. La preparazione
e l’analisi dei campioni richiede un tempo inferiore
(riduzione>50% tempo operatore) e comporta costi
decisamente minori (eliminazione colonne e solventi per
SPE e derivatizzazione) rispetto alla metodica precedente
Conclusioni. La metodica LC/MS/MS descritta, rispetto
all’analisi in GC/MS, non richiedendo preparativa SPE
e successiva derivatizzazione consente l’esecuzione del
test di conferma in matrice urinaria per cocaina e oppiacei
con notevole risparmio di risorse umane ed economiche.
161
VARIATIONS AND ACCURACY OF
CARBOHYDRATE-DEFICIENT TRANSFERRIN
DURING PREGNANCY
1
1
1
1
162
LA RISPOSTA DEL LABORATORIO ALLE NUOVE
RICHIESTE DEI CLINICI: PRESENTAZIONE DI UN
CASO CLINICO
1
1
1
2
V. Bianchi , A. Ivaldi , A. Raspagni , C. Arfini , M.
2
Vidali
1
Toxicology Laboratory, Dept. of Clinical Pathology, SS.
Antonio e Biagio e C. Arrigo Hospital, Alessandria, Italy
2
Clinical Chemistry Unit, Maggiore della Carità Hospital,
Novara, Italy
M. Vidali , M. Bagnati , C. Luna , A. Rosina , L.
2
2
1
Castello , G.C. Avanzi , G. Bellomo
1
2
Medicina e Chirurgia d’Accettazione e d’Urgenza,
A.O.U. Maggiore della Carità, Novara
Introduction and Aim. Contrasting data are available
on the diagnostic accuracy of Carbohydrate-Deficient
Transferrin (CDT) during pregnancy. These differences
may depend in part on how CDT was evaluated and
expressed. Here, we report on variations in CDT levels
in pregnant women using an HPLC candidate reference
method (Helander et al., CCLM 2007).
Patients and Methods. Alanine Aminotransferase
(ALT), Aspartate Aminotransferase (AST), GammaGlutamyltransferase (GGT), Mean Corpuscular Volume
(MCV), Serum Transferrin, urine and serum Ethyl
glucuronide (EtG) and CDT were measured in 65 women,
self-reporting as non-alcohol abusers, at different stages
of normal pregnancy (gestational weeks: median 28,
IQR 8.5-32.5). CDT was expressed as percentage of
disialotransferrin to total transferrin (CDT%), with cut-off
at 2.0%. Statistical analyses were performed by SPSS
statistical software v. 15.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).
Results. AST, ALT, GGT and MCV were respectively 19
IU/L (IQR 16-23), 15 IU/L (IQR 12-21), 8 IU/L (IQR 5-11)
and 86.5 fL (IQR 82.7-90.4). Recent alcohol consumption
was excluded in all women by both undetectable serum
and urine EtG values. CDT% and Transferrin were
respectively 1.4% (IQR 1.1-1.6%, min-max 0.5-2.0%) and
377 mg/dL (IQR 313-423, min-max 221-681). Transferrin
was associated with both CDT% (r=0.63, p<0.001) and
gestational week (r=0.68, p<0.001). Interestingly, CDT
% was highly correlated with gestational week (r=0.75,
p<0.001), even after controlling for the effect of total
transferrin (partial correlation r=0.64, p<0.001). Moreover,
statistically significant differences in CDT% were also
evident between women grouped for pregnancy trimester
(1st trimester: median 1.0%, IQR 0.9-1.1; 2nd trimester:
median 1.3%, IQR 1.2-1.4; 3rd trimester: median 1.6%,
IQR 1.4-1.7; ANOVA p<0.001). Trend analysis confirmed
a proportional increase of CDT% along with pregnancy
trimesters (p<0.001). Three women had CDT% close to
the cut-off (1.9, 2.0, 2.0).
Conclusions. CDT is independently associated with
gestational week. The diagnostic accuracy of CDT for
detecting alcohol abuse may be limited in pregnant
women and the effect of gestational week should be
considered.
Reference: Stauber RE et al. Alcohol & Alcoholism 1996;
4:389-392
L’introduzione di nuove tecnologie in Laboratorio, in
particolare di una strumentazione LC/MS/MS, permette
di rispondere adeguatamente alle richieste dei clinici,
rappresentando un valido supporto in situazioni critiche.
In questo lavoro presentiamo un caso clinico di sospetta
tossicità da digitossina.
GM e LR, marito e moglie, arrivano in PS, presentando
un quadro clinico ed ECG compatibile con intossicazione
da digitale. Confusi, raccontano di aver consumato una
discreta quantità di erbe, di cui non sanno riferire i dettagli.
Sono quindi tenuti sotto osservazione, monitorando le
funzioni vitali, in attesa dell’arrivo degli anticorpi specifici
antidigossina, la cui somministrazione determinerà un
miglioramento importante delle condizioni cliniche ed
infine la risoluzione del caso.
Di fronte a concentrazioni di digossina indosabili in
entrambi i pazienti, il Laboratorio è stato chiamato
a valutare l’eventuale presenza di digitossina, non
rilevabile però con i dosaggi di chimica clinica per
digossina; né erano disponibili kit specifici per digitossina.
Una rapida revisione della letteratura scientifica ha
permesso l’individuazione di opportune condizioni per
la preparazione e la successiva analisi del campione.
500µl di plasma e 100µl di idrossido di ammonio sono
miscelati per 3 min con 5 ml di t-butilmetiletere. Dopo
centrifugazione, 4 ml di surnatante sono evaporati e
ripresi con 300µl di una soluzione acqua:acetonitrile
(50:50). L’analisi è eseguita con strumentazione HPLC
Agilent 1290 Infinity LC e triplo-quadrupolo Agilent 6410.
L’acquisizione in tempi rapidi di uno standard puro di
digitossina (>98,8%) ha permesso non solo di confermare
la presenza del farmaco nei due campioni ma anche di
accertarne le elevate concentrazioni compatibili con la
gravità dei quadri clinici (rispettivamente 50 e 100 ng/ml;
range terapeutico 10-30 ng/ml). Un campione delle stesse
erbe portato in Ospedale dai due coniugi, 15 giorni dopo
le dimissioni, risulterà essere Digitalis purpurea, pianta da
cui si estrae la digitossina.
Questa esperienza evidenzia come il dialogo e
la fattiva collaborazione tra clinici e laboratoristi,
unitamente all’innovazione tecnologica e alla sua
disponibilità, rappresentino fattori essenziali per una
risposta appropriata in situazioni critiche.
469
163
L’IMPLEMENTAZIONE DI EVIDENCE RANDOX
NELLA ROUTINE DI UN LABORATORIO DI
RIFERIMENTO PER L’ACCERTAMENTO DI
ASSENZA DI TOSSICODIPENDENZA NELLE
MANSIONI A RISCHIO: VALUTAZIONE OPERATIVA
E ORGANIZZATIVA
1
1
M. Vidali , G. Bellomo
1
Lab. di Ricerche Chimico-Cliniche, A.O.U Maggiore
L’entrata in vigore del provvedimento del 18/09/2008,
per gli accertamenti sanitari per sostanze d’abuso in
lavoratori addetti a mansioni a rischio, ha determinato
per i Laboratori la necessità di identificare strumentazioni
adeguate e stabilire procedure organizzative idonee per
gestire il conseguente incremento del carico di lavoro.
Nel 2009 il Laboratorio di Novara ha ricevuto 2013
richieste per screening tossicologico per mansioni a
rischio. A fine maggio 2010 le richieste sono state 1343
(a fine maggio 2009: 658, aumento 204%) con aggiuntive
richieste per 264 benzodiazepine (totale anno 2009: 145)
e 508 per buprenorfina (totale anno 2010: 401).
Dopo sperimentazione (lug-dic 2009) e valutazione delle
performance analitiche, da gen 2010 l’analisi di screening
semiquantitativa viene condotta su strumentazione
dedicata Evidence Randox, che combina la tecnologia
Biochip Array, l’elevata produttività dell’analizzatore
automatico Evidence ed il pannello Drug of Abuse plus
(opp, amf, metamf, coca, THC, barb, benzo1, benzo2,
metad, pcp, MDMA, bupre, creat). Unitamente alle
ottime performance analitiche (accuratezza, precisione,
specificità, concordanza con l’analisi di conferma),
valutate anche da altri autori (Marchioro et al. 2007), la
soluzione scelta presenta numerosi vantaggi: calibratori
e controlli multi-analita (riduzione dei costi e facilità di
stoccaggio), riduzione rifiuti, elevata produttività (fino a
>1200 test/ora), automazione completa, manutenzione
limitata, prezzo competitivo (comparabile ai test speditivi
on site). La resa media di un kit (test effettivamente usati
per pazienti) di 360 biochips è dell’89%, comparabile
ad altri strumenti per immunochimica. La strumentazione
è inserita in un sistema organizzativo con la presenza
di differenti figure professionali: personale segreteria
(accettazione), pre-analitica (aliquotazione campione),
tecnico (analisi campioni), dirigente (validazione).
L’attività, con cadenza trisettimanale richiede l’intervento
di un unico tecnico per un tempo complessivo medio di
un’ora/giorno (tempo effettivo escluso quello per l’analisi).
Evidence Randox in un contesto di appropriatezza
organizzativa rappresenta una valida ed efficiente
soluzione nella gestione dello screening per droghe
d’abuso nelle mansioni a rischio.
470
164
MONITORAGGIO TERAPEUTICO DELLA
RIBAVIRINA IN PAZIENTI DIALIZZATI CON EPATITE
C
1
2
3
M. Tempestilli , C. Cherubini , P. Narciso , C.
3
2
1
4
Tommasi , B. Bartoli , L. Mazzitelli , P. Ascenzi , S. Di
2
1
Giulio , L.P. Pucillo
1
Lab. di Biochimica Clinica e Farmacologia, I.N.M.I
“L.Spallazani”, Roma
2
U.O.S. Nefrologia e Dialisi nelle malattie infettive,
S.Camillo Forlanini e I.N.M.I “L.Spallazani”, Roma
3
Div. di malattie infettive e tropicali, I.N.M.I
“L.Spallazani”, Roma
4
Dip. di Biologia, Università Roma 3, Roma
Introduzione: nei pazienti affetti da epatite da HCV
con normale funzionalità renale, è raccomandata la
terapia combinata con interferone peghilato (PEG-IFN) e
ribavirina (RBV). Il 90% della RBV viene eliminata per
via renale e, a causa dell’alterata farmacocinetica per
accumulo da mancata eliminazione, la RBV è sconsigliata
in pazienti emodializzati allo scopo di evitare fenomeni
tossici (anemia). In questi pazienti il monitoraggio
della concentrazione plasmatica del farmaco (TDM)
rappresenta la base per il management della terapia.
Metodi: quindici pazienti emodializzati HCV+, con viremia
da 4.2 a 6.7 log10 UI/mL sono stati arruolati per iniziare
il trattamento con PEG-IFN alfa-2a 1.5 microgr/Kg/
settimana e RBV 200mg/die. La Ctrough della RBV è
stata monitorata, tramite HPLC-UV, a 2, 4, 8, 12 settimane
e, successivamente una volta al mese, insieme agli altri
parametri emato-chimici, in particolare la concentrazione
di emoglobina (Hb). Risultati: il range terapeutico della
RBV (1500-2100ng/mL) è stato superato fra le 4 e le 8
settimane di terapia. A causa dell’accumulo di farmaco, 12
pazienti hanno modificato il regime terapeutico passando
da 200mg/die a 200mg a giorni alterni, in accordo
con i valori di concentrazione di RBV. La viremia HCV
è risultata non determinabile in 10 su 15 pazienti.
I fallimenti erano in pazienti con genotipi di difficile
trattamento (3-4). Le concentrazione di RBV sono risultate
inversamente correlate con i valori di Hb (p<0.01).
Conclusione: il TDM della RBV in pazienti emodializzati
affetti da HCV e insufficienza renale cronica, sottoposti
a dialisi, è un efficace mezzo per modulare i livelli
plasmatici del farmaco minimizzando gli effetti collaterali
massimizzando la risposta terapeutica. Fenomeni di
accumulo del farmaco si sono verificati nel secondo mese
di terapia e il TDM ha permesso di modificare la terapia
senza necessità di sospensioni premature. A seguito della
modulazione della terapia, i pazienti emodializzati HCV
+ possono essere trattati con successo utilizzando PEGIFN e RBV permettendo a questi pazienti l’inserimento
in lista d’attesa per trapianto. Bibliografia: Bruchfeld A,
et al. Ribavirin treatment in dialysis patients with chronic
hepatitis C virus infection, a pilot study. J Viral Hepat. 2001
Jul;8(4):287-92.
165
EVALUATION OF ANALYTICAL METHODS FOR
WHOLE BLOOD EVEROLIMUS DETERMINATION
THROUGH LC-MS/MS AND FPIA TECHNIQUES
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Vancheri , M.T. Barba , A. Caropreso
1
Lab. di Biochimica Clinica - Sez. Farmaco-Tossicologia,
A.O.U. San Giovanni Battista di Torino - sede Molinette
Introduction. Recent pharmacological research led
to discovery of new rejection molecules including
Everolimus, subject of our study. Due to the narrow
therapeutic index monitoring becomes significative.
Therefore, analytical data to provide clinicians must
be accurate and precise to avoid underdoses or
overdoses. To this end, immunochemical (FPIA) and
chromatographic (LC-MS/MS) analytical methods have
been developed.
Aim. The aim of the study is to evaluate the low limit of
quantification, linearity, repeatability and riproducibility of
an LC-MS/MS method for the quantification of Everolimus
in whole blood and correlate the results obtained with an
FPIA method on a population of 170 patients for a total
of 640 samples from kidney, heart, liver and bone marrow
transplantation.
Materials and Methods. All tests have been performed
TM
using the MassTrack
Immunosuppressants XE RUO
Waters kit on WATERS Alliance 2695 HPLC supporting
QUATTRO MICRO
TM
API Micromass mass spectrometer
and INNOFLUOR
®
CERTICAN
®
diagnostic kit from
®
Seradyn on TDx instrument.
Results. For LC-MS/MS method the low limit of
quantification was found to be 1.0 µg/L with a CV% ≤
15%; the linearity between 1.0 and 25.9 µg/L; the intra-day
repeatability, 20 tests performed on three pools containing
between 2–3, 4–6 and 7–10 µg/L, gave a CV% of 10.1,
6.7 and 7.3 %. The 14 inter-day tests (riproducibility) over
a period of three weeks gave a CV% of 9.7, 9.2 and 7.7 %.
The correlation of the two analytical methods provides the
following Passing Bablok equation: [Ev-FPIA] = 1.5[EvLCMS] – 1.0, with a Bland Altman bias of 23.9%.
Discussion and Conclusions. The Results show a higher
sensitivity and specificity of LC-MS/MS method compared
to FPIA technique. Moreover, FPIA overestimates
Everolimus due to the monoclonal antibody crossreactivity to its metabolites. Thus LC-MS/MS technology
becomes an important analytical support to a more
accurate routine Everolimus determination.
References
Streit F., Armstrong V.W., Oellerich M., et al. Clin Chem
2002; 48(6):955-8.
166
RICERCA DI SOSTANZE STUPEFACENTI NEL
SANGUE: PROPOSTA DI UN TEST PRELIMINARE DI
SCREENING
1
1
1
1
F. Svaizer , A. Lotto , M. Gottardi , M.P. Miozzo
1
Lab. Sanità Pubblica - Azienda per i Servizi Sanitari di
Trento
La notevole espansione dell’utilizzo di droghe d’abuso
ha portato all’incremento dei controlli da parte delle
Forze dell’Ordine per verificare l’eventuale violazione
dell’art.187 C.d.S.e la contestuale individuazione
dell’attualità d’uso di sostanze stupefacenti.Ciò ha
determinato un aumento di richieste di indagini su
sangue,in quanto questa è ritenuta la matrice idonea
a documentare se,all’atto della contestazione,il soggetto
fosse sotto l’effetto di sostanze stupefacenti.
Al fine di garantire l'attendibilità del dato analitico,di
rendere più celere l’indagine e di contenere
i costi,è importante disporre di due tecniche
analitiche,indipendenti tra loro e basate su principi diversi
per la purificazione del campione,l’estrazione degli analiti
e la loro rilevazione.
Per la ricerca di droghe su sangue intero,presso il LSP di
Trento vengono utilizzate tecniche LC/MS e GC/MS ed è
inoltre allo studio un test di screening per individuare la
presenza di Opp,Coc,Amf,XTC,THC,Met,Bup,BDZ.Esso
prevede una fase di deproteinizzazione del campione,la
sua concentrazione tramite evaporazione a secchezza,la
solubilizzazione delle molecole con il reattivo VMA-T e
l’analisi con gli analizzatori automatizzati ed i reagenti
impiegati per la ricerca in screening delle droghe in
urina.Sono state predisposte curve di taratura in matrice
ed allestiti campioni ematici blank e fortificati mediante
aggiunta di sostanze pure.I cut-off utilizzati sono quelli
proposti nelle linee guida del GTFI(rev.n°3 del 1/3/2010).I
campioni reattivi al test di screening sono stati testati
con metodo LC/MS o GC/MS, unitamente a campioni
negativi.Su circa 100 campioni reali,la concordanza delle
due tecniche sui negativi è stata del 100%;sui positivi
si è riscontrata concordanza al 100% per Cocaina e
Oppiacei,qualche risultato aspecifico sulla classe delle
Amfetamine.La positività al test di screening per i
Cannabinoidi ha trovato conferma con presenza di
THC,CBD,CBN e/o di THC-COOH,anche se in qualche
caso con concentrazioni inferiori al cut-off.
Dall’analisi complessiva dei dati si evince che la metodica
di screening nei confronti di quella cromatografica
presenta una sensibilità pari al 100%,mentre
la valutazione della specificità richiede ulteriore
approfondimento.La casistica è ancora preliminare ma i
risultati sono soddisfacenti e molto promettenti.
471
167
SPERIMENTAZIONE E VALUTAZIONE DEI
REAGENTI CEDIA E DRI PER LA DETERMINAZIONE
DELLE DROGHE D’ABUSO SU SIERO UTILIZZANDO
L’ANALIZZATORE ILab 650
1
1
1
1
M.A. Mangano , C. Corsaro , G. Magrì , A. Signorelli , I.
1
Zinno
1
Lab. di Chimica e Clinica Tossicologica, ASP 3, Catania
Il protocollo operativo per gli accertamenti richiesti
dall’art.187 del CdS, prevede che siano effettuati test
di screening su campioni di sangue per la ricerca di
sostanze stupefacenti e/o psicotrope ed eventuale analisi
di conferma sulle seconde aliquote. Si è resa necessaria
quindi la messa a punto di un lavoro di sperimentazione
e valutazione delle performance analitiche dei reagenti
CEDIA e DRI, normalmente utilizzati per i dosaggi
urinari di oppiacei, cocaina, cannabinoidi, amfetamine/
metamfetamina/MDMA e metadone, per la rispettiva
determinazione su siero utilizzando l’analizzatore ILab
650.La concentrazione degli analiti nella matrice serica è
inferiore a quella urinaria pertanto per costruire le curve
di calibrazione sono stati testati sia i calibratori urinari
a più bassa concentrazione sia diluizioni degli stessi o
con siero negativo o con calibratore negativo urinario.I
dosaggi immunoenzimatici sono stati eseguiti su ILab
650 mentre le conferme su GC/MS Varian 220-MS. Per i
reagenti DRI è stata preparata una curva di calibrazione a
tre punti utilizzando i calibratori “Multidroghe DRI” tal quali;
per i CEDIA si è proceduto invece a preparare due diverse
curve di calibrazione, ciascuna a due punti, utilizzando
diluizioni dei seguenti calibratori CEDIA: “Multicalibratore
cut-off primario” per AMP/MDMA, cocaina e oppiacei;
“PPX metadone intermedio” per il metadone e “cal. 50
ng/mL THC” per i cannabinoidi.I controlli utilizzati sono
stati ottenuti diluendo con siero negativo al GC/MS i
calibratori ad alta concentrazione CEDIA. Per ambedue
reagenti sono stati calcolati i LOD. L’elaborazione dei dati
relativi alle curve di calibrazione e all’analisi di campioni
serici, negativi e positivi al GC/MS, ha dimostrato che la
metodica CEDIA con utilizzo di calibratori diluiti con pool
di sieri negativi, offre maggiore precisione e accuratezza.
La performance dei reagenti è migliorata conservando
gli stessi in frigorifero piuttosto che on board. Dai dati
ottenuti si è deciso di adottare i seguenti valori di cutoff: oppiacei 10 ng/mL, cocaina 10 ng/mL, cannabinoidi
5 ng/mL, amfetamine/metamfetamina/MDMA 10 ng/mL,
metadone 10 ng/mL, valori che saranno revisionati alla
fine della sperimentazione. Bibliografia:Henderson, DR,
Friedman, SB, Harris JD. et al. CEDIA, a homogeneous
immunoassay system. Clin Chem. 32 (1986) 1637-1641
472
168
LE INDAGINI TOSSICOLOGICHE EFFETTUATE
SEGUENDO LA NORMATIVA DELL’ ACCORDO
IN MATERIA DI ACCERTAMENTO DI ASSENZA DI
TOSSICODIPENDENZA (GU N.234 DEL 6.10.08)
1
1
2
3
M. Corbelli , L. Leone , P. Basilicata , R. Guadagni , A.
3
4
4
4
Simonelli , S. Sartori , E. Bassotti , G. Zenobi , M.
4
4
Matteucci , G. Alici
1
Lab. “Dr. P. Pignatelli”, Lecce
2
Dip. di Medicina Pubblica e della Sicurezza Sociale
- Facoltà di Medicina e Chirurgia - Univ. degli studi di
Napoli "Federico II"
3
Dip. di Medicina Sperimentale - Sez. di Medicina del
Lavoro, Igiene e Tossicologia Industriale - Seconda
Università degli Studi di Napoli SUN
4
Eureka srl
Obbiettivi: valutazione dei risultati ottenuti durante 18
mesi di controlli effettuati seguendo la normativa dell’
Accordo in materia di accertamento di assenza di
tossicodipendenza (GU n.234 del 6.10.08)
Materiali e metodi: le procedure di prelievo e di
campionamento sono avvenute secondo le modalità
previste dalla normativa (verbale, sigillo per i tre campioni,
catena di custodia, ecc.)
Lo “screening” è stata effettuato con metodica CEDIA su
strumento Olympus AU640. Alcuni campioni, selezionati
in base al valore di concentrazione “borderline”, sono stati
analizzati con metodica rapida su striscia “InstAlert Multi
Drug” (Biorad).
Le urine risultate positive al test di screening CEDIA sono
state analizzate attraverso tecnica di conferma (GC-MS).
Risultati: sono stati analizzati 487 campioni di urine
appartenenti ad operatori attivi nel settore dei trasporti
pubblici e privati, di sesso maschile, di età compresa tra
23 e 64 anni.
Il test di screening ha evidenziato in 13 lavoratori positività
per una sostanza e in 1 lavoratore per 2 sostanze.
N.10 positività delle 15 riscontrate al test di screening
sono state confermate con metodica di II livello (GC-MS,
LC-MS).
Conclusioni: I risultati ottenuti indicano una diffusione
delle sostanze stupefacenti del 3% negli operatori del
trasporto con netta prevalenza di THC (46,6%) rispetto
alle altre sostanze.
Le indagini eseguite attraverso steps successivi
garantiscono la corretta valutazione dei risultati (33,3% di
“falsi positivi” allo screening) e la tutela dei lavoratori.
L’utilizzo di metodiche “rapide” per il test di screening
ha evidenziato una scarsa attendibilità del metodo nella
valutazione di campioni con concentrazioni “borderline”.
Riferimenti bibliografici: Provvedimento n. 99/cu del
30.10.2007
Provvedimento n. 178/csr del 18.09.2008
169
ACMIA VERSUS MEIA ASSAY IN THERAPEUTICAL
MONITORING OF SIROLIMUS
1
1
1
M. D'Alessandro , P. Mariani , B. Evangelista , D.
1
1
1
Severi , V. Sargentini , A. Bachetoni
1
U.O. Patologia Clinica, Dip. Chirurgia Generale e
Trapianti d'organo "P.Stefanini", Univ. Sapienza di
Roma.
Background: Sirolimus (Rapamune, Wyeth-Ayerst,
Princeton, USA), is a macrolide antibiotic inhibitor
of mammalian target of rapamycin (mTOR-i) with
antiproliferative and immunosuppressant properties. This
drug has a narrow therapeutic index and individual
farmacokinetic variability requiring blood monitoring. The
HPLC-MS is the referring method for blood sirolimus
assay although immunoassay systems are widely used in
therapeutic drugs monitoring. In this study we compare
the sirolimus determinations using the Microparticle
Enzyme Immunoassay (MEIA) run on the IMx analyser
(Abbott) with the recently introduced Affinity ColumnMediated Immunoassay (ACMIA), run on the Dimension
Xpand (Siemens Corporation, Deerfield,USA). Aim of our
study was to evaluate the performance of ACMIA method,
that has the advantage of not requiring pre-treatment
procedure, compared to the MEIA method.
Methods: 50 samples from kidney or liver transplant
recipients and 21 samples from International Proficiency
Testing Scheme (patients pool and sirolimus added
samples) were analyzed using Dimension Xpand with
sirolimus Flex reagent for ACMIA method and IMx
sirolimus for MEIA method.
Results: Sirolimus concentration of patient samples
measured by ACMIA method closely correlated with those
measured by MEIA method (r = 0.88 ). The BandAltman plot showed that more than 95% of the values
were within the confidence interval and the bias between
methods was 2.193 showing a specific trend of higher
results measured by the Flex assay (mean values MEIA:
6.06±3.2 – ACMIA: 8.2 ± 4.3 ng/ml). Comparison of
Proficiency testing samples assayed with the two methods
showed a similar trend ( r= 0.86 )and Band-Altman plot
with a bias of 1.973. The concentration of the samples
with sirolimus added were also correlated to the target
concentration: MEIA assayed r= 0.89, ACMIA assayed r=
0.93.
Conclusion: ACMIA method used for Sirolimus assay
is a valid alternative to MEIA method. Not requiring
sample’s pre-treatment makes ACMIA method faster and
its accuracy is proven by the good performance in respect
to its target values of proficiency testing samples.
170
SHORT AND LONG TERM STABILTY OF FREEZEDRIED URINE SAMPLES AS REFERENCE
MATERIALS FOR DRUGS OF ABUSE TESTING IN
PHARMACO-TOXICOLOGY
1
2
3
F. Brandimarti , S. Bompadre , S. Pichini , S.
4
1
Sartori , R. Giorgetti
1
Sez. Medicina Legale, Dip. Neuroscienze, Univ. Polit.
Marche, Ancona
2
Dip. di Scienze Biomediche, Univ. Polit. Marche,
Ancona
3
Ist. Sup. Sanità, Roma
4
Eureka lab division s.r.l, Chiaravalle (AN)
Introduction: The need of ready-to use reference material
for drugs of abuse testing has increased in forensic and
clinical laboratories to rapidly set up the assay validation
protocol and as quality control process. Lyophilized urine
samples containing drugs of abuse and metabolites can
be a useful material which can circumvent the lengthy
administrative process to acquire expensive drugs of
abuse standards.
The crucial point of lyophilized urine samples use is to
establish stability of different drugs and metabolites during
production and storage.
Aim: We evaluated short and long term stability of
morphine, codeine, cocaine and benzoylecgonine in
lyophilized urine samples provided by Eureka s.r.l.
Methods: For preparation of the samples, blank urines
previously subjected to filtration for clarification were
fortified with standard solutions of the corresponding
compounds and filtered under sterile conditions. Shortterm stability was evaluated at 25°C for up to 7 days. Longterm stability was evaluated at different time intervals
for up to 6 months at -20 degree C. Concentrations
were determined by liquid chromatography reverse
phase separation with gradient mobile phase and triple
quadrupole MS/MS detection (1).
Results: Results obtained showed minimal differences
(lower than 10%) between lyophilised and non-lyophilised
aliquots stored at -20 degree C at all time periods. The ongoing investigation include the study of stability up to 24
months.
(1)Development
and
validation
of
a
liquid
chromatography-mass spectrometry assay for the
determination of opiates and cocaine in meconium.
Pichini S, Pacifici R, Pellegrini M, Marchei E, PérezAlarcón E, Puig C, Vall O, García-Algar O.
J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2003 Sep
5;794(2):281-92.
473
171
VARESPLADIB INHIBITS EX-VIVO SECRETORY
PHOSPHOLIPASE A2 IN BRONCHO-ALVEOLAR
LAVEGE FLUIDS FROM DIFFERENT TYPES OF
NEONATAL LUNGl INJURY
1
1
1
172
VCS PARAMETERS AS MARKERS OF SEPSIS. A
CASE-CONTROL STUDY
1
2
D. Tripodi , A. Minucci , D. De Luca , J. Trias , B.
1
1
1
Giardina , C. Zuppi , E. Capoluongo
1
Lab. di Biologia Molecolare Clinica, Policlinico "A.
Gemelli" Univ. Cattolica del Sacro Cuore di Roma
2
Anthera Pharmaceuticals inc., Hayward (CA) – USA
Varespladib inhibits ex-vivo secretory phospholipase A2
in broncho-alveolar lavage fluids from different types of
neonatal lung injury
1
1
1
Domenico Tripodi , Angelo Minucci , Daniele De Luca ,
2
1
1
Joaquim Trias , Bruno Giardina , Cecilia Zuppi , and
1
Ettore Capoluongo .
1
Laboratory of Clinical Molecular Biology, Institute
of Biochemistry and Clinical Biochemistry, Catholic
University of Rome, Italy.
2
Anthera Pharmaceuticals inc., Hayward (CA) – USA.
Background: Secretory phospholipase A2 (sPLA2)
enzymes are crucial for surfactant catabolism and lung
inflammation. They have been associated with lung
stiffness, impaired surfactant activity and the degree
of respiratory support both in acute respiratory distress
syndrome and in some forms of neonatal lung injury.
Varespladib potently inhibits this enzyme in animal models
of lung injury.
Materials and methods: Forty mechanically ventilated
neonates affected by either hyaline membrane disease,
infections or meconium aspiration have been subjected
to bronchoalveolar lavage. This was subdivided in
four aliquots and added with increasing varespladib
concentration (10µM, 40µM, 100µM) or saline. sPLA2
enzyme activity, proteins and albumin were measured.
Results. At concentrations 40 µM varespladib
inhibits secretory phospholipase in hyaline membrane
disease (p<0.0001), infections (p=0.003) and meconium
aspiration (p=0.04).
Discussion: A substantial body of literature suggests that
both catabolic and pro-inflammatory action of sPLA2
enzymes might affect lung function, causing respiratory
distress syndrome. The role of sPLA2 enzymes in lung
inflammation and surfactant catabolism suggests that this
family of enzymes could be the target for novel treatments
in some distinct forms of neonatal acute lung injury.
Reference: Secretory phospholipase A2 pathway during
pediatric acute respiratory distress syndrome: A
preliminary study. De Luca D, Minucci A, Cogo P,
Capoluongo ED, Conti G, Domenico P, Carnielli VP,
Piastra M. Pediatr Crit Care Med. 2010 Mar 25.
474
1
1
L. Napoli , R. Chiaramonte , G. Evangelico , A.
2
2
2
Cortegiani , A. Di Benedetto , S. Mangione
1
Analysis Lab. Dept. of Anaesthesiology Intensive Care
and Emergency, P.Giaccone Hosp. Univ. of Palermo
2
Dept. of Anaesthesiology Intensive Care and
Emergency, P.Giaccone Hosp. Univ. of Palermo
A cheap and fast diagnostic parameter for detection
of sepsis would have both economic and therapeutic
benefits. Coulter LH series hematology analyzer uses
the VCS technology (Volume, Conductivity and LaserScatter) to determine 24 positional parameters concerning
all main leucocytes. It detects mean value and standard
deviation of V, C and S. Many authors have analyzed the
usefulness of VCS parameters in reactive neutrophils for
detection of infections. An increase in Mean cell Volume
and a decrease in Mean Scatter have been described
in septic patients. The aim of this study is to verify the
correlation between VCS parameters and sepsis.
We enrolled 92 patients, at the admission in our ICU.
We divided them in two groups according to ACCP/
SCCM diagnostic criteria: Controls (48) and Sepsis (44).
For each patient we collected a blood sample in EDTA
tube immediately after making the diagnosis. All samples
were analyzed for detection of VCS parameters by
Coulter LH 500 hematology analyzer. Arithmetic mean
and standard deviation of Mean V,C,S were calculated;
comparison between arithmetic means was performed by
using the Student t test. A P value less than .05 was
considered significant. ROC curves were also realized. A
statistically significative difference was observed between
MNV among the 2 groups,instead of none between MNC
and MNS. The Area under the ROC curve was 0,816 for V;
0,546 for C; 0,604 for S. The correlation with sepsis was a
linear positive one for V (strong) and C (weak) instead of a
linear negative one for S. The best cut-off value was >163
for V (Sens: 84%; Spec: 68%); >137 for C (Sens: 72%;
Spec: 41%); <134 for mean-S (Sens: 56%; Spec: 64%).
Our study demonstrates the high diagnostic performance
of Mean-V and the weak one of Mean-C and MeanS in septic patients. The clinical usefulness of Mean-V
is strengthened by the quickness and cheapness of its
analysis. It seems to be a remarkable laboratoristic help
for critical patient’s clinical assessment.
Bibliography
Chavez F et al.: Quantitative determination of neuthrophil
VCS parameters by the Coulter automated analyzer: new
and reliable indicators for acute bacterial infection. Am J
Clin Pathol 2005; 124:440-444
173
A STUDY OF LYMPHOCYTIC SUBPOPULATION IN A
SARDINIAN POPULATION OF ELDERLY
1
2
174
SEROPREVALENCE FOR T.GONDII, CMV, EBV,
HSV, VZV IgG IN A SARDINIAN POPULATION OF
ELDERLY
2
A. Marchisio , M.L. Pettinato , M. Cilliano , A.
2
1
1
1
Muredda , G. Rocca , S. Pinna , A. Zinellu , P.
1
1
2
1
Occhineri , C. Carru , M.S. Mura , L. Deiana
1
Biochimica Clinica, Biologia Molecolare Clinica, Facoltà
di Medicina, Univ. di Sassari
2
Istituto di Malattie Infettive, Facoltà di Medicina, Univ. di
Sassari
During senescence have been described some
immunological alterations that cause the decay of the
defense functions, contributing in this way to the biological
phenomenon of aging. The analysis of these changes
should keep in mind the extreme complexity of the
immune system. The cells derived from thymus and
the functions of natural killer cells undergo profound
changes with age. Indeed there is a decrease in the
turnover of cytotoxic T lymphocytes, but also in those
with modulator function (T helper and T suppressor). It
follows an alteration of the immunity cell-mediated and an
alteration of the B lymphocyte functions. In the healthy
elderly more than a decline we have a remodeling of
the immune system, with some parameters and immune
functions strongly affected, and other, extraordinarily well
preserved or even activated (especially in centenarians).
In our study we performed, by flow cytometry in six colors,
the count of lymphocyte subpopulations of 26 subjects (19
females and 7 males), recruited in the AKeA Project, aged
between 80 and 105 years, with median age of 101 years.
The lymphocyte count was also performed on a control
population of 103 healthy subjects (69 females and 34
males) aged between 20 and 45 years. The lymphocyte
count was given to the CD3 +, CD3 + CD8 +, CD3 + CD4
+, CD16 + CD56 +, CD19 +, CD45 + and CD4/CD8 ratio.
The values of lymphocyte subpopulations in the group of
elderly were comparable to those in the control population.
From this preliminary study we showed that the
elderly population has lymphocytic subpopulations values
comparable to those of the control population.
This finding might indicate that in the long-lived
subjects that we examined there is not an impairment
of the immune system, which normally follows the
senescence. We would extend the study to a larger
sample. Furthermore, to assessing the actual activities
of circulating lymphocytes would be appropriate and
interesting study the cellular subgroups in the population
of CD4 + and CD8 +.
2
1
2
M.L. Pettinato , A. Marchisio , M. Cilliano , G.
2
2
1
1
1
Coinu , G. Cattari , G. Rocca , E. Canu , S. Sotgia , A.
1
1
1
1
Bacciu , C. Carru , M.S. Mura , L. Deiana
1
Biochimica Clinica, Biologia Molecolare Clinica, Facoltà
di Medicina, Univ. di Sassari
2
Istituto di Malattie Infettive, Facoltà di Medicina, Univ. di
Sassari
In the elderly, physiologically, there is a general
depression of the immunity both cell-mediated than
humoral. The cell-mediated immunity depression is
manifested by a reduction in peripheral lymphocyte
proliferation and an increase in immature T lymphocytes,
while the humoral depression is manifested with a
reduced affinity of the antibody for the antigen and an
increased production of autoantibodies. The status of
efficiency of the immune system of elderly is closely
related to their health. In some cases (centenarians),
however, age-related changes lead to a "reconfiguration"
of the immune system. The data on the remodeling
of immune function with age rather than unidirectional
deterioration, prove the existence of complex interactions
between nervous, endocrine and immune systems,
human behavior and environmental influences that need
further study. The maintenance of defenses depends on
the capacity to resist, adapt or repair the damage caused
by pathogenic noxae.
In our study, we analyzed 150 individuals recruited in
the AKeA Project, older than or equal to 100 years (93
females and 57 males) and 18 controls aged between
18 and 37 years (10 females and 8 males). We done
the research for each individual by enzyme immunoassay
of serum IgG antibodies, directed against: Toxoplasma
gondii, cytomegalovirus, Epstein-Barr (VCA), Herpes
Simplex, Herpes Zoster.
In the group examined we showed a positive serology
(IgG) to all infectious agents tested, significantly higher
than the control group.
The data obtained corroborate what we expected. Infact
the patients have had more time and have lived in a
historical period of exposure to infectious agents. All
the person examined showed a humoral memory still
protective, indicating a good efficiency of the immune
system. This feature is considered a positive factor
favoring longevity. For a possible confirmation of this
hypothesis, we propose to extend the study to a larger
sample.
475
175
MISURARE L'APPROPRIATEZZA DELLA
DIAGNOSTICA ALLERGOLOGICA IN VITRO, IN
EMILIA ROMAGNA
176
ANTICORPI ANTI MITOCONDRIO: ANALISI DEL
MARCATORE IN UNA COORTE ITALIANA
1
1
2
3
A.T. Scacchetti , V. Cova , L. Battistelli , C.
4
5
6
6
Chiodino , S. Ghisellini , M. Lodolini , M. Martelli , F.
7
8
Panichi , E. Savi
1
Dip. Patol. Clin., Lab. Tossic. e Diagnostica Avanzata,
Nuovo Osp. Civile S. Agostino Estense, Modena
2
Lab. Aria Vasta Romagna, AUSL Ravenna
3
Lab. Ematochimica, AOU Parma
4
Lab. Analisi Osp. di Guastalla, AUSL Reggio Emilia
5
Lab. Analisi, AOU S.Anna Ferrara
6
Lab. Analisi Osp. Maggiore, AUSL Bologna
7
Lab. Analisi, AO Arcispedale S. Maria Nuova Reggio
Emilia
8
U.O.S. Allergol. Osp. G. Da Saliceto AUSL Piacenza
Obiettivo. I test erogati per la Diagn. Allergologica
in vitro sono da considerare appropriati dopo aver
preso correttamente in considerazione: i pazienti che
possono beneficiarne; il setting laboratoristico più idoneo,
comprese le caratteristiche dei professionisti coinvolti; il
momento, all’interno della storia naturale della condizione
da trattare, più favorevole al profilo beneficio-rischio.
Su questi principi, il Lab.di Diagn. Allergologica in
vitro,deve massimizzare la probabilità di ottenere gli effetti
desiderati e ridurre gli sprechi, facendo in modo che
i benefici attesi eccedano, con un sufficiente margine
di probabilità, le conseguenze negative dell’intervento
stesso. Metodologia. Nell'ambito dei prodotti erogati dal
piano di Formazione Aziendale è stato possibile avviare
un evento formativo "Progetto di Formazione sul campo"
avendo come attività di addestramento la "Partecipazione
a progetti di Miglioramento".La partecipazione è stata
limitata ai professionisti operanti in sede regionale nella
disciplina in oggetto. Il disegno di un n. di ore complessive
(300 nell’arco di un anno), la realizzazione di un
verbale (testimoniante gli incontri e la programmazione
del lavoro) sono requisiti indispensabili, insieme alla
motivazione della richiesta e agli obiettivi da raggiungere,
perché tale evento sia presentato in Commissione
Regionale per l’attribuzione dei crediti ECM. Questo
strumento formativo ha reso possibile la formazione
di un “gruppo di lavoro”accreditato ECM. Risultati e
Conclusioni. 5 indicatori saranno analizzati per procedere
all’individuazione e mantenimento di un percorso
diagnostico clinico-laboratoristico standardizzato e
validato: caratteristiche del paziente: cliniche, con
riferimento alla condizione acuta o cronica della
patologia presentata, socio-culturali; caratteristiche della
prestazione: efficienza/efficacia, sicurezza, costo; tempo
di erogazione della prestazione in relazione alla
storia clinica del paziente: caratteristiche del livello
assistenziale; caratteristiche del professionista che
fornisce la prestazione. La realizzazione di un documento
regionale condiviso e validato permetterà al laboratorio
di diagnostica allergologica di sviluppare una elevata
autonomia organizzativa con compiti prioritariamente
assistenziali.
476
1
1
1
L. Nava , G. Giana , E. Minotti , T. Tamborini , N.
1
1
1
1
Forlani , C. Valli , C. Cali' , M. Frigerio
1
Lab. analisi Chimico-Cliniche e Microbiologia, Osp.
Cantù , A.O. S.Anna di Como
Scopo. La Cirrosi Biliare Primitiva (PBC) è una malattia
cronica epatica su base autoimmune che trova negli
anticorpi anti Mitocondrio (AMA) il marcatore sierologico
principale sia diagnostico che predittivo. In questo lavoro
si è analizzata l’incidenza degli AMA in rapporto al
sesso e all’età per verificarne l' incidenza prima dell’età
considerata il picco di incidenza della malattia (40-60
anni). Lo studio è stato effettuato su pazienti del Comasco
nel periodo gennaio-dicembre 2009.
Metodologia. Sono stati eseguiti 496 test per la ricerca
degli AMA di cui 294 su femmine e 202 su maschi.. Il test
è stato eseguito con la metodica di immunofluorescenza
indiretta utilizzando il kit “Mosaic Basic Profile 3A” della
ditta Euroimmun automatizzato sul preparatore di vetrini
APS 16 Plus della ditta DAS. La diluizione di screening
è stata di 1/40; sui campioni positivi è stata eseguita
la titolazione anticorpale con diluizioni a raddoppio fino
all’end-point.
Risultati. Le percentuali di positività degli AMA riscontrate
nelle femmine (7.5%) e nei maschi (0.99%) sono
perfettamente sovrapponibili ai dati di letteratura riguardo
alla prevalenza della PBC nel rapporto femmine/maschi
(8-9/1). L’analisi dei risultati positivi in rapporto all’età e al
sesso ha evidenziato la maggior prevalenza del marcatore
dopo i 40 anni con una percentuale del 70,8% nelle
femmine e del 8,3% nei maschi. Inoltre il 20,9% delle
pazienti risultate positive presentava un’ età inferiore a 39
anni.
Conclusioni. I risultati preliminari permettono di
evidenziare un’alta percentuale di presenza del marcatore
ad alto titolo in donne di età inferiore a 39 anni.
La conferma di questo dato permette di selezionare
persone ad alto rischio di PBC da sottoporre a follow up
così da poter intervenire il più precocemente possibile con
la terapia in grado di rallentare l’evoluzione della malattia
stessa consentendo ai pazienti una migliore qualità di vita.
Bibliografia.Tozzoli R., Bizzaro N., Villalta D., Tonutti
E., Pinchera A. “Il laboratorio nelle malattie autoimmuni
d’organo”. Bologna: Società Editrice Esculapio; 2009.
177
INFLAMMATORY CYTOKINES PATTERN IN
RECURRENT MISCARRIAGE
1
2
2
1
M. Emanuelli , S. Giannubilo , B. Landi , V. Pozzi , R.
2
1
1
1
Raffio , D. Sartini , M. Cecati , F. Ferretti , P.
2
2
2
Stortoni , A. Corradetti , A.L. Tranquilli
1
Dip. Biochimica, Biologia e Genetica, Univ. Politecnica
Marche, Ancona
2
Dip. Scienze Cliniche Specialistiche e
Odontostomatogiche, Univ. Politecnica Marche, Ancona
Objective: To investigate inflammatory cytokines
expression pattern in trophoblastic tissue from women
with unexplained recurrent spontaneous miscarriage.
Materials and methods: Trophoblastic tissue was obtained
during surgical uterine evacuation in 11 women with
recurrent miscarriage and in 20 healthy pregnant women
undergoing elective termination of pregnancy as controls.
The array was performed with GEArray Q Series Human
Inflammatory Cytokines & Receptors Gene Array HS-015
membranes. The data were confirmed by quantitative
real-time PCR (qPCR). The Mann-Whitney U test was
performed for statistical analysis.
Results: Macroarray analysis identified three genes
differentially expressed. Quantitative real-time PCR in
trophoblast tissue confirmed a significant down-regulation
for Transforming Growth Factor beta 3 (TGF- b3) and
for Interleukin 25 ( IL-25) (5-fold reduction and 2.5-fold
reduction, respectively) and a significant up-regulation
for CD-25, also known as Interleukin 2 receptor alpha
(IL-2RA) (7-fold increase) in women with recurrent
miscarriage compared to controls.
Conclusion: The trophoblast cytokines expression pattern
allows us to confirm at the maternal-fetal interface the
assumption about the immunotrophic theory as revealed
by a switch between Th1 and Th2 profile in recurrent
miscarriage. Immunological and inflammatory regulations
of the placental environment have certainly a key role in
the success of pregnancy.
178
ITALIAN MULTICENTRE STUDY FOR APPLICATION
OF A DIAGNOSTIC ALGORITHM IN AUTOANTIBODY
TESTING FOR AUTOIMMUNE RHEUMATIC
DISEASE : CONCLUSIVE RESULTS
1
2
3
C. Bonaguri , A. Melegari , A. Ballabio , P.
4
1
1
5
Terenziani , A. Russo , L. Battistelli , R. Aloe , P.
6
2
1
Dall'Aglio , T. Trenti , G. Lippi
1
U.O. Diagnostica Ematochimica, Dip. Patologia e Med.
Laboratorio, A.O.U. Parma
2
Lab. Tossic. e Diagn.Avanzata, Dip. Pat. Clin., AUSL
Modena
3
Lab. Analisi P.O. Castel San Giovanni, AUSL Piacenza
4
Lab. Microbiologia, ASMN Reggio-Emilia
5
S.S. Dip.Biochimica Elevata Automazione, Dip.
Patologia e Med. Laboratorio, A.O.U. Parma
6
Clin.Immunol.Medica, A.O.U. Parma
Aims. The presence of specific auto-antibodies in serum
(i.e. ANA, anti-dsDNA, anti-ENA), is one of the major
criteria for the diagnosis of Autoimmune Rheumatic
Disease. As such, the request of these tests has grown
exponentially in the laboratory practice. The aim of this
study is to implement a common guideline for reducing
clinically inappropriate test requests of autoantibody
testing in a broad geographic area (Parma, Modena,
Piacenza, Reggio-Emilia) with reference to the diagnosis
of Autoimmune Rheumatic Disease. Methods. This study,
supported by a Regional grant for innovative research
projects and started in January 2008, is an observational
research aimed to compare the number of tests (ANA,
anti-dsDNA, anti-ENA) and the percentage of positive test
results before and after implementation of the diagnostic
algorithm for hospitalised patients.
Results.
1) A multidisciplinary team comprising clinical immunology
and laboratory scientists was instituted, with the aim to
collect and analyse diagnostic criteria, clinical needs,
laboratory report formats, analytical procedures and
number of tests performed.
2) A common guideline for autoantibody testing, which
poses ANA test at the first level, has been developed and
implemented since January 2009.
3) The results for the period January -June 2009 (12.738
tests) were compared to those of the same period
in 2008 (13.067 tests). A significant reduction in the
number of anti-dsDNA (26%) and anti-ENA (15%) was
observed. The percentage of second-level tests positivity
after implementation of the diagnostic protocol has also
remarkably increased both for ENA (13% vs 17%) and
dsDNA (9% vs 11%).
Discussion. In our study the development and
implementation of diagnostic algorithms for hospitalised
patients not only allowed a reduction in the number of
second-level tests, but also increased their diagnostic
specificity. We hope that a close collaboration between
Clinicians, Laboratory Specialists and Health Care
Services could allow to apply diagnostic algorithms not
only for hospitalised patients, but also for outpatients
(about 65% of overall patients).
477
179
GLI ALLERGENI RICOMBINANTI
NELL’EPIDEMIOLOGIA DELLE ALLERGIE
NELL’AREA MILANESE
1
1
180
DOSAGGIO DELLA VITAMINA D IN
CHEMILUMINESCENZA (Liaison®) E PATOLOGIE
CONNESSE. ESPERIENZE E CONSIDERAZIONI
NELLA POPOLAZIONE BRINDISINA
1
M. Ramondetta , R. Maiavacca , M.C. Garlaschi , M.T.
1
2
2
1
Zanferrari , M. Previdi , G. Stucchi , E. Torresani
1
Lab. Centrale di Analisi Chimico Cliniche e
Microbiologia, Fondazione IRCCS Ca’ Granda Osp.
Maggiore Policlinico, Milano
2
U.O.S. Allergologia Ambientale e Occupazionale,
Fondazione IRCCS Ca’ Granda Osp. Maggiore
Policlinico, Milano
I ricombinanti sono considerati di grande utilità nella
diagnosi, eziologia e cura delle allergie e permettono lo
studio di fenomeni complessi come le reazioni crociate tra
fonti allergeniche in apparenza distanti.
I pazienti (pz) allergici agli alimenti si dividono in due
categorie: tipo 1, sensibilizzati primariamente ad alimenti
vegetali, (responsabili LTP); tipo2, con sensibilizzazione
all’alimento secondaria alla cross-reattività con un
sensibilizzante primario (responsabili proteine strutturali e
difensive della pianta come profiline e PRP, presenti sia
in pollini che in frutti di alberi anche lontani tra loro sotto
l’aspetto botanico).
Scopo del lavoro è stato caratterizzare i profili di
sensibilizzazione (tipo 1 e 2) di soggetti dell’area
milanese, sintomatici dopo assunzione di alimenti
vegetali.
Sono state dosate, mediante metodica ImmunoCAP
(Phadia), IgE sieriche dirette verso allergeni inalanti,
alimentari e ricombinanti Bet v1, Bet v2, Cor a8, Pru p3.
Degli 82 pz selezionati (M/F: 28/54, età media 32,5 anni)
15 pz presentano positività di tipo 1 (11 per LTP, 2 per
noci, 1 per arachidi, 1 per semi), 67 di tipo 2 (46 per PR10,
18 per profilina, 3 per latex).
L’analisi dei 2 campioni (pollinosici e allergici ad alimenti
vegetali) conferma un rischio elevato, statisticamente
significativo, di riscontrare allergia alimentare nei pz
primariamente sensibilizzati ai pollini, in particolare
betulacee. Infatti, il 30,7% di tutti i pollinosici (e il 44%
dei sensibilizzati alle betulacee) riferiscono sintomi di
allergia alimentare; mentre il 79% dei pz con allergia
alimentare risultano sensibilizzati ai pollini (il 94% nel
caso dei sensibilizzati agli alberi). La sensibilizzazione agli
alberi non consente di attribuire a PR10 tutti i casi di OAS
per rosacee e frutta con guscio, al contrario il ricorso al
dosaggio dei ricombinanti costituisce, a fianco dei dati
clinico-anamnestici un utile strumento per la diagnosi
differenziale. La prevalenza di sensibilizzazioni di tipo 2,
notoriamente più rappresentata nel nord Europa, risulta
anche nell’area della città di Milano, ricca di alberi della
famiglia delle betulacee.
Bibliografia
Zuidmeer L et al. The prevalence of plant
foodallergies: a systematic review. J Allegy Clin Immunol
2008;121:1210-8.
478
1
1
1
1
M. Scoditti , A. Sanasi , P. Robert , T. Voi , R.
1
1
1
1
1
Incalza , B. Carlo , D. Nigro , A. Vitale , D. D'astore , L.
1
1
Poci , F. Pedali
1
Lab. di Patologia Clinica Distrettuale e Tossicologia
La vitamina D è presente in natura in 2 forme:
ergocalciferolo o vitamina D2 presente in pochi
alimenti e calciferolo o vitamina D3 che viene
sintetizzata nella pelle dalla luce solare. Un’adeguata
esposizione al sole garantirebbe l’80% del fabbisogno
di vitamina D. Il restante 20% potrebbe essere
assicurato dall’alimentazione. Considerati i limiti alla
sintesi endogena della vitamina D3 (ridotta esposizione
al sole, uso di creme solari, ecc.) e la scarsa reperibilità
nell’alimentazione possiamo comprendere la ragione
della diffusione della condizione di ipovitaminosi D in
Italia. Per questo motivo, lo status della vitamina D
è correlata ad un elevato rischio di patologie extrascheletriche, quali ipertensione, malattie cardiovascolari,
cancro, sclerosi multipla, artrite reumatoide ed altre
malattie autoimmuni. Nel Laboratorio di Patologia Clinica
Distrettuale e di Tossicologia “A. Di Summa” di Brindisi la
vitamina D viene dosata con lo strumento Liaison Diasorin
secondo il metodo della chemiluminescenza diretta a 2
fasi. Lo scopo del nostro studio è stato quello di stabilire i
nuovi range di riferimento di vitamina D per la popolazione
brindisina. Nel nostro laboratorio nel 2009 sono stati
effettuati 300 dosaggi di vitamina D. Prima di effettuare
questo studio, i valori di riferimento da noi utilizzati erano
9,0-55,0 ng/ml, valori non conformi con quanto riportato
in letteratura. Infatti, dei 300 dosaggi, 32 risultavano
fuori range, in particolare 22 per ipovitaminosi e 10 per
ipervitaminosi. I valori superiori a 49 non sono stati presi
in considerazione perché 15 campioni cadono nel range
50- 100 ng/ml e solo 2 sono maggiori di 100 ng/ml.
Dalla valutazione statistica è emerso che la frequenza più
alta per valori di vitamina D è intorno a 23 ng/ml che è
stato fissato come limite minimo. Il limite massimo, invece,
in accordo con i dati in letteratura, è stato fissato a 100
ng/ml.
181
IMPROVEMENT OF ANTI-TRANSGLUTAMINASE
ANTIBODIES (tTG) DIAGNOSTIC ACCURACY
BY AGE-RELATED CUT-OFFS IN A SELECTED
PEDIATRIC POPULATION
182
LIVELLI SIERICI DELLA PROTEINA S-100
IN PAZIENTI SOTTOPOSTI A STENTING O
ENDOARTERIECTOMIA CAROTIDEA
1
1
2
1
3
D. Bozzato , F. Brotto , D. Basso , C. Mescoli , F.
1
1
1
1
Navaglia , P. Fogar , E. Fadi , E. Greco , C.
1
1
2
1
Zambon , E. Rossi , G. Guariso , M. Plebani
1
Dept. of Laboratory Medicine Univ. of Padova
2
Dept. of Pediatrics Univ. of Padova
3
Dept. of Medical Diagnostic Sciences and Special
Therapies Univ. of Padova
Background: For both adult and children a unique cut-off
is currently used for tTG.
Aim. To ascertain in children whether tTG diagnostic
performance could be enhanced by the identification of
age-related cut-offs.
Methods 423 children (291 females) with a clinical
suspicion of celiac disease (CD) were consecutively
subjected to EGD. CD was diagnosed (n=305) or ruled out
(n=118) on the basis of small bowel histological findings.
Fasting sera for tTG (Quanta Lite, INOVA Diagnostics)
and total IgA (Dade Behring GmbH) were obtained before
EGD. Total IgA deficiency was defined for values < 0.06
g/L. Diagnostic accuracy, negative (NPV), positive (PPV)
predictive value, were calculated.
Results: The 305 histologically proven CD patients had
also positive tTG results (>20 U as recommended by the
manufacturer). 12/118 children with negative histological
findings had positive tTG results: within a 2-year followup, 8 were CD diagnosed, while 4 remained negative.
Considering children overall, ROC curve analysis by using
the best DPR [sensitivity-(1-specificity)] allowed to identify
35 U as the best cut-off (sensitivity 96.7%, specificity
94.1%, PPV 97.7%, NPV 91.7%). Children were then
subdivided into 5 statistically comparable groups: group 1
(n=84; £ 3 yrs); group 2 (n=84; >3 and £ 5 yrs); group 3
(n=84; >5 and < 8 yrs); group 4 (n=79; ³ 8 and < 12 yrs);
group 5 (n=92; ³ 12 and £ 17 yrs). In each group tTG levels
were compared between CD and controls excluding those
children with total IgA deficiency. The best cut-offs were:
69.5 U in group 1 (sensitivity 97.3%, specificity 100%, PPV
100%, NPV 84.6%); 14.75 U in group 2 (100%, 88.9%,
98.7%, 100%); 21.16 U in group 3 ( 100%, 100%, 100%,
100%); 15.75 U in group 4 (100%, 96.9%, 97.9%, 100%);
54.15 U in group 5 (95.7%, 100%, 100%, 95.7%).
Discussion
Age related cut-off might significantly improve tTG
diagnostic accuracy in children. Higher cut-offs are
required for children less than 3 or more than 12 years.
Given the high sensitivity and specificity obtainable in
the pediatric age by age related cut-offs, this test among
symptomatic children might probably replace biopsy,
which should probably be deserved only to cases without
response to gluten-free diet.
1
1
1
R. Ledonne , F. Greco , R. Tenuta , M. Mauro , N.
1
2
2
1
Elia , E. Scarcello , F. Morrone , C. Giraldi
1
UOC Microbiologia e Virologia Clinica e Molecolare
P.O. Annunziata Cosenza
2
UOC Chirurgia Vascolare P.O. Annunziata Cosenza
Introduzione: S-100 è una proteina acida chelante il
calcio a basso peso molecolare (21 KDa), presente nel
tessuto nervoso di tutti i mammiferi . La determinazione
della proteina S100 nel siero è utile nella prognosi e
nel decorso clinico dei pazienti affetti da melanoma
maligno ed è inoltre indicata nella valutazione del
danno cerebrale secondario a: trauma, asfissia perinatale,
arresto cardiaco, chirurgia cardiaca e stroke. Scopo del
nostro studio è stato quello di determinare l’utilità clinica
e prognostica di S100 nel siero di pazienti sottoposti a
stenting (CAS) o endoarteriectomia (CEA) per stenosi
carotidea.
Metodi: dal 1° Dicembre 2009 al 1° Febbraio 2010, 25
pazienti, età media di 75 anni, sei di sesso femminile,
sono stati trattati per stenosi carotidea emodinamica
(22 mediante CAS e 3 mediante CEA, 1 per eversione
e 1 con posizionamento di patch) nell’UO di Chirurgia
Vascolare dell’Azienda Ospedaliera (AO) di Cosenza.
N.12 pazienti erano sintomatici e due, entrambi sottoposti
a CAS, hanno presentato minor stroke. In tutti è stato
eseguito, presso l’UOC di Microbiologia e Virologia
Clinica e Molecolare di Cosenza, il dosaggio sierologico
della proteina S-100 con la strumentazione LIAISON®
(DiaSorin Saluggia-VC) presente nel laboratorio, insieme
alla valutazione neuroradiologica mediante TAC encefalo
o RMN diffusione, prima e dopo l’intervento chirurgico.
Risultati: l’analisi dei dati evidenzia una prevalenza di
complicanze neurologiche, pari al 24%. La specificità
del test, superiore all’84%, indica come S100 sia un
marcatore biochimico sufficientemente efficace di danno
cerebrale. Nella nostra indagine, infatti, la percentuale dei
falsi positivi è risultata inferiore al 16%, con una probabilità
superiore al 66% (VPP) nell’identificazione dei pazienti
con danno neurologico, e un VPN pari al 100% in quelli
esenti da complicanze neurologiche.
Conclusioni: il monitoraggio della proteina S100 è risultato
di grande utilità clinica nella prognosi dei pazienti con
sequele neurologiche clinicamente non rilevabili. Sulla
base di queste osservazioni, è auspicabile l’avvio un
protocollo diagnostico che preveda, per questi pazienti,
insieme all’esecuzione sistematica postprocedurale di
indagini radiologiche dell’encefalo, la valutazione dei livelli
plasmatici di S100.
479
183
REFERENCE CHANGE VALUE (RCV) OF 25
HYDROXYVITAMIN D TO ESTIMATE THE CRITICAL
DIFFERENCES FOR SIGNIFICANT CHANGES IN
SERIAL RESULTS
184
DISTRIBUZIONE DEI VALORI DELL’ISOENZIMA
OSSEO DELLA FOSFATASI ALCALINA IN UNA
POPOLAZIONE DI RIFERIMENTO
1
1
1
1
1
V. Brescia , M. Tampoia , A. Mileti , G. Urso , F. Di
1
Serio
1
Background. Recently, vitamin D analogs have been
introduced for the treatment in many diseases. When a
molecular marker is used to detect changes in patient’s
health status or response to treatment, the best way
to detect analytical changes consists in the comparison
between serial results, rather than a comparison with
population-based reference ranges. Data on biological
variation assess the utility to estimate the critical
differences for significant changes detection. Since there
is no evidence in literature on the use of the biological
variability data for 25-hydroxyvitamin D (25OH-D) (1).
Objective. To determine the biological variations of 25hydroxyvitamin D.
Methods. We took blood specimens from 11 apparently
healthy laboratory workers (6 women, 5 men, age
range 33–50 years, mean 42.5),once a week for 12
weeks. All samples were analyzed in a single run in
duplicate. 25OH-D concentrations were determined by
chemiluminescent analyzer Liaison (DiaSorin). On the
same samples we have been determined i-PTH, Ca and
P. The intra-individual (CVI) and interindividual (CVG)
biological variation were calculated by nested ANOVA
and subtraction analytical variation calculated according
to NCCLS EP15-A2. The reference change value (RCV)
and the index of individuality (II) were derived using the
following formulae: RCV =2.77(CVI ); II= CVI / CVG .
Results. The media were respectively 24.32 ng/mL (range
15.6 to 35.2) for 25OH-D, 25.98 pg/mL (14.8 to 36.3)
for i-PTH, 9.31 (8.6 to 11.8) mg/dL for Ca and 3.75 mg/
dL (range 2.8 to 4.8) for P. The intra-individual variability
(CVI) produced by 25OH-D, i-PTH, Ca and P were
respectively 4.71%, 14.88%, 3.12%, 10.14%. The interindividual (CVG), was of 64.39% for 25OH-D, 22.42% for iPTH, 5.09% for Ca and 26.21% for P. The RCV calculated
for 25OH-D, i-PTH, Ca and P were respectively 18.02%,
42.61%, 9.41% and 29%.
Conclusions. The individuality index of 25OH-D was close
to 0.6 showing that the RCV is adequate for interpretation
of serial results from a patient. Our study on biological
variation demonstrate that the applicable differences
required for two results to detect a response to 25OH-D
replacement therapy is great of 18,2% (RCV).
1. Westgard: http://www.westgard.com/biodatabe1.htm
480
1
1
A. Fortunato , C. Marchetti , G. Soffiati
1
Lab. di Chimica clinica ed Ematologia, Osp. "San
Bortolo" - Vicenza
Scopo del lavoro: L’isoenzima osseo della fosfatasi
alcalina (bALP) è associato alla mineralizzazione
dell’osso ed è un ottimo marcatore dei processi
di neoformazione nello studio delle malattie
osteometaboliche. In questo lavoro è stata verificata
la distribuzione delle concentrazioni di bALP in una
popolazione di soggetti presunti sani, inoltre è stata
verificata la correlazione tra due metodi commerciali.
Materiali e metodi: due sistemi automatizzati (DXi 800BeckmanCoulter e Liaison-DiaSorin) sono stati utilizzati
per misurare la bALP in 182 soggetti, selezionati per
assenza di patologie acute o croniche e non assunzione
di terapie farmacologiche: 90 uomini con età compresa
tra 18 e 40 anni (media 29,2 - IC 95%: 27,8-30,6) e
92 donne, non in menopausa, con età tra 20 e 40 anni
(media 31,2 - IC 95%: 29,9-32,5) e in 77 pazienti afferenti
al laboratorio con richiesta di determinazione di bALP
per motivi diagnostici con età media di 65 anni (IC 95%:
62-68).
Risultati: nella popolazione di riferimento (n. 182 soggetti)
le concentrazioni di bALP negli uomini erano comprese
tra 3,9 e 29,4 µg/L (media 13,4 -IC 95%: 12,4-14,5) e
tra 2,1 e 38,1 µg/L (media 15,5 - IC 95%: 14,2-16,8);
nelle donne tra 5,0 e 37,4 µg/L (media 10,7 - IC 95%:
9,7-11,8) e tra 4,5 e 39,6 µg/L (media 11,7 - IC 95%:
10,5-14,9) rispettivamente con DXi800 e con Liaison.
L’estrapolazione degli intervalli di riferimento al 95°le,
da questi dati, indica per gli uomini valori massimi di
25,0 e 28,0 µg/L e per le donne di 20,6 e 26,7 µg/L
rispettivamente con DXi800 e con Liaison. Il confronto
dei due metodi sui risultati dei complessivi 259 campioni
(soggetti di riferimento e con patologia) ha dimostrato
una retta di regressione, secondo Passing e Bablok, con
equazione y(Liaison)=1,4x(DXi800) - 2,4 e coefficiente di
correlazione di 0,722 (IC 95%: pendenza da 1,3 a 1,5,
intercetta da -3,3 a -1,4, correlazione da 0,676 a 0,764).
Discussione e conclusioni: nella nostra esperienza si
conferma una differenza di intervalli di riferimento tra i due
metodi, sia per gli uomini che per le donne, come riportato
negli inserti di prodotto.
Nello studio di correlazione, in particolare con il
diagramma di Bland e Altmann, si evidenzia che la
sovrastima di un metodo rispetto all’altro è maggiore
all’aumentare delle concentrazioni misurate.
185
ANDAMENTO DEI MARKERS INFIAMMATORI DOPO
INTERVENTO DI BYPASS AORTOCORONARICO
1
2
1
186
CEREBRAL AND EXTRA-CEREBRAL
CHOLESTEROL BIOSYNTHESIS IS IMPAIRED IN HD
PATIENTS
1
M. Brugia , M. Pierri , V. Scocco , M. Tocchini
1
Lab. Biochimica Clinica e Microbiologia. A.O. Riuniti
Ancona
2
Cardiochirurgia A.O. Riuniti Ancona
Introduzione Scopo dello studio è valutare l’andamento
dei principali markers infiammatori dei pazienti sottoposti
ad intervento di rivascolarizzazione miocardica mediante
circolazione extracorporea. Sono stati inclusi solo i
pazienti programmati per essere sottoposti ad intervento
elettivo di bypass aortocoronarico.
Materiali e metodi Nel periodo 01/10/2007 al 30/06/2010
sono stati studiati prospetticamente 232 pazienti (193
maschi e 39 femmine) età media 71 anni. Sono stati
determinate proteina C reattiva (nefelometria ad alta
sensibilità Behring), interleuchina-6 e interleuchina-10
(Medical Systems ) prima dell’intervento, dopo 12 e 24
ore e i globuli bianchi prima dell’intervento chirurgico, in
prima, seconda e quarta giornata.
Risultati
I
marker
dell’infiammazione
si
modificano
significativamente nel periodo post-operatorio ed in
modo differenziato. La concentrazione dell’interleuchina-6
aumenta dopo poche ore dall’intervento, raggiunge il
picco a 12 ore per poi ridursi e tornare nella norma
successivamente. La proteina C inizia ad aumentare dopo
12 ore dall’intervento e raggiunge il picco dopo 24 ore e
si mantiene elevata fino alla dimissione. L’aumento dei
globuli bianchi si registra in prima giornata.
Il 3% dei pazienti ha avuto complicanze di tipo respiratorio.
Conclusioni
Il bypass cardiopolmonare determina un’attivazione
significativa dei processi infiammatori
che possono essere monitorati con i dosaggi seriali di
interleuchina 6, 10 e PCR.
1
1
1
1
V. Leoni , C. Mariotti , L. Nanetti , C. Tomassello , E.
2
3
3
Salvatore , F. Soletti , A.R. Bentivoglio , M. Bandettini
4
5
6
1
del Poggio , S. Piacentini , F. Squiteri , S. Di Donato
1
Unit of genetic of neurodegenerative and metabolic
diseases, IRCCS National Institute of Neurology Ć.
Besta´
2
Dept of Neurological Science, University of Napoli, Italy
3
Università Cattolica del Sacro Cuore, Istituto di
Neurologia, Roma, Italy
4
Dept. of Neuroscience Ophtalmology and Genetics,
University of Genova
5
Department of Neurology, University of Florence,
Florence, Italy.
6
Neuropharmacology Unit, IRCCS Neuromed, Pozzilli,
Italy.
Background. Cholesterol in CNS is fundamental
for membrane trafficking, signal transduction and
synaptogenesis. Almost all the brain cholesterol is
locally synthetised. Homeosthasis is maintained through
a neuronal-specific cholesterol 24-hydroxylase which
converts cholesterol into 24-hydroxycholesterol (24OHC).
The levels of 24OHC in plasma thus reflect the number of
active neurons and the volume of grey matter.
We previously found that plasma levels of 24OHC were
progressively reduced in early Huntington’s disease (HD)
(1), and that cholesterol biosynthesis was significantly
impaired in the brain of multiple mouse HD models and in
fibroblasts from HD patients.
Methods We analyzed by isotope dilution mass
spectrometry the plasma levels of cholesterol precursor
lathosterol and lanosterol (marker of cholesterol
biosynthesis), 24OHC and bile acid precursor 27hydroxycholesterol, in 130 HD gene-positive subjects
(from pre-symptomatic to advanced stage of disease).
Results We found that the plasma levels of lathosterol
and lanosterol, together with 24OHC and 27OHC were
reduced in all HD patients compared to healthy controls
(P<0.001).
Conclusion Whole-body cholesterol synthesis and brainderived 24OHC were significantly decrease following the
disease burden. We suggest that the early reported
significant decrease of plasma 24OHC levels in early
HD (1) is associated with two concurrent mechanisms,
i.e. the progressive loss in grey matter linked to the
neurodegenerative process and the impairment in brain
cholesterol biosynthesis, in agreement with our previous
findings across multiple rodent models of Huntington’s
disease .
1. Leoni et al. Brain 2008;131:2851-9.
481
187
FAMILIAL HYPERCHOLESTEROLEMIA: A FLOW
CHART FOR THE MOLECULAR DIAGNOSIS
1
1
3
M.N. D'Agostino , M. Romano , M.D. Di Taranto , G.
4
4
4
2
Marotta , M. Gentile , P. Rubba , G. Fortunato
1
Ceinge s.c.a.r.l. Biotecnologie Avanzate, Napoli
2
Dip. di Biochimica e Biotecnologie Mediche, Università
degli Studi di Napoli Federico II, Napoli
3
Fondazione IRCCS SDN, Napoli
4
Dip. di Medicina Clinica e Sperimentale, Università
degli Studi di Napoli Federico II, Napoli
Introduction – Monogenic dyslipidemias are mainly
responsible for the elevation of LDL-cholesterol such as
Familial Hypercholesterolemia (FH). The LDL receptor
(LDLR) gene is the locus mainly involved in FH while
the Apoliprotein B (ApoB) and Proprotein Convertase,
Subtilisin/Kexin-type 9 (PCSK9) genes are involved in
a lower percentage of cases. Recently the international
diagnostic criteria for FH (Minhas R. et al. Heart
2009;95:584-591) include the differentiation between
“definite FH” and “possible FH” in relation to clinical
features and family history. A definite FH is diagnosed
if major alterations of cholesterol levels are present in
the suspected patients in addition to the presence of
tendon xanthomas in a first- or second-degree relative.
Mild clinical features in patient’s relatives lead to the
classification as possible FH. The identification of a
causative mutation in above-mentioned genes constitute
an unique criterion for the diagnose of definite FH.
Materials and Methods – 89 unrelated patients from
Southern Italy with clinically diagnosed FH were enrolled.
The promoter and the 18 exons of the LDLR gene were
amplified by PCR and directly sequenced. To confirm
splicing mutations, we performed RT-PCR analysis on the
mRNA.
For detection of large rearrangements, copy number
quantification of the 18 exons of the LDLR gene was
performed by the SALSA MLPA P062C1 kit (MRCHolland). Long-PCR have been carried out in order to
confirm large rearrangements.
Results and conclusions – We screened 89 unrelated
FH patients for mutations in the LDLR gene. Direct
sequencing of the promoter and encoding regions of
the LDLR gene revealed mutations in 60/89 patients
(mutation rate 67.4%). In the 29 patients without
detectable mutations at sequence analysis, we carried
out an MLPA analysis to search for large rearrangements
and found gross deletions in 5/29 subjects. Using these
two methods, we identified mutations in 65/89 subjects
(mutation rate 73.0%).
Our results indicate that large rearrangements of LDLR
gene are responsible of FH in more than 5% of patients
suggesting that genetic screening for FH disease should
include the detection of large rearrangements.
Acknowledgements – CEINGE Convenzione Regione
Campania, DGRC 1901/2009
482
188
AUMENTATI LIVELLI DELLA SOMOCISTEINILAZIONE DELLE LDL NELLA
MALATTIA RENALE CRONICA
1
2
3
1
C. Carru , A. Zinellu , G. Loriga , B. Scanu , E.
1
1
3
1
Pisanu , M. Sanna , A.E. Satta , L. Deiana
1
Dip. Scienze Biomediche, Univ. di Sassari
2
Porto Conte Ricerche Srl, Tramariglio, Alghero
3
Dip. Medicina Interna, Univ. di Sassari
Recenti studi hanno dimostrato che l’omocisteinilazione
delle LDL aumenta l’ aterogenicità delle lipoproteine
suggerendone, in particolare, un ruolo nelle patologie
croniche renali, nelle quali l’elevata concentrazione di
lipidi fortemente contribuisce ad un eccesso di morbilità e
di mortalità.
Nel nostro studio sperimentale, mediante l’utilizzo della
elettroforesi capillare, abbiamo effettuato le misura
dei tioli legati alle LDL [omocisteina (Hcy), cisteina
(Cys), cisteinilglicina (Cys-Gly); glutatione (GSH) e della
glutamilcisteina (Glu-Cys)] in 30 pazienti affetti da malattia
renale cronica e in 60 soggetti di controllo. Sono anche
state effettuate le determinazione dei tioli plasmatici totali
e il profilo lipidico. Sono stati riscontrati aumentati livelli
di Hcy, Cys, GSH e Glu-Cys plasmatici totali nei pazienti
rispetto ai controlli; sono risultati significativamente
aumentati anche i valori di Hcy e Cys legati alle LDL nei
soggetti nefropatici mentre erano bassi i livelli di apoBGSH, apoB-Glu-Cys e apoB-Cys-Gly. Utilizzando un test
di regressione lineare multipla, abbiamo rilevato che, nei
soggetti sani, la Hcy totale plasmatica era il determinante
più importante della Hcy legata alla LDL e che la CysGly era associata negativamente con la concentrazione di
apoB-Hcy.
Nella malattia cronica renale il più importante
determinante della S-omocisteinilazione è risultata la
creatinina mentre la Hcy plasmatica totale era debolmente
associata con apoB-Hcy; inoltre in questi pazienti
la Cys-Gly era inversamente correlata con la Somocisteinilazione, suggerendo un ruolo protettivo di
queste molecole verso la S-omocistenilazione delle LDL.
L’aumento dei livelli di S-omocisteinilazione delle LDL
osservato nei pazienti con malattia renale cronica, in
considerazione anche di nostre precedenti osservazioni
sperimentali sulla tossicità della modificazione delle
lipoproteine, potrebbe spiegare, almeno in parte,
l’aumentato rischio di malattia cardiovascolare nei
pazienti partecipanti allo studio.
189
DETERMINAZIONE DELLA MALONDIALDEIDE
PLASMATICA MEDIANTE ELETTROFORESI
CAPILLARE CON DETECTOR UV
1
2
3
1
E. Pisanu , A. Zinellu , S. Manca , L. Murgia , A.
1
1
1
1
1
Mannu , M. Sanna , B. Scanu , L. Deiana , C. Carru
1
Dip. di Scienze Biomediche, Univ. di Sassari
2
3
Lab. di Base, Azienda ASL 1, Sassari
Un passo importante nella degradazione delle membrane
cellulari è la reazione di specie reattive dell'ossigeno con
i doppi legami di acidi grassi polinsaturi per generare
idroperossidi lipidici. Si possono dunque generare una
grande varietà di aldeidi, relativamente stabili e allo stesso
tempo biologicamente attive, e pertanto considerati come
''citotossici e secondi messaggeri''. Il danno determinato
dai radicali liberi dell’ossigeno sulla per ossidazione
lipidica gioca un ruolo chiave nell’eziologia di alcuni
disturbi come diabete, aterosclerosi, cancro e morbo
di Parkinson. Purtroppo la misurazione diretta della
produzione dei radicali liberi risulta assai complessa,
per questo la misurazione della perossidazione lipidica
è diventata una tecnica comunemente utilizzata per
valutare lo stress ossidativo. La determinazione della
malondialdeide (MDA) è il metodo più utilizzato per il
monitoraggio della perossidazione lipica. È stata messa
a punto una semplice metodica con campo d’iniezione
amplificato del campione (field amplified sample injection,
FASI) in elettroforesi capillare con detection UV per la
separazione e misurazione della malondialdeide libera
nel plasma. La rilevazione avviene in meno di 8 minuti,
utilizzando come buffer di corsa un tampone Tris-Fosfato
200 mmol/L a pH 5,0. i campioni di plasma vengono trattati
con acetonitrile che consente la precipitazione delle
proteine e il surnatante viene direttamente iniettato senza
particolari procedure di purificazione o derivatizzazione.
Utilizzando l’iniezione elettrocinetica il limite di detection
di un campione reale è di 3 mmol/L; dunque è stato
migliorato di circa 100 volte il limite di detection (LOD)
rispetto ai saggi in elettroforesi capillare già presenti
in letteratura. I test di precisione indicano una buona
ripetibilità del nostro metodo, sia per quanto concerne
i tempi di migrazione (CV=1,11%), sia per quanto
riguarda le aree sottese ai picchi (CV=2,05%). Inoltre è
stata ottenuta anche una buona riproducibilità intra- ed
inter-saggio (CV=2,55% e CV=5,14% rispettivamente).
L’adeguatezza del metodo è stata testata misurando i
livelli di MDA in 44 soggetti sani.
190
TROPONIN DETERMINATION IN ELDERLY
PATIENT WITHOUT CHEST PAIN IN EMERGENCY
DEPARTMENT
1
1
1
2
N. Bettinardi , I. Felicetta , B. Luppi , F. Porro , E.
1
Torresani
1
U.O. Central Laboratory, Fondazione IRCCS Ca'
Granda, Ospedale Maggiore Policlinico. Milan, Italy
2
U.O. Emergency Medicine, Fondazione IRCCS Ca'
Granda, Ospedale Maggiore Policlinico. Milan, Italy
Background. Troponin (Tn) is recognized as the best
biomarker for detecting miocardial damage. Chest pain is
the most common presenting symptom for patients with
unstable coronary syndromes or myocardial infarction
(MI); it is also known that elderly patient should have Tn
elevation not due to acute coronary syndrome (ACS) but
to causes well-recognized.
Aim. Verify if TnT request is inappropriate in elderly patient
presenting in emergency department (ED) without chest
pain.
Method. Over a 1-month period we consulted electronic
clinical records from the ED presentation to discharged of
all patients aged ≥65 years (min 65 years, max 101 years,
mean age: 82,8 years; M/F: 47/53) with TnT request and
without chest pain (n=100); we recorded the discharge
diagnoses and we matched them with TnT concentrations
(negative: <0,03 ng/mL, positive: ≥0,03 ng/mL). In patients
with positive TnT and a final diagnoses (no ACS) that did
not match with TnT result, we noted evidences of known
causes of raised TnT.
Results. 17 patients had TnT negative: 16 of them had
also normal ECG, and the only patient with abnormal ECG
dead of cerebral hemorrhage. 21 patients had positive
TnT and final diagnoses (ACS) matched with that. 62
patients had TnT positive and discharge diagnoses did
not match with TnT result (TnT elevation in absence
of ischemic heart disease); about the remaining 7
patients, the discharge diagnoses were: acute pulmonary
edema (n=2), syncope (n=2), atrial flutter (n=1) and
electrolyte disturbances (n=1); one patient died without
any diagnosis.
Conclusion. In elderly patients without chest pain we
found 21% with positive TnT and ACS as discharge
diagnosis; all these patients had ECG characteristic
of IMA. Specialized literature recommended that in
patients with diagnostic ECG abnormalities, diagnosis and
treatment should not be delayed while awaiting TnT result
(level of evidence: C). We concluded that TnT request is
not necessary to diagnose AMI in elderly patients without
chest pain; on the contrary, in this population, because
of possible TnT elevation in absence of ischemic heart
disease (55%), TnT determination could be a confounding
in diagnostic process.
References. NACB Practice Guidelines: Clinical for
Biomarkers in ACS. Circulation 2007; 115:356-375
483
191
LA TROPONINA NELLA VALUTAZIONE DELLA
CARDIOTOSSICITA' DA CHEMIOTERAPICI
1
1
1
2
B. Morrocchi , D. Veggi , F. Balboni , F. Innocenti , A.
3
2
Fanelli , G. Bellesi
1
Lab. Analisi Chimico-Cliniche, IFCA, Firenze
2
DH Ematologia, IFCA, Firenze
3
Dip. Diagnostica di Laboratorio, Lab. Generale,
Az.Osp.Univ. Careggi, Firenze
Negli ultimi anni le strategie per la cura oncologica
hanno compiuto notevoli passi, nonostante ciò i farmaci
antitumorali, proprio per il loro meccanismo di azione,
restano fra le sostanze più tossiche per l’apparato
cardiovascolare.
La cardiotossicità secondaria alla terapia antitumorale
rappresenta un importante fattore che condiziona la
terapia e il decorso della malattia.
Scopo del lavoro è stato quello di valutare il ruolo
del dosaggio della TnI nell'individuazione pre-clinica del
danno cardiaco nei pazienti ricoverati da Settembre 2009
presso il DH ematologico della nostra struttura e sottoposti
a CTAD, al fine di poter gestire al meglio la terapia
e instaurare un trattamento cardioprotettivo capace di
controllare gli effetti dannosi della terapia.
I dosaggi della TnI sono stati effettuati su 36 pazienti ( 27
LNH, 3 LLC, 6 HDG) utilizzando il metodo RPIA Stratus
CS , prima e dopo ogni ciclo chemioterapico, seguendo
I protocolli terapeutici del reparto che si differenziano in
base alla patologia.
I risultati sono stati I seguenti: 27 pazienti hanno mostrato
nel periodo di osservazione sempre TnI negativa e
nel follow up non è stata riscontrata alcuna riduzione
significativa della FEV ne evento cardiaco avverso, in un
paziente è stato rilevato un aumento transitorio della TnI
ed è tuttora in monitoraggio cardiologico.
Un paziente ha mostrato un aumento significativo dei
livelli sierici di TnI per un mese e nei monitoraggi
cardiologici di controllo è stata riscontrata una riduzione
significativa della FEV fino al 20% con conseguente
interruzione della terapia.
L'assenza, la presenza e la persistenza di valori di TnI
positivi ci consente di discriminare tra pazienti a più alto
rischio di sviluppare cardiotossicità e quelli con una buona
prognosi cardiologica.
L'alto valore predittivo negativo della TnI permette infatti
di identificare con sicurezza i pazienti a basso rischio di
cardiotossicità, che rappresentano la maggior parte dei
soggetti sottoposti a CTAD , consentendo di riservare
le risorse necessarie per una stretta sorveglianza
cardiologica ai soli pazienti positivi.
Cardinale D, Sandri MT, Colombo A, et al. Prognostic
value of troponin I in cardiac risk stratification of
cancer patients undergoing high-dose chemotherapy.
Circulation. 2004;109:2749-54.
484
192
COMPARISON OF NT-proCNP AND CNP PLASMA
LEVELS IN ENDOTHELIAL DYSFUNCTION-LINKED
DISEASES
1
2
1
1
S. Del Ry , M. Cabiati , S. Turchi , G. Catapano , C.
1
1
1
1
Caselli , T. Prescimone , C. Passino , M. Emdin , D.
1
Giannessi
1
CNR Institute of Clinical Physiology and Fondazione G.
Monasterio CNR-Regione Toscana, Pisa, Italy;
2
Dept. of Medicine, Scuola Superiore Sant’Anna, Pisa,
Italy.
Background. C-type natriuretic peptide (CNP) plays
a central role in clinical conditions characterized by
endothelial dysfunction. CNP plasma levels are extremely
low and a pre-analytical phase is necessary to assay
plasma CNP concentrations. Amino-terminal CNP (NTproCNP) circulates at higher concentrations than CNP,
allowing a direct assay and the use of smaller amounts of
plasma.
Aim. To evaluate the analytical performance of a
direct NT-proCNP assay and to measure its plasma
levels in clinical conditions characterized by endothelial
dysfunction.
Methods. NT-proCNP and CNP were measured in 246
subjects: 130 with chronic heart failure (CHF), 19 with
diabetes, 24 with hepatic cirrhosis and 73 controls.
Results. Plasma NT-proCNP was higher in all
the clinical conditions studied with respect to
controls (controls:45.5±1.84 pg/ml, CHF:67.09±7.36,
diabetes:51.5±5.75 cirrhosis:78.4±19.9; p=0.034, p=0.04
CHF and cirrhosis vs. controls, respectively). In CHF
patients NT-proCNP concentrations showed a significant
increase as a function of clinical severity.
By comparison of ROC curves, CNP assay resulted better
associated with disease than NT-proCNP assay in all the
different clinical condititions.
Conclusions.
Although
NT-proCNP
analytical
performance is satisfactory, CNP is better in
discriminating between disease and normality. Only after
its diagnostic power will be well assessed, it will be
possible to use reliably NT-proCNP assay instead of CNP.
Ref: Prickett TCR, et al.. Identification of amino-terminal
pro-C-type natriuretic peptide in human plasma. Biochem
Biophys Res Commun 2001; 286:513-17.
193
EVALUATION OF DIAGNOSTIC ACCURACY OF BNP
FOR CONGENITAL HEART DISEASE IN NEWBORNS
AND INFANTS
1
1
1
194
VALUTAZIONE E CONFRONTO DELLE
PERFORMANCE ANALITICHE E DEGLI INTERVALLI
DI RIFERIMENTO DELLA TROPONINA T ED I AD
ALTA SENSIBILITÀ
1
S. Storti , M. Cantinotti , C. Prontera , S. Giovannini , L.
1
1
1
2
Zyw , M. Crocetti , B. Murzi , A. Clerico
1
Pisa
2
In order to evaluate the diagnostic accuracy of BNP
assay in the diagnosis of congenital heart disease (CHD)
we measured plasma BNP in 188 apparently healthy
newborns and infants throughout the first month of extrauterine life, as well as in 245 healthy infants with age
ranging from 1 month to 12 years. Furthermore, we
measured plasma BNP n 152 neonates with CHD; 154
healthy children, matched for age, were used as controls
for diagnostic accuracy testing by ROC analysis. BNP
was measured with a fully automated platform (Triage
BNP reagents, Access Immunoassay Systems, Beckman
Coulter, Inc.).
In healthy newborns and infants, BNP levels are highest
in the first three days of life with a rapid fall in the next
days of the first month of life. According to these data
some age-dependent upper limits of reference values for
BNP assay should be taken into account in newborns and
infants. BNP values were significantly higher (p < 0.0001)
in newborns and infants with CHD than healthy subjects
(CHD patients: median 1167.5 ng/L, range 25-54447 ng/
L; healthy subjects: median 150.5 ng/L, range 5-866 ng/
L). The diagnostic accuracy of BNP assay was assessed
by ROC analysis taking into account three different groups
divided according to age. Group 1: all CHD patients and
healthy newborns and infants as a whole (i.e., from birth
to the 30th day of life); Group 2: from the first to the third
day of life; Group 3: from the 4th to the 30th day of life.
The AUC of the ROC curve of Group 3 (0.935) was found
to be significantly higher than those of Group 1 (0.843,
p = 0.009) and Group 2 (0.769, p = 0.0003), while the
AUC values of Group 1 and Group 2 were not significantly
different (p= 0.191).
In conclusion, the accuracy of BNP assay can greatly vary
during the first month of extra-uterine life, showing the
lowest diagnostic accuracy in the first 3 days after birth.
After the second week of life the biomarker becomes more
accurate in ruling in CHD.
1
3
3
1
C. Prontera , A. Mercuri , G. Zucchelli , S. Storti , S.
3
1
2
Giovannini , S. Turchi , A. Clerico
1
Pisa
2
3
In accordo con le linee guida, abbiamo calcolato i valori
del 99° URL per alcuni metodi di dosaggio della cTnI e
cTnT di nuova generazione in più di 200 soggetti adulti
apparentemente sani (54% maschi). Sono stati valutati
i seguenti metodi: TnI-Ultra (ADVIA CP®, Siemens
Medical Solutions Diagnostics SrL), Access AccuTnITM
(UniCell® DxI 800, Beckman Coulter), HS-cTnT (Roche
Diagnostics) e cTnT standard (Roche Diagnostics).
I metodi ad alta sensibilità per la troponina I (TnI-Ultra
ADVIA) e T (HS-cTnT) hanno mostrato performance
analitiche in linea con quanto richiesto dalle linee guida
internazionali, in quanto il 99° URL risulta misurato con
imprecisione inferiore al 10% CV (TnI-Ultra ADVIA, 99°
URL = 87 ng/L, 10% CV = 57 ng/L; HS-cTnT 99° URL
= 37 ng/L, 10% CV= 13 ng/L). Il metodo standard per il
dosaggio della cTnT ha mostrato valori non dosabili in
tutti i campioni testati nei soggetti normali. Infine, il valore
del 99° URL è 70 ng/L per il metodo cTnI Access con un
10% CV=70 ng/L. I valori di cTnI e cTnT misurati con i
differenti metodi erano significativamente correlati fra di
loro (p<0.001). E’ stata trovata una correlazione altamente
significativa fra l’età ed i valori di cTnI, misurati con il
metodo ADVIA (Rho= 0.527, p<0.0001), e quelli di cTnT,
misurati con il metodo HS (Rho=0.336, p<0.0001). E’ stata
anche trovata una correlazione altamente significativa fra
i valori di NT-proBNP (misurati con la piattaforma Elecsys,
Roche Diagnostics) ed i valori di cTnI, misurati con i
metodi ADVIA (Rho= 0.346, p<0.0001), e quelli di cTnT,
misurati con il metodo HS (Rho=0.301, p<0.0001).
In conclusione, si conferma che soggetti adulti
apparentemente sani presentano valori misurabili di cTnI
e cTnT se si utilizzano per il dosaggio metodi ad alta
sensibilità di nuova generazione. Si conferma inoltre che
i valori di riferimento dipendono oltre che dal metodo di
dosaggio anche dall’età dei soggetti testati.
485
195
DIFFERENTE REGOLAZIONE DI ANP E BNP
IN PAZIENTI CON PATOLOGIE CARDIACHE
ACQUISITE E CONGENITE
196
CARDIAC INJURY MARKERS IN NON-ELITE
ULTRAENDURANCE RUNNERS
1
1
1
3
C. Prontera , M. Fontana , A. Mercuri , S.
3
2
1
1
Giovannini , C. Passino , M. Emdin , P. Festa , L. Ait1
3
2
Ali , G. Zucchelli , A. Clerico
1
Pisa
2
3
Nel presente studio abbiamo misurato il peptide proANP
ed il peptide NT-proBNP allo scopo di valutare se l’utilizzo
combinato di questi due biomarcatori potesse migliorare
la discriminazione fra patologie acquisite cardiache da
quelle congenite, in particolare la tetralogia di Fallot.
Per la determinazione del proANP abbiamo utilizzato il
metodo immunofluorescente B.R.A.H.M.S (Hennigsdorf,
Germany) sul sistema KRYPTOR, che utilizza due
anticorpi che riconoscono il segmento peptidico regionale
medio del peptide (MR-proANP). La determinazione
di NT-proBNP è stata eseguita mediante il metodo
elettrochemiluminescente (ECLIA, Elecsys Roche). Sono
stati arruolati 115 pazienti con differente grado di
scompenso cardiaco (età media±SD: 67.15±14.68 anni)
e 68 con tetralogia di Fallot (età media±SD: 18.87±9.3
anni). Mediamente, i valori di entrambi i peptidi sono più
elevati (p<0.0001) nei pazienti con scompenso cardiaco
conclamato (HF) che nei pazienti con tetralogia di Fallot
(HF, media±SE: NT-proBNP 505.7± 60.5 pmol/L, MRproANP 376.3±23.9 pmol/L; Fallot: NT-proBNP 20.7±64.4
pmol/L, Mr-proANP 97.8±25.4 pmol/L). Tuttavia, il
rapporto fra i valori di NT-proBNP e quelli di MR-proANP
risulta significativamente differente nei due gruppi di
pazienti (HF 1.08±0.08, Fallot 0.24±0.09; p < 0.0001).
L’analisi mediante curve ROC indica che il rapporto NTproBNP/MR-proANP discrimina fra scompenso cardiaco
sintomatico e teratologia di Fallot (AUC 0.90).
I nostri risultati mostrano che la produzione e/o la
degradazione periferica del MR-proANP e del NT-proBNP
sono differenti nei pazienti adulti con scompenso cardiaco
conclamato rispetto ai pazienti con tetralogia di Fallot,
indicando una differente regolazione dei due sistemi
principali di peptidi natriuretici cardiaci (ANP e BNP)
nelle diverse malattie cardiache. Pertanto, il nostro
studio suggerisce che la misura di differenti peptidi
natriuretici cardiaci potrebbe essere utile nell’evidenziare
differenze nei meccanismi fisiopatologici e/o nei parametri
emodinamici dei pazienti con malattie cardiovascolari di
differente etiologia.
486
1
2
1
S. Cauci , L. Debellis , G. Stel , S. Lazzer , D.
1
1
1
Salvadego , R. Guerra , P.E. di Prampero , G.
1
Antonutto
1
Dip. Scienze e Tecnologie Biomediche, Scienze
Motorie Gemona e Facoltà di Medicina e Chirurgia, Univ.
di Udine, Udine, Italy.
2
Dip. di Patologia e Medicina Sperimentale e Clinica,
Facoltà di Medicina e Chirurgia, Univ. di Udine, Udine,
Italy.
Introduction. An elevation of cardiac injury markers
including creatinine kinase (CK), myoglobin (Myo) and
cardiac troponin (cTn) especially cTnT has been observed
in elite athletes following strenuous exercise. The
mechanism and significance of this observation however
have not been fully elucidated.
Aim. The goals of this study were: 1) to determine the kind
and amount of changes in plasma biomarkers in non-elite
athletes; and 2) to identify possible clinical or biochemical
associations.
Methods. We recruited 10 non-elite runners in 2009,
performing a 3 days long race (23 km on day 1, 49 km on
day 2 and 19 km on day 3). Demographic data and blood
samples were collected for analysis of CK, CKMBm, Myo,
cTnI, and Creatinine (Cr) levels within two hours of race
start (baseline), at race completion, and 5 days post-race.
Results. All subjects exhibited significant elevations in
Myo (P <0.001) , CK (P <0.001), CKMBm (P <0.001),
cTnI (P = 0.03) and Cr (P = 0.02) immediately postrace. However, the CKMBm/CK ratio did not differ. All
biomarkers returned to baseline (pre-race) values 5 dayspost race.
Conclusion. Dramatically elevated values of plasma
biomarkers normally associated with cardiac damage
likely do not indicate real cardiac injury as highlighted
by the absence of CKMBm/CK variation. The modest
elevation in cTnI levels post-race is likely a non-specific
phenomenon in marathon runners. However, whether the
increase in the levels of these enzymes represents true
subclinical myocardial injury or a result of the release of
cTnI from the myocytes (or other cells) requires further
investigation.
197
CIRCULATING LEVELS OF ADIPONECTIN ARE
CORRELATED WITH CARDIOVASCULAR RISK
SCORES AND WITH THE PREVALENCE OF
CORONARY ARTERY DISEASE DETECTED BY CT
ANGIOGRAPHY
1
2
3
C. Caselli , M. Coceani , T. Prescimone , M.
1
4
5
7
Schlueter , M. Cabiati , M. Bianchi , S. Del Ry , A.
7
6
7
7
Mazzarisi , F. Cocci , P. Marraccini , D. Giannessi
1
CNR Institute of Clin. Physiol. Pisa Italy
2
Fondazione Toscana Gabriele Monasterio Pisa Italy
3
Università di Siena
4
Scuola Superiore S. Anna
5
AUOP
6
Università di Pisa
7
CNR Institute of Clin. Physiol. and Fondazione Toscana
G. Monasterio Pisa Italy
198
LIMITI DECISIONALI PER LA TROPONINA I,
VALUTAZIONE ANALITICA DI UN DOSAGGIO AD
ELEVATA SENSIBILITA’
1
2
1
1
C. Tardi , F. Ferranti , L. Tittarelli , A. Bertoli , F.
2
1
Ammirati , C. Paparella
1
U.O.C. Lab. Analisi, Osp. "G.B.Grassi" ASL RM/D
2
U.O.C. Cardiologia Osp. “G.B. Grassi” ASL RM/D
Scopo: La troponina cardiaca I (TnI) è l’indicatore
più sensibile e specifico di cardiopatia ischemica
e le linee guida suggeriscono l’adozione, come
valore “soglia”, del valore corrispondente al 99°
percentile in soggetti sani, indicando che a tale valore
l’imprecisione totale del dosaggio deve essere <10%.
Abbiamo voluto verificare tali valori impiegando un
dosaggio automatizzato in chemiluminescenza (Abbott
ARCHITECT TnI), classificato tra i metodi con elevata
1
Purpose. The prognostic value of Adiponectin (ADN), an
insulin-sensitizing, anti-atherogenic and anti-inflammatory
adipocytokine, in heart disease is still debated. We
aimed to evaluate in patients (pts) referred for chest
pain syndrome who underwent CT coronary angiography
(CTCA) the relationship between circulating ADN and 1the predicted 10-year risk of cardiovascular disease, 2Agaston Calcium Score (AS), 3- presence of coronary
artery disease (CAD) and number of diseased vessels.
Methods. We prospectively included 106 consecutive
pts (71 males, age 54±8 yr). Circulating total and
High Molecular Weight (HMW) ADN were measured
by dedicated ELISAs (Linco Research and ALPCO
Diagnostics-Pantec). Cardiovascular risk estimation was
assessed by Framingham Risk Score (FRS) and
Systematic Coronary Risk Evaluation (SCORE) for low
risk populations. AS was evaluated by standard method.
Coronary atherosclerosis and presence of stenosis
(≥50%) were evaluated by an interactive application on
multiplanar reformatting CTCA reconstruction.
Results. Total and HMW ADN were negatively associated
with FRS and SCOREs. Total AND was 11.3±1.3 µg/mL,
7.6±0.5 and 5.2±0.6 in low, intermediate and high risk
groups of FRS, (p<0.01 low vs intermediate and high risk
group), respectively and HMW AND was 2.4±0.4, 1.6±0.1
and 1.2±0.1 (p=0.02 low vs high risk). Total AND resulted
9.4±0.8 and 7.6±0.9 (p=0.02) for low and intermediate risk
group of fatal CHD SCORE as well as 9.5±0.8 and 6.3±0.6
(p=0.005) for low and intermediate risk group of fatal
CVD no-CHD SCORE. A similar behaviour was observed
for HMW ADN. No significant correlation was observed
between ADN and AS. CAD was detected in 58/106 pts
(55%), 8 of which (7.6%) had 3 vessel CAD. Total ADN
were significantly greater in non-CAD compared with CAD
and 3 vessel CAD pts (10.0±1.0, 7.0±0.5, 5.4±1.0, p=0.03
and p=0.009).
Conclusion. Low ADN levels correlated with risk scores
of cardiovascular disease and presence and severity of
CAD. The absence of a link with AS suggests that ADN
may be not related to the calcification phase of coronary
atherosclerosis. Thus, ADN may have a specific role in a
future integrated system of coronary risk stratification.
sensibilità analitica (≤ 0,01 ng/mL).
Materiali e Metodi: Per la valutazione dei valori
normali sono stati utilizzati campioni provenienti da una
popolazione di individui sani : 313 soggetti normali,
stratificati per sesso (158 femmine, 155 maschi) e per
classi di età (>25 soggetti per sesso per ogni decade dai
20 ai 79 anni). La sensibilità funzionale è stata misurata
preparando dei “pools” di plasma a diluizioni scalari con
concentrazioni attese di troponina da 1,200 a 0,009 ng/
mL. Aliquote di ciascun “pool” sono state analizzate in
doppio in 10 sessioni diverse nell’arco di un mese.
Risultati: Il valore di 99° percentile era 0,027 ng/mL,
ma con una significativa differenza tra maschi (0,039)
e femmine (0,015). Una tendenza all’innalzamento con
l’età era presente in entrambi i sessi, ma soprattutto tra
i maschi (99° percentile >70 anni: 0,061 ng/mL). Sulle
diluizioni, i valori misurati erano del tutto consistenti con
quelli attesi (differenza <9%) e la soglia di imprecisione
corrispondeva alla concentrazione di 0,034 ng/mL (CV
totale = 9,45%).
Discussione: La variazione per sesso ed età dei valori
2
normali di TnI, peraltro già documentata , induce ad una
certa cautela nell’adozione della soglia al 99° percentile;
i nostri dati indicano, a conferma di altri studi e dei
dati riportati in metodica, che il metodo ARCHITECT TnI
presenta una variabilità <10% ad una concentrazione
di 0,034 ng/mL, e riteniamo che questo valore possa
essere utilizzato come soglia diagnostica per i pazienti
con sospetta sindrome coronarica acuta, nell’ambito del
protocollo diagnostico proposto dalle U.O.
1
Reichlin T. et al , N Engl J Med 2009; 361: 858-867.
2
Clerico A. et al, Clin Chem Lab Med 2008; 46 (6):
804-808
487
199
HEART-TYPE FATTY ACID BINDING PROTEIN IN
THE DETECTION OF SUB-CLINICAL MYOCARDIAL
DAMAGE IN PATIENTS WITH HEART FAILURE:
COMPARISON WITH HIGH-SENSITIVE TROPONIN I
2
4
4
5
M. Cabiati , S. Savelli , C. Caselli , P. Di Cecco , M.
1
3
1
1
Fontana , T. Prescimone , S. Turchi , A. Mercuri , S.
1
1
1
Del Ry , M. Emdin , D. Giannessi
1
CNR Istituto di Fisiologia Clinica-CNR – Fondazione
G.Monasterio (Pisa)
2
Scuola Superiore S. Anna Pisa
3
Università di Siena
4
CNR Istituto di Fisiologia Clinica-CNR
5
Fondazione G.Monasterio (Pisa)
Purpose. The presence of sub-clinical myocardial damage
in heart failure (HF) identifies patients at increased risk
of subsequent cardiac events. Aim of this study was to
compare the Heart-Type Fatty acid Binding Protein (HFABP), a small cytosolic protein rapidly released into the
circulation after cardiac membrane damage, with indices
of myofibril damage - cTroponin (Tn) I and high-sensitive
(hs) cTnI - and with the classical markers of myocardial
injury (myoglobin, LDH).
Methods. Biomarkers were analyzed in 40 healthy
subjects and in 60 HF patients (age: 69±10yrs; sex:
87% male; NYHA class I-II, n=31; NYHA III-IV, n=29;
median ejection fraction, EF%: 38). Plasma H-FABP was
measured by a specific ELISA (HBT(NL)-Pantec), hs-TnI
by ADVIA TnI-ultra method and the other biomarkers,
including Nt-proBNP, with conventional fully automated
assays.
Results: H-FABP significantly increased in failing patients
as a function of disease severity (1.9±0.2 ng/ml in
controls; 2.7±0.2 in NYHA I-II; 4.2±0.7 NYHA III-IV,
p=0.05 class III-IV vs I-II, p<0.0001 class III-IV vs
controls). An increase of all cardiac markers was detected
in function of clinical severity, as expected. H-FABP
positively correlates with the other biomarkers: r = 0.7,
p<0.001 with Nt-proBNP, r = 0.44, p<0.001 with cTnI,
r = 0.49, p<0.001 with hs-cTnI, r = 0.7, p<0.001 with
myoglobin and r = 0.52, p<0.001 with LDH. The AUC
of ROC curves for H-FABP, cTnI and hs-cTnI for the
association with disease were 0.778, 0.666 and 0.770,
respectively (p=ns H-FABP vs cTnIs).
Conclusions. The increase of both H-FABP and cTnIs in
failing patients as a function of clinical severity suggests
the presence of an ongoing irreversible cardiomyocyte
damage in these patients. Serial measurement of both
indices could provide a new monitoring tool to guide
therapy and management of HF patients.
488
200
IL DOSAGGIO DELLA MIOGLOBINA È REALMENTE
UTILE NELLA DIAGNOSTICA DELLA NECROSI
MIOCARDICA MEDIANTE TROPONINA I
ULTRASENSIBILE?
1
1
1
1
M. Vidali , M. Sciancalepore , S. Tota , M. Faccio , G.
1
Bellomo
1
Nel set-ott 2008, il Laboratorio dell’Azienda ha iniziato un
processo di Audit Clinico sull’uso dei biomarcatori cardiaci
nell’ambito dei servizi di Emergenza, in particolare
sull’utilizzo della sola troponina I ultrasensibile in
alternativa alla richiesta combinata di mioglobina e
troponina per la diagnosi di infarto del miocardio.
Fasi Audit: 1) revisione della letteratura (ott 2008);
2) valutazione della pratica corrente (nov 2007 – nov
2008); 3) pianificazione della nuova strategia diagnostica
basata sulla sola troponina I ultrasensibile (dic 2008); 4)
sperimentazione (apr 2009 – aprile 2010); 5) revisione dei
dati. Durante la fase 2, sono stati studiati 1297 pazienti
che presentavano almeno 2 dosaggi seriati di troponina
e mioglobina, comparando le variazioni di mioglobina
in rapporto alle variazioni contestuali di troponina. La
compliance degli operatori è stata valutata esaminando le
richieste nel periodo gen 2009 – dic 2009.
La maggior parte dei pazienti negativi per mioglobina
ad entrambi i dosaggi (n=864) sono confermati dal
permanere o dal ritornare dei valori di troponina ad una
concentrazione <0,04 ng/ml (cut-off cTn). I soggetti che si
sono positivizzati alla mioglobina tra il primo ed il secondo
dosaggio (n=111), o con valori costantemente aumentati
(n=270), presentano paralleli incrementi di troponina o
comunque valori elevati di troponina ad entrambi i dosaggi
(test esatto di Fisher, p<0.0001). A fronte di un numero
invariato di richieste di troponina, si è osservata una
significativa riduzione delle richieste di mioglobina, già
evidente a partire da feb 2009, con un decremento
del rapporto richieste combinate troponina+mioglobina/
(totale richieste di troponina) da una media mensile del
51,3% (gen 2008 – gen 2009), ad una del 15,9% (apr 2009
– dic 2009).
La disponibilità di un test per le troponine ad alta
sensibilità, e l’abbassamento dei limiti decisionali legato
ad una migliore imprecisione, rendono l’utilizzo di un
ulteriore marcatore precoce, ma aspecifico come la
mioglobina, non più consigliabile. I dati evidenziano
un’ottima compliance delle Unità Operative alle nuove
modalità prescrittive, rappresentando un ottimo esempio
di collaborazione professionale tra Clinici e Laboratoristi.
201
RETICULOCYTE COUNT IN CARDIO-RENAL
SYNDROME
1
2
3
202
MMP-2 LEVELS ARE INCREASED IN HIGH RISK
PATIENTS FOR CAD: A CORRELATION STUDY
WITH CT CALCIUM SCORE
1
L. La Sala , R. Galeazzi , R. Lisa , F. Olivieri , R.
3
4
2
1
Antonicelli , M. Lorenzi , F. Busco , A.D. Procopio
1
Dept. of Molecular Pathology and Innovative Therapies
Polytechnic Univ. of Marche, Ancona
2
Clinical Laboratory & Molecular Diagnostics, I.N.R.C.A.
Natl Inst, Hosp, Ancona
3
Cardiologic Unit (CCU), I.N.R.C.A. Natl Inst, Hosp,
Ancona
4
Center of Clinical Pathology and Innovative Therapies,
Research Dept. I.N.R.C.A. National Institute, Ancona
Background: Anaemia and renal dysfunctions are
frequently associated with heart failure (HF), especially
in elderly patients. This syndrome, called Cardio-Renal
Syndrome (CRS), is associated with an increased
hospitalization and mortality (1). However the CRS
prevalence and the relationships between CRS related
parameters are poorly investigated (2).
Aim: The aim of our study was to investigate the
prevalence of CRS in an elderly cohort hospitalized
patients, and the relationships between some parameters
related to anaemia and renal failure in these patients.
Methods: Data were obtained from 196 hospitalized
patients older than 65 years, consecutively admitted to
CCU, INRCA, Ancona from January to December 2008
(mean age ± SD; 100 males, 81,2 ± 8 and 96 females,
83,4 ± 8). 159 patients were affected by HF. Biochemical
(Modular-Roche) and haematological (Sysmex DASIT)
parameters were analysed in all enrolled patients. Clinicalanamnestic data were also collected.
Results: HF patients showed an increased numbers of
reticulocytes respect to non HF patients (GLM, p=0.001).
Moreover, in HF patients the reticulocytes count increased
significantly in NYHA classes II, III and IV (n.94) respect
to NYHA classe I (n. 65)(GLM, p=0.014). HF with anemia
and RF (CRS)(n. 51) had reticulocytes count lower
than HF with anemia without RF (n.19)(GLM, p=0.045).
A significant negative correlation between reticulocytes
count and Hb level (Pearson correlation= -0.3527,
p<0.001) was observed. In HF patients a significant
positive correlation between creatinine level and BUN
(Pearson correlation= 0.70, p<0.001) was observed.
Conclusion: In the studied cohort 48,6% of HF patients
was affected by anemia (Hb<12g/dL) and 58% of
HF patients was affected by RF. The prevalence of
CRS was 39,6%. An increased reticulocytes count
was observed in HF patients respect to non HF,
and this increasing was related to NYHA classes.
These data suggest that reticulocytes producted from
bone-marrow were increasing with the severity of
HF. In conclusion, reticulocytes count could be an
haematological inexpensive and non-invasive marker
associated with HF and its severity, including CRS.
References
1.Palazzuoli, Int J Clin Pract, 2008
2.Silverberg, Eur J Heart Failure, 2008
La Sala and Galeazzi contributed equally
1
3
1
C. Caselli , T. Prescimone , M. Coceani , P. Di
1
1
1
4
Cecco , M. Schlueter , M. Cabiati , M. Bianchi , S.
1
1
2
1
Del Ry , A. Mazzarisi , F. Cocci , P. Marraccini , D.
1
Giannessi
1
CNR Institute of Clinical Physiology and Fondazione
Toscana Gabriele Monasterio Pisa Italy
2
Univ. di Pisa
3
Univ. di Siena
4
AUOP
Purpose. Many studies suggest that metalloproteases
(MMPs) are involved in several steps of the
atherosclerotic process. MMP-2, which is highly
expressed in the vulnerable regions of the atherosclerotic
plaques, may also play a role in plaque rupture process.
We aimed at evaluating in patients referred for chest
pain syndrome who underwent CT coronary angiography
(CTCA) the relationship between circulating MMP-2 and
1- the predicted 10-year risk of cardiovascular disease, 2Agaston Calcium Score (AS), 3- presence of significant
coronary artery disease (CAD).
Methods. We prospectively included 198 consecutive
patients (121 males, age 64±12 yr). Significant coronary
stenosis in at least one major vessel, was present
in 107/198 patients (55%), of whom 23 presented
triple vessel disease. Cardiovascular risk estimation
was assessed by Framingham Risk Score (FRS) and
Systematic Coronary Risk Evaluation (SCORE) for low
risk populations. AS was evaluated by standard method.
Coronary atherosclerosis and presence of stenosis
(≥50%) were evaluated by an interactive application on
multiplanar reformatting CTCA reconstruction. Circulating
MMP-2 was measured by dedicated ELISA (Quantikine
MMP-2 immunoassay, R&D Systems).
Results. MMP-2 was weakly correlated with FRS
(r=0.182, p<0.05) and SCOREs ( r=0.326, p<0.001 for
fatal CHD SCORE, r=0.376, p<0.001 for fatal CVD
non CHD SCORE and r=0.363, p<0.001 for fatal
CVD SCORE, respectively). Patients with AS>400 had
significant higher concentration of MMP-2 as compared to
patients with AS=0 (240±12 vs 208±10 ng/mL, p<0.028).
Moreover, patients with three vessel disease as compared
to patients without CAD (AS=0, no coronary stenosis)
had higher levels of MMP-2 (253±14 vs 219±7 ng/mL,
p=0.013).
Conclusion. MMP-2 was able to detect patients with high
risk scores as well as with known CAD. Thus, MMP-2
circulating levels may be considered in an algorithm for
CAD assessment and stratification.
489
203
MARCATORI DI LESIONE E FUNZIONE MIOCARDICA
SU SISTEMA SIEMENS DIMENSION VISTA 1500
1
1
2
G. Bonetti , F. Stefini , L. Caimi
1
U.O. Lab. Analisi Chimico Cliniche, A.O. Spedali Civili
di Brescia
2
Dip. di Scienze Biomediche e Biotecnologie, Univ. degli
Studi di Brescia
1
Introduzione. Secondo le linee guida NACB-IFCC
il TAT per la determinazione dei marcatori cardiaci
dovrebbe essere<60min. Il sistema Dimension Vista 1500
(Vista) Siemens permette la determinazione di Troponina
cardiaca I (TnI) in 10 min.
Scopo del lavoro. Valutare le performance analitiche di
Vista TnI, creatinchinasi MB (CK-MB) e Nt-propeptide
natriuretico B (Nt-proBNP).
Materiali e metodi. Determinazione di TnI, CK-MB e NtproBNP mediante metodo immunochemiluminometrico
con tecnologia LOCI®con 2 Ac monoclonali. E’ stato
effettuato uno studio di imprecisione secondo doc. CLSI
EP5-A2 e per CK-MB e Nt-proBNP una comparazione
con il metodo in uso presso il laboratorio (Elecsys
2010,Roche) secondo doc. CLSI EP9-A2. E’ stata
valutata preliminarmente la distribuzione dei valori di cTnI
in 100 soggetti donatori di sangue (50 F,50 M,età media
43,range:20-60 anni).
Risultati.
Imprecisione
totale
(CVt)
di
TnI:19.7%,12.4%,9.3%,7.6%
e
5.7%
a
0.022,0.034,0.048,0.071,0.128
µg/L,
rispettivamente,
stima del 10% CVt a 0.043 µg/L. Relativamente alla
distribuzione della TnI 97 soggetti mostravano valori
<0.015 µg/L. CVt 2.62% a 21.7 µg/L per CK-MB,
1.34% e 1.20% a 100 e 335 ng/L per Nt-proBNP,
rispettivamente. Nello studio di comparazione tra metodi,
regressione lineare: CK-MB Vista=0.974xElecsys+1.3,
Syx=7.8, r=0.996, Nt-proBNP Vista=1.04xElecsys+13,
Syx=147, r=0.998.
Discussione. Vista CK-MB mostra un CVt entro il goal
analitico ottimo derivato dalla variabilità biologica ed
è comparabile al metodo in uso nella classificazione
dell’estensione dell’IMA. Per la distribuzione in soggetti
di riferimento si rende necessario un ampliamento della
numerosità del campione. Il CVt di Nt-proBNP risulta
2
inferiore a quanto dichiarato dalla ditta e da altri autori .
Conclusioni. Vista mostra caratteristiche analitiche e
strumentali, tempi d’esecuzione delle analisi, che
lo rendono idoneo nella valutazione biochimica di
una sospetta necrosi miocardica e nella valutazione
dell’estensione di IMA. Il CVt di Nt-proBNP è inferiore
al metodo validato in uso, la concordanza di Nt-proBNP
3
al valore di 300 ng/L ne permetterebbe l’impiego
nell’esclusione di un’origine cardiaca in soggetti con
dispnea acuta.
Bibliografia
1.Clin Chem 2007;55:547-51
2.Clin Biochem 2009;42:1444-51
3.Eur Heart J 2006;27:330-7
490
204
COMPARISON OF THREE HIGHLY SENSITIVE
TROPONIN ASSAYS FOR RISK STRATIFICATION OF
MYOCARDIAL INJURY
1
2
3
2
G. Lippi , G.L. Salvagno , M.M. Mion , M. Gelati , M.
2
2
3
Montagnana , E. Danese , M. Zaninotto , M.
3
2
Plebani , G.C. Guidi
1
U.O. di Diagnostica Ematochimica, A.O.U. di Parma,
Italy
2
Sez. Chimica Clinica, Dip. Scienze MorfologicoBiomediche, Univ. di Verona, Italy
3
Dip. di Medicina di Laboratorio, Univ. di Padova,
Padova, Italy
Background. A positive cardiac troponin test represents
the gold standard for detection of myocardial injury,
risk stratification of acute coronary syndromes, as well
as for the diagnosis of acute myocardial infarction. To
enable the appropriate stratification of the cardiovascular
risk, however, the laboratory should use highly sensitive,
specific, and precise assays, which would also enable an
appropriate clinical decision making.
Materials and Methods. Fifty consecutive heparin-plasma
samples referred from the intensive care unit were
simultaneously tested with on traditional troponin T (TnT)
assay (Roche Diagnostics) and three different highly
sensitive troponin assays. Serum Troponin I (TnI) was
measured with two high sensitive assay on Centaur TnI
Ultra (Siemens Healthcare Diagnostics) and Dimension
Vista (Siemens Healthcare Diagnostics). High sensitive
TnT was measured with the new Hs-TnT for the
Modular analytical platform (Roche Diagnostics). The 99th
percentile of the upper reference limit (URL) for apparently
healthy subjects is 0.04 µg/L for Centaur TnI Ultra, 0.045
µg/L for Dimension Vista cTnI LOCI, and 0.014 µg/L for
Hs-TnT, respectively.
Results. The Spearman correlations between assays
were 0.981 (Hs-TnT versus TnT), 0.925 (Hs-TnT versus
Centaur TnI Ultra), 0.924 (Hs-TnT versus Vista cTnI LOCI)
and 0.969 (Centaur TnI Ultra versus Vista cTnI LOCI). The
prevalence of samples exceeding the 99th percentile of
the URL of the respective assays was 82% (n=41), 100%
(n=50), 98% (n=49) and 98% (n=49), with TnT, Hs-TnT,
Centaur TnI Ultra and Vista cTnI LOCI, respectively.
Conclusions. Results of our investigation attest that the
clinical decision making based on 99th percentile of
the URL does not differ significantly measuring troponin
with either Hs-TnT or Centaur TnI Ultra and Vista
cTnI LOCI.Reference. Lippi G, Cervellin G, Plebani M.
Sensitive cardiac troponin T assay. N Engl J ed. 2010 Apr
1;362(13):1242.
205
TREATMENT WITH CYCLOPHOSPHAMIDE,
LENALIDOMIDE AND DEXAMETHASONE
(CLD) INDUCES AN INCREASE IN N-TERMINAL
NATRIURETIC PEPTIDE TYPE B AND TROPONIN I IN
PATIENTS WITH AL AMYLOIDOSIS
206
LA GESTIONE DEL PAZIENTE
CON SCOMPENSO CARDIACO
ACUTO :MONITORAGGIO NEURORMONALE (BNP) E
BIOIMPEDENZOMETRICO (BIVA)
1
1
1
1
P. Russo , G. Palladini , L. Zenone Bragotti , R.
2
2
1
1
1
Albertini , G. Sarais , V. Valentini , A. Foli , L. Obici , F.
1
2
3
1
Lavatelli , G.B. Vadacca , R. Moratti , G. Merlini
1
Amyloidosis Research and Treatment Center and Dep.
of Bioch., Fond. IRCCS Polic. San Matteo and Univ. of
Pavia, Pavia
2
Clin. Chem. Lab., Fond. IRCCS Polic. San Matteo,
Pavia
3
Direz. Scien., Fond. IRCCS Polic. San Matteo, Pavia
In AL amyloidosis (AL) N terminal natriuretic peptide type
B (NT-proBNP) and cardiac troponins (cTn) are indicators
of cardiac dysfunction and prognosis. Changes in NT1
proBNP are markers of cardiac response. We report
the modifications in cardiac biomarkers (CB) observed
during a trial of cyclophosphamide (C), lenalidomide
(L) and dexamethasone (D) in 21 previously treated
AL patients (pts). Serum NT-proBNP and cTnI were
measured by an electrochemiluminescence sandwich
immunoassay (ECLIA, Roche: upper reference limits,
u.r.l., in men and women were 88 ng/L and 153 ng/L,
respectively, in subjects <50 years, and 227 ng/L and
334 ng/L in those ≥50 years) and a chemiluminescence
assay (Advia Centaur CP, Siemens Diagnostics: u.r.l.
40 ng/L), respectively. Baseline cTnI ≥100 ng/L was an
exclusion criterion. Treatment comprised ≤9 cycles of
C (500 mg on days 1, 8 and 15), L (15 mg on days
1-21) and D (40 mg on days 1, 8, 15 and 22) q28
days. Heart involvement (HI) was defined as a >12 mm
mean left ventricular wall thickness at echocardiography.
Clinically relevant changes in CB were defined as ≥30%
and ≥300 ng/L for NT-proBNP and ≥20% and ≥40 ng/
L for cTnI. Eight pts (38%) presented with HI, and NTproBNP and cTnI were above the u.r.l. in 14 (67%) and 4
(19%) cases, respectively. Baseline median (range) NTproBNP was 860 ng/L (62-2778 ng/L) and cTnI 20 ng/
L (0-91 ng/L). After cycle 1 median (range) NT-proBNP
increased to 2243 ng/L (130-11167 ng/L) and cTnI to
39 ng/L (0-355 ng/L). NT-proBNP increased only in the
14 pts with initially elevated NT-proBNP. Cardiac TnI
increased in 10 pts (48%), all with elevated baseline NTproBNP, including 3 with high baseline cTnI. Two months
after treatment discontinuation, NT-proBNP decreased
in 6/14 pts (43%) and cTnI in 3/10 pts (30%) and
median (range) NT-proBNP fell to 1036 ng/L (45-28817
ng/L) and cTnI to 21 ng/L (3-221 ng/L). Changes in CB
were not associated with modifications in symptoms of
heart failure, wall thickness, ejection fraction, creatinine,
fluid retention, hematologic response and survival. The
transient increase of CB in AL pts treated with CLD
should be considered when evaluating cardiac response.
The pathogenesis of this phenomenon warrants further
studies.
1
2
2
F. Veneziani , F. Petrucci , L. Goedecke , L. Fratoni , V.
2
2
Fabbri , M. Milli
1
Lab. Analisi Chimico Cliniche, Osp. S. Maria Nuova,
Firenze
2
UTIC, Osp. S. Maria Nuova, Firenze
La strategia terapeutica ottimale del paziente con
scompenso cardiaco acuto congestizio (SC) è
il trattamento diuretico infusivo, con eliminazione
dell’eccesso di fluidi senza compromissione della
funzionalità renale. Abbiamo valutato il monitoraggio
neurormonale (BNP) con quello bioimpedenzometrico
(BIVA) nella gestione clinica di una popolazione di 60 pz
ricoverati per SC. Il BNP è stato dosato con il kit Triage
BNP (Inverness) su DxC 600i ( Beckman Coulter) con cutoff di normalità a 100 pg/mL. Il monitoraggio BIVA è stato
eseguito sull’apparecchio EFG (AKERN) ottenendo valori
di resistenza (R), reattanza (XC) ed un nomogramma
che esprime lo stato di idratazione tissutale e lo stato
“nutrizionale” del pz. L’aumento di XC corrisponde a
riduzione dei fluidi interstiziali. Sono stati identificati 2
gruppi: Gruppo A (GA): 30 pz trattati secondo “usual
care” (monitoraggio clinico e del BNP). Gruppo B(GB): 30
pz con “usual care” e monitoraggio giornaliero BIVA. Nel
GB la gestione della terapia diuretica è stata guidata dai
dati di idratazione tissutale. Sono stati valutati : il valore
della Cr e del BNP alla dimissione, il numero dei reingressi
ospedalieri per SC , la mortalità per causa cardiovascolare
a 3 mesi e nel GB anche la relazione tra i valori del BNP
e di XC. Risultati: Alla dimissione, i pz del GB (BIVA)
mostravano valori di Cr più bassi rispetto a quelli del GA .Il
GA presentava un tasso di eventi più elevato rispetto al
GB (BIVA) (decessi + riammissioni per SC a 3 mesi). I
valori di BNP ed il ∆ durante il ricovero sono simili nei 2
gruppi .La relazione XC-BNP nei 30 pz del GB presenta 2
pattern di comportamento: Pattern 1 (21 pz): concordanza
XC-BNP (riduzione del BNP con aumento della XC).
Pattern 2 (9 pz): discordanza XC-BNP (persistenza di
BNP elevato con aumento della XC). Conclusioni: il
monitoraggio con BNP e BIVA è un approccio affidabile
e semplice per ottimizzare la rimozione di liquidi in pz
ricoverati per SC severo. Verosimilmente si raggiunge
un migliore bilancio idrico alla dimissione con minore
compromissione della funzionalità renale.
Bibliografia
Dickstein K, Cohen-Solal A, Filippatos G, et al.- ESC
guidelines for the diagnosis and treatment of acute
and chronic heart failure 2008. Eur Heart J2008; 29:
2388-2442.
1
Palladini G et al. Blood 2006;107:3853-8.
491
207
B TYPE NATRIURETIC PEPTIDE (BNP) AS
A MARKER OF CARDIAC RESPONSE IN AL
AMYLOIDOSIS
1
1
2
208
RUOLO DELLA COPEPTINA SIERICA
NELL'ESCLUSIONE DELL'INFARTO ACUTO DEL
MIOCARDIO ( DATI PRELIMINARI)
2
P. Russo , G. Palladini , R. Albertini , G. Sarais , V.
1
1
1
1
Valentini , A. Foli , L. Zenone Bragotti , L. Obici , F.
1
2
3
1
Lavatelli , G.B. Vadacca , R. Moratti , G. Merlini
1
Amyloidosis Research and Treatment Center and
Department of Biochemistry, Fondazione IRCCS
Policlinico San Matteo and Univ. of Pavia, Pavia
2
Clinical Chemistry Laboratory, Fondazione IRCCS
Policlinico San Matteo, Pavia
3
Direzione Scientifica, Fondazione IRCCS Policlinico
San Matteo, Pavia
N-terminal pro natriuretic peptide type B (NT-proBNP) is
a powerful marker of cardiac dysfunction and prognosis
in AL amyloidosis (AL). Decrease of NT-proBNP after
chemotherapy predicts better survival and is a surrogate
1
marker of cardiac response. Measurement of BNP is
more widely available than that of NT-proBNP, but its
utility in AL patients (pts) has not been investigated
so far. We report the prognostic relevance of BNP
changes in 136 newly diagnosed consecutive AL
pts, evaluated before and 6 months after treatment
initiation. Serum NT-proBNP was measured with
an electrochemiluminescence sandwich immunoassay
(ECLIA, Roche). Plasma BNP was assessed by a 2site immunochemiluminescence assay (ADVIA Centaur,
Bayer). Based on the biological variability of natriuretic
peptides (NPs), response and progression of NT-proBNP
were defined as ≥30% and ≥300 ng/L changes, and
for BNP as changes ≥30% and ≥50 ng/L. Partial
hematologic response (PR) was defined as a ≥50%
reduction of the amyloidogenic serum free light chains
(FLC) and complete response (CR) as a normalization of
FLC kappa/lambda ratio with negative serum and urine
immunofixation. Differences in survival were tested for
statistical significance by log-rank test. The ability of
NPs to predict survival was tested in univariable and
multivariable Cox models.
Fifty-one pts (38%) achieved PR and 23 (17%) CR.
PR and CR were associated with a median 25% and
45% NT-proBNP and a median 15% and 40% BNP
decrease, respectively. There was a 79% concordance
between NPs response (p<0.001) and 89% between NPs
progression (p<0.001). Both NT-proBNP (91% vs. 62%
surviving 3 years, p=0.008) and BNP (89% vs. 66%
surviving 3 years, p=0.03) responses predicted longer
survival, whilst progression of NT-proBNP (85% vs. 31%
surviving 3 years, p<0.001) and BNP (80% vs. 36%
surviving 3 years, p<0.001) was associated with poor
prognosis. At multivariable analysis, progression of NTproBNP (p<0.001) or BNP (p<0.001) and hematologic
response (p=0.05 in the NT-proBNP model, p=0.006
in that of BNP) were the only independent prognostic
variables. In AL amyloidosis, BNP can substitute NTproBNP as a marker of cardiac response. Progression of
NPs emerges as an important prognostic determinant.
1
Palladini G et al. Blood 2006;107:3853-8.
492
1
1
1
R. Grillone , A. Chiefalo , A. Contina , V. De
1
2
2
2
Cristofaro , M. Guarino , F. Paladino , F. Schiraldi , B.
1
Dente
1
U.O.C. Medicina di Laboratorio, Osp. San Paolo ASL
Napoli 1 centro
2
U.O.C. Medicina d'Urgenza, Osp. San Paolo ASL
Napoli 1 centro
Introduzione: E’ indispensabile escludere rapidamente
la diagnosi di IMA in PS. Attualmente l’ECG e la
determinazione della Troponina T rappresentano il primo
approccio diagnostico per i pazienti che afferiscono
al PS con dolore toracico o altri sintomi premonitori
di infarto. Questo approccio diagnostico comporta un
periodo di attesa relativamente lungo ed un aggravio
dei costi di degenza.Recenti studi hanno documentato
che la Copeptina, porzione c-terminale del pro-ormone
vasopressina, aumenta in maniera significativa nell’infarto
acuto e, quindi, hanno spinto a valutare l’utilità della sua
determinazione per una più veloce e sicura diagnosi di
IMA.
Scopo:
Verificare
l’accuratezza
diagnostica
dell’associazione Copeptina /Troponina T per l’esclusione
precoce dell’Infarto Acuto del Miocardio.
Metodi: Sono stati selezionati 39 pazienti afferenti al
P.S. del D.E.A. Osp. San Paolo con dubbio diagnostico
per infarto del miocardio e ricoverati nel reparto
di Osservazione. Il protocollo di ricerca concordato
prevedeva al tempo O’ la determinazione di Copeptina
(metodo immunometrico in chemiluminescenza della ditta
Brahms), Troponina T (Roche Diagnostics), ECG ed ECO
e la ripetizione della Troponina T e dell’ECG dopo 3 e 6
ore.
Risultati: 19/39 (49%) delle Copeptine misurate sono
risultate inferiori al valore soglia di 14.1 pmol/L; tali
pazienti avevano una Troponina T < 0.010 microgr/L
con un ECG aspecifico.Il 100% non ha sviluppato IMA.
Viceversa, delle restanti 20 (51%) che presentavano un
valore > 14.1 pmol/l, 5 pazienti (25%) hanno evidenziato
nelle successive determinazioni un incremento della
Troponina T ed un ECG patologico.
Conclusioni: Dai dati preliminari emerge un alto valore
predittivo negativo della Copeptina. Ovviamente i dati
statistici avranno una significatività maggiore quando sarà
raggiunto l’obiettivo di arruolare nello studio almeno 500
pazienti.
Bibliografia: Reichlin T. et al. Incremental Value of
Copeptin for Rapid Rule Out of Acute Myocardial
Infarction. Journal of American College of Cardiology
2009, 54 (1): 60-8.
209
PRESTAZIONI ANALITICHE DEL SISTEMA AQT90
FLEX PER LA DETERMINAZIONE DEI MARCATORI
CARDIACI IN URGENZA
210
LA COPEPTINA NEL “RULE OUT” PRECOCE
DELL’INFARTO
1
1
1
1
1
A. Fortunato , A. Morello , L. Crestale , G. Soffiati
1
Lab. di Chimica Clinica ed Ematologia, Osp. "San
Bortolo" - Vicenza
Scopo del lavoro: sono state valutate le prestazioni
analitiche e la praticabilità del sistema automatizzato
AQT90 FLEX (Radiometer ApS) per i parametri Troponina
I (TnI) e Mioglobina (Myo) osservando la precisione e la
correlazione con i metodi in uso.
Materiali e metodi: La TnI e la Myo sono state misurate
in 170 pazienti sia su campioni di plasma, con LiEparina, che sui corrispondenti campioni di sangue intero,
in EDTA, con AQT90. I campioni di plasma sono stati
processati nella stessa seduta analitica anche con il
sistema AIA360 (Tosoh). La precisione del metodo è stata
verificata con la determinazione di campioni di controllo
commerciali, pronti all’uso e dello stesso lotto, su tre
livelli di concentrazione in 20 sedute analitiche di giorni
differenti.
Risultati: per la TnI i risultati ottenuti con il sistema
AQT90 erano compresi tra 0,01 e 14,0 ng/mL con valore
medio sui campioni di sangue intero di 0,59 ng/mL (IC
95%:0,30-0,88), e valore medio di 0,63 ng/mL (IC 95%:
0,18-1,07) nei campioni di plasma. Gli stessi campioni
sul sistema AIA 360 erano distribuiti tra 0,001 e 120 ng/
mL con valore medio di 2,98 ng/mL (IC 95%: 1,20-4,76).
I coefficienti di correlazione tra i risultati dei sistemi
confrontati risultano 0,919 (IC 95%:0,891-0,941) e 0,973
(IC 95%:0,957 to 0,983) rispettivamente per i campioni
di sangue intero e plasma. Per la ripetibilità sono stati
ottenuti CV% compresi tra 4,9 e 9,3 per concentrazioni
tra 0,025 e 1,04 ng/mL. Analogamente per la Myo le
concentrazioni misurate erano tra 20 e 1000 ng/mL con
medie di 247 (IC 95%:205-288), 238 (IC 95%:176-299) e
189 (IC 95%:149-229) ng/mL rispettivamente e CV% tra
3 e 12,8 per valori tra 70 e 306 ng/mL.
Discussione e conclusioni: il sistema valutato si dimostra
di elevata praticabilità per la semplicità operativa richiesta.
I valori riscontrati nella misura della TnI evidenziano
una maggiore compressione dei valori di concentrazione
assoluti ottenuti con il sistema AQT90 rispetto al metodo
in uso, sia per le misure effettuate su sangue intero
(campione ideale per l’assenza di preparazione del
campione) che per quelle fatte su plasma, tuttavia non
si registrano diverse classificazioni dal punto di vista
clinico rispetto ai limiti soglia dei due sistemi valutati
(rispettivamente 0,023 ng/mL per AQT90 e 0,07 ng/mL
per AIA 360).
2
1
A. Tabucchi , V. Tommassini , F. Carlucci , A.
3
3
1
Camarri , S. Sartini , C. Scapellato
1
U.O. Lab. Analisi Cliniche - A.O.U. Senese
2
Dip. Medicina Int. Scienze Endocrino-Metab. e
Biochimica - Univ. Siena
3
U.O. Pronto Soccorso e Medicina d'Urgenza - A.O.U.
Senese
BACKGROUND
Il dolore toracico rappresenta una delle cause più
frequenti di chiamata al 118 e di accesso autonomo al
Pronto Soccorso. Attualmente il gold standard diagnostico
è rappresentato dalla Troponina T (TnT), rilasciata
in circolo a seguito della necrosi del miocardio. La
regolazione del sistema di risposta endogeno allo stress
avviene da parte del sistema arginina-vasopressina
(AVP): elevati livelli sono stati riscontrati in soggetti
colpiti da infarto del miocardio (IMA) e in diversi stati di
shock settico. Il suo utilizzo diagnostico risulta limitato a
causa della breve emivita (5-15 min.). Uno studio recente
ha dimostrato come i livelli di Copeptina, porzione Cterminale del precursore AVP (CTproAVP), aumentino in
soggetti colpiti da IMA e come tale molecola sia di più
facile determinazione per l’elevata stabilità.
Scopo di questo studio è quello di verificare se la
combinazione Troponina-Copeptina permetta un più
rapido e accurato “rule out” di IMA.
METODOLOGIA:
Nei mesi Aprile-Maggio 2010 sono stati reclutati 45
pazienti afferenti all’U.O. di Pronto Soccorso e Medicina
D’Urgenza, per dolore toracico tipico. I criteri di inclusione
nello studio prevedevano un Chest Pain Score (CPS)
>4 e ECG negativo per Sindrome Coronarica Acuta. La
Copeptina è stata valutata con kit B.R.A.H.M.S. Copeptin
su analizzatore automatizzato Kryptor, con tecnologia
TRACE, in campioni di plasma-EDTA; la Troponina T con
metodica Eclia su analizzatore Roche Cobas 601.
RISULTATI E CONCLUSIONI
Dei 45 pazienti analizzati, 25 sono stati dimessi con
valori negativi di TnT; 4 sono stati ricoverati in UTIC; 5
in Cardiologia; 5 in Medicina; 5 in Osservazione Breve
Intensiva; 1 paziente è stato ricoverato in Pneumologia.
L’analisi combinata dei valori di TnT e CTproAVP nei
pazienti con IMA diagnosticato in reparto evidenzia che,
in quelli con CPS>4 valori negativi di entrambi i markers
permettono di escludere un IMA in atto, la positività
della sola Copeptina autorizza all’osservazione/ricovero,
la positività della sola TnT può indicare un IMA recente ma
non in atto o altra causa non dovuta a IMA. La positività
di entrambe indica pazienti con alto rischio di IMA in atto.
Keller T. et al. Copeptin Improves Early Diagnosis of Acute
Myocardial Infarction. J Am Coll Card 2010; 55:2096-106.
493
211
TROPONINA I ULTRASENSIBILE: INTRODUZIONE IN
UN LABORATORIO D'URGENZA
1
1
1
1
L. Paterna , F. Lavarda , S. Perolini , G. Lavarda , G.
1
1
Olivieri , V. Rizza
1
Lab. di Chimica Clinica e di Ematologia, Osp. San Carlo
Borromeo, Milano
Introduzione. I test ultrasensibili per la determinazione
della Troponina giocano un ruolo importante nel processo
decisionale clinico, in quanto possiedono le principali
caratteristiche del marcatore ideale: elevata sensibilità e
specificità, precocità di rilascio, ampia finestra diagnostica
e risultati in tempi adeguati alle esigenze cliniche.
Scopo della Ricerca. Presso il nostro Laboratorio
d'Urgenza è in via di introduzione un nuovo strumento per
la determinazione della Troponina I ultrasensibile al fine di
fornire un miglior supporto nella gestione del paziente con
cardiopatia ischemica. Lo scopo dello studio è verificare le
performance analitiche del nuovo test sia rispetto a quanto
dichiarato dal produttore sia rispetto al test in uso.
Materiali e Metodi. Strumenti: Vista1500 (CTNI hs)
e Dimension RxL (CTNI) ditta Siemens. Pazienti: 70
soggetti apparentemente sani e 70 pazienti afferenti al
Pronto Soccorso. Analisi Statistica: 1) Calcolo del 99°
percentile sui soggetti apparentemente sani. 2) Calcolo
del CV a diversi livelli di concentrazione sullo strumento
Vista. 3) Confronto tra i risultati ottenuti sui due strumenti
per i pazienti del Pronto Soccorso.
Risultati.1) Il calcolo del 99° percentile è risultato essere
0,050 ng/mL pressocchè in accordo con quanto dichiarato
dalla ditta produttrice (0,045). 2) I CV calcolati a diverse
concentrazioni sono: 1,8% per 0,150 ng/mL; 5 % per
0,050 ng/mL e 8,5% per 0,035 ng/mL. 3)Il confronto con lo
2
strumento in uso ha evidenziato r = 0,996 con la seguente
retta di regressione Vista=0,003+1,1RXL. Rispetto all'RxL
(cut-off 0,15 ng/mL) il nuovo strumento ha classificato
come positivi il 13% in più dei pazienti.
Conclusioni. Dal punto di vista analitico i risultati ottenuti
sono soddisfacenti e quindi proporremo ai Clinici il nuovo
valore di cut-off ottenuto e cioè 0,050 ng/mL coerente
con un CV<10%. E' chiaro che l'elevata sensibilità del
nuovo test abbassa il limite di positività; sarà quindi
necessario costituire un gruppo di studio con gli specialisti
per monitorare l'impatto clinico del nuovo test e valutare
i risultati lievemente alterati (zona grigia) rispetto alla
presenza di malattia.
494
212
DETERMINAZIONE DELLA MIELOPEROSSIDASI
NELLA DIAGNOSI PRECOCE DI SINDROME
CORONARICA ACUTA: UNA REALE UTILITA’
CLINICA?
1
1
2
M.M. Mion , M. Zaninotto , G. Biasillo , M.
2
2
1
Gustapane , L.M. Biasucci , M. Plebani
1
Servizio di Medicina di Laboratorio, A.O.U. degli Studi
di Padova, Padova
2
Istituto di Cardiologia, Univ. Cattolica del Sacro Cuore,
Roma
Per il riconosciuto ruolo dell’infiammazione nel processo
di aterogenesi, i marcatori biochimici di flogosi
sono stati particolarmente studiati nell’ambito della
sindrome coronarica acuta (SCA). Recentemente la
mieloperossidasi (MPO) é stata proposta come nuovo
biomarcatore potenzialmente utile nella diagnosi precoce
di SCA. Gli studi finora condotti tuttavia hanno fornito
risultati contrastanti. Questo studio ha valutato l’utilità
clinica della determinazione di MPO nella diagnosi
precoce di SCA in confronto alla determinazione della
troponina cardiaca. Le concentrazioni di MPO (Siemens
Health Care Diagnostics) e di troponina cardiaca T
misurata con metodi tradizionali e ad alta sensibilità
(cTnT e hs-cTnT rispettivamente, Roche Diagnostics),
sono state determinate in campioni (MPO, pmol/L:
plasma K2EDTA; cTnT, µg/L e hs-cTnT, ng/L: siero)
ottenuti all’ammissione da pazienti (pts) afferenti al pronto
soccorso (PS) per dolore toracico entro 12 ore dall'esordio
dei sintomi. Pts arruolati consecutivamente: n=356 (216
maschi, 140 femmine; età, 50° percentile, range: 63,
15-94 anni); tempo dall’esordio dei sintomi: <3 ore=32%,
3-6 ore=17%, >6 ore=51%; n=114 pts (32%) sono stati
successivamente ricoverati, n=242 pts (68%) sono stati
dimessi direttamente dal PS; diagnosi alla dimissione:
SCA, n=37 pts (10%); non-SCA, n=319 pts (90%).
50° percentile (range): MPO=SCA 353 (143-2926), nonSCA 370 (35-4139); cTnT=SCA 0.080 (<0.010-1.33),
non-SCA <0.010 (<0.010-1.04); hs-cTnT=SCA 90.82
(4.46-1513.00), non-SCA 5.74 (<3.00-451.70). Mann
Whitney U test (p): SCA vs non-SCA=MPO (0.8753);
cTnT (<0.0001); hs-cTnT (<0.0001). AUC (95% CI):
MPO 0.49 (0.39-0.60); cTnT 0.81 (0.73-0.90); hs-cTnT
0.90 (0.84-0.96). Confronto tra AUC (p): cTnT vs MPO
(<0.0001); hs-cTnT vs MPO (<0.0001); hs-cTnT vs cTnT
(0.0073). La determinazione di MPO nella diagnosi
precoce di SCA non ha fornito alcuna informazione
clinicamente utile e/o aggiuntiva rispetto a quella
ottenuta dalla troponina cardiaca determinata con metodi
tradizionali e/o ad alta sensibilità. Numerosi fattori infatti
influenzano i livelli circolanti di MPO rendendo l’enzima
un biomarcatore caratterizzato da scarsa specificità in
una popolazione non selezionata come quella considerata
nello studio.
213
MR-PROADM E CT-PROAVP: VALORE
PROGNOSTICO NELLO SCOMPENSO CARDIACO
CRONICO
1
1
2
1
M.M. Mion , M. Zaninotto , G.M. Boffa , M. Plebani
1
Servizio di Medicina di Laboratorio, A.O.U. degli Studi
di Padova, Padova
2
Dip. di Scienze Cardiologiche, Toraciche e Vascolari,
Univ. degli Studi di Padova, Padova
Lo scompenso cardiaco cronico (SCC) è una malattia
che rappresenta un crescente problema di salute pubblica
nei Paesi industrializzati. L’identificazione di pazienti (pts)
con SCC ad elevato rischio di mortalità e che potrebbero
beneficiare di una terapia più aggressiva resta una delle
più importanti sfide nel trattamento di questa patologia.
Studi recenti suggeriscono una potenziale utilità clinica
nello SCC di MR-proADM (regione media del precursore
dell’adrenomedullina) e di CT-proAVP (frammento del
precursore della vasopressina). In questo studio è stato
valutato il valore prognostico di MR-proADM e di CTproAVP in pts affetti da SCC. I livelli plasmatici di MRproADM (nmol/L) e di CT-proAVP (pmol/L) (BRAHMS)
sono stati misurati in n=103 pts (92 maschi, 11 femmine;
età, 50° percentile, range: 61, 17-83 anni) ricoverati
per SCC da disfunzione sistolica (NYHA: I+II n=48,
III+IV n=55); end-point combinato: morte per tutte le
cause/trapianto cardiaco. Sono stati analizzati come
possibili fattori di rischio parametri anagrafici, clinici,
strumentali e di laboratorio. Durante il follow-up (media
±DS=14±8 mesi), n=26 pts (25%) hanno subito un
evento avverso (morte: n=11; trapianto cardiaco: n=15).
All’analisi di sopravvivenza univariata di Cox sono risultate
significative (p): le concentrazioni plasmatiche di MRproADM (0.01), CT-proAVP (<0.001), sodio (<0.001),
IL-6 (interleuchina 6) (0.04), hs-PCR (proteina C reattiva
ad alta sensibilità) (0.018), BMI (body mass index) >30
(0.008), FE (frazione di eiezione del ventricolo sinistro)
(0.001). All’analisi multivariata di Cox, le variabili che
hanno mantenuto un potere predittivo indipendente (p)
sono risultate: le concentrazioni plasmatiche di MRproADM (0.006), CT-proAVP (0.001), sodio (<0.001),
IL-6 (0.02), BMI>30 (0.015), FE (0.01). Le curve di
sopravvivenza di Kaplan-Meier ed il log rank test hanno
evidenziato un maggior rischio di eventi avversi in pazienti
con livelli di MR-proADM e di CT-proAVP superiori al
50° percentile calcolato nella popolazione considerata
(0.876 e 10.74 rispettivamente). In pazienti con SCC
sistolico, i livelli circolanti di MR-proADM e CT-proAVP
hanno dimostrato un valore predittivo indipendente per
l’end-point combinato morte per tutte le cause e trapianto
cardiaco.
214
OTTIMIZZAZIONE DELLA RICHIESTA DI PSA FREE,
ESPERIENZA DELL’ASL4 CHIAVARESE: RICADUTE
IN TERMINI COSTI
1
1
1
1
G. Devoto , V. Marrè , S. Massaro , C. Devoto , R.
1
1
Tronci , P. Botto
1
Lab. Analisi, ASL 4 Chiavarese, Lavagna, Genova
Scopo del presente lavoro è stato quello di valutare
la riduzione dei costi in beni e servizi (Reagenti di
Laboratorio) derivante dall’applicazione delle Linee Guida
(NACB: Practice guidelines and recomendations for use
of tumor markers in the clinic 2002 e 2005) nell’ambito
della Patologia Prostatica. Le sopradette Linee Guida
invitano i Clinici e i Medici di laboratorio a seguire le
seguenti indicazioni: il valore di cut off per il PSA Totale
è 4.0 ng/mL, da considerarsi come limite decisionale
e non come valore “NORMALE”, la determinazione del
PSA Free è indicata solamente nei pazienti con valori
di PSA Totale nel range 4 – 10 ng/mL, il monitoraggio
della malattia deve prevedere la sola determinazione
del PSA Totale. Per essere maggiormente garantiti, in
accordo con i colleghi Urologi del ASL 4 Chiavarese,
abbiamo allargato il range entro il quale determinare il
PSA Free portandolo a 2 – 20ng/mL. Materiali e Metodi:
Sulla base di quanto premesso abbiamo applicato,
dall’anno 2008, il seguente protocollo diagnostico: il
Clinico, di fronte ad un sospetto di patologia prostatica,
indipendente dall’età del paziente, richiederà solamente
la determinazione del PSA Totale, il laboratorio analisi
effettuerà autonomamente la determinazione del PSA
Free solamente nei pazienti con PSA Totale nel range
2 - 20 ng/mL.Risultati: analizzando i dati statistici riferiti
agli anni 2006-2007, abbiamo registrato che il 60% delle
richieste contenevano entrambi gli analiti generando un
Costo di 25.000 Euro per il PSA Free e di 27.000
Euro per il PSA Totale su base annua.La stessa analisi,
applicata agli anni 2008-2009 dopo l’applicazione di tale
protocollo diagnostico, evidenziavo la riduzione del 50%
delle determinazioni di PSA Free cui corrispondeva una
riduzione dei costi di 15.000 EURO su base annua.
Conclusioni: l’esperienza dell’ASL 4 Chiavarese dimostra
come la collaborazione tra Medici di Laboratorio e
Clinici,sia una pratica non solo auspicabile ma possibile.
Che tale pratica determina una significativa ottimizzazione
dei costi, senza incidere negativamente nella pratica
clinica e sull’outcome del Paziente. Ci permettiamo di
proporre l’estensione di tale protocollo a livello Regionale.
495
215
THE ROMA (RISK OF OVARIAN MALIGNANCY
ALGORITHM) FOR ESTIMATING THE RISK OF
EPITHELIAL OVARIAN CANCER IN WOMEN
PRESENTING WITH PELVIC MASS: IS IT REALLY
USEFUL?
216
NICOTINAMIDE N-METHYLTRANSFERASE: A
POTENTIAL TARGET MOLECULE FOR EFFECTIVE
THERAPY AND EARLY DIAGNOSIS OF ORAL
SQUAMOUS CELL CARCINOMA
1
1
1
1
M. Montagnana , E. Danese , O. Ruzzenente , S.
1
1
1
1
Giudici , M. Gelati , G.L. Salvagno , G. Lippi , M.
1
1
Franchi , G.C. Guidi
1
Sez. di Chimica Clinica, Univ. degli Studi di Verona,
Verona
Objectives: The objective of this study was to evaluate
the performance of the predictive model ROMA (Risk
of Ovarian Malignancy Algorithm), which utilizes the
combination of Human Epidydimis Protein 4 (HE4) and
CA125 values, to assess the risk for epitelial ovaric cancer
(EOC) in women with a pelvic mass.
Methods: 104 women diagnosed with a pelvic mass and
scheduled to have surgery were enrolled. Preoperative
serum levels of HE4 and CA125 were measured.
Separate logistic regression algorithms ROMA for premenopausal and post-menopausal women were utilized
to categorize patients into low and high risk groups for
EOC. Statistical analyses were performed with GraphPad
Prism 5.0. The Area Under Curve (AUC), the sensitivity
and the specificity were calculated for HE4, CA125 and
ROMA in diagnoses of ovarian cancer by using receiver
operating characteristic (ROC) analysis.
Results: The pre-menopausal group had 36 benign cases
of which 31 were classified as low risk providing a
specificity of 86.1% (95% CI: 70.5-95.3), and 15 EOC of
which 8 were classified as high risk, providing a sensitivity
of 53.3% (95% CI: 26.6-78.7). The postmenopausal group
contained 13 benign cases of which 11 were classified as
low risk giving a specificity of 84.6% (95% CI: 54.6-98.0),
and 40 EOC tumors of which 33 were classified as high
risk giving a sensitivity of 82.5% (95% CI: 67.2-92.7).
In pre-menopausal group, the AUC was 0.71 (0.54-0.88)
for CA125, 0.77 (0.62-0.92) for HE4 and 0.77 (0.63-0.92)
for ROMA. In post-menopausal group, the AUC was 0.86
(0.76-0.96) for CA125, 0.94 (0.88-0.99) for HE4 and 0.92
(0.85-0.99) for ROMA.
Conclusion: The ROMA is a simple scoring system which
shows a high sensitivity and specificity for the detection
of malignant adnexal masses in post-menopausal women
but not in pre-menopausal women. Moreover, the dual
marker combination of HE4 and CA125 (ROMA) don’t
show a better performance of HE4 alone.
Reference
Moore RG, McMeekin DS, Brown AK, et al. A novel
multiple marker bioassay utilizing HE4 and CA125 for the
prediction of ovarian cancer in patients with a pelvic mass.
Gynecol Oncol 2009;112:40-6.
496
1
2
3
D. Sartini , V. Pozzi , A. Santarelli , C. Rubini , M.
4
1
2
5
Tomasetti , E. Renzi , R. Rocchetti , L. Lo Muzio , M.
1
Emanuelli
1
Dip. di Biochimica, Biologia e Genetica, Univ. Politec.
Marche, Ancona
2
Dip. di Scienze Cliniche, Specialistiche e
Odontostomatol., Univ. Politec. Marche, Ancona
3
Dip. di Neuroscienze, Univ. Politec. Marche, Ancona
4
Dip. di Patologia Molecolare e Terapie Innovative, Univ.
Politec. Marche, Ancona
5
Dip. di Scienze Chirurgiche, Univ. di Foggia, Foggia
Oral squamous cell carcinoma (OSCC) is the most
common form of head and neck cancer worldwide.
Up to now, reliable biomarkers for early diagnosis and
prognostic monitoring of OSCC are still lacking. Therefore,
it is necessary to identify new target molecules for
effective therapy and for diagnosis at the premalignant
and/or early stages of OSCC.
We focused on the expression of Nicotinamide NMethyltransferase (NNMT), which catalyses the Nmethylation of nicotinamide, pyridines and other structural
analogs, playing an important role in the biotransformation
and detoxification of many xenobiotics. We analysed
the enzyme expression in paired tumour (T) and nontumour (NT) tissues obtained at surgery by RT-PCR,
Real-Time PCR, and western blot. Compared with
normal mucosa, OSCC exhibited significantly increased
expression of NNMT in 11 of 22 (50 %) examined
patients. Interestingly, NNMT was upregulated in most of
the favourable OSCCs (N0). Both, pT and pathological
staging showed an inverse correlation with NNMT mRNA
levels, and a significant negative association of the
amount of NNMT expressed by tumour tissue compared
to the adjacent normal mucosa was found with metastasis.
Immunohistochemical analyses results seem to indicate a
favourable prognosis in patients with tumours expressing
high NNMT levels, whereas the absence of marked NNMT
expression seems to constitute a hallmark of aggressive
biological behaviour. We also evaluated the effect of
shRNA-mediated inhibition of NNMT on the proliferative
potential and apoptosis of oral cancer cell line PE/CAPJ15. ShRNA vectors targeted against NNMT efficiently
suppressed gene expression, showing inhibition rates
around 70 %, observed at both the mRNA and protein
levels. The shRNA-mediated gene silencing of NNMT
resulted in a significant rise in apoptosis rate.
Preliminary studies on salivary NNMT by western blot
showed strong immunoreactive bands in samples of
OSCC patients and negative or weakly positive bands in
normal saliva samples.
The present data support the hypothesis that NNMT
plays a role in tumour expansion and represents a highly
promising marker for early detection of oral cancer.
Moreover, knowing the status of NNMT expression would
be helpful in predicting the prognosis of each patient.
217
MICRO-RNA PROFILING IDENTIFIES MIR-126
AS PROMISING BIOMARKER FOR PROGNOSIS
AND EARLY DETECTION OF MALIGNANT
MESOTHELIOMA
218
HER2 REAL-TIME QPCR, A POTENTIAL METHODS
ABLE TO MONITOR THE OUTCOME OF BREAST
CANCER PATIENTS
1
1
2
2
2
D. Sartini , L. Santarelli , E. Strafella , S. Staffolani , M.
2
1
1
2
Amati , M. Emanuelli , V. Pozzi , M. Bracci , A.
3
4
5
2
Sabbatini , R. Ranaldi , S. Gasparini , M. Tomasetti
1
Dep. of Biochemistry, Biology and Genetics,
2
Dep. of Molecular Pathology and Innovative Therapies,
3
Thoracic Surgery Unit, Hospital Univ. of Ancona,
Ancona
4
Pathological Anatomy Unit, Hospital Univ. of Ancona,
Ancona
5
Pneumology Unit, Hospital Univ. of Ancona, Ancona
Background: Improved detection methods for diagnosis
of malignant pleural mesothelioma (MPM) are essential
for early and reliable detection and treatment. Since
recent data point to abnormal levels of microRNAs
(miRNAs) in tumors, we hypothesized that a profile of
deregulated miRNAs may be a marker of MPM and
that the levels of specific miRNAs may be used for
monitoring its progress. Methods: miRNAs isolated from
fresh-frozen biopsies of MPM patients were tested for
the expression of 88 miRNAs known to play a regulatory
role in neoplastic diseases. Three selected miRNAs were
assayed in cancerous tissue and adjacent non-cancerous
tissue sample pairs collected from 27 MPM patients
by quantitative reverse transcription-PCR. Furthermore,
the performance of the selected miRNAs as biomarker
was evaluated in serum samples of asbestos-exposed
subjects, MPM patients and compared with age-matched
healthy subjects. Results: A considerable difference in the
miRNA expression pattern was observed between tumors
and normal tissues. Of all miRNAs, mostly showing
lower levels of expression, only eight were significantly
downregulated. Of these, three miRNAs were analysed in
a larger sample series, with miR-126 and miR-32 showing
significant differential expression. A strong association
was found for low miR-126 and elevated miR-32 levels in
cancerous tissue and worse prognosis of the patients. The
miR-126 significantly distinguishes asbestos-exposed
subjects from MPM patients and from age-matched
controls. Conclusions: Deregulation of specific miRNAs is
involved in MPM and is associated with patient prognosis.
We propose miRNA-126 in association with soluble
mesothelin-related peptides as marker combination for
early detection of MPM.
1
1
2
M. Savino , M. Garrubba , A.P. Gallo , G. Merla , B.
2
3
4
4
Augello , R. Murgo , V.M. Valori , E. Maiello , S.A.
1
Santini
1
Clinical Analysis Laboratory, CSS Hospital, IRCCS,
San Giovanni Rotondo (FG)
2
Medical Genetics Service, CSS Hospital, IRCCS, San
Giovanni Rotondo (FG)
3
Dept. of Surgery, CSS Hospital, IRCCS, San Giovanni
Rotondo (FG)
4
Dept. of Onco-ematology, CSS Hospital, IRCCS, San
Giovanni Rotondo (FG)
Recently we developed a real-time quantitative reverse
transcription PCR assay, able to detect Her2neu
expression in peripheral blood samples. The HER2 QPCR
method was suitable, sensitive and reproducible for the
determination of HER2 status in the blood of breast
cancer patients, attending the Breast Cancer Unit of CSS
Hospital, before administration of anti-Her2neu specific
therapy.
Now, we suggest that this approach could be predictive
of the clinical outcome and might be useful for monitoring
the response to treatment. Therefore, aim of this study
was to evaluate the potential application of HER2 QPCR
in clinical samples collected during therapy and follow-up.
Patients: Twenty breast cancer patients were enrolled
at the Breast Cancer Center of CSS Hospital before
administration of anti-Her2neu specific therapy. After six
months from surgery 10 did not show evidence of disease
(NED), and the remaining 10 patients were affected
by advanced breast cancer (ABC). From each patients,
peripheral blood were collected during the follow up
(surgery, 6, 12, 18 and 24 months).
Methods: RNA extracted from peripheral blood was
reverse transcribed and the specific real-time quantitative
PCR assay (HER2 QPCR) was performed.
Results: according to the established cut off value, 6
out of the 10 ABC patients scored positive for Her2neu
expression after immunotherapy (24 months of the clinical
diagnosis), whereas 7 out of the 10 NED patients have
a Her2neu expression lower than the cut off value after
24 months of the clinical diagnosis. All patients presented
HER2 over expression during immuno-therapy.
Only in one patient, classified as NED six months after
surgery, we found an HER2 over expression eighteen
months after surgery, suggesting the tumour progression.
Conclusions: All samples from patients with more
aggressive disease, even if immune-treated, were found
positive for the Her2neu transcript. As expected, a good
response to the therapy was associated to the HER2
expression value below the cut off. Our date suggest that
the QPCR can be used to identify breast cancer patients
with poor prognosis and to monitor the response to the
therapy.
References.
Clin Chim Acta. 2007 Sep;384(1-2):52-6.
Cell Oncol. 2009;31(3):203-11.
497
219
PCA3 EVALUATION AS A NEW BIOMARKER FOR
PROSTATE CANCER DETECTION
1
1
2
M.A. Cicilano , P. Pazienza , D.F. Randone , S. De
2
3
1
Luca , R. Passera , P. Milillo
1
Lab. Analisi, Presidio Sanitario Gradenigo, Torino
2
Div. Urologia, Presidio Sanitario Gradenigo, Torino
3
Div. Medicina Nucleare 2, Univ. degli Studi di Torino
PSA is used as a marker of prostate disease, but its limits
as prostate cancer diagnostic test are well recognized.
PSA increase is not cancer specific. PCA3 is noncoding mRNA overexpressed in prostate cancer, used
as new diagnostic biomarker. PCA3 assay performance
is currently under investigation. Aim: to evaluate role
of PCA3 for prostate cancer diagnosis in men with
high level of PSA and to verified if PCA3 score cutoff suggest by Gene Probe (35) is the optimal one. We
characterized PCA3 performance in two different groups:
i) 552 men enrolled in our hospital, with increased serum
PSA level (2.5-10 ng/mL), negative DRE and scheduled
for a first biopsy, ii) 227 men enrolled in 10 Piedmont
clinical centres, with one or more previous negative
prostate biopsies, persistent high PSA and scheduled to
repeat biopsy. First catch of urine sample were collected
following DRE and tested to quantify PCA3 and PSA
mRNA concentrations using the Progensa PCA3 assay
(Gene Probe). Best PCA3 score cut-off was identified
by ROC analysis. Results were analysed using Fisher’s
exact test, Mann-Whitney test and Bivariate correlations.
Data from 552 patients scheduled for first biopsy show
PCA3 test had 68.3% sensivity (vs 69.1% of PSA,
71.4% of f%PSA) for detection of prostate cancer, 35.6%
specificity (vs 28.5% PSA, 34.8% of f%PSA) and negative
predictive value 82.3% (vs 66.7% PSA, 77.6% of f%PSA)
using PCA3 score cut-off=35. ROC AUC was 0.586 for
PCA3, 0.520 for PSA, 0.557 for f%PSA. Among 227
men with previous negative biopsy only 70 had positive
repeat biopsy (30.8%). PCA3 test had 70.3% sensivity
for detection of prostate cancer, 81.6% specificity and
negative predictive value of 86.3% using PCA3 score cutoff=35. ROC analysis show that using PCA3 score=40
the test had 74.3% sensivity for detection of prostate
cancer, 86.6% specificity and negative predictive value of
88.3%. Our results reveal PCA3 assay is not better than
PSA test in prostate cancer screening, on the contrary
these data suggest usefulness of PCA3, after one or
more negative biopsies, to identify patient risk for positive
re-biopsy. PCA3 score cut-off=40 get optimal balance
between sensivity and specificity.
498
220
SERUM BIOMARKERS OF PANCREATIC CANCER
(PC) AND PANCREATIC CANCER DERIVED
DIABETES MELLITUS (DM)
1
2
1
1
A. Padoan , P. Fogar , E. Fadi , E. Greco , D.
1
1
2
2
Bozzato , S. Moz , F. Navaglia , C. Zambon , R.
3
4
2
5
Seraglia , S. Pedrazzoli , D. Basso , M. Plebani
1
Dip. Scienze Diagnostiche e Terapie Speciali, Univ. di
Padova, Padova
2
Dip. Medicina di Laboratorio, A.O. di Padova, Padova
3
CNR, ISTM, Padova
4
Dip Scienze Mediche e Chirurgiche, Univ. di Padova,
Padova
5
Dip Scienze Diagnostiche e Terapie Speciali e
Medicina di Laboratorio, A.O.U. di Padova, Padova
Objectives: To verify whether discontinuous SDS-PAGE,
perfomed in the conditions which allowed the isolation of
NT-S100A8 from PC tissues, can identify potential serum
markers of PC and PC induced DM.
Methods :We collected sera from 42 PC patients (17 with
and 25 without DM) and from 11 healthy controls (C).
Results: In the low MW range (15,000 - 1,000 Da),
nine protein bands were identified and numbered 1
to 9 from heaviest to lightest. Only band number 2
(14,200 Da approximately), was correlated with PC
diagnosis, being present in 10/11 C and absent in
2
37/42 cancer cases (χ =26.8,p<0.001). Two bands, 4
and 9, MW 10,000 and 1,000 Da respectively, correlated
2
with each other (χ =4.8,p<0.05). In PC, the absence
of both bands correlated with the presence of DM
2
2
(χ =8.6,p<0.01 for band 4 and χ =6.6,p<0.05 for band
9) and was significantly associated with higher fasting
plasma glucose levels (p<0.05 for band 4 and p<0.01 for
band 9). The absence of band 9 was also significantly
associated with HbA1c (p<0.05) and with glucose/Cpeptide ratio (p<0.05).
To characterize the protein inversely correlated with PC
diagnosis, we performed a MALDI-TOF analysis of the
tryptic in-gel digestion of band 2. The identified peaks
were analysed by Mascot Peptide Mass Fingerprint and
showed a high homology with human hemoglobin subunit
b (score 76, p<0.05)
Conclusion: SDS-PAGE analysis of the low MW serum
proteins allowed the detection of peptides correlated with
PC derived DM and the identification of free beta globin
as a potential PC serum marker.
Reference: Basso D, Greco E, Fogar P, Pucci P, Flagiello
A, Baldo G, Giunco S, Valerio A, Navaglia F, Zambon
CF, Falda A, Pedrazzoli S, Plebani M. Pancreatic cancerderived S-100A8 N-terminal peptide: a diabetes cause?
Clin Chim Acta. 2006;372(1-2):120-8.
221
DETECTION AND EVALUATION OF CIRCULATING
TUMOR CELLS IN LOCALLY ADVANCED
COLORECTAL CANCER
222
SERUM MESOTHELIN IN ASBESTOS -EXPOSED
WORKERS
1
1
1
1
L. Zorzino , M. Picozzi , M.C. Cassatella , M.G.
2
4
3
5
Zampino , A. Chiappa , E. Botteri , L. Adamoli , E.
2
4
1
Magni , E. Bertani , M.T. Sandri
1
U.O. di Medicina di Laboratorio, Istituto Europeo di
Oncologia, Milano
2
U.O. di Cure Mediche, Istituto Europeo di Oncologia,
Milano
3
Div. Epidemiologia e Biostatistica, Istituto Europeo di
Oncologia, Milano
4
Div. Chirurgia Generale e Laparoscopica, Istituto
Europeo di Oncologia, Milano
5
Dip. di Medicina, Istituto Europeo di Oncologia, Milano
Background. Circulating tumor cells (CTC) in blood
are essential for the formation of metastasis. There
is growing evidence that CTCs can serve as new
diagnostic, prognostic and predictive marker. Recent
studies demonstrated that CTCs detected at baseline
and at disease-evaluation during treatment were an
independent prognostic factor in metastatic colorectal
cancer, while the role in early stages after radical surgery
is under investigation. Aim of this study is to investigate
the role of CTCs in locally advanced rectal cancer patients
undergoing neo-adjuvant chemoradiotherapy, for whom
no information is to date available.
Methods. Blood samples from 40 patients (pts) with
cT3-4 and/or N+ rectal cancer were obtained at baseline
(T0), after neoadjuvant therapy with capecitabine and
concomitant external radiotherapy (T1), 3-5 days after
curative surgery (T2) and at 6 months from surgery (T3).
The first 18 pts had 10 ml blood sampling, while the
subsequent 22 had thirty ml at each time point. CTC
enumeration was performed using the CellSearch System
(Veridex, USA), by means of immunomagnetic separation
and by staining with fluorescent reagents. CTCs were
defined as nucleated cells expressing cytokeratin 8,18
and 19, but lacking CD45. A sample was considered
positive when 1 or more cells were detected.
Results. Forty pts underwent T0 sampling, 33 completed
CT/RT (T1) and 32 underwent T2 sampling. At baseline
7 pts presented 1 CTC (17.5%), one 2 CTCs (2.5%), one
27 CTCs (2.5%), while in 31 pts (77.5%) no CTCs were
detected. Among these latter, 4 were missed for other
time-points evaluations. In the remaining 27 pts, 25 were
CTC negative and 2 were CTC positive. Among 9 pts with
CTC positive at baseline, one had not other time-point
2
3
4
P. Marroni , M. Mencoboni , F. Spigno , V. Mortara , L.
3
2
3
2
Michelazzi , C. Ferrarazzo , A. Cioè , R. Galli , R.
5
Filiberti
1
Patologia Clinica, Ist. Nazionale per la Ricerca sul
Cancro, Genova
2
Oncologia Medica, A.O. Villa Scassi, Genova
3
Medicina del Lavoro, Univ. di Genova, Genova
4
INAIL, Genova
5
Epidemiologia, Biostatistica e Clinical Trials, Ist.
Nazionale per la Ricerca sul Cancro, Genova
Background: Recent reports have raised interest on
soluble mesothelin-related peptides (SMRP) as potential
markers in diagnosis and prognosis of malignant
mesothelioma. The role of SMRP for screening of at-risk
asbestos-exposed subjects has also been discussed. The
goal of our study was to evaluate the predictive value
of SMRP in a cohort of subjects with past exposure to
asbestos, at risk for malignant mesothelioma.
Methods: The study subjects were recruited from those
working as dockers and ship-builders or in a steel
industry. A detailed questionnaire on demographic data,
smoking history, occupation (industry, occupational task,
duration of asbestos exposure), familial cancer history
and clinical anamnesis was administered to all subjects.
Blood samples from all individuals were collected
by routine venipuncture and participants underwent
medical examination. A written informed consent was
obtained from all patients before enrollment. SMRP was
determined wit a commercial ELISA kit.
Results: We analyzed 1233 subjects, mean age 61.3±6.5
years. Sixty-four of them were smokers or former
smokers. One of the participants was diagnoses a
malignant mesothelioma and had a serum SMRP value
of 21 nM/L. In the remaining subjects, mean SMRP was
0.56±0.46 nM/l (range 0-4.45 nM/L). SMRP was lightly
correlated with age (r=0.11). No correlation was found
with smoking habits. The analysis of medical anamnesis
showed the following mean SMRP values: 0.51±0.3 in
subjects with no disease, 0.95±0.6 and 0.67±0.4 in
patients with a previous tumor of lung or in other sites,
respectively. Subjects with benign respiratory diseases
had a mean SMRP value of 0.74±0.6. Conclusion:
This preliminary analysis on asbestos-exposed subjects
confirmed the presence of higher SMRP values in
individuals with tumors of pleura and lung.
samples, 6 were CTC negative and 2 presented ≥ 1 CTC.
Only one patient was CTC positive on all time points. No
evidence of correlation was found between patient/tumor
characteristics and CTC count.
Conclusion. The preliminary results of this study show that
at least 1 CTC was detected in 9 pts out of 40 evaluable
pts at baseline (22.5%) and in only one patient showed
CTC at all time of sampling. No association with clinical
or pathological findings was observed. The study is still
ongoing.
499
223
INVOLVEMENT OF AKT/NF-KB PATHWAY IN N6ISOPENTENYLADENOSINE INDUCED APOPTOSIS
IN HUMAN BREAST CANCER CELLS
1
2
3
4
T. Di Matola , C. Laezza , A.M. Malfitano , P. Ricchi , S.
1
1
3
Esposito , G. Somma , M. Bifulco
1
Lab. di Pat. Clin., “C.T.O.”, ASL Napoli 1 Centro,
Naples, Italy
2
Centro di Endocr. ed Onc. Sperim. del CNR, Dip. di
Biol. e Pat. Cell. e Mol.“Federico II”, Naples, Italy
3
Dip. di Scienze Farmac., Univ. degli Studi di Salerno,
Fisciano (SA), Italy
4
Dip. di Oncoemat., U.O.C. Centro delle Microcit., AORN
“A. Cardarelli”, Naples, Italy
Introduction. Breast cancer is the most common cancer
among Italian women; it accounted for 29.0% of
cancer incidence in women and 16.9% of cancer
6
mortality. N -isopentenyladenosine (i6A) is a modified
nucleoside with a pentaatomic isopentenyl derived
from mevalonate that induces inhibition of tumor cell
proliferation in several tumor cell lines; i6A arrests
tumor cell proliferation by inhibiting farnesyl diphosphate
synthase and protein prenylation and competes for
6
nucleoside transport. N -isopentenyladenosine inhibits
the tumour cell growth by inducing cell apoptosis;
however, little is known regarding the mechanisms by
which the drug induces cell apoptosis. Matherials and
Methods. Human breast cancer cells (MDA-MB-231)
were obtained from ATCC and cultured in DMEM/F12
medium. After incubation and extraction, the lysed cells
were electrophoretically transferred to a nitrocellulose
membrane. Each membrane was incubated with
monoclonal antibodies, washed with TTBS and incubated
with secondary antibody conjugated with peroxidase.
The signal was then detected using chemiluminescent
detection system (Western blot analysis). Results. In this
study, we further explored the molecular mechanisms of
i6A as an anticancer agent on a human breast cancer
cell line MDA-MB-231. Treatment with i6A decreased
the cell proliferation of MDA-MB-231 cells in a dosedependent manner by arresting the cells at G0/G1 phase.
This effect was strongly associated with concomitant
decrease in the level of cyclin Dl, cyclin E, cdk2, and
increase of p21wafl and p27kip. In addition i6A also
induced apoptotic cell death by increasing the expression
of Bax, and decreasing the levels of Bcl-2 and Bcl-xL, and
subsequently triggered mitochondria apoptotic pathway
(release of cytochrome C and activation of caspase-3).
We observed that i6A suppressed the nuclear factor
kappaB (NF-KB) pathway and inhibited the Akt activation.
Conclusions. The results of this study indicate that i6A
decreases cell proliferation, induces apoptotic cell death in
human breast cancer cells, possibly by decreasing signal
transduction through the Akt/NF-kB cell survival pathway,
and may be a potentially effective chemopreventive or
therapeutic agent against breast cancer. Bibliography.
C. Laezza et al.: N6-isopentenyladenosine inhibits cell
proliferation and induces apoptosis...-Int. J. Cancer: 124,
1322–1329(2009)
500
224
CLINICAL RELEVANCE OF ANALYTE LEVELS
AND APPROPRIATE MATRIX COMPOSITION
FOR COMMERCIAL TUMOR MARKER MULTI
CONSTITUENT CONTROLS
1
1
1
1
M. Olsson , O. Nilsson , C. Hall , C. Fermér , K.
1
1
Majnesjö , M. Lundin
1
Fujirebio Diagnostics AB, Gothenburg, Sweden
Aim: Quality Assurance of Tumor Marker assays require
access to control materials that closely resemble patient
samples. Several Multi Constituent Tumor Marker Control
kits are marketed for this purpose. The objective of this
study was to compare six commercially available products
in terms of analyte levels and control matrix.
Materials and Methods: The analyte levels for AFP,
CA15-3, CA19-9, CA125, CEA, Ferritin, FreePSA and
Total PSA were determined for six Multi Constituent
Tumor Marker Control kits: Bio-Rad Liquichek™ (REF
548X), Bio-Rad Lyphochek® (REF 368X), CliniQA Liquid
QC™ (REF 91302), MAS® T-marker (REF TUM-S1),
Fujirebio Diagnostics TM Control (REF 108-20) and
Randox Quality Control Sera (REF IA2633). To evaluate
matrix composition, the different control materials and
normal serum samples were analyzed with a Serum
Protein Electrophoresis (SPE) kit.
Results: All kits contained one control where the levels
for each analyte corresponded to the normal range and
at least one control with analyte levels in the pathological
range. Clinically relevant percentages of FreePSA to Total
PSA were only observed in the controls from Fujirebio
and Cliniqa, with 30% and 10% FreePSA respectively.
The remaining control materials tested contained >90%
FreePSA. The Fujirebio and Lyphochek controls showed
similar pattern on SPE compared to normal serum
samples, including bands in the albumin, alpha-, beta- and
gammaglobulin regions. Alpha- and beta globulin bands
were merged for the Cliniqa control. The Liquichek, MAS
and Randox controls showed a distinct albumin band only.
Conclusions: Clinically relevant analyte levels and
appropriate sample matrix are the most important
parameters for any quality control. The Fujirebio and
Cliniqa controls showed a clinically relevant ratio of
FreePSA to Total PSA, and were identified as suitable for
quality assurance of Total PSA assays. The controls with
a matrix most similar to patient samples were Fujirebio
and Lyphochek.
Reference: Lilja H, Ulmert D, Vickers A. Prostate-specific
antigen and prostate cancer: prediction, detection and
monitoring. Nature Reviews Cancer 8, 268-278 (2008).
225
SINGLE-NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS OF
MICRORNAS IN NSCLC PATIENTS: GENOTYPE
DISTRIBUTION, CORRELATION WITH EXPRESSION
AND CLINICAL FEATURES
1
1
1
1
S. Vinci , S. Gelmini , N. Pratesi , S. Conti , F.
1
1
1
1
Malentacchi , L. Simi , M. Pazzagli , C. Orlando
1
U.O. di Biochimica Clinica, Dip. Fisiopatologia Clinica,
Univ. degli Studi di Firenze, Firenze
Since single miRNA can have a large number of
potential mRNA targets, even minor variations in their
expression can have influences of hundreds of putative.
The presence of sequence variants in miRNA genes
may influence their processing, expression and binding
to target mRNAs. Here we evaluated 98 paired samples
(cancer and normal tissues) from NSCLC patients to study
the genotype distribution of SNPs in four miRNA genes:
miR-196a2 (rs11614913 C-T), miR-146a (rs2910164 CG), miR-149 (rs2292832 C-T) and miR-499 (rs3746444
G-A) and their influence on expression of respective
miRNAs.
The simultaneous analysis of paired tissues excluded that
SNPs in these miRNAs may undergo somatic mutations
during cell transformation. We did not find any association
between distribution of miR-149, miR-196a2 and miR-499
genotype and risk of NSCLC. Conversely CG allele of
miR-146a appeared associated to an increased risk for
NSCLC (p=0.042 and 1.77 OR). The same genotype
was correlated to a relevant increase (about six–fold)
of its expression in NSCLC. Also for miR-149, the CC
genotype seems associated to an increased miRNA
expression, but in this case this feature tended to
favour an improvement of overall survival. The previously
described tendency to the up-regulation of mir-196a2
expression was confirmed also in this study (p<0.001),
without any evident association with its genotype.
226
SPLICING VARIANTS OF CARBONIC ANHYDRASE
IX IN BLADDER CANCER AND URINE SEDIMENTS
1
1
2
F. Malentacchi , S. Vinci , A. Della Melina , J.
3
1
2
3
Kuncova , M. Pazzagli , D. Villari , G. Giannarini , G.
4
3
1
Nesi , C. Selli , C. Orlando
1
U.O. Biochimica Clinica, Dip. Fisiopatologia Clinica,
2
U.O. Urologia, Dip. di Area Critica Medico Chirurgica,
3
U.O. Urologia, Dip. di Chirurgia, Univ. di Pisa, Pisa
4
Dip. Patologia e Oncologia Umana, Univ. degli Studi di
Firenze, Firenze
In human cancers, carbonic anhydrase IX (CAIX)
influences cell proliferation and tumor progression,
maintaining pH under hypoxic conditions. An alternative
CAIX isoform (AS), independent from the hypoxia
levels, was recently demonstrated in cancer cells(1).
AS competes with the full-length (FL) isoform in the
regulation of the extracellular pH. In the present study we
evaluated mRNA expression of the two CAIX isoforms
and their clinical relevance in 45 patients affected by
bladder transitional cell carcinoma and benign mucosa
and in urine sediment of 81 bladder cancer patients and
93 controls by real-time PCR technology.
Expression of FL was lower than AS in benign mucosa
(p=0.006) whereas in paired bladder cancers FL mRNA
was higher (p=0.007). Consequently, the percentage of
FL in bladder cancers was significantly higher than in
benign mucosa (p<0.0001). In the urinary sediments
of bladder cancer patients FL mRNA was higher in
comparison to benign mucosa (p=0.003). FL percentage
appeared dramatically higher in urine sediments of
bladder cancer patients in comparison to controls
(p<0.0001). In addition FL% was significantly different in
sediments from pTa-pT1 and ≥ pT2 patients (p=0.016).
Stratification according tumor grade indicated that FL%
was lower in G1 bladder cancers in comparison to G2G3 (p=0.005) The clinical sensitivity for FL% in urine
sediments was 93%, with a 76% specificity. Using the
same cut-off positive predictive value (PPV) was 72% ,
whereas negative predictive value (NPV) was 91%.
Our results seem to indicate that in bladder cancers and
related urine sediments, FL is the prevalent and most
accurate clinically relevant variant surrogate of hypoxic
stress.
(1) Barathova M, Takacova M, Holotnakova T et al.
Alternative splicing variant of the hypoxia marker carbonic
anhydrase IX expressed independently of hypoxia and
tumour phenotype. Br J Cancer 2008;98:129–36.
501
227
ADVANCES IN DIAGNOSTICS: ASSESSMENT
OF THE PCA3 TEST FOR EARLY DIAGNOSIS OF
PROSTATE CANCER
228
THE MEANING OF THE THYMIDINE KINASE (TK) IN
LYMPHOPROLIFERATIVE DISEASE
1
1
2
2
3
P. Bruni , F. Galasso , R. Giannella , S. Perdonà , G.
2
1
Sepe , R. Giulivo
1
Lab. Biodiagnostica Montevergine-Malzoni, Avellino
2
Clinica Malzoni, Avellino
3
INT Fondazione G. Pascale, Napoli
Background.
PCA3 is a prostate specific non-coding mRNA significantly
overexpressed in prostate cancer tissue. Urinary PCA3
levels have been associated with prostate cancer grade
suggesting a significant role in the diagnosis of prostate
cancer. We have examined 1792 patients from several
areas of Italy and assessed the association of urinary
PCA3 score with the results of prostate biopsy.
Material and Methods.
First-catch urine samples were collected after digital rectal
examination (DRE). PCA3 and PSA mRNA levels were
measured using Trascription-mediated PCR amplification.
The PCA3 score was calculated as the ratio of PCA3 and
PSA mRNA (PCA3 mRNA/PSA mRNA x 1000) and the
cut off was set at 35.
Results.
A total of 1792 PCA3 tests were performed from
December 2008 to July 2010. The rate of informative
PCA3 test was 99%, with 1767 patients showing a valid
PCA3 score value: 862 patients (48.78%) presented a
PCA3 score higher than the cut-off (>=35) whereas the
remaining 905 patients (51.22%) presented a PCA3 score
lower than the cut-off limit (<35).
Of the 1767 patients only 408 had undergone rebiopsy;
among those patients we found that mean and median
PCA3 scores were significantly higher in the PCa versus
the biopsy negative group (110 and 82 vs 44 and 33
respectively).
The mean PCA3 score (73) for the patients diagnosed
with HGPIN/ASAP at biopsy was intermediate between
patients with negative and positive biopsy.
The PCA3 test was < 35 in 71 of 140 patients with negative
concurrent biopsy findings and >= 35 in 86 of 100 with
positive biopsy findings (sensitivity 86.0% and specificity
50.7%).
Conclusions.
PCA3 urine assay shows improvement of the performance
characteristics and identification of serious disease
compared with PSA, detection techniques have
acceptable diagnostic accuracy rates, and might be useful
in choosing between repeat biopsy and more conservative
follow-up.
502
1
1
1
V. Brescia , A. Mileti , M. Tampoia , G. Urso , A.
1
1
1
Verna , V. Masellis , F. Di Serio
1
Background.The Thymidine Kinase (TK) is an effective
marker of cell proliferation, perhaps the only marker that
can be measured in serum
Aim of study. Evaluation of TK concentration in patients
with lymphoproliferative disease.
Materials and Methods. Were evaluated 26 healthy
subjects (control group) and 105 patients with
lymphoproliferative disease (18 viral infections, 20
autoimmune diseases, 18 monoclonal gammopathies
(MG), 16 CLL, 33 NHL). TK was assayed using a
chemiluminescent kit commercial laboratory (Dia-Sorin)
on the LIAISON® automated analyzer. To verify the
analytical precision was used protocol NCCLS EP15-A2.
The Dunnett's Multiple Comparison test was used for
comparison of medians. The assessment of sensitivity
and specificity for different cutoff values was performed by
ROC curves.
Results. The analytical precision was 1.69-2.5 (Within
run CV%) and 2.22-2.98 (Within laboratories CV%). The
median TK in the control group was 4.0 U/L (range
1.7-6.3), in subjects with virus infection was 25.0 U/L
(range 5.2-280), with autoimmune disease was 11.1 U/L
(range 3.8-33.3), with MG was 8.8 U/L (range 2.2-45), with
CLL was 10.0 U/L (range 2.0-231) and with NHL was 34.9
U/L (range 5,2-640). The comparative analysis provided
statistically significant differences between normal vs
NHL (P <.001). The analysis of ROC curves (patients
vs healthy subjects) revealed: to cutoff value of 5.3 U/
L sensitivity and specificity of 94.4 and 92.3 in virus
infection, 85.0 and 92.3 in autoimmune disease, 81.8 and
92.3 in CLL; to cutoff value of 6.3 U/L sensitivity and
specificity of 66.7 and 100 in MG, 87.5 and 100 in the NHL,
respectively.
Discussion. Our data show that the concentration of
TK, for the appropriate analytical performances, lends
the introduction into the routine. TK are increased in
both disease oncohematology that in viral infections and
autoimmune diseases, therefore, the "usefulness" in the
primary diagnosis of lymphoproliferative disease seems
limited.
Conclusion TK itself as "biomarker" in lymphoproliferative
disease, useful for assessing the development of benign
disease and response to therapy of malignancy or chronic
1.O’Neill KL, Buckwalter MR, Murray BK: Thymidine
kinase: diagnostic and prognostic potential. Expert Rev
Mol Diagn 2001;1: 428–433.
229
INTRATHECAL SYNTHESIS OF TUMOR MARKERS
IN LEPTOMENINGEAL METASTASIS
1
1
1
230
VALUTAZIONE DI UN DOSAGGIO ELISA PER LA
DETERMINAZIONE DELLA CROMOGRANINA A E
CONFRONTO CON UN METODO IRMA
2
E. Corsini , G. Bernardi , E. Ciusani , A. Salmaggi , D.
1
Croci
1
U.O di Patologia Clinica e Genetica Medica
2
U.O. di Neurooncologia
Leptomeningeal metastasis (LM) is a neurological
complication occurring in patients affected by solid
or hematological malignancies. Although prognosis is
generally poor (mean servival time <6 months), an early
diagnosis of LM is crucial to start aggressive treatments
and to prevent further neurological deterioration.
Cytological detection of tumor cells in Cerebrospinal Fluid
(CSF) is the “gold standard” for LM, but the sensitivity
of this test is unsatisfactory (sensitivity: 50-60% at first
lumbar puncture), because of the rapid deterioration of
cells in CSF. Therefore there is an urgent need of novel
CSF markers able to improve the diagnosis of LM.
The tumor markers (TM) CEA, CA15.3, CA125 e CA19.9
are glycoproteins released at high levels by tumor cells.
High TM concentrations in serum are not considered
specific of malignancies, since TM may be increased also
in some benign conditions. However, within the CNS only
tumor cells may produce TM. We quantified TM in serum
and CSF in 29 patients with LM and in 100 patients
affected by Other Neurological Diseases (OND) with an
automated analyzer (Modular Analytics SWA, Roche) and
then we evaluated the putative intrathecal synthesis of TM
(TMIS), calculated according the mathematical approach
suggested by Reiber for immunoglobulins (IgA).
All LM patients showed intrathecal synthesis for at least
one markers, while all OND patients were negative
(specificity of the test: 100%). TMIS was as sensitive as
cytological examination and in 2 dubious cases confirmed
the diagnosis. We found no clear correlation between TM
and tumor type.
CEA was detected in most of the patients (26/29),
regardless of the type of carcinoma. Therefore, CEA could
be the marker of choice as a diagnostic test of LM.
Our data suggest that TMIS is a specific and sensitive
parameter and a reliable diagnostic tool for diagnosis of
LM.
References
Kosmas C et al. Changes of cerebrospinal fluid tumor
marker levels may predict response to treatment and
survival of carcinomatous meningitis in patients with
advanced breast cancer. Med Oncol 2005;22(2):123-28.
1
1
1
R. Dittadi , I. Bertoli , R. Bastianello , S.
1
1
Bonaventura , M. Gion
1
Lab. Analisi, Osp. dell'Angelo, Mestre-Venezia
La Cromogranina A (CgA) è una proteina prodotta da
cellule di origine neuroendocrina, la cui determinazione
è considerata utile nella gestione di pazienti con tumori
neuroendocrini.
Scopo del lavoro è la valutazione analitica, ed il
confronto con un metodo IRMA (CisBio International), del
metodo ELISA recentemente sviluppato dalla stessa Ditta
utilizzando i medesimi anticorpi.
L'imprecisione è stata valutata testando due pool di
plasma EDTA (P1 e P2) secondo il protocollo CLSI EP-15.
La linearità è stata valutata mediante diluizioni (da 1/2 ad
1/30) di 5 campioni a concentrazioni iniziali da 929 a 133
µg/L.
I valori di riferimento su plasma EDTA (matrice utile per
una migliore conservazione, ma non valutata alla Ditta)
sono stati determinati usando 120 soggetti normali (CLSI
C28-A2.)
94 campioni sono stati inoltre dosati anche con il dosaggio
IRMA.
Imprecisione: P1 (72.5 µg/L) ha mostrato un C.V.
intradosaggio di 4.7% ed un C.V. totale di 6.8%. P2 (389
µg/L) un C.V. intradosaggio di 4.4% ed un C.V. totale di
7.9%. I risultati confermano i dati forniti dalla Ditta (C.V.
intradosaggio <6%, C.V. totale <10%).
Linearità: I risultati mostrano percentuali di recupero tra il
90% e il 120% su 3 campioni su tutti i rapporti di diluizione.
Con altri due campioni si sono evidenziati recuperi non
adeguati solo per valori <25 µg/L e >900 µg/L.
Confronto con IRMA: La regressione di Passing-Bablock
fra ELISA ed IRMA ha fornito un'ottima correlazione
[ELISA= -0,53(-5.5/+3.7) + 0.789(0.757/0.820) IRMA],
con sottostima dei valori ottenuti con ELISA. L'analisi di
Bland-Altman conferma il dato, mostrando un bias medio
di -25.3% (range ±2 ds da -51.3 % a +1.0%).
Intervallo di riferimento: la valutazione dei soggetti sani su
plasma EDTA ha fornito un valore del 95° percentile della
distribuzione di 119 µg/L, contro un valore di riferimento
del sistema IRMA di 150 µg/L.
Il metodo ELISA si mostra ben correlato con l’originale
CgA -IRMA. Presenta una sottostima media di circa
il 22%, e parallelamente un intervallo di riferimento
diminuito all’incirca della stessa entità. Nel corso di questo
studio il range di calibrazione è stato ristretto dalla Ditta
produttrice, per migliorare la linearità. Complessivamente
il metodo sembra risultare sufficientemente attendibile e
robusto per l'introduzione in routine
503
231
CHARACTERIZATION OF A SERUM PROTEINS
PATTERN FROM NSCLC PATIENTS TREATED WITH
GEFITINIB
232
DOSAGGIO DI “ MONOTOTAL” CON UN SISTEMA
AUTOMATICO RANDOM ACCESS
1
1
3
5
V.M. Garrisi , I. Bongarzone , A. Mangia , M.
3
3
3
2
Cremona , M. De Bortoli , E. Vaghi , D. Galetta , U.
4
1
1
1
Pastorino , V. Cafagna , M. Quaranta , I. Abbate , A.
5
Paradiso
1
Dip. Onc. Sper., U.O. Lab. An., Ist. Tum. IRCCS, Bari
2
Dip. Onc. Clin., Ist. Tum. IRCCS, Bari
3
Dip. Onc. Sper. e Lab., Fond. IRCCS Ist. Naz. Tum.,
Milano
4
Dip. Chir., U. O. Chir. Toracica, Fond. IRCCS Ist. Naz.
Tum., Milano
5
Dip. Onc. Sper., Lab. Onc. Sper.,Ist. Tum. IRCCS, Bari
Introduction. EGFR-targeted therapy, i.e. Gefitinib, has
shown favourable efficacy only in a minority of
patients with chemotherapy-refractory Non Small Cell
Lung Cancer. A strongly predictive blood-based test
is needed. We have evaluated in serum SELDI-TOF
spectra a pattern of proteins included in a MALDITOF based algorithm previously reported by Taguchi
et al. (1) as predictive of response to EGFR TKIs
treatment and identified the principal components of such
algorithm. Methods. In 11 pre-treatment sera from patients
undergoing in Gefitinib monotherapy, we identified the
cluster with m/z 5843, 11445, 11529, 11685, 11759,
11903 using NP 20 proteinchip array. Four peaks with m/
z 5843, 11445, 11529, 11685 appeared to be linked to
the acute phase protein SAA (Serum Amyloid A) family
based on their calculated molecular weight. To confirm
that such peaks were isoforms of SAA, we analysed
the spectra of serum mixture from one patient both
before and after immunodepletion of SAA. To identify
SAA we run anti-SAA immunoprecipitated on a onedimensional SDS-PAGE gel and after silver staining, we
excised a band from the gel with MALDI-TOF analysis.
Peptide Mass fingerprint revealed the exclusive presence
of the SAA protein in the excised band. Finally, in
order to evaluate SAA concentration, we performed an
ELISA for SAA. Results. 5 out of 8 peaks of Taguchi
algorithm corresponded to the isoforms of SAA. SAA
concentrations were ranging from 7.41 to 43.47 µg/ml.
Considering the 5 µg/ml the upper limit of the normal
range of the ELISA assay used, we concluded that all
sera showed high level of SAA and there was no obvious
trend relating these concentrations to SAA and response
to Gefitinib treatment. Conclusion. The majority of m/
z features reported by Taguchi are linked to SAA and
high-levels of this acute-phase protein were present in
all patients irrespective of response to therapy. Further
studies on a large cohort of patients are required to
definitely establish if this algorithm can be used to predict
response to treatment.
Reference. 1.Taguchi F et al. Mass Spectrometry to
classify Non Small Cell Lung Cancer patients for clinical
outcome after treatment with epidermal growth factor
receptor tyrosine kinase inhibitors: a multicohort crossinstitutional study. J Natl Cancer Inst 2007;99:838-46.
504
1
1
1
C. Cosma , D. Faggian , P. Hoxha , F. Favaro , M.
1
Plebani
1
Dip. di Medicina di Laboratorio, Univ. degli Studi di
Padova, Italia
Le citocheratine (CK) sono proteine strutturali presenti
nelle cellule epiteliali del filamento intermedio. Durante
la trasformazione di cellule normali a maligne la
conformazione delle CK è generalmente mantenuta.
Tale proprietà ha permesso di utilizzare le CK come
marcatore tumorale. Le CK 8,18 e 19 sono quelle che si
trovano maggiormente in vari tipi di carcinoma (vescica,
mammella, polmone, apparato gastrointestinale, ovaio
e prostata). In particolare queste tre citochine sono
un marcatore molto sensibile del cancro al polmone,
soprattutto nei casi di tumore a cellule squamose non
piccole (NSCLC), essendo il loro livello ben correlato con
la carica tumorale e la gravità della malattia.
Il dosaggio RAD Monototal (ditta Radim, Pomezia
Terme, Italia) prevede l’utilizzo di una tecnologia
immunoenzimatica a fluorescenza in completa
automazione applicata allo strumento RAD 120.
Nel corso dello studio sono state valutate le prestazioni
analitiche e di accuratezza del prodotto RAD120
Monototal, reclutando nei mesi di aprile e maggio 2010
una popolazione di oltre 200 campioni pervenuti con
richiesta di TPA, i cui risultati erano inferiore al cut-off
in 50 campioni mentre 150 campioni avevano valori di
TPA elevati. I risultati di Monototal sono stati confrontati
con quelli del TPA ottenuti con metodo Liaison (Diasorin)
che è lo strumento utilizzato nel nostro laboratorio per la
routine, la cui qualità viene monitorata attraverso CQI e
schemi specifici di VEQ. Considerando il quadro clinico
del pannello di sieri analizzato, ed il contemporaneo
dosaggio di altri markers, si è ottenuto un valore di
sensibilità del 81.4%, di specificità del 94.2%, ed una
concordanza pari a 86.3%.
La ripetibilità del metodo è stata valutata attraverso
sedute di intra-assay a tre livelli (alto, medio e basso)
ed abbiamo ottenuto i seguenti CV%: 6,2%, 8.11% e
6,6% rispettivamente. Mentre l’inter-assay ha evidenziato
i seguenti CV% : 7.22%, 15.18%, 1.06%.
Il sistema in completa automazione, l’accesso random dei
campioni con caricamento continuo, la capacità operativa
fino a 120 campioni a bordo con identificazione positiva
del campione attraverso barcode e una produttività fino ad
un massimo di 120 test/ora sono solo alcuni degli aspetti
importanti del dosaggio del Monototal su RAD 120.
233
APPLICAZIONE DEL DOSAGGIO QUANTITATIVO
PER LA CROMOGRANINA AD UN SISTEMA
AUTOMATICO RANDOM ACCESS : L’ESPERIENZA
DI PADOVA
234
EFFECTS OF COMBINED REGULAR TRAINING AND
ORGANIC-BASED DIET ON OXIDATIVE STRESS
PARAMETERS IN YOUNG SOCCER PLAYERS
1
1
1
1
1
C. Cosma , D. Faggian , P. Hoxha , A. Tasinato , M.
1
Plebani
1
Padova, Italia
La Cromogranina è una proteina acida idrofila di
439 aa (49 kD) presente nei granuli cromaffini delle
cellule neuroendocrine. Il dosaggio RAD Cromogranina
(ditta Radim, Pomezia Terme, Italia) è basato su una
tecnologia immunoenzimatica a fluorescenza in completa
automazione applicata allo strumento RAD 120. Nel corso
dello studio sono state valutate le prestazioni analitiche
e di accuratezza del prodotto RAD120 Cromogranina,
reclutando una popolazione di oltre 150 pazienti pervenuti
con richiesta di Cromogranina nei mesi di aprile e
maggio 2010. I risultati ottenuti con la metodica in
uso (RIA CGA-RIA CT, CIS BIO International, France)
hanno evidenziato 45 campioni con valori al di sotto del
cut-off e 120 con valori elevati di Cromogranina. Sul
siero di questi pazienti e su altri 20 dei quali si aveva
una diagnosi certa di tumore neuroendocrino intestinale,
abbiamo eseguito il dosaggio Cromogranina RAD 120. I
risultati ottenuti sono stati confrontati con quelli ottenuti
con il metodo utilizzato in laboratorio. La ripetibilità del
metodo è stata valutata attraverso sedute d’intra-assay
a tre livelli (alto, medio e basso) ottenendo i seguenti
CV%: 7%, 1,9% e 1,7%. L’inter-assay ha evidenziato
i seguenti CV% :5.3%, 9.2%;,12.21%. Il confronto
RAD Cromogranina vs CGA-RIA CT ha dimostrato una
sensibilità del 90,68% e una specificità dell’88.32%. Per
i campioni clinicamente caratterizzati, si è effettuato il
confronto tra le aree sottese alle curve ROC ottenute con
entrambi i metodi : CGA-RIA CT vs RAD Cromogranina
0,67 vs 0,69 rispettivamente. In conclusione, oltre ai
risultati soddisfacenti, sono da sottolineare la semplicità
dell’utilizzo dello strumento RAD120, la capacità a
bordo di 120 campioni con identificazione positiva del
campione attraverso barcode, la ripetizione automatica
a diverse pre-diluizioni del campione fuori curva e il
tempo di refertazione sicuramente inferiore rispetto a
quello impiegato adoperando il metodo radioisotopico
attualmente in uso nel nostro laboratorio.
1
1
2
G. Soldi , A. Silvestro , M. Becatti , E. Castellini , V.
2
2
1
1
Di Tante , I. Scacciati , N. Taddei , P.A. Nassi , G.
2
1
Galanti , C. Fiorillo
1
Dept. of Biochemical Sciences, Univ. of Florence,
Florence
2
Sports Medicine Center, Univ. of Florence, Florence
Physical exercise leads to the formation of ROS in skeletal
muscles, and its effects on athletic performance have
been extensively investigated. Oxidative stress balance is
a complex issue, involving many intra- and extracellular
elements, and it's hard to assess whether the overall
status is due mainly to one or another cause. Moreover,
a consequence of regular physical training is the hormetic
effect: the presence of a light but continuative stimulus
induces adaptation (1). Another interesting issue is the
effect of the diet on oxidative stress parameters: in
particular, in the last few years a lot of attention has been
put in evaluating the potential benefits of organic food on
antioxidant defenses.
We performed our study on a group of 18 young soccer
players. 9 of them ate normally during the study period (10
training weeks), while the other 9 followed a diet based
on organically grown/prepared foods. Blood samples were
drawn at fasting conditions from each subject before the
beginning of training season and after 10 weeks, a day
after the last training session. Plasma was immediately
separated and stored at -80°C until assayed. Three main
parameters were evaluated: total antioxidant capacity
(TAC), protein carbonyl content (PCC) and thiobarbituric
acid reactive substances (TBARS).
Our results show that TAC significantly increased after the
10 weeks (from 182,7 to 223,4 nmol of Trolox eq./mg prot);
PCC significantly decreased (from 5,16 to 3,3 nmol/mg)
and TBARS did not undergo significant variations (from
0,238 to 0,256 nmol Trolox eq./mg prot). No significant
differences were noticed between the "diet" group and the
"control" group.
Our findings suggest that, in spite of the probable increase
in ROS production due to exercise, the adaptation effect
leads to a burst of the overall antioxidant capacity that
counteracts oxidative stress. The different diet appears
unimportant in this case. We can hypothesize that the
gain of antioxidant capacity is mainly due to gene
up-regulation, rather than to non-enzymatic antioxidant
supplementation by food. A beneficial effect of the
organic-based diet on antioxidant defenses cannot be
excluded but, with regard to young sportsmen, a much
greater influence of regular training is evident.
(1) Gomez-Cabrera et al., 2007
505
235
INFLUENCE OF CHRONIC AEROBIC EXERCISE ON
URINARY NEUTROPHIL GELATINASE-ASSOCIATED
LIPOCALIN (NGAL)
1
2
3
236
INFLUENCE OF 60 KM -MARATHON IN
PROFESSIONAL RUNNERS ON COAGULATION
TESTING
1
2
1
1
G. Lippi , G.L. Salvagno , F. Schena , M.
2
1
4
2
Montagnana , R. Aloe , G. Cervellin , G.C. Guidi , T.
5
Trenti
1
U.O. Diagnostica Ematochimica, A.O.U. di Parma, Italy
2
Sez. Chimica Clinica, A.O.U. di Veorna, Italy
3
Sez. di Scienze Motorie, Univ. di Verona, Italy
4
U.O. di Medicina d'Urgenza, A.O.U. di Parma, Italy
5
Dip. di Patologia Clinica, AUSL di Modena, Italy
E. Danese , G. Lippi , G.L. Salvagno , M. Gelati , M.
1
3
3
1
Montagnana , C. Tarperi , C. Capelli , F. Schena , G.C.
1
Guidi
1
2
Italy
3
Sez. Scienze Motorie, Dip. Scienze Neurologiche e
della Visione, Univ. di Verona, Italy
Background.
NGAL (neutrophil gelatinase associated lipocalin) is
an early marker for acute kidney injury (AKI), whose
plasma and urinary levels rise soon after renal damage
and are therefore used for diagnosing and monitoring
AKI in several circumstances such as intensive care,
emergency medicine, renal transplantation. Nevertheless,
no information is available so far on the influence of
chronic aerobic exercise on this novel and promising
marker.
Materials and Methods.
Urinary NGAL was assessed in 40 members of the
Italian National cross country sky team and in 40 healthy
sedentary subjects matched for age and sex. Urine
samples were collected in the morning, after an overnight
fast. Athletes had rested at least 18 hrs from the previous
training. Urinary NGAL was measured by ARCHITECT
NGAL (Abbott Laboratories), an assay which utilizes a
non-competitive, sandwich format with chemiluminescent
signal detection. Urinary creatinine was also measured on
a DxC 800 system (Beckman Instruments, Inc). Results
were finally expressed as geometric mean and 95%
confidence of interval (95% CI).
Results.
No significant difference was observed in urinary NGAL
between athletes and sedentary controls: 15.8 ng/mL
(95% CI: 3.0-89.2 ng/mL) versus 20.0 ng/mL (95% CI:
2.0-84.2 ng/mL; p=0.227). When correcting urinary NGAL
values for urinary creatinine, a non significant trend
towards higher values was however observed in athletes
(19.0 ng/mg creatinine; 3.7-121.0 ng/mg creatinine) than
in the sedentary subjects (12.6 ng/mg creatinine; 1.7-86.9
ng/mg creatinine; p=0.086).
Discussion.
The results of the present investigation have two notable
clinical implications. First, chronic aerobic exercise does
not significantly influence the levels of both urinary
NGAL and urinary NGAL corrected for urinary creatinine,
when measured in resting athletes. Then, we have
also shown that in special circumstances, such as in
subjects undergoing high volumes of physical activity, the
correction of urinary NGAL for urinary creatinine might
be more helpful to mirror the renal function and monitor
changes throughout time.
Background.
Little is known about the influence of strenuous exercise
on the blood coagulation testing. To further clarify
the influence of an endurance training on coagulation
testing, Activated Partial Thromboplastin Time (APTT),
Prothrombin Time (PT), Fibrynogen, Protein C (PC),
Protein S (PS), Antithrombin (AT) and the new ProtacInduced Coagulation Inhibition Percent (PcCi%) were
assayed on 18 professional ultra trained marathon
runners.
Materials and Methods. Blood was collected from 13
male and 5 female Ultra Marathon runners from the
Italian National Team (current age range, 34-49 and 37-43
years, respectively), immediately before and after a 60 Km
marathon run
Results. Data are expressed as geometric mean ±
the standard error of the mean. Statistically significant
variations by one-way analysis of variance were observed
for APTT (27.3±0.4 vs 23.5±0.4 sec; p<0.001), PT
(10.7±0.2 vs 11.6±0.2 sec; p<0.001), AT (111±2 vs 118±2
U/L; p<0.05) and PcCi% (89.7±0.9 vs 75.4±2.4; p<0.001)
before and after the Ultra-marathon. No difference were
instead observed for PC, PS and Fibrinogen.
Conclusions. Ultra-marathon running is associated with
a wide range of significant variations in coagulation
testing, which should be acknowledged and taken
into consideration to prevent misinterpretation and to
improve the usefulness of coagulation investigations in
professional athletes.
Reference. Lippi G, Salvagno GL, Ippolito L, Franchini M,
Favaloro EJ. Shortened
activated partial thromboplastin time: causes and
management. Blood Coagul
Fibrinolysis. 2010 Jul;21(5):459-63
506
237
ACUTE VARIATION OF LEUCOCYTES COUNTS
FOLLOWING A ULTRA -MARATHON IN
PROFESSIONAL RUNNERS
1
2
1
1
E. Danese , G. Lippi , G.L. Salvagno , M. Gelati , M.
1
3
3
3
Montagnana , C. Tarperi , C. Capelli , F. Schena , G.C.
1
Guidi
1
2
Italy
3
Sez. Scienze Motorie, Dip. Scienze Neurologiche e
della Visione, Univ. di Verona, Italy
Background. Laboratory haematology is catalyzing a
mounting focus in the field of sports medicine, for both
clinical and antidoping purposes. This growing interest
should however be supported by awareness of the major
issues and latent drawbacks of the preanalytical phase,
including the potential influence of physical exercise
on a variety of haematological parameters, to prevent
misinterpretation of data and to improve the clinical
usefulness of these investigations. To further clarify this
issue, complete blood cell count was assessed on 18
professional ultra marathon trained.
Materials and Methods. Blood was collected from 13
male and 5 female Ultra Marathon runners from the
Italian National Team (age range, 34-49 and 37-43 years,
respectively) immediately before and after a 60 Km
marathon run. Results were expressed as mean ± the
standard error of the mean and significance of variation
was evaluated by one-way analysis of variance.
Results. Statistically significant variations from the
baseline values were observed for Platelets (276±14
vs 357±20 x 109/L), White blood cells (6.0±0.4 vs
16.3±1.0 x 106/L), Neutrophils (3.3±0.3 vs 13.3±0.9 x
106/L), Monocytes (0.4±0.0 vs 0.9±0.1 x 106/L), and
Eosinophils (0.2±0.1 vs 0.1±0.1 x 106/L) counts (all
p<0.001). No significant differences were recorded for
other hematological parameters, including haematocrit,
haemoglobin and red blood cells count. Conclusions.
Ultra-marathon running is associated with a broad range
of hematological variations which must be recognized
and taken into consideration to prevent misinterpretation
and to improve the usefulness of haematological
investigations in the professional athletes.
Reference. Lippi G, Banfi G, Maffulli N. Preanalytical
variability: the dark side of the
moon in blood doping screening. Eur J Appl Physiol. 2010
Jul;109(5):1003-5
238
COMET ASSAY TO ASSESS DNA DAMAGE
AND RESVERATROL ACTIVITY IN VOLUNTARY
RUNNERS
1
1
1
1
B. Tomasello , S. Grasso , G. Malfa , S. Stella , M.
1
Favetta
1
Dipartimento Chimica biologica, Chimica medica e
Biologia molecolare- Università di Catania
In presence of an unbalance of cellular redox state due
to either a massive increase in ROS/RNS production or
a decrease in efficiency/quantity of antioxidant systems
arises oxidative stress condition promoting different
oxidative stress-related diseases such as premature
aging, neurodegenerative disorders and cancer.
Regular aerobic exercise is well known to modulate
redox condition and ameliorate quality of life, decreasing
morbidity and mortality in older people. Many researches
have demonstrate that regular physical exercise, i.e. long
term activities, having both elevated energy expenditure
and high oxygen consumption, may promote ROS
production and oxidative stress conditions, depending on
duration and type of exercise as well as on the individual
lifestyle and eating habits.
We were aimed to study in voluntary runners the
peripheral blood cell DNA status in order to examine: the
global and oxidative, as level of 8-OH-guanine (8-oxo-dG),
DNA status; the runners’ DNA susceptibility to an in vitroinduced H2O2 oxidative insult; the capabilities of 3,5,4’trihydroxystilbene (RESV), a natural promising antioxidant
polyphenol, in reducing DNA damage.
Twentyfive male voluntary runners were compared with
twenty sedentary control male and DNA damage was
evaluated by alkaline, neutral and Fpg modified versions
of Comet assay. The H2O2 and/or RESV treatments were
performed directly on agarose embedded cells (atypical
Comet assay).
The results evidenced DNA damage and levels of 8-oxodG higher in runners than in sedentary control subjects.
Blood cell DNA of athletes results to be prone to the in vitro
induced oxidative insult (200µM H2O2) and RESV100µM
was able to switch from antioxidant to pro-oxidant, acting
as angel or devil, depending on the basal DNA damage
and redox state of the single athlete.
Our results underlie “the good, the bad and the ugly”
properties present in the resveratrol, or probably in its
metabolites, pointing out the need of a greater regulatory
control in widely using some poly-mechanistic herbal
medicines as micronutrients in diet supplementation,
in particular when the objective is to ameliorate the
performance of athletes.
Di Giacomo C et al. J Med Food.12:145-150, 2009
507
239
LE ALBUMINE: FAST E SLOW. EVIDENZIATE IN
ELETTROFORESI IN GEL D’AGAROSIO (AGE) E IN
ELETTROFORESI CAPILLARE (CZE)
1
2
1
1
M. Falcone , M. Castronovi , S. Petti , M. Angiolilli
1
1° Lab. Analisi Cliniche, Azienda Ospedaliero
Universitaria OO.RR. di Foggia
2
Nefrologia e Dialisi
Sono stati evidenziati due differenti tipi di alloalbumina,
su tracciati elettroforetici nel lavoro di routine: la variante
fast e la variante slow, la prima migra in zona prealbumina
e la seconda in zona α1 all’elettroforesi delle proteine.
Scopo: l’AGE e la CZE evidenziano le varianti, ma
l’AGE fa vedere meglio di che tipo di variante si tratta.
Presso il 1° Laboratorio degli OO.RR. di Foggia non è
infrequente trovare delle alloalbumine. In pochi mesi si
sono trovate diverse varianti slow, mentre non era mai
stata evidenziata una variante fast. Nel mese di gennaio
una signora ricoverata in D.H. di Nefrologia evidenzia
all’AGE una doppia banda di albumina variante fast.
Esaminato il padre, anche questi presenta la stessa
variante, il figlio della signora non mostra la variante.
Mentre le slow albumine trovate nei mesi precedenti
erano tutti di cittadini nativi italiani, la signora era cittadina
italiana, ma nativa sudamericana, figlia di padre italiano
e madre sudamericana. L’AGE svela meglio la posizione
delle bande di albumina. Infatti, sullo stesso gel sono
allineati gli altri tracciati che danno un punto di repere
delle albumine e quindi diventa evidente la posizione
delle bande, se sono in posizione α1 o in prealbumina.
Mentre ciò non è molto evidente in CZE, infatti, i tracciati
sono singoli e non si possono confrontare con gli altri,
come se venisse meno il punto di repere. Conclusione:
L’AGE sembra non tramontare e conserva sempre delle
performance che altre tecnologie, che sono migliorative
su altri aspetti, non la sostituisco pienamente. Nel settore
proteine è necessario avere in funzione un apparecchio
per AGE, perché tante volte risolve quesiti che CZE pone.
Bibliografia: I. Infusino, A. Dolci, M. Panteghini. Confronto
tra due sistemi per elettroforesi capillare e in gel
d'agarosio per la ricerca e caratterizzazione di componenti
monoclonali nel siero. Biochimica Clinica, vol. 32 n.6 2008
240
SERUM PEPTIDE PROFILING BY MALDI-TOF MASS
SPECTROMETRY IN WOMEN WITH GROSS CYSTIC
DISEASE OF THE BREAST (GCDB)
1
2
3
R. Mangerini , A. Profumo , P. Guglielmini , A.
4
3
5
Rubagotti , G. Schiavone , P. Romano , A.
6
7
8
2
Facchiano , M. Muselli , G. Damonte , R. Mattia , F.
4
Boccardo
1
Med. Onc. B Dep,, Nat. Canc. Research Inst., Genoa
2
Biopolim. and Proteom. Unit, Nat. Canc. Research
Inst.,Genoa
3
Dep. Onc., Biol. and Gen., Univ. Genoa
4
Med. Onc. B Dept. Nat. Canc. Research Inst., Genoa
and Dept. Onc., Biol. and Genetic, Univ. Genoa
5
Bioinform. Unit, Nat. Canc, Research Inst., Genoa
6
Inst. Food Science, Nat. Research Council, Avellino
7
Inst. Electronics, Computer and Telecommunication
Engin., Nat. Research Council, Genoa
8
Dep. Experim. Med., Univ. Genoa
The commonly recognized risk factors for breast cancer
(except for BRCA mutations)are not so predictive to
discriminate the women suitable for specific surveillance
or chemopreventive interventions.This explains the
increased interest in developing novel risk markers.This
study was designed to assess whether proteomics would
allow to generate peptide signatures able to further
discriminate the breast cancer risk of women affected
by GCDB, a benign condition per se implying a 2-4 fold
increased risk of developing a breast cancer depending
on prevalent cyst type. We identified a training set of
30 criopreserved sera collected between 1985 and 1993
from women affected by GCDB.16 of these women were
found to have subsequently developed an invasive breast
cancer and served as cases.The other women who were
still cancer-free served as controls and were selected
after matching by age, family history, cyst fluid cation
and EGF concentrations, follow-up and serum storage
duration.Serum sample analysis was performed by
magnetic bead-assisted serum peptide capture coupled to
AP-MALDI-TOF-MS.Data handling was performed using
two bioinformatic tools:PROTEO and ALISPECTRA. The
resulting data spreadsheet was analyzed by means of
two alternative statistical algorithms:significance analysis
of microarray and shadow clustering, a machine learning
model that generates a set of rules that is able to
discriminate between two or more groups of samples.
Distinct patterns were observed in the two groups on study
independently of the algorithm employed.We identified
34 peptides whose pattern distribution differed in cases
and controls (p=0.016).14 peptides have been previously
identified by means of MS/MS tandem spectrometry.All
of them,except for fibrinopeptide A,were decreased in
cases as compared to controls, including complement
C3f,bradykinin and inter-α-trypsin inhibitor heavy chain
H4.The characterization of the other significant signals is
underway.
508
241
DOPAMINE PEROXIDATION IN HUMAN
CEREBELLUM: NEW PERSPECTIVES OF
INVESTIGATION THE PATHOGENESIS OF
PARKINSON'S DISEASE
1
2
2
242
ERYTHROCYTE GLUTATHIONE TRANSFERASE
OVER-ACTIVITY AND ITS CORRELATION WITH
PLASMA HOMOCYSTEINE IN CHRONIC KIDNEY
DISEASES
4
A. De Iuliis , G. Pantano , H. Pranvera , G. Arrigoni , P.
5
4
4
Zambenedetti , G. Miotto , M. Massimino , F.
4
1
Vianello , P. Arslan
1
Dip. di Scienze Medico-Diagnostiche e Terapie
Speciali, Univ. degli Studi di Padova
2
Scuola di Specializzazione di Patologia Clinica, Univ.
degli Studi di Padova
3
Scuola di Specializzazione di Patologia Clinica, Univ.
degli Studi di Padova
4
Dip. di Chimica Biologica, Univ. degli Studi di Padova
5
Div. di Anatomia Patologica, Osp. di Dolo-Venezia,
Univ. degli Studi di Padova
6
Dip. di Anestesiologia e Farmacologia, Univ. degli Studi
di Padova
Introduction: The cerebellum is a brain area not
traditionally considered dopaminergic, but it contains
neuronal elements, which are indicative of dopaminergic
neurotransmission.
In order to investigate on the dopamine (DA) metabolism
occurring in human cerebellum, we analysed this brain
region by using the in gel-detection of DA peroxidizing
activity, by us set out. Parallely, we assayed DA levels
in cerebellar tissues in comparison with DA levels
in midbrain tissue.Tyrosine hydroxylase (TH) and DA
transporter protein (DAT) immunoreactivity was also
tested in the same tissues.
Methods: Protein mixtures from human normal cerebellum
homogenates were separated in native gel and
subjected to specific activity staining, by using DA
and hydrogen peroxide as substrates. The reactive
gel bands were analysed by mass spectrometry. DA
assays were performed by High Performance LiquidChromatography-coupled to Electrochemical Detection
(HPLC-ED). Immunocytochemical techniques were used
to test TH and DAT protein expression.
Results:Mass spectrometry analysis of the cerebellar
reactive bands identified: Peroxiredoxins-1 (Prx-1),
Prx-2, Prx-6 and DJ-1. DA levels were lower in
cerebellar tissues if compared to midbrain tissue.
DAT immunoreactivity was instead apparently higher
than TH immunoreactivity. Conclusions: The cerebellar
peroxidative reaction revealed the presence of some
proteins, peroxiredoxins and DJ-1, interplaying with the
oxidative metabolism of DA. Considering that DJ-1, whose
mutations are associated with autosomal recessive earlyonset Parkinson’s disease, has been reported to be
involved in DA synthesis, as well as DAT is specific marker
of DA axons, our results suggest a possible cerebellar
dopaminergic system, highlighting new perspectives of
investigation in the pathogenesis of Parkinson’s disease.
1
2
4
1
M. Dessì , A. Noce , A. Bocedi , I. Martini , R.
1
1
5
Massoud , G. Fucci , A. Pastore , S. Manca di
2
3
1
Villahermosa , G. Ricci , G. Federici
1
Dep. of Lab. Med, Univ. Hosp. Tor Vergata, Rome
2
Nephrology and Dialysis Unit, Univ. Hosp. Tor Vergata,
Rome
3
Dep. of Chem. Sc. and Tech., Univ. of Rome “Tor
Vergata”
4
Dept. of Mol. Gen. and Microb., Duke Univ., Durham,
NC, USA
5
Bioch. Lab., Children’s Hosp. and Research Inst.
“Bambino Gesù”, Rome
Previous study reported increased expression of
erythrocyte glutathione transferase (e-GST) in end-stage
renal disease patients on maintenance hemodialysis
(MHD), and physiological e-GST level in chronic kidney
diseases patients under conservative therapy (CKD).
Hyperhomocysteinemia is present in more than 90%
uremic patients. We re-evaluated the e-GST levels in
CKD patients and studied the correlation between eGST expression and plasma homocysteine (Hcy) levels in
MHD patients. E-GST activity was assayed using a new
automated procedure. Our simplified procedure, adapted
to an automated apparatus (Modular P800), requires only
20 ml of whole blood and no erythrocyte purification
step. Linearity and recovery experiments were performed
using blood samples implemented by authentic GSTP1-1.
Intra-day precision and inter-day precision were evaluated
using four whole blood samples. GST activity was
measured six times for each sample and the relative
standard deviation was 2.9% and 3.5% for intra-day and
inter-day assay, respectively. 72 CKD patients divided into
four stages according to the K-DOQI guidelines staging,
62 MHD patients and 80 healthy controls were studied. A
new automated spectrophotometric procedure for e-GST
activity, validated by intra-day, inter-day and recovery
experiments, confirmed an increased e-GST activity in
MHD patients (10.2±2.7 U/g Hb) compared with controls
(5.8±1.8 U/g Hb). A surprising significant increase of eGST activity was observed in pre-dialysis patients related
to K-DOQI stages (7.4±2.4 U/g Hb, 8.1±4.5 U/g Hb,
9.5±2.5 U/g Hb, 12.3±2.7 U/g Hb in stages from I to IV,
respectively). No correlation was found between e-GST
activity and classical markers of systemic inflammation.
For the first time a significant correlation was observed
between increased plasma Hcy levels and e-GST activity
(P<0.0001) in MHD patients. Using a simple procedure
for e-GST activity a significant increase of activity was
found in CKD patients related to the stage of renal
insufficiency.A direct correlation between plasma Hcy and
e-GST expression was found in MHD patients. e-GST
proposes as new biomarker for MHD and CKD patients.
Reference: Galli F, Rovidati S, Benedetti S, et al.
Overexpression of erytrocyte glutathione-S-transferase in
uremia and dialysis. Clin Chem 45: 1781–1788,1999
509
243
ANALYSIS OF IRON RELEASE FROM FERRITIN BY
MEANS OF REAL TIME SAXS MEASUREMENTS
1
2
2
1
244
AN IN-VITRO MODEL OF ALUMINIUM UPTAKE INTO
APOFERRITIN CAVITY
1
1
2
2
C. Rossi , M. Rodio , G. Ciasca , M. Chiarpotto , A.
2
3
3
3
1
Bianconi , A. Alimonti , B. Bocca , A. Pino , P. De Sole
1
Dip. di Biochimica e Biochimica Clinica, Univ. Cattolica
del Sacro Cuore, Roma
2
Dip. di Fisica, Univ. degli Studi ”La Sapienza”, Roma
3
Dip. di Ambiente e Connessa Prevenzioni Primaria,
M. Chiarpotto , C. Rossi , G. Ciasca , A. Bianconi , A.
3
3
3
2
1
Alimonti , B. Bocca , A. Pino , M. Rodio , P. De Sole
1
Dip. di Biochimica e Biochimica Clinica, Univ. Cattolica
del Sacro Cuore, Roma
2
Dip. di Fisica, Univ. degli Studi ”La Sapienza”, Roma
3
Dip. di Ambiente e Connessa Prevenzioni Primaria,
Increased iron concentration in tissues appears to be
a factor in the genesis and development of different
inflammatory and degenerative diseases; in particular,
anomalous iron concentrations in brain tissue seem to
be involved in some neurological diseases, such as
Alzheimer’s disease (AD). Many experimental findings
suggest that Fe accumulation in brain could be strongly
linked to the presence of ferritin dysfunctions. As,
indeed, demonstrated in the work of Quintana et. al.,
ferritin iron core composition significantly differs between
physiological and AD’s brain ferritins, where an increase
of toxic ferrous iron (Fe2+) has been
detected [1].
Providing a clear understanding of the mechanism behind
the release of toxic Fe2+ from ferritin core
may help to elucidate the role of ferritin dysfunctions into
the development of neurological disorders [2].
In this study, we present a new developed method to study
the toxic Fe2+ release from ferritin, based
on real-time small angle X-ray scattering measurements
(SAXS).
Horse spleen ferritin has been used as a model system.
Iron release from the ferritin cavity has been induced
simply by means of chemical reduction and subsequent
chelation.
Assuming radial symmetry, our method allows to measure
density variations of the ferritin core as a function of time
and distance from the core centre i.e. to provide reliable
time-resolved three dimensional model of the core during
the iron release process. Furthermore our SAXS analysis
suggest that the iron release process proceeds towards
several steps, namely a defect nucleation in the outer part
of the mineral core, the diffusion of the reducing agent
towards that inner part of the core and, finally, the erosion
of the core from the inner to the outer part.
[1] C. Quintana et al. J. Struc. Biol. 131, (2000) 210.
[2] N. Galvetz et al. J. AM. CHEM. SOC. 9 (2008) 8062.
In a recent study we have shown that human serum
ferritin is filled in with metals other than iron (Fe), mainly
aluminium (Al). As, indeed, shown by mass spectroscopy,
the Al/Fe molar ratio ranges from ~0.6 to ~6.5 in different
clinical conditions. Although the ability of ferritin to bind
Al together with Fe is known, no paper has shown
an Al/Fe molar ratio as high as reported in our work.
Furthermore, we have shown that ferritin metal content is
inversely correlated with the serum ferritin concentration
[1]. These results open the way to the development of
new diagnostic tools based on the measurements of the
serum ferritin metal content. In this regard, providing a
clear understanding of the mechanism behind Al uptake
in to the ferritin cavity is of paramount importance.
Here we present an in-vitro model of the Al and Fe
uptake in paraphysiological conditions based on the remineralization of horse spleen apoferritin cavity. Al and
Fe uptake has been induced incubating apoferritin at
37°C in a reaction solution containing FeSO4•7H2O and
AlK(SO4)2•12H2O, both at 1mM concentration. Different
Al/Fe molar ratio in solution have been obtained simply
tailoring the aluminium solubility.
By means of mass spectroscopy measurements, we
demonstrate that apoferritin is able to mineralize the
510
-
physiological form of aluminium, i.e Al(OH)4 -. This is a
notable finding because ferritin is known to bind only
few kind of minus charged compounds [2]. Furthermore,
we show that the total amount of mineralized aluminium
into the apoferritin core is directly proportional to the
concentration of soluble aluminium in solution.
To gain a better understanding of the mechanisms behind
the metal uptake into the apoferritin cavity, we investigate
the structural features of the core at different stage of the
re-mineralization process by small angle x-ray scattering.
Our results show that the mineralization process starts
from the outer shell and proceeds towards the centre of
the cavity.
[1] P.L. Spada et al., Clinical Biochemistry, 42 (2009) 1654
[2] X. Yang et al., Biophys. J., 78 (2000) 2049
245
IL DOSAGGIO DELLA PROCALCITONINA NELLA
PRATICA CLINICA DELLE UNITA’ DI TERAPIA
INTENSIVA E RIANIMAZIONE: CONFRONTO TRA
METODI
1
1
1
C. Vendramin , T. Callegari , V. Copponi , P.
1
1
1
2
Camurati , V. Perticone , E. Paradiso , M. Vidali , C.
1
Arfini
1
Lab. Analisi, Dipartimento di Patologia Clinica, AO SS
Antonio e Biagio e C. Arrigo, Alessandria
2
Lab. Ricerche Chimico Cliniche, AOU Maggiore della
Carita', Novara
Introduzione: La procalcitonina (PCT), unitamente alla
valutazione clinica del paziente, si è dimostrata un
marcatore biologico con elevato grado di accuratezza
diagnostica nella diagnosi precoce di infezioni batteriche
delle basse vie respiratorie e di sepsi. Utilizzando un cutoff di PCT di 0.25 ng/mL è possibile differenziare i pazienti
con sospetto di infezione batterica e sepsi dai pazienti
privi di risposta infiammatoria. Scopo del nostro studio
è stato quello di confrontare il metodo VIDAS BRAHMS
PCT, attualmente in uso presso la nostra Struttura, con il
metodo ADVIA CENTAUR BRAHMS PCT.
Materiali e Metodi: Per questo studio sono stati inclusi 64
pazienti consecutivi (41 uomini / 23 donne; età: mediana
54, IQR 40-73) afferenti alle Unità di Terapia Intensiva
e Rianimazione della Azienda Ospedaliera SS Antonio e
Biagio e C. Arrigo di Alessandria con richiesta di PCT. Il
dosaggio di PCT è stato effettuato con il metodo VIDAS e
con il metodo ADVIA CENTAUR.
Risultati: I valori di PCT nel campione considerato erano
compresi tra <0.01 e 49.47 ng/mL. I valori mediani (IQR,
min-max) di PCT per il test VIDAS e CENTAUR erano
rispettivamente 0.86 ng/mL (0.15-4.05, 0.05-49.47) e
0.51 ng/mL (0.23-2.40, 0.01-34.82). La differenza media
tra i due metodi (VIDAS-CENTAUR) era 1.3 ng/mL
(95% delle differenze comprese tra -4.5 e 7.1 ng/mL).
Considerando solo i valori di PCT compresi tra 0.05 e 4
ng/mL, il bias medio era invece di 0.25 ng/mL (95% delle
differenze comprese tra -0.55 e 1.05 ng/mL). Tuttavia,
era evidenziabile sia un aumento della variabilità delle
differenze lungo l’intervallo di concentrazione sia una
dipendenza delle stesse dalla media dei valori. L’analisi
di regressione nonparametrica di Passing e Bablok ha
evidenziato un’intercetta di 0.02 (95%IC da -0.002 a 0.04)
e un coefficiente angolare significativo di 0.696 (95%IC da
0.666 a 0.726). Per cut-off (VIDAS) di 0.1, 0.25, 0.5 e 2
ng/mL la concordanza (indice K di Cohen) tra i due test
era rispettivamente 84.1%, 92%, 75% e 78.4%.
Conclusioni: Nonostante la discrepanza dei valori sia
risultata rilevante, con aumento della stessa lungo
l’intervallo di concentrazione, al cut-off di 0.25 ng/mL i
due metodi presentano una buona concordanza (coppie
concordanti 62/64 (97%), K di Cohen=0.92).
246
DEFINING THE APPROPRIATE PANEL OF
LABORATORY TESTS BEFORE CONTRAST MEDIA
ADMINISTRATION: THE EXPERIENCE OF CAREGGI
HOSPITAL
1
2
1
2
A. Caldini , M. Bartolini , A. Terreni , I. Menchi , G.
1
Messeri
1
Dip. Diagnostica di Laboratorio , A.O.U. Careggi,
Firenze, Italy
2
Dip. di Radiodiagnostica, A.O.U. Careggi, Firenze, Italy
Major advances in medical imaging have led to much
wider use of diagnostic procedures employing contrast
media: as a consequence the occurrence of scenarios
with risk of contrast-induced nephropathy (CIN) could
increase. The definition of the appropriate panel of
laboratory tests to be performed before contrast media
administration for the prevention of CIN is still a challenge
in our country. Despite the large body of evidence that
monoclonal gammopathies “per sè” do not increase the
risk of CIN, serum protein electrophoresis (SPE) and
Bence Jones protein (BJP) are largely requested before
contrast media administration, often as STAT requests
in case of an urgent imaging procedure. The workload
for the laboratory is not negligible both in terms of
time and cost. To overcome this, a protocol for contrast
media administration, based on international guidelines
(1) indications, was produced in cooperation between
Radiodiagnostic and Laboratory Medicine departments .
Regarding laboratory tests, the protocol indicates that,
in order to evaluate the risk of CIN, the most important
test is the evaluation of renal function while widespread
requests of SPE and BJP are not justified. Renal function
is assessed by means of creatinine measurement and
e-GFR estimation, performed in our lab according to
SIBioC –SIMeL -SIN recommendations. As first step,
the protocol was discussed among the operators of the
Radiodiagnostic dpt. In a second phase, it is planned
to approve the protocol as official document of AOU
Careggi, and then to present it to clinicians of our hospital
during an educational meeting, organized in cooperation
between Radiodiagnostic and Medicine Laboratory dpts.
The widespread application in our hospital of this protocol
will give clinicians the advantage of requiring only fast TAT
tests like creatinine and e-GFR, reducing thus the time
for the diagnostic procedure and reducing at the same
time the number of SPE an BJP requests, saving time
and costs. The diffusion of the protocol will furthermore
give us the opportunity to focus clinicians’ attention
on monoclonal gammopathy related tests, with the aim
of developing further shared protocols for screening,
diagnosis and follow-up of plasma cell disorders.
1. ESUR Guidelines on Contrast Media 2007
www.esur.org
511
247
HEXOSAMINIDASE ACTIVITY OF ERYTHROCYTES
PLASMA MEMBRANE AS A POSSIBLE BIOMARKER
OF OXIDATIVE STRESS AND KIDNEY CONDITIONS
IN OLD PATIENTS WITH CHRONIC RENAL FAILURE
UNDER RENAL REPLACEMENT THERAPY
248
ANALISI PROTEOMICA DELLA FRAMMENTAZIONE
DELLE PROTEINE PLASMATICHE E
URINARIE: EFFETTI SULLA DETERMINAZIONE
IMMUNOMETRICA DELL'ALBUMINA
1
1
1
1
2
G. Goi , L. Massaccesi , C.J. Baquero , C. Musetti , D.
2
3
Cusi , S. Bertoli
1
Dept. of Medical Chemistry, Biochemistry and
Biotechnology, University of Milan, Italy
2
Graduate School of Nephrology, University of Milan,
Italy
3
Dialysis Unit, IRCCS Multimedica, Sesto San Giovanni,
Milan, Italy
The hexosaminidase (Hex) and its isoformes are
ubiquitous enzymes (1). Several studies underline strong
relation between their levels in body fluids and pathologies
or different degree of complications as shown for
plasma levels of Hex in diabetes (2) or urinary Hex in
nephropathy (3). Recently, Hexs are found and deeply
studied in plasma membrane and in cytosol of human
erythrocytes (4). Red cells are a useful model for
investigating physio-pathological conditions; erythrocyte
glycohydrolases, particularly the Hexosaminidase (Hex),
are considerate new and sensitive oxidative stress
markers (5). Renal replacement therapies (RRT) exposes
patients to oxidative stress increasing the inflammatory
state already present (6). We assessed Hex activity on
erythrocyte’s plasma membrane in 11 Chronic Renal
Failure (CRF) patients on conservative treatment, in 15 on
peritoneal dialysis (PD), in 12 on haemodialysis, before
(HD-pre) and after (HD-post) a treatment and compared
these to 30 healthy controls to evaluate the role of
different RRT on oxidative stress. Moreover, we compared
for their behaviour Hex and total plasmatic antioxidant
defences (LagTime) analyzed in our previous study. In
CFR patients, Hex activity show a significant increase
respect to controls (p<0.001). It’s remarkable that, with
the progression of the pathology (and through different
RRT), the activity decreased until, in HD patients, values
similar to controls. This suggest, in HD patients, a minor
oxidative stress exactly how indicated from Lag-time in our
precedent study. Evidence strengthened by the negative
correlation between Hex e Lag-time. Data confirmed the
role of Hex as early biomarker of oxidative stress and
consequent cellular damages and highlighted positive
effects of RRTs suggesting HD how the least oxidant
treatment as RRT for older patients. Results remark
a possible role of this enzyme as a marker of kidney
conditions and as a further signal to start RRT.
1 Perez LF, et al. Ups J Med Sci. 2007;112,3:296-302
2 Jovanovic VB ,et al. J Clin Lab Anal. 2008;22,4:307-13
3 Basturk T, et al. Ren Fail. 2006;28,2:125-8
4 Massaccesi L e t al. Clin Biochem. 2007 Apr;40,7:467-7
5 Massaccesi L, et al. Mech Ageing Dev. 2006
Apr;127,4:324-31
6 Morena M,et al. Hemodial Int. 2005 Jan;9,1:37-46
512
1
1
E. Furlani , A. Cortelazzo , H. Cerutti , C.
2
1
1
Scapellato , R. Leoncini , R. Guerranti
1
Dip. Medicina Interna, Scienze Endocrino-Metaboliche
e Biochimica, Univ. di Siena
2
U.O.C. Laboratorio Analisi Cliniche, A.O.U. Senese
Il proteoma plasmatico e quello urinario sono costituiti
da proteine intere e dai relativi frammenti ottenuti
per effetto delle proteasi fisiologiche. L’identificazione
e la determinazione di tali frammenti sta assumendo
un ruolo sempre più importante nella diagnostica
di laboratorio poiché la proteolisi risente delle varie
condizioni patologiche in cui viene alterata l’attività
proteasica.
Tale problematica è di particolare interesse per
l’albumina, la cui determinazione è necessaria per la
diagnosi di alcune patologie renali quali la nefropatia
diabetica. La proteolisi della sua catena polipeptidica
influenza la determinazione dell’albumina urinaria poiché
alcuni frammenti non sono rilevabili dai comuni saggi
immunologici (1).
Lo scopo di questa indagine preliminare è: individuare
i frammenti dell’albumina urinaria modificati rispetto al
plasma per gettare luce sull’attività proteasica nel rene
e vie urinarie; capire se i frammenti hanno diversa
immunoreattività rispetto alla proteina intera. Per questo
abbiamo effettuato un confronto tra proteine plasmatiche
e urinarie di soggetti sani con elettroforesi bidimensionale
su gel per evidenziare eventuali differenze nel pattern
dei frammenti proteolitici. Inoltre le proteine urinarie
di soggetti sani, dopo separazione con elettroforesi
bidimensionale, sono state rivelate sia con silverstaining MS compatibile che tramite immunoblot con lo
stesso Ab anti-albumina impiegato nelle determinazioni
nefelometriche. In base a ciò è possibile accertare
la presenza di frammenti di albumina non rilevabili
dall’anticorpo. I nostri risultati evidenziano una parziale
corrispondenza fra i frammenti plasmatici e quelli urinari.
Inoltre dal confronto dello stesso campione urinario
analizzato in silver e in Western Blot emerge che
alcuni frammenti perdono la loro immunoreattività e ciò
può essere responsabile di una sottostima della misura
dell’albumina urinaria con i problemi diagnostici che ne
possono conseguire. Tali studi saranno estesi anche ad
altre patologie in cui il grado di frammentazione proteica
è addirittura superiore.
1) Sviridov D, Drake SK, Hortin GL. Reactivity of
urinary albumin (microalbumin) assays with fragmented or
modified albumin. Clin Chem. 2008 Jan;54(1):61-8
249
LA VALUTAZIONE DELLE ADIPOCHINE NELLA
DIAGNOSI DELL’OBESITÀ SEVERA
1
2
1
250
RILIEVO DI COMPONENTI SIERICHE
MONOCLONALI IN ZONA BETA2: IMPORTANZA
DELL’ELETTROFORESI CAPILLARE
3
G. Labruna , F. Pasanisi , C. Nardelli , R. Caso , D.F.
4
2
1
Vitale , F. Contaldo , L. Sacchetti
1
CEINGE Biotecnologie Avanzate S.C. a R.L. e Dip. di
Biochimica e Biotecnologie Mediche, Università di Napoli
Federico II
2
Centro Interuniversitario di Studi e Ricerche
nell’Obesità e Disturbi del Comportamento Alimentare
e Dip. di Medicina Clinica e Sperimentale, Università di
Napoli Federico II
3
Dip. Assistenziale di Medicina di Laboratorio AOU
Federico II, Napoli
4
Fondazione Salvatore Maugeri, Istituto IRCCS,
Benevento
Ad oggi diversi fenotipi di obesità sono stati descritti
(Blüher M. Curr Opin Lipidol 2010;21:38-43). In
particolare, i pazienti “a rischio” di complicanze
metaboliche sono caratterizzati da insulino-resistenza
e da alti livelli di grasso viscerale e lipidi plasmatici
se paragonati ai pazienti metabolicamente sani (MHO),
sebbene entrambi i gruppi abbiano BMI e massa grassa
elevati (Karelis AD et al. J Clin Endocrinol Metab
2004;89:2569-75).
Scopo del presente lavoro è stato valutare le
concentrazioni sieriche di diverse adipochine, ormoni
gastro-intestinali e molecole pro-infiammatorie per
ricercare eventuali marcatori biochimici del fenotipo “a
rischio”.
Lo studio è stato effettuato in una popolazione di giovani
pazienti del Sud Italia affetti da obesità di grado severo
2
(n=160; età media=25.2 anni; BMI medio=44.9 kg/m ;
65% femmine). In particolare, sono state misurate le
concentrazioni sieriche di glucagone, grelina, GIP, GLP-1,
IL-6, TNFα, leptina, adiponectina, adipsina e visfatina
tramite tecnologia xMAP su strumentazione Bio-Plex
(BioRad). Inoltre, è stato calcolato il rapporto leptina/
adiponectina (L/A) ed il fatty liver index (FLI), un indice di
steatosi epatica.
Dei soggetti analizzati, il 21,3% erano MHO. All’analisi
univariata, il gruppo dei pazienti “a rischio” è risultato
avere livelli medi più alti di BMI (p<0,0001), leptina
(p=0,039), FLI (p<0,0001) e rapporto L/A (p=0,003), e
più bassi di visfatina (p=0,026) rispetto ai pazienti MHO.
All’analisi multivariata, il rapporto L/A, i trigliceridi sierici
ed il sesso maschile risultavano essere statisticamente
associati al fenotipo “a rischio” spiegando il 19,5%
dell’insulino resistenza osservata in questi pazienti.
I nostri risultati rappresentano un’ampia caratterizzazione
biochimica del soggetto giovane severamente obeso e
dimostrano che il rapporto L/A ed i trigliceridi sierici sono
markers del fenotipo “a rischio”. Tali indicatori possono
essere utilizzati nella routine clinica per lo screening dei
pazienti obesi al fine della messa a punto di strategie
terapeutiche mirate per la prevenzione delle complicanze
associate all’obesità.
Lavoro finanziato da Conv. CEINGE-Regione Campania
(DGRC 1901/2009), Regione Campania LR n5/2005 e
MIUR PRIN 2008.
1
1
1
1
M. Stanziola , M. Monti , G. Caruso , A. Mennella , A.
1
Castagliuolo
1
U.O.C. Di Patologia Clinica Ospedale A.Rizzoli Lacco
Ameno Ischia Napoli
Background: Il riscontro all’esame elettroforetico di picchi
anomali in particolare nella zona β2, impone l’integrazione
con metodica dell’elettroforesi capillare ( EC ) per la
ricerca qualitativa di proteine sieriche monoclonali M che
in alcune condizioni migrano in zone diverse da quella γ.
Scopo: Vengono descritti 2 casi in cui sono stati rilevati in
modo occasionale alcuni picchi anomali, particolarmente
elevati
in
zona
ß2
all’esame
elettroforetico.
L’ulteriore impiego dell’immunotipizzazione proteica
( Immunotypying capillarys ) ha successivamente
consentito la qualificazione di tali componenti che sono
risultate Imunoglobuline della classe IgA con catene
pesanti di tipo κ o λ. L’ulteriore ricerca della proteina
di Bence Jones,determinata con metodica quantitativa
nefelometrica , confermava la presenza di catene pesanti
libere nelle urine dei rispettivi pazienti.
Conclusioni: Generalmente fattori del Complemento
( C3, C4) e proteina C reattiva migrano in
zona ß2 e potrebbero indurre un’interpretazione non
corretta dell’esame elettroforetico per la possibilita’
che componenti monoclonali possano nascondersi in
zone diverse dalla zona γ. Pertanto l’applicazione
sistematica di metodiche sensibili, quali l’Elettroforesi
capillare e l’immunotipizzazione, consente la ricerca
e l’identificazione di componenti sieriche monoclonali
M anche in zone diverse contribuendo non solo alla
diagnosi di una possibile gammopatia monoclonale
che rimarrebbe misconosciuta per anni ma anche
al follow-up di pazienti portatori di una MGUS. In
particolare, poiche’ la prima osservazione viene effettuata
in un laboratorio di Patologia Clinica, una corretta
interpretazione ed identificazione di picchi monoclonali
contribuira’ sicuramente ad una diagnosi di certezza ed
ad una precoce strategia terapeutica.
513
251
PLASMIN SYSTEM IN CSF OF ALZHEIMER'S
DISEASE PATIENTS
1
1
2
G.M. Sancesario , S. Bernardini , Z. Esposito , M.
1
2
1
2
Nuccetelli , R. Sorge , G. Federici , G. Bernardi , G.
2
2
Sancesario , A. Martorana
1
Dept. of Clinical Biochemistry Internal Medicine, Univ.
of tor Vergata, Rome, Italy
2
Dept. of Neuroscience, Univ. of tor Vergata, Rome, Italy
Background: Alzheimer’s disease (AD) is characterized
by the extracellular deposit of amyloid ß (Aß) in the
hippocampus and neocortex. The imbalance between Aß
production from the amyloid precursor protein and its
degradation likely plays a key role in the pathogenesis
of sporadic AD. Several proteases are involved in Aß
degradation and among them plasmin has assumed
an emerging role because it efficiently degrades Aß
aggregates in vitro and co-localizes in the periphery of
amyloid plaques. Plasminogen is converted to active
plasmin by tissue plasminogen activator (t-PA) that is
inhibited by plasminogen activator inhibitor (PAI-1 and –
2). It is known that plasmin levels are significantly reduced
in the hippocampus and cortex of AD patients, but not
in the cerebellum. It would be useful to known whether
changes of the plasmin system in the brain tissue can also
be detected in the CSF in vivo.
Methods: To further clarify whether the plasmin system
is involved in vivo in patients with AD, we analyzed 76
CSF samples of AD (n=36) and control patients (n=40)
for plasminogen, tPA and PAI-1 levels using ELISA.
The activity of tPA and uPA in CSF samples were
determined by zymographic analysis. The AD biomarkers
were analyzed using ELISA kits.
Results: While the levels of Aß and tau were significantly
low and high, respectively, in the CSF of AD patients,
confirming the diagnosis of dementia, we found that the
levels of plasminogen, tPA and PAI-1 were similar in
both groups. Moreover, the changes of Aß and tau did
not correlate with the contents of any protein of the
plasminogen system in AD. Finally, t-PA activity was
similar in the CSF of AD and controls.
Conclusion: We have demonstrated that the plasmin
complex in the CSF in vivo is normal in AD patients;
therefore, the CSF does not reflect the plasmin changes
observed post mortem in brain tissue by previous studies.
Our data suggest that plasmin reduction in the brain of AD
patients could be a secondary late event, induced in the
Aß plaques after Aß burden had occurred. Alternatively,
the plasminogen system detected on the whole in the CSF
could not be sensitive enough to reflect correspondent
focal changes in the brain tissue.
Tucker et al. Neurosci Lett. 2004, 368:285-9.
514
252
IMMUNOFISSAZIONE DELLE SIEROPROTEINE CON
ANTISIERO PENTAVALENTE
1
1
1
1
L. Nava , G. Giana , E. Minotti , T. Tamborini , N.
1
1
1
1
Forlani , M. Romanò , C. Colombo , F. Asnaghi
1
Lab. analisi Chimico-Cliniche e Microbiologia, Osp.
Cantù, A.O. S.Anna Como
Scopo. L’Elettroforesi capillare, introdotta di recente nella
routine diagnostica, evidenzia anche lievissime anomalie
del tracciato che richiedono un approfondimento di
secondo livello con l’Immunofissazione. Di recente è stata
sviluppata una tecnica Immunofissativa che utilizza un
antisiero pentavalente per lo screening delle Componenti
monoclonali (CM). Questo lavoro si prefigge di saggiare
l’utilità di tale test.
Metodologia. E’ stato utilizzato il kit “Hydragel 6 IF
Penta”(IFE pentav.) della Sebia, che prevede l'utilizzo
di un unico antisiero pentavalente. Sono stati analizzati
104 campioni suddivisi in 4 gruppi in base all’intensità
della banda visibile alla elettroforesi capillare e in base al
fatto cha la CM fosse nota oppure no. Inoltre sono stati
esaminati in doppio 51 sieri sia in IFE pentav. che in IFE
classica.
Risultati. Il 50% (32/64) dei sieri con bande <0,04g/
dL, classificate come “lievissime”, ha dato un risultato
negativo. Il 25% dei sieri con presenza di banda non
nota (6/24) è risultato negativo alla IFE pentavalente.
Per quanto riguarda i campioni esaminati in doppio con
i due test, si è rilevata una completa sovrapposizione
dei due test per i campioni con bande >0.04 g/dL
e per i due campioni con riduzione della frazione
immunoglobulinica policlonale. Per i 33 campioni con
bande considerate lievissime si sono avuti 2 dubbi e
3 positivi al pentavalente risultati poi negativi alla IFE
classica e un falso negativo in un contesto di aumento
policlonale delle Immunoglobuline.
Conclusioni. I risultati ottenuti permettono di confermare
l’utilità di un test di screening di immunofissazione in
quanto circa il 40% delle sospette CM visualizzate alla
elettroforesi sono risultate negative al Pentavalente e
quindi possono essere refertate molto più velocemente.
L’introduzione dell’immunofissazione con l’antisiero
pentavalente permetterebbe di utilizzare al meglio il test
di immunofissazione classica e, per ultimo, consentirebbe
di verificare in modo più approfondito tutti i casi di
richieste di immunofissazione per sospetto clinico così
da non perdere le rare CM che non sono evidenziate
dall’elettroforesi capillare.
253
SCREENING IFE-PENTA PER LA RICERCA DELLE
COMPONENTI MONOCLONALI NEL SIERO E NELLE
URINE: IL SUO UTILIZZO NELLA PRATICA DEL
LABORATORIO
254
CRITICITA' NELLA REFERTAZIONE DEL DOSAGGIO
DELLA GLUCOSIO-6 FOSFATO DEIDROGENASI
(G6PDH)
1
1
1
1
1
G. Cigliana , E. Curti , B. Frollano , M. Attanasio , F.
2
2
Gulli , U. Basile
1
Patologia Clinica, Istituto Nazionale Tumori "Regina
Elena", Roma
2
Lab. Immunologia, Ist. Patologia Generale, Univ.
Cattolica "Sacro Cuore", Roma
Nel siero la ricerca e l’identificazione delle
componenti monoclonali (CM) viene effettuata
attraverso metodiche elettroforetiche (EF) e metodiche
di immunotipizzazione: immunoelettroforesi (IFE) e
immunosottrazione automatizzata (ISE). Nelle urine,
per la ricerca delle CM (BJP), viene esclusivamente
raccomandato il metodo IFE.
Scopo: utilizzare un metodo di screening per la ricerca
delle CM che consenta di individuare i campioni negativi
e di analizzare quelli positivi con i metodi di conferma più
opportuni ISE o IFE con riduzione dei tempi di lavorazione
tecnica e di refertazione.
Metodi: per lo screening abbiamo utilizzato l’antisiero
IFE-Penta della Sebia (antisieri IgG, IgA, IgM, K e L)
applicando la metodica definita per i sieri e quella per
le BJP sullo strumento Hydrasis (Sebia). Nel siero la
metodica, già validata dalla Sebia, consente di valutare 24
campioni per gel. Nelle urine abbiamo testato 12 campioni
per gel utilizzando fissativo e antisiero IFE-Penta per
ciascun campione.
Risultati: abbiamo testato circa 500 campioni sierici/urinari
in pazienti prevalentemente oncologici dell’ istituto Regina
Elena. Nei sieri abbiamo trovato: 22% negativi, 42%
positivi con CM singole e franche inviati alla conferma
con ISE (Immunotyping Capyllaris Sebia), 36% dubbi o
positivi con CM multiple o deboli inviati alla conferma
con IFE (Hydragel 2/4 IF MS/MD). La metodica ISE
senza lo screening con IFE-Penta necessita una ulteriore
conferma in IFE del 40% dei campioni analizzati. Lo
screening con IFE-Penta consente di ottimizzare l’uso
della metodica ISE automatizzata riducendo le conferme
in IFE allo 0.5%.
Nelle urine abbiamo trovato: 47% negativi e 53% dubbi
o positivi inviati alla conferma con IFE (Hydragel 2/4 BJUP MS/MD). Dei dubbi/positivi l’87% si sono confermati
veri positivi mentre il 17% si sono rivelati falsi positivi alla
conferma con IFE.
Conclusioni: il metodo di screening IFE-Penta descritto
per i sieri e per le urine consente di ridurre
significativamente i tempi di processazione e di
refertazione dei campioni e di ottimizzare l’uso delle
risorse e delle metodiche disponibili mantenendo i requisiti
di sensibilità e di specificità consigliati dalle linee guida.
Inoltre si realizza un contenimento dei costi utilizzando le
metodiche di conferma solo per i campioni positivi o dubbi.
1
1
1
M. Vidali , B. Bardone , A. Mora , G. Bellomo
1
La valutazione della G6PDH riveste un ruolo chiave
nell’individuazione dei pazienti a rischio di crisi emolitiche.
Tuttavia, non vi è ancora accordo sulle modalità di
refertazione della G6PDH (normalizzazione per RBC o
Hb) nè sulla necessità di segnalare nel referto fattori
confondenti potenzialmente associati a falsi negativi. In
questo lavoro abbiamo esaminato differenti parametri
reticolocitari in pazienti sottoposti al test per G6PDH.
L’attività della G6PDH è stata misurata (Trinity Biotech
G6PDH su Siemens ADVIA 2400) in 415 pazienti non
selezionati ed espressa come Unità per numero di
eritrociti (vn 146-376 U/10^12 RBC) o per grammi di
emoglobina (vn 4.6-13.5 U/g Hb). Per ogni paziente erano
disponibili i parametri emocromocitometrici e reticolocitari.
Il campione presentava valori mediani di G6PDH di
331 U/10^12 RBC (IQR 305-360) e 11.4 U/g Hb (IQR
10.5-12.6), ed una frequenza di positività del 2.9% per
entrambe le normalizzazioni (concordanza coppie 100%,
K di Cohen=1). I pazienti (n=40) con una prevalenza
maggiore del 10% di reticolociti immaturi avevano
valori significativamente minori di conta eritrocitaria, Hb,
ematocrito, e maggiori di conta reticolocitaria assoluta e/o
relativa (p<0.001). Inoltre, gli stessi mostravano maggiori
livelli sia di G6PDH non normalizzato (p=0.034) sia
normalizzato per RBC (p<0.001) o Hb (p<0.001). 4 di
5 pazienti con deficienza parziale di G6PDH (attività
10-60% del valore normale medio) e 4 di 6 pazienti con
valori di G6PDH vicini al limite inferiore dell’intervallo di
riferimento presentavano una reticolocitosi assoluta e/o
relativa aumentata.
I dati supportano la possibilità di sovrastima dell’attività
della G6PDH, e quindi di una diagnosi errata (grave vs
parziale deficienza, parziale deficienza vs normalità) in
pazienti in cui l’enzima viene dosato a breve distanza
da un episodio emolitico acuto. Lo studio evidenzia
inoltre la necessità, qualora si presentasse il sospetto,
di refertare l’attività dell’enzima unitamente ai parametri
reticolocitari, suggerendo da una parte la possibilità di
un’errata valutazione del paziente e dall’altra la necessità
di ripetere il dosaggio a distanza dall’evento emolitico.
Infine, i risultati mostrano un’ottima concordanza dei valori
ottenuti con le due differenti normalizzazioni.
515
255
HANDLING TEMPERATURE OF CSF AFTER
LUMBAR PUNCTURE IS A CRITICAL FACTOR
LOWERING THE DETECTABLE Aß1-42 IN AD
PATIENTS
1
1
2
G.M. Sancesario , S. Bernardini , Z. Esposito , M.
1
2
1
2
Nuccetelli , R. Sorge , G. Federici , G. Bernardi , A.
2
2
Martorana , G. Sancesario
1
Dept. of Internal Medicine, Faculty of Medicine and
Surgery, The Univ. of Rome Tor Vergata, Italy
2
Dept. of Neuroscience, Faculty of Medicine and
Surgery, The Univ. of Rome Tor Vergata, Italy
Background - The peptide amyloid-beta 1-42 (Aβ1-42),
extensively studied in the CSF of humans as biological
marker for Alzheimer’s disease (AD), is highly unstable
and results are variable. Although many efforts have
been developed to assess a uniform standardization of
preanalytical procedures, a recent paper has pointed
out how there is still a considerable variation for
Aβ1-42 measurement not only between but also within
centres (Verwey et al., Ann Clin Biochem 2009; 46:
235–240). Mostly, collecting tube surface, pre¬analytical
temperature, repeated freeze/thaw cycles and storage
at 4, 18, and 37 °C can produce a major influence on
the stability of Aβ1-42. We investigated whether Aβ1-42
detection in CSF may be affected by handling temperature
after lumbar puncture.
Methods - CSF was collected from patients affected by
probable AD (n = 27), other dementias (OD) (n = 24), or
other neurological disorders without cognitive impairment
(OND) (n = 23). After lumbar puncture, CSF samples
were either maintained at physiological 37 °C, or handled
according to standard procedures and centrifuged at 4
°C for 10 min; thereafter, one aliquot was stored at 4 °C
and another at 37 °C, before freezing samples 90 min
later at – 80 °C, pending analysis. Aβ1-42 and total tau
were determined using a commercially available sandwich
enzyme-linked immunosorbent assay ELISA.
Results and discussion - Reduced Aβ1-42 and increased
total tau CSF levels were confirmed as hallmarks of the
OD and AD groups, providing standard measurement in
samples stored at 4 °C before freezing. However, avoiding
cooling or reheating CSF from 4 to 37 °C before freezing
increased the Aβ1-42 concentration detectable in the AD
group (P < 0.01), but not in control groups. The relative
Aβ1-42 concentration detected in the samples reheated
at 37 °C respective to that at 4 °C (Aβ1-42 Detection
Variability Index) may have an adjunctive diagnostic
value, representing an index of Aβ1-42 variable detection
at different temperatures. We suggest that coupling the
absolute Aβ1-42 concentration, detected in standard
conditions after cooling at 4 °C, and the Aβ1-42 Detection
Variability Index may improve discrimination between
diagnostic groups, adequately differentiating the AD from
the OND as well from the OD groups.
516
256
ARMONIZZAZIONE DEI METODI PER LA
DETERMINAZONE DEGLI ENZIMI DEL SIERO:
CRITERI PER LA SCELTA DI IDONEI MATERIALI DI
CALIBRAZIONE
1
2
G. Cattozzo , C. Franzini
1
A.O.U. Osp. di Circolo e Fondazione Macchi, Varese
2
Univ. degli Studi, Milano
In due esperimenti di armonizzazione dei risultati forniti
dai metodi per la determinazione di ALP (tampone AMP
e tampone DEA) e di LDH (reazione lattato-piruvato, LP,
e reazione piruvato-lattato, PL), si è valutata l’affidabilità
di due criteri per la scelta dei materiali di calibrazione
(MC) idonei al trasferimento dell’esattezza analitica di un
metodo assunto come riferimento (metodi AMP e LP).
Come parametro di affidabilità si è utilizzato il rapporto
tra i valori misurati per i sieri da pazienti (SP) con
il metodo ricalibrato e con il metodo di riferimento: la
mediana di tali rapporti non dovrebbe discostarsi da
1 in misura superiore all’errore totale accettabile (ETa)
stimato sulla base della variabilità biologica. Entrambi
i criteri confrontano la posizione dei dati relativi ai MC
con la retta di regressione lineare (ascisse metodo di
riferimento, ordinate metodo alternativo) dei valori ottenuti
per i SP. Secondo il criterio A (CrA), lo scostamento
dalla retta (lungo l’asse delle ordinate) di ciascun MC
è espresso come residuo normalizzato (residuo diviso
per la deviazione standard dei residui calcolati per i SP):
se questo risulta < 3, il MC è considerato commutabile
con i SP e quindi idoneo al trasferimento di esattezza.
Secondo il criterio B (CrB), tale scostamento è espresso
come percentuale della concentrazione misurata per
ciascun MC con il metodo di riferimento: il MC è ritenuto
idoneo se tale scostamento è inferiore all’ETa. Nei
due esperimenti i MC, a turno, sono stati utilizzati per
convertire i risultati misurati con i metodi DEA e PL nei
corrispondenti risultati ottenibili con i metodi di riferimento
nell’analisi di 106 SP per ALP e 109 SP per LDH.
Nell’esperimento riguardante ALP i 3 MC idonei ed i 5 MC
inidonei venivano riconosciuti correttamente applicando
entrambi i criteri. Nell’esperimento riguardante LDH 23
MC risultavano idonei e 8 inidonei: CrA riconosceva
correttamente 10 MC idonei e 7 MC inidonei, mentre
CrB riconosceva correttamente 13 MC idonei e tutti i MC
non idonei; CrA riconosceva come idoneo anche un MC
inidoneo, mentre tutti i MC considerati idonei secondo CrB
erano correttamente classificati. Globalmente, i risultati
depongono per un’accettabile, anche se non assoluta,
affidabilità dei due approcci alla valutazione dell’idoneità
dei MC al trasferimento dell’esattezza analitica.
257
URINARY MICROPARTICLE COMPOSITION IN
RENAL CELL CANCER: TOWARD BIOMARKERS
DISCOVERY
1
1
1
1
M. Pitto , L. Morosi , C. Bianchi , F. Magni , C.
1
1
2
3
Chinello , P. Brambilla , C. Salemi , G. Zanetti , S.
4
1
Ferrero Bogetto , F. Raimondo
1
Dept. of Exp. Medicine, Univ. Milano-Bicocca, Monza
2
Dept. of Lab. Medicine, Desio Hospital - Univ. MilanoBicocca, Desio, Milano
3
Dept. of Urology, Hospital Maggiore IRCCS, Univ.
Milano, Milano
4
Dept. of Medicine Surgery and Dentistry, Pathological
Anatomy, S. Paolo Hospital, Univ. of Milano, Italy
Clear cell renal carcinomas (RCC) is representing about
3% of all kidney cancers. No biomarkers for diagnosis
or for post-surgery monitoring of RCC are yet available.
Urines contain membranous nanovesicles (50-100 nm),
that are known to be released from urothelial cells of the
kidney and of the renal tract. Using urinary microparticles
(MPs) as a starting material for biomarker discovery
was shown to be advantageous, since reduction of the
complexity of the urine proteome together with enrichment
in renal proteins towards plasmatic ones is achieved (1).
We performed antibody-based quantification of putative
biomarkers in urinary vesicles from a patient cohort
in order to search for potential tumor marker. MPs
were isolated from about 30 ml of urines collected
from 41 patients (29 clear cell RCC, 6 malignant
non-clear cell and 6 benign) and 28 control healthy
subjects, matched for sex and age, by ultracentrifugation.
Specific membrane protein detection was performed
by SDS-PAGE/WB. After band intensity densitometric
quantification and normalization by urinary creatinine,
evaluation of diagnostic performance was accomplished
by ROC analysis. Results show that Aquaporin-1 (AQP1)
and the Extracellular Matrix Metalloproteinase Inducer
(EMMPRIN) are reduced in ccRCC patient urinary MPs,
while Matrix metallo-protease 9 (MMP-9) and Carbonic
Anhydrase IX (CA9) result more abundant. ROC curve
analysis show good discrimination power between ccRCC
patients and the control group. Moreover the analysis of
MPs purified from follow-up urines of RCC patients shows
that, after two years from surgery, protein levels change
again and are similar to controls. In conclusion our work
suggests that MP isolation may provide an efficient first
step in biomarker discovery in urine.
1) Hoorn EJ, et al., Nephrology 2005;10:283-90.
Grants from FIRB: Rete Nazionale per lo studio del
proteoma umano (n. RBRN07BMCT).
258
RUOLO DEI BIOMARKER LIQUORALI NELLA
DIAGNOSI DI MALATTIA DI ALZHEIMER:
L'ESPERIENZA DEL NOSTRO CENTRO
1
1
2
2
G. Passerini , A. Carobene , L. Ferrari , F. Caso , G.
2
1
1
1
Magnani , M. Locatelli , F. Ceriotti , F. Dorigatti
1
Diagnostica e Ricerca San Raffaele, IRCCS Osp. San
Raffaele, Milano -LABORAF2
Dip. di Neurologia, IRCCS Osp. San Raffaele, Milano
Introduzione. Nonostante i progressi compiuti negli
ultimi venti anni in merito alla comprensione dei
meccanismi patogenetici e la disponibilità di nuove
indagini strumentali, la diagnosi precoce di Malattia di
Alzheimer (AD) in molti casi è ancora difficoltosa. L'iter
diagnostico dipende da criteri prevalentemente clinici;
alcuni Autori sostengono tuttavia che i biomarker liquorali
ß-amiloide(1-42), tau e tau fosforilata(181P) possono fornire
un valido supporto alla diagnosi di AD in fase preclinica.
Obiettivo del nostro studio è valutare se vi sia una
correlazione tra i livelli liquorali di ß-amiloide(1-42), tau e
tau fosforilata (181P) e la diagnosi di AD e di demenza
fronto-temporale (DFT).
Metodi. Sono stati analizzati i prelievi liquorali di 149
soggetti, ricoverati presso la Divisione di Neurologia
dell'Ospedale San Raffaele, da novembre 2008 a
maggio 2010: 53 erano affetti da AD secondo i criteri
NINCDS-ADRDA, 12 da DFT, 42 presentavano una
compromissione cognitiva lieve (MCI), 42 erano controlli
sani. Sui dati raccolti è stata condotta un'analisi statistica
con il T-test di Student.
Risultati. I pazienti affetti da AD rispetto al gruppo
di controllo, mostravano livelli maggiori di proteina tau
fosforilata (p=0,001) e una ridotta concentrazione di
ß-amiloide (p=0,005). L’aumentata concentrazione di
proteina tau fosforilata nel gruppo di pazienti con AD
risultava anche dal confronto con i pazienti affetti da DFT
(p=0,001) e da MCI (p=0,001). Una ridotta concentrazione
di ß-amiloide si evidenziava anche confrontando il gruppo
AD con i pazienti affetti da DFT (p=0,019) e da MCI
(p=0,018).
Non sono state trovate differenze statisticamente
significative tra le misure di proteina tau dei pazienti
appartenenti al gruppo di controllo rispetto ai pazienti
affetti da DFT, da AD e da MCI. Al contrario le misure
di proteina tau dei pazienti affetti da AD mostravano
incrementi statisticamente significativi rispetto ai valori
determinati nel gruppo di pazienti con MCI (p=0,019).
Conclusioni. I dati presentati, in accordo con la letteratura
internazionale, evidenziano che i dosaggi liquorali di
proteina tau, proteina tau fosforilata(181P), ß-amiloide(1-42),
possono fornire al clinico un utile strumento nella diagnosi
di AD e nella diagnosi differenziale tra AD e DFT.
517
259
UN CASO DI MIELOMA IPERLIPIDEMICO, UNA
RARA VARIANTE DEL MIELOMA MULTIPLO
1
2
3
1
A. Terreni , D. Cammelli , R. Alterini , B. Peruzzi , G.
1
1
Avveduto , A. Caldini
1
Lab. Generale, Dip. Diagnostica di Laboratorio, A.O.U.
Careggi, Firenze
2
Patologia Medica, Dip. di Biomedicina, A.O.U. Careggi,
Firenze
3
Ematologia, Dip. di Biomedicina, A.O.U. Careggi,
Firenze
Il mieloma iperlipidemico (MI) è una rara variante di
mieloma multiplo associato a elevati valori di trigliceridi
e colesterolo, non riconducibili a dislipoproteinemia.
A causa della sua bassa incidenza, dalla sua prima
descrizione avvenuta 30 anni fa, restano a oggi poco
conosciuti i sintomi, il decorso clinico e la terapia ottimale.
Il meccanismo alla base del MI è ancora poco noto: una
delle ipotesi è che la paraproteina leghi le lipoproteine
inibendone la degradazione. Noi presentiamo il caso di
R.G., una donna di 58 aa giunta alla nostra attenzione nel
2008 a causa di un dolore al rachide dorsale associato a
lombosciatalgia. La risonanza magnetica del rachide, la
biopsia osteo-midollare (BOM) e gli esami emato-chimici
evidenziavano un quadro compatibile con mieloma
multiplo (MM) IgA λ. La paziente presentava livelli di
colesterolemia (693mg/dl) e trigliceridemia (551 mg/dl)
molto elevati rispetto ai precedenti controlli. Utilizzando
tecniche di immunofissazione e immunosottrazione
non è stato possibile dimostrare un’associazione tra
lipoproteine e componente monoclonale (CM). La
paziente iniziava il trattamento chemioterapico, nel corso
del quale l’andamento dell’iperlipidemia seguiva quello
della CM. Dopo un periodo di remissione, a gennaio
del 2010, la paziente andava incontro a una ricaduta
di malattia che progrediva nell’aprile 2010 quando nel
sangue periferico si evidenziavano numerosi elementi
plasmocitoidi. La BOM confermava una metaplasia a
elementi plasmoblastici. Poco dopo la paziente moriva per
emorragia celebrale in corso di leucemia plasmacellulare.
La storia clinica e l’andamento dei parametri biochimici
in risposta alla terapia, hanno permesso di inquadrare
la paziente come MI, anche in assenza di una
dimostrazione biochimica dell’interazione tra lipoproteine
e CM. D’altronde in una recente revisione sul MI (1) viene
riportato che solo nel 45% dei 53 casi descritti è stato
dimostrata la presenza di un complesso CM/lipoproteina,
suggestivo di una inibizione della degradazione lipidica
da parte della CM. In conclusione l’associazione tra MM
e iperlipidemia è una condizione rara ma clinicamente
rilevante, le cui caratteristiche cliniche e meccanismi
patogenetici sono ancora in gran parte sconosciuti.
(1) Ann Hematol 2010;89:569-77
518
260
LA CISTATINA C NEL LIQUIDO CEREBROSPINALE
DI PAZIENTI CON SCLEROSI MULTIPLA
1
1
1
1
G. Previtali , M. Amadei , M. Donati , M. Frasanni , E.
2
1
Montanari , C. Zurlini
1
Dip.Patologia Clinica, Osp.Fidenza AUSL Parma
2
Dip.Neurologia, Osp. Fidenza AUSL Parma
Obiettivo della ricerca
Scopo del lavoro è di determinare i valori di cistatina
C( Cys C) nel liquor cerebrospinale (CSF) di pazienti
con varie forme di Sclerosi Multipla(SM) e in pazienti
con malattie neurologiche non infiammatorie(OND) presi
come gruppo di controllo e osservare se i valori di Cys C
nei pazienti con SM siano significativamente ridotti.
Pazienti e metodi
I campioni di CSF provengono da 54 pazienti con diverse
forme di SM definita(35femmine/19 maschi) età media 39
anni(19-62) e da 20 pazienti con differenti patologie non
correlate a malattie neurologiche infiammatorie (OND) (10
femmine/10 maschi) età media 48 anni(21-88) .
I campioni di CSF, dopo la raccolta per puntura
lombare,sono stati centrifugati per eliminare la frazione
cellulare e congelati -70°C fino al momento dell'uso.
Il lavoro è stato effettuato rispettando la Dichiarazione di
Helsinki.
I valori di Cys C nel CSF sono stati determinati con metodo
nefelometrico utilizzando il kit diagnostico Cystatin C PET
della ditta Dako su strumento Immage 800 della Beckman
secondo le indicazioni fornite dalla ditta.
Analisi Statistica
L'analisi della varianza è stata valutata con ANOVA
test(MedCalc statistical software)e per la significatività
della differenze fra le medie è stata usato il Tukey HSD
Test.
Risultati
L'analisi della varianza ANOVA mostra che almeno due
medie sono statisticamente diverse(p=0.000195).
Il Tukey HSD Test ci indica una differenza
significativa(p<0.01) fra le medie di alcuni gruppi con
diverse forme di SM e il gruppo dei pazienti con malattie
neurologiche non infiammatorie.
Conclusioni
I l lavoro evidenzia un limitato significato fisio-patologico
nel confronto fra i valori della Cys C dei pazienti con SM
e quelli con OND in quanto i risultati mostrano che molti
pazienti ,in tutti i gruppi, hanno valori di Cys C nel CSF
compresi fra 2-6 mg/L.
Nonostante la riduzione statisticamente significativa delle
medie sopratutto fra i gruppi di MS Recidivante-remittente
e OND non è possibile discriminare ,secondo la nostra
esperienza,fra pazienti con MS e il gruppo di controllo con
la sola determinazione della Cys C (1).
Bibliografia
1.Bever CT, Garver DW. Increased cathepsin B activity in
multiple sclerosis brain. J Neurol Sci 1995 ;
131:71-73.
261
DOSAGGIO CDT: CONFRONTO TRA METODI
1
1
262
MR-proANP: A POSSIBLE ADDITIONAL CARDIAC
MARKER IN AL AMYLOIDOSIS
1
M. Daves , M. Floreani , G. Cosio
1
Lab. di Biochimica Clinica, Comprensorio Sanitario di
Bolzano
Introduzione: la CDT o transferrina carboidrato carente
è un marcatore di abuso alcolico. Nel nostro laboratorio
la CDT viene eseguita dal 2005 con elettroforesi
multicapillare (EC) e abbiamo analizzato 35600 sieri.
Dall’anno 2009 tutti i sieri superiori al cut-off in EC sono
stati dosati anche con un metodo HPLC.
Materiali e metodi: abbiamo eseguito 6011 CDT in EC
(Capillarys, Sebia), di questi il 9% (n=541) superiori al
cut-off di 1,3%, sono stati processati con metodo HPLC
(ClinRep, Recipe, cut-off >1,8%).
Risultati: Il valore medio di CDT e la deviazione standard
dei 541 sieri è risultata in EC 2.09%±1,46 e in HPLC
2,24%±1,53. Dalla comparazione tra i metodi abbiamo
ottenuto la retta y=0,93x+0,009 e il coefficiente r=0,976. I
sieri sono stati inoltre divisi in due: gruppo 1 con CDT ≥2%
(n=156) e gruppo 2 con CDT compresa tra 1,3% e 1,9%
(n=385). La correlazione tra i metodi è ottima (r=0,98) nel
gruppo 1, ma è meno buona (r=0,6) nel gruppo 2. Nel
primo gruppo solo 1 paziente ha un valore discordante nei
due metodi, mentre nel secondo gruppo ben 239 pazienti
(62%). Tali differenze sono imputabili solo nel 10% dei
casi ad una scarsa separazione delle frazioni in EC.
Abbiamo poi considerato come veri positivi solo i campioni
con CDT superiore alla soglia con entrambi i metodi;
variando il cut-off in EC da 1,3% a 1,4% e quindi a 1,5%
diminuiscono progressivamente i falsi positivi (valore
predittivo positivo del test aumenta progressivamente
55%, 67% e 79%), ma aumentano i falsi negativi e la
sensibilità del test si abbassa.
Conclusioni: Il sistema multicapillare è un metodo ottimale
per lo screening della CDT per la buona produttività, la
sensibilità analitica e la possibilità di utilizzare la provetta
primaria. Il problema dei valori discordanti tra EC e HPLC
non viene risolto variando i cut-off . Viste le implicazioni
medico legali del test, ci sembra consigliabile fornire un
dato di CDT superiore alla soglia quando si osserva
una concordanza tra almeno due metodi analitici basati
su principi chimico-fisici differenti. Da quando abbiamo
adottato tale procedura la qualità del dato fornito risulta
sicuramente più affidabile e difendibile.
2
2
2
2
P. Cardelli , G. Ferranti , G. Salerno , M.T. Corsetti , A.
1
1
2
Moscetti , F. Saltarelli , F. Capogreco , C. Della
3
2
1
Costanza , P. Iaquinto , G. La Verde
1
A.O. S. Andrea, Roma
2
Dip. di Medicina Clinica e Molecolare - Univ. Sapienza
di Roma
3
Bios SPA Diagnostica di Laboratorio, Roma
Introduction. Primary amyloidosis (AL amyloidosis), a
plasmacellular discrasia, represents a group of diseases
characterised by the deposition of light chains fibrils
that infiltrate tissues leading to multi systemic organ
involvement. About one third to a half of patients
with Al amyloidosis have a clinically-significant cardiac
involvement. The degree of cardiac compromise depends
on the extent and location of amyloid deposition in
the heart and the most common presentations are
congestive heart failure-mainly a restrictive infiltrative
pattern-and conduction system disturbances. Cardiac
biomarkers can provide usefull prognostic information
in light chain amyloidosis. Aims. The aim of this study
is to evaluate the use of MR-proANP(1-98, which is
the mid-regional portion of the prohormone of the
active atrial natriuretic peptide(99-126) as an earlier
predictor marker of cardiac impairment. Materials and
Methods. Blood samples were collected (-80°C) from
6 patients with systemic amyloidosis(GR1) and from
4 patients with localized amyloidosis(GR2) and serum
levels of MR-proANP(Brahms MR-Pro-ANP Kryptor) ,NTproBNP(Elecsys® proBNP), Free Light Chain(FLC,
Binding Inside) Kappa(κ) and Lambda(λ) were assayed.
The Mann-Whitney(p<0.05) test was used to compared
results. The non parametric Spearman test( p<0.05)
was used to value the significantly correlations. Results.
Serum MR-proANP was significantly higher (p=0.02)
in patients of GR1(349.00±296.20 pmol/l) respect to
the GR2 patients (55.02±64.92 pmol/l) as well as NTPro-BNP level (p=0.004). About FCL only the FLC-λ
concentration was significantly (p=0.004) increased in
GR1(342.40±153.60 mg/L) vs GR2 (56.69±6.52 mg/L).
In GR1, a significant correlation MR-Pro-ANP vs NT2
Pro-BNP(p=0.0004;r =0.976) and MR-Pro-ANP vs FLC2
L (p=0.046; r =0.738) was observed. Conclusions. MRProANP in addition to NT-ProBNP appear as a good
marker of cardiac impairment available for diagnose and
follow up of cardiac impairment in patients with systemic
AL amyloidosis.
References. Current treatment of AL amyloidosis.
Giovanni Palladini, Giampaolo Merlini. Haematologica,
Vol
94,
Issue
8,
1044-1048
doi:10.3324/
haematol.2009.008912
519
263
VARIATION OF THE PRINCIPAL ELECTROLYTES
IN CEREBROSPINAL FLUID(CSF) AND SERUM OF
PATIENTS WITH MULTIPLE SCLEROSIS
2
2
264
PLASMA γGLUTAMYLTRANSFERASE FRACTIONS:
DIAGNOSTIC AND PROGNOSTIC PREDICTIVE
VALUE
2
M.R. Favaroni , G. Salerno , G. Ferranti , M.T.
2
2
2
1
Corsetti , P. Tiranno , F. Capogreco , F. Tabacco , L.
1
2
Portaro , P. Cardelli
1
A.O. S. Andrea, Roma
2
Dip. di Medicina Clinica e Molecolare - Univ. Sapienza
di Roma
Introduction. Multiple sclerosis (MS) is a nervous
system disease that affects the brain and spinal
cord. It damages the myelin sheath, the material that
surrounds and protects the nerve cells. This disease
slows down or blocks messages between the brain
and the body, leading to the symptoms of MS. The
neuron’s damages include alterations in the membrane
to generate intracellular-versus-extracellular gradient of
+
+
+
ions including sodium(Na ), potassium(K ), chloride(Cl )
+2
and calcium(Ca ). Aims. The aim of study is to
evaluate in CSF and serum Na+, K+, Cl- and Ca+2
levels in patients with multiple sclerosis(G1) and non
autoimmune nervous diseases(G2, control group) to find
out potential differences and correlations. Materials and
Methods. The CSF and blood samples were collected
(-80°C) from 8 patients of the G1 and from 6 control
patients. The samples were tested on the Vitros Fusion
5.1 Johnson & Johnson and GEM 4000 Instrumental
Laboratories. Mann-Whitney(p<0.05) test was used to
compared results. Results. Na+, K+, Cl- levels were
significantly higher (p=0.019, p=0.02, p=0.023, p=0.019)
while Ca+2 level was significantly lower (p= 0.01) in
the CSF of patients G1 compared to the control group.
No modification in the electrolytes serum values of
both groups were observed. In G1, the CSF/Serum
gradient was statistically significant with respect to the
control group for Na+ and K+ only (p=0.010, p= 0.042).
Conclusion. In patients with SM these results indicate
a selective modification of the CSF/Serum gradient
electrolyte that could be ascribed an alteration of the
Na+/ K+ pump the lower CSF Ca+2 levels and the
increased the Cl- levels, could contribute to the anomalies
in the transmission of electrical impulse. Further studies
are needed to evaluate the utility of the CSF/serum
electrolytes gradient in the follow up of MS patients.
References. Cerebrospinal fluid from multiple sclerosis
patients inactivates neuronal Na+ current. Hubertus
Koller, Jochen Buchholz and Mario Siebler. Brain (1996),
119, 457-63
520
1
1
2
M. Franzini , I. Fornaciari , H.A. Elawadi , V.
3
3
1
1
Fierabracci , A. Pompella , A. Clerico , C. Passino , M.
4
3
Emdin , A. Paolicchi
1
Scuola Superiore Sant’Anna, Pisa
2
Dip. di Chirurgia Generale e Trapianti di Fegato, Univ.
di Pisa, Pisa
3
Dip. di Patolgogia Spermentale BMIE, Univ. di Pisa,
Pisa
4
Fondazione Toscana G. Monasterio, Pisa
γ#Glutamyltransferase (GGT) is a common diagnostic
marker of liver dysfunction, but its values are also
associated with the risk marker of cardiovascular events
related with atherosclerosis, and the onset of type 2
diabetes, irrespective of hepatic disease and alcohol
consumption. Due to its low specificity, GGT is not used
in the risk stratification of patients. Thus, we developed
a novel high-sensitivity FPLC method, which allowed us
to identify four GGT fractions (b-GGT, m-GGT, s-GGT, fGGT, with molecular weights, MW, ranging from 2000 kDa
to 70 kDa) in human plasma [1].
To establish their diagnostic and prognostic value, we
participated to the Framingham Heart Study (FHS) with
the project entitled “GGT fractions as predictors of the
metabolic syndrome and incidence of cardiovascular
disease”. At the present, statistical analysis is ongoing to
determine the predictive value of each fraction concerning
cardiovascular and metabolic diseases. To discriminate
the effect of the main confounders on GGT activity, we
analysed also cohorts of patients with conditions (NAFLD,
NASH, alcohol abuse) associated with GGT elevation.
Results showed that f-GGT is the most abundant
form (>60% of total GGT) in the plasma of healthy
subjects, while the increase of s-GGT was associated with
hepatocellular damage and the increase of b-GGT was
connected with liver steatosis and dyslipidemia. Changes
in the ratio between b- and s-GGT were more specific than
total GGT for identifying alcohol abuse (ROC AUC 0.834
and 0.510 respectively).
In patients affected by tumors we identified a fifth fraction
having a MW higher than b-GGT. Dimension (100-50 nm),
density (1.063-1.210 g/ml) and sensitivity to detergent and
protease action suggest that b-GGT might be constituted
by microparticles and exosomes, possibly originating by
tissue other than liver.
In conclusion all collected data suggest that the GGT
fraction pattern has a specific diagnostic value. These
data, combined with results from FHS, will represent the
basis to validate GGT fractions as specific biomarkers of
hepatic, metabolic and cardiovascular disease.
[1] Franzini M, Paolicchi A, Fornaciari I, et
al.
Cardiovascular
risk
factors
and
gammaglutamyltransferase fractions in healthy individuals. Clin
Chem Lab Med. 2010;48:713-7.
265
THE ROLE OF URINARY NGAL (uNGAL) AND
ALBUMINURIA AS EARLY MARKERS OF CARDIAC
DAMAGE IN PRIMARY HYPERTENSION
1
2
2
2
M. Fravega , G. Leoncini , F. Viazzi , P. Bezante , G.
2
2
1
1
Deferrari , R. Pontremoli , R. Degrandi , M. Mussap
1
Dept. of Laboratory Medicine, University-Hospital,
Genoa, Italy
2
Dept. of Cardionephrology, Univ. of Genoa, Italy
Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin (NGAL) is
an early and specific marker of acute kidney injury
(AKI). Recent evidences suggest that NGAL may also
be involved in chronic vascular remodeling during the
development of atherosclerosis. NGAL demonstrated the
best sensitivity and specificity when measured in urine.
Albuminuriua, a powerful predictor of cardiovascular
events, is thought to reflect widespread subclinical
vascular abnormalities. We investigated the relationship
between urinary NGAL (uNGAL) and albuminuria in the
respect of left ventricular mass in low risk patients with
primary hypertension.
A total of 121 untreated, non diabetic patients, aged
25-73 y, with primary hypertension were studied. NGAL
was measured by a chemiluminescent microparticle
method, optimized on a fully-automated analytical
platform (ARCHITECT, Abbott Diagnostics Inc, Rome,
IT). Albuminuria was measured by nephelometry
(BN II, Siemens Healthcare Diagnostics, Milan, IT)
and expressed as albumin/creatinine ratio (ACR).
Left ventricular mass (LVM) was assessed by
echocardiography and indexed to body surface area
(LVM/BSA) as well as height to allometric power of 2.7
(LVM/h2.7). Statistical analyses were performed by using
non-parametric tests (Spearman’s rho, etc.).
There was no correlation between uNGAL and ACR;
however, both variables were directly related to
clinic systolic blood pressure (rho=0.241, p=0.008
and rho=0.247, p=0.007 respectively), LV relative wall
thickness (rho=0.242, p=0.019 and rho=0.269, p=0.009),
LVM/BSA (rho=0.277, p=0.0075 and rho=0.219,
p=0.0348) and LVM/h2.7 (rho=0.203, p=0.0499 and
rho=0.215, p=0.0381). The simultaneous occurrence
of increased uNGAL and ACR (above the median)
was associated with higher left ventricular mass index
values (LVM/BSA, p=0.0120; LVM/h2.7 p=0.0354) and
entailed an increased risk of having left ventricular
hypertrophy (LVH) (LVH/BSA, chi2 p= 0.0014; LVH/h2.7,
chi2 p=0.0259). Furthermore, logistic regression analysis
showed that the risk of presenting LVH increased more
than 4-fold when uNGAL and ACR were both above the
median, even after adjustment for age, gender and blood
pressure values.
High-normal values of uNGAL and ACR interact in the
identification of increased left ventricular mass in low risk
patients with primary hypertension.
266
DIAGNOSTICA DELLE MALATTIE INFIAMMATORIE
CRONICHE INTESTINALI IN PEDIATRIA: L’APPORTO
DEL DOSAGGIO DELLA CALPROTECTINA FECALE
1
1
2
1
S. Spagnuolo , A. Guzzo , P. Kosova , S. Orefice , B.
1
Dente
1
U.O.C. di Medicina di Laboratorio, Osp. San Paolo,
Napoli
2
Ambulatorio di Gastroenterologia pediatrica, Osp. San
Paolo, Napoli
Introduzione. Le malattie infiammatorie croniche
intestinali (IBD) sono il risultato di una disregolazione della
risposta immunitaria verso la flora intestinale normale
in un ospite geneticamente suscettibile. Il 25% dei casi
esordisce nell'infanzia e il resto durante l'età adulta, con
un picco nel 2° e 3° decennio di vita.
La variabilità dello spettro clinico delle IBD esige nuovi
strumenti nella diagnosi differenziale, specie con la
sindrome dell’intestino irritabile (IBS). Si può valutare
un eventuale coinvolgimento della mucosa intestinale
dosando nelle feci i principali marcatori di flogosi, fra
i quali, la Calprotectina fecale, proteina che deriva dai
granulociti neutrofili e resta inalterata nelle feci per molto
tempo.
Obiettivo: confermare che il dosaggio della calprotectina
fecale è utile come marcatore non invasivo di attività dello
stato flogistico nelle IBD del bambino alla diagnosi e nel
follow-up.
Materiali e metodi. 48 piccoli pazienti affetti da IBD
(39 diagnosticati istologicamente, di cui 18 MC, 13
CU, 8 Coliti indeterminate, e 9 in attesa di esame
endoscopico), 19 affetti da IBS e 9 da intolleranza
al lattosio, seguiti dall’ambulatorio di Gastroenterologia
pediatrica del ns. Ospedale, sono stati sottoposti a
valutazione clinica e al dosaggio della calprotectina
fecale. I livelli di quest’ultima sono stati determinati con
test ELISA quantitativo (Calprest, Eurospital, Italia) ed
espressi come µg/g di feci (val. norm. < 100 µg/g in
soggetti pediatrici).
Risultati. Valori di calprotectina marcatamente aumentati
nei pazienti con MC, CU e Colite indeterminata si
sono contrapposti a valori compresi nell’intervallo di
normalità nei pazienti con IBS. Le differenze sono risultate
statisticamente significative (p<0,0001).
Conclusioni. La calprotectina si riconferma marcatore
molto sensibile, anche se non malattia-specifico, di uno
stato flogistico dell’intero tratto intestinale. Pertanto è
di grande aiuto nella diagnosi differenziale tra malattia
organica caratterizzata da infiammazione della mucosa
intestinale e disordini intestinali funzionali.
Bibliografia.
1) Scherr R, Essers J, Hakonarson H, Kugathasan S. :
Genetic determinants of pediatric inflammatory bowel
disease: is age of onset genetically determined? Dig Dis.
2009 Sep;27(3):236-9.
521
267
MULTIPLE MYELOMA AND MGUS: A SERUM
EVALUATION OF PCT, MR-PROAMD AND MR PROANP
1
1
2
F. Tabacco , G. La Verde , M.R. Favaroni , G.
2
2
2
Salerno , M.T. Corsetti , G. Ferranti , A. Costante
2
1
1
1
, L. Troccoli , F. Saltarelli , A. Moscetti , C. Della
3
2
Costanza , P. Cardelli
1
A.O. S. Andrea Roma
2
Dip. di Medicina Clinica e Molecolare, II Facoltà di
medicina e Chirurgia - Univ. Sapienza di Roma
3
BIOS SPA - Diagnostica di Laboratorio
Introduction.Plasma
cell
disorders(plasma
cell
dyscrasias) are uncommon but became more frequent
in the elderly people. They begin when a single
B lymphocytes starts to multiply excessively and
produces a large quantity of a single type of
antibody, the M-protein. Plasma cell dyscrasias include
multiple myeloma (MM) which is symptomatic debilitating
malignancy plasma cells disease as well as monoclonal
gammopathies of undetermined significance (MUGS)
which is asymptomatic with a stable M-protein levels lower
then 1.5 g/dL. Only the patients with MM develop cardiac
disorders or recurrent infections as well. Aims. The aim
of this study is to evaluate the serum concentration
of MR-ProANP(1-98) - the mid-regional portion of the
prohormone of the atrial natriuretic peptide(99-126) -,
MR-ProADM -the mid-regional portion of the prohormone
of adrenomedullin- and PCT which is a marker of
bacterial infections, in MM and MUGS patients as a
possible markers of clinical complications. Materials and
Methods. Blood samples were collected from 6 patients
with MM and from 7 patients with MGUS and serum
levels of Pro-ANP, Pro-ADM and PCT were assayed
(Brahms Kryptor). The Mann-Whitney(p<0.05) test was
used to compared results. The non parametric Spearman
test( p<0.05) was used to evaluate the significantly
correlations. Results. MR-ProANP and MR-ProADM
serum values are increased over the physiological
range only in subjects with MM. MR-ProANP serum
level is significantly higher (p=0.014) in patients with
MM (320.3±408.6 pmol/l) with respect to patients with
MGUS (76,65±42,91pmol/l) as well as MR-ProADM
which is significantly (p= 0.0082) increased in MM
(1.124±0.851pmol/l) vs MGUS(0,422±0,176pmol/l). PCT
values are in the physiological range in both groups. In
MM, a significant correlation MR-Pro-ANP vs MR-ProADM(p=0.001; r2=0.973) has been observed. Conclusion.
These preliminary results show: a) MR-ProANP and
MR-ProADM are selectively enhanced in serum of MM
patients indicating that these molecules could be used in
the follow up of these patients; b) if serum concentration of
MR-ProANP and MR-ProADM increase at an earlier step
of MUGS degeneration in MM they assays could assume
a great clinical relevance. Further studies are needed
to verify these finding. References. Multiple myeloma
involving the myocardium and coronary vessels
522
268
VALUTAZIONE PRELIMINARE DEL
SOFTWARE INTEGRATO MIDDLEWARE
PER L'INTERPRETAZIONE DEI TRACCIATI
ELETTROFORETICI
1
1
1
1
S. Calatroni , S. Gelsumini , E. Piazza , G. Asperti , S.
1
1
1
1
1
Conti , G. Gatti , E. Ferri , M. Biffi , A. Vernocchi
1
Servizio di Medicina di Laboratorio, A.O. Treviglio (Bg)
Il software Middleware (Sebia Italia srl, Vision Sisge srl)
è un sistema per interpretare i tracciati elettroforetici
che integra numerose regole per determinare variazioni
quantitative nelle diverse frazioni, insieme al sistema
Neurosoft per rilevare anomalie morfologiche del tracciato
sieroproteico.
Scopo di questo studio è stato confrontare i risultati
interpretativi dei tracciati forniti dal software integrato e
quelli ottenuti dal personale esperto del settore Proteine.
Sono stati presi in esame 10142 campioni sierici
consecutivi con richiesta di elettroforesi sieroproteica,
pervenuti al nostro laboratorio in un intervallo di tempo
di 2 mesi (aprile e maggio 2010). Tutti i campioni sono
stati sottoposti all'analisi mediante elettroforesi capillare
delle sieroproteine ed alla valutazione interpretativa del
tracciato secondo le procedure standard del laboratorio,
da parte di personale esperto. I tracciati sono stati, quindi,
trasferiti al software Middleware, rianalizzati e classificati
in 4 gruppi identificabili mediante valori (check) compresi
tra 0 e 3, corrispondenti rispettivamente all'assenza
di anomalie morfologiche e quantitative, presenza solo
di alterazioni quantitative, presenza solo di anomalie
morfologiche e contemporanea presenza di anomalie
morfologiche e quantitative.
Il personale esperto ha individuato 539 (5,3%)
tracciati patologici (presenza di componenti monoclonali,
CM), 2438 (24,1%) anomali (presenza di alterazioni
quantitative/morfologiche del tracciato) e 7162 (70,6%)
normali.
L'analisi mediante Middleware ha prodotto i seguenti
risultati: 97,9% dei tracciati patologici (CM) e 94,9%
dei tracciati anomali sono stati allertati dal sistema
(check 1-3), mentre il 55,6% dei tracciati normali è stato
classificato correttamente (check 0). La rielaborazione,
dopo la modifica di alcune regole del software, ha
permesso di ottenere una specificità del 62,2% senza
variazioni significative di sensibilità (97,6% nei patologici
e 92,5% negli anomali) che, tuttavia, potranno essere
implementate continuando a valutare in dettaglio le regole
applicate dal software.
269
THE SERUM LEVELS OF MR-proANP IN
PATIENTS HCV POSITIVE WITH AND WITHOUT
CRYOGLOBULINEMIA
2
2
2
1
P. Cardelli , F. Leone , G. Salerno , S. Battarelli , M.T.
2
1
2
2
Corsetti , A. Pennica , F. Capogreco , P. Iaquinto , G.
2
1
1
2
Ferranti , L. Portaro , F. Tabacco , P. Cipriani
1
A.O. S. Andrea Roma
2
Dip. di Medicina Clinica e Molecolare II Facoltà di
Medicina e Chirurgia - Univ. Sapienza di Roma
Introduction. Hepatitis C virus (HCV) is the main
etiologic agent of non-A, non-B chronic hepatitis. The
HCV is a significant clinical problem throughout the
world. About 85% of people infected with HCV develop
chronic infection, and approximately 70% of patients
develop histological evidence of chronic organ disease.
The virus infection, can cause cryoglobulinemia, kidney
and lymphoproliferative alteration function. The patients
with HCV can develop cardiac disorders. Cardiac
biomarkers can provide usefull prognostic information
in HCV infection. Aims. The aim of this study is to
evaluate the use of MR-proANP(1-98) , which is the
mid-regional portion of the prohormone of the active
atrial natriuretic peptide(99-126) as an earlier predictor
marker of cardiac impairment. Materials and Methods.
Blood samples were collected from 7 patients HCV
positive(GR1) with cryoglobulinemia and from 10 patients
HCV positive without cryoglobulinemia(GR2). The serum
levels of MR-proANP (Brahms, Kryptor) and HCVviremia (Cobas Amplicor HCV) were assayed. The ttest(p<0.05) and Mann-Whitney test(p<0.05) were used
to compared results. The Pearson test( p<0.05) was
used to value the significantly correlations. Results.
MR-Pro-ANP(physiological range <85.2 pmol/l) serum
levels were significantly higher(p=0.015) in patients
of GR1(143.3±41.95 pmol/l) respect to patients of
GR2(9.46±3.56 pmol/l). HcV-Viremia was significantly
(p=0.0001) increased in GR1(6.82*106±1.12*106 copies/
ml) vs GR2 (95424±17632 copies/ml). In GR1, a
significant high correlation MR-Pro-ANP vs HCV2
Viremia(p=0.00001;r =0.997) was observed. In GR2 MR2
Pro-ANP vs HCV-viremia (p=0.001; r =0.894) correlation,
in relation with the physiological levels of the MRPro-ANP, a cardiac damages for this group can be
excluded. Conclusions. MR-Pro-ANP in association with
HCV-viremia, appear new markers for the cardiac and
circulatory evaluation of the patients affections from HCV
with cryoglobulinemia.
References. J Card Fail. 2006 May;12(4):293-8.
Myocarditis and heart failure associated with hepatitis C
virus infection. Matsumori A, Shimada T, Chapman NM,
Tracy SM, Mason JW
270
UN UTILE ALGORITMO DIAGNOSTICO RELATIVO
ALLA TROPOMIOSINA: PANALLERGENE CROSSSENSIBILIZZANTE DEGLI INVERTEBRATI
1
1
1
L. Finaurini , G. Napoli , F.M. Mei
1
U.O. Allergologia, ASUR Marche ZT3, Fano (PU)
Le tropomiosine (TM) sono una famiglia di proteine
coinvolte nella contrazione muscolare. Ne esistono
varie isoforme che inducono la produzione di IgE
specifiche e responsabili di cross-reattività molecolare e
clinica tra invertebrati edibili (crostacei,molluschi)e non
(aracnidi,insetti,parassiti). La TM è allergene maggiore
dei crostacei, ma anche allergene minore degli acari,
perciò pazienti allergici ai crostacei possono avere un test
cutaneo positivo per acaro e viceversa. Si dosa in pazienti
con reazioni allergiche ai crostacei con sintomi clinici vari:
orticaria, SOA, shock anafilattico, e in quelli allergici ad
acari o perché presentano sintomi respiratori e cutanei
e talora sistemici in seguito ad ingestione di crostacei o
molluschi, o per valutare il rischio di tali reazioni, o per
prevedere l’efficacia dell'ITS.
Tra gli afferenti all’U.O. Allergologia dell’Ospedale di Fano
positivi allo screening inalatorio al prick test (SPT) per
acari, alcuni sono stati valutati con RAST (Phadia250) per
dosare sia estratti allergenici, sia 4 componenti molecolari
Der p1, Der p2 (all.maggiori acaro) Der p10 (TM all.minore
acaro), Pen a1 (TM all.maggiore dei crostacei). Individuati
pattern diversi di sensibilizzazione, è stato perfezionato un
algoritmo diagnostico in 4 punti che consente di operare
scelte terapeutiche appropriate.
Paz.1:rinite persistente. SPT per acari POS;RAST d1,d2
POS;all.maggiori degli acari POS;TM NEG. Diagnosi:
allergia ad acari, attualmente in trattamento con ITS.
Paz.2:rinite persistente, reazione da crostacei. SPT per
acari POS;RAST d1,d2,f24,p4,i6 POS;all.maggiori degli
acari NEG;TM POS. Diagnosi: sensibilizzazione a TM
quindi evitare l’ingestione di crostacei e molluschi.
Paz.3:reazione da crostacei. SPT per acari POS;RAST
d1,d2,f24,f37,p4 POS;all.maggiori degli acari POS;TM
POS. Diagnosi: polisensibilizzazione verso acari e TM.
Paz.4:reazione da crostacei. SPT per acari POS;RAST
d1,d2,f24 POS;all.maggiori degli acari NEG;TM NEG.
Diagnosi: polisensibilizzazione verso acari e crostacei
dovuta a componenti allergeniche minori degli invertebrati
(es. argininkinasi o la catena leggera della miosina
recentemente identificate).
523
271
CHARACTERIZATION OF THE BIOCHEMICAL,
BIOPHYSICAL AND STRUCTURAL PHENOTYPES
OF SEVEN PAH NATURAL VARIANTS
IDENTIFIED IN PATIENTS AFFECTED BY
HYPERPHENYLALANINEMIAS
1
2
2
2
M. Cerreto , P. Cavaliere , C. Carluccio , A. Zagari , A.
3
4
Daniele , F. Salvatore
1
CEINGE, Biotecnologie Avanzate, Napoli
2
CEINGE, Biotecnologie Avanzate, Napoli; Dip. Scienze
Biologiche, Univ. Federico II, Napoli
3
CEINGE, Biotecnologie Avanzate, Napoli; Dip. Scienze
Ambientali, SUN, Italy ; SDN-IRCCS, Napoli
4
CEINGE, Biotecnologie Avanzate, Napoli ; SDNIRCCS, Napoli
Hyperphenylalaninemias (HPA) comprise a group of
autosomal recessive disorders primarily due to mutations
in phenylalanine hydroxylase (PAH) gene. To date, more
than 500 mutations have been identified in PAH gene
responsible of HPA phenotypes with different degree
of severity. The aim of this study has been to provide
information about the effects of seven PAH mutations
previously identified, by our group, in Southern Italy
patients and their relationships with HPA disease. We
reproduced the PAH mutants in E. coli and expressed mg
amounts of full-length wild type and of mutant proteins.
We assessed the in vitro PAH enzyme activity, the
oligomerization equilibrium of the tetrameric enzyme and
the conformational stability of all recombinant proteins.
Each mutant showed peculiar features with a decreased
activity compared to the wild-type enzyme; also FPLC
chromatographic profiles, circular dichroism spectra and
thermal denaturation curves revealed differences in
the mutant enzymes compared to the wild type. Our
results support a correlation between the biochemical
phenotype of PAH mutant forms and their biophysical
behaviour that can explain the lower activity in vivo of
the mutants. In addition, our data suggest that defects in
the oligomerization and conformational stability of PAH
are among the most relevant causes of HPA disease.
Acknowledgement: Regione Campania (Convenzione
CEINGE-Regione Campania), GR 27/12/2007
524
272
URINARY NEUTROPHIL GELATINASE-ASSOCIATED
LIPOCALIN IN ADULT PATIENTS AFTER CARDIAC
SURGERY
1
1
1
2
C. Cosma , D. Faggian , M.M. Mion , R. Bianco , M.
1
1
1
Dept. Of Laboratory Medicine, Univ. of Padua, Italy
2
Dept. of Medical And Surgical Sciences, U.O.
Cardiosurgery, Univ. of Padua, Italy
Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) has
been proposed as an early marker of kidney injury. 36
adult patients (pts) submitted to cardiac surgery (CS)
(coronary artery by-pass, n=34; cardiac transplantation,
n=2) from April to June 2010 were enrolled. In urine
samples collected preoperatively (group A), immediately
post-CS (group B) and 2 (group C), 4 (group D) and 24
(group E) hours later, NGAL levels were measured using
an automated assay (Architect, Abbott Diagnostics). A
serum creatinine-based definition for Acute Kidney Injury
(AKI) has been adopted (increase in serum creatinine
from A values by>50% within 48 hours). Observed NGAL
levels (mean±SD, ng/ml): 14.89±16.21 (A), 75.92±136.79
(B) (NGAL A vs B, p=0.0488), 111.15±273.29 (C) (NGAL
A vs C, p=0.0414), 133.19±233.31 (D) (NGAL A vs
D, p=0.0083) and 51.55±85.35 (E). Serum creatinine
concentrations were similar in A and B samples
(84.48±19.94 vs 76.52±27.8 µmol/L) but increased in E
samples (101.29±51.67, p<0.0001). In six patients (17%)
developing postoperative AKI, a typical NGAL release
kinetic has been observed: low levels in A samples
(19.07±2121), a significant increase in B samples
(69.25±113.1), a peak in C samples (176.71±198.76),
consistently high concentrations in D (157.4±214.2) as
well as in E samples (134.38±170.3). Mean serum
creatinine values in A, the day of CS and E samples were:
87.75±27.61, 106±30.98 and 147.72±82.73 respectively.
In thirty patients (83%) not developing postoperative
AKI, the NGAL release kinetic was similar: low levels
in A samples (20.06±21.63), a significant increase in B
samples (78.42±148.02), a peak in C (104.74±296.06)
and consistently high values (127.3±246) in D samples,
but, differently from AKI group, a significant decrease
(35±38.24) in E samples were observed. In these patients,
the levels of creatinine in A, the day of CS and E
samples were 86.5±21, 69.89±22 and 84.3±24.71 µmol/
L respectively. In all adult patients submitted to cardiac
surgery, urinary NGAL levels suggest the development of
a renal failure: in 60% of patients developing AKI, higher
levels immediately after CS have been observed, even
if the great interindividual variability prevents to obtain a
statistically significant difference in values between AKI
and non-AKI patients.
273
ERM/DA 471: EXPERIENCE OF
RESTANDARDIZATION OF SENTINEL CYSTATIN C
ASSAY
1
1
1
274
RUOLO DEL DOSAGGIO DELLA ß2MICROGLOBULINA SIERICA IN SOGGETTI
PORTATORI DI UNA COMPONENTE
MONOCLONALE
1
C.A. Ferrero , F. Magro , S. Portaluppi , V. Maffulli , G.
1
Borsani
1
Sentinel CH. SpA
Objective: An International Reference Material for
Cystatin C (ERM/DA 471) was recently introduced.
This study describes the Target value transfer protocol,
the obtained results and provides a preliminary insight on
the impact of the new International Reference Material on
previously established reference range.
Materials/Instruments:
IFCC ERM/DA 471: material is available from IRMM;
assigned value is 5,48 mg/L (uncertainty 0,15 mg/L).
Cystatin C assay, SENTINEL CH., is a particle
enhanced turbidimetric immunoassay (PETIA). Abbott’s
ARCHITECT cSystems and AEROSET Systems are
random-access analyzers.
Design study:
Restandardisation Protocol: two phases restandardisation
protocol was defined. Phase1: ERM/DA 471 was tested
on triplicate over three independent runs. Mean of the
measured values was used to calculated the conversion
factor. Phase 2: a panel of human sera ranging from 0,50
mg/L to 5,95 mg/L was tested with ERM standardized
assay vs in-house standadised assay. ERM material must
be recovery after restandardisation 95 – 105%.
Normal reference range: 258 plasma samples from
healthy blood donors (Bayern Red Cross) were assayed
on the Architect cSystem in duplicate. The reference
range was defined at the 95% interval.
Results:
Restandardisation: mean of ERM/DA 471 was 4,90 mg/
L (n=9; CV% 0,94), thus the conversion factor resulted to
be 1,119.
Verification: Comparison of Restandardised assay vs in
house standardized assay (x) gave a slope of 1,10,
intercept +0,01, r=0,999, n = 70.
Recovery of ERM/DA 471 on restandardised assay was
98%.
Reference range [mg/L]
Overall analysis: (n=258) 0.31 to 0.99
Gender subgroups:
Male (74, age <50 years) 0,31 to 0,79; Male (62, age >50
years) 0,41 to 0,99
Female (62, age <50 years) 0,41 to 0,99; Female (60, age
>50 years) 0,40 to 0,93
Conclusion:
Restandardisation of Sentinel CH assay required a
conversion factor of x1,119 in comparison to the onthe-market in-house standardization. Comparison on
human sera confirmed the found conversion factor, hence
remarking the commutability with human sera.
New Reference range was established and found to be in
agreement with the previous published data and on the
current product claims.
1
1
1
1
G. Grandi , G. Avveduto , F. Fissi , A. Neri , V.
1
1
1
1
1
Sbolci , M. Brogi , F. Pirolo , P. Tozzi , A. Ognibene
1
Introduzione
La ß2-Microglobulina (ß2M), è una piccola proteina dal
peso di 11.8 KDa localizzata sulla superficie di tutte le
cellule nucleate. Poichè , a causa del suo peso molecolare
ridotto, il 95% della proteina libera viene filtrata dai
glomeruli renali, la misura della concentrazione sierica di
tale proteina è considerata un buon indice di disfunzione
renale. Un’elevata concentrazione plasmatica di ß2M,
in assenza di patologie renali, risulta essere correlata
alla presenza di patologie autoimmuni o linfoproliferative.
Lo scopo di questo studio è verificare l’utilità clinica
del dosaggio della ß2M in soggetti portatori di una
componente monoclonale in riferimento alla misura delle
Catene Leggere (K/λ) libere nel siero.
Materiali e Metodi
Sono stati selezionati in maniera casuale 146 pazienti (77
donne e 69 uomini, età media di 62,8 anni (DS +/- 12.8),
studiati dal 2008 al 2010, tutti positivi all’immunofissazione
ed esaminati per i seguenti test: ß2M, Creatinina,
Proteinuria di Bence Jones (BJ), Catene Libere K e λ.
Attraverso la misura della creatinina è stato stimato il
filtrato glomerulare (GFR) con la formula MDRD.
Risultati
Dei 146 soggetti, 37 presentavano proteinuria di BJ
positiva (BJP) e 109 negativa (BJN). La GFR è
risultata fisiologica in 126 soggetti. La curva ROC,
costruita assumendo come soggetti patologici i portatori
di proteinuria di BJ, ha evidenziato un’area sotto la curva
di 0.67 (95%, CI 0.57-0.77, p<0.005) e 0.61 (95%, CI
0.50-0.71, p=NS) per il rapporto rispettivamente K/λ e
ß2M.
Tra i pazienti con GFR normale, quelli BJN, avevano
valore patologico di ß2M nel 15.6% dei casi (15/96)
mentre quelli BJP lo avevano nel 26.6% (8/30). Tra i
pazienti con GFR alterato quelli BJN, avevano valore
patologico di ß2M nel 92.3% (12/13) e quelli BJP nel 85.7
% (6/7)
La differenza di performance dei due test studiati diventa
più ampia se si considerano solo i soggetti con funzionalità
renale diminuita, anche se la specificità diminuisce in
entrambi..
Conclusioni
Il dosaggio della ß2M risulta di scarsa utilità nei soggetti
con componente monoclonale e particolarmente nei
soggetti con concomitante valore patologico di GFR.
525
275
SCREENING DEL CARCINOMA COLON-RETTALE:
CONSIDERAZIONI SUL CUT-OFF
1
1
1
1
E. Grassi , F. Speziani , C. Romano , D. Folegatti
1
Lab. di Sanità Pubblica ASL Brescia
La DDG N°7248 del 2-07-2007 della Regione Lombardia,
così come le Linee Guida Nazionali ed Europee,
suggerisce l’utilizzo del cut-off di 100 ng/ml nel test
immunochimico di 1°livello per distinguere i campioni
negativi da quelli positivi.
Scopo
Il presente lavoro intende fare un’analisi dei risultati
del primo test di screening, in quei soggetti che
sottoponendosi al secondo test ( dopo due anni), risultano
positivi. Questo per verificare la percentuale di pazienti
che al primo test avevano valori di emoglobina fecale
vicino al cut-off.
Materiali e Metodi
Nel periodo giugno-luglio 2009 sono stati analizzati
presso il Laboratorio di Sanità Pubblica della ASL di
Brescia 7123 campioni di feci per la ricerca del sangue
occulto in soggetti rispondenti al programma di screening
del carcinoma colon-rettale. Sono risultati positivi 417
campioni di cui 307 avevano già eseguito il test due anni
prima (come previsto dal programma), con esito negativo.
Il metodo utilizzato nel LSP, è un metodo immunochimico
basato sulla reazione di agglutinazione con anticorpi anti
emoglobina umana assorbiti su particelle di polistirene, e
conseguente incremento dell’assorbanza a 570 nm.
Risultati
I 307 soggetti risultati positivi al secondo test di screening,
presentano una media di emoglobina fecale di 980.6
ng/ml e un range tra 100-19550. I campioni negativi
degli stessi soggetti eseguiti due anni prima (primo test)
presentavano una media di 44 ng/ml con un Range di
0-96. Di questi campioni negativi solo 5, pari al 1,6%,
avevano valori di emoglobina fecale superiori a 90 mg/ml.
Questi pazienti sono stati sottoposti a colonscopia che ha
dato esito negativo per due di loro, mentre per gli altri tre
è stata diagnosticata la presenza di polipi benigni.
Conclusioni
I dati analizzati confermano quanto già evidenziato in
altri studi e cioè che il sanguinamento della lesione
neoplastica è intermittente, che abbassando il cut-off a
90 ng/ml si creerebbe una situazione insostenibile per
i centri di secondo livello (colonscopie) che non viene
giustificato dal tipo di lesioni successivamente trovate
(per lo più benigne e non urgenti),con un peggioramento
complessivo del servizio.
Bibliografia
British Journal of Cancer (2009) 100, 259-265
526
276
INFLAMMATORY CYTOKINES IN FRACTURE
HEALING: INVOLVEMENT AND ANALYSIS
1
2
3
3
R. Zenobi , M.G. Giganti , A. Torriero , C. Rau , U.
3
Tarantino
1
Dept. of Int. Med. Tor Vergata Univ., Rome
2
Dept. of Experim. Med. and Bioch. Scien,, School of
Med., Tor Vergata Univ, Rome.
3
Univ. of Rome Tor Vergata, Faculty of Med. and
Surgery, “Polic, Tor Vergata” Foundation, Div. of Orthop.
and Traumatol.
The importance of the interplay of both skeletal
and immune systems is reflected by the emerging
interdisciplinary research field, called osteoimmunology,
focused on common aspects of osteology and
immunology. Many segnaling molecules, such as
transcription factors, membrane receptors, IL-6 and TNFα, are involved in the bone remodelling. The purpose of
this study was to evaluate markers of bone metabolism
and cytokines in patients with fragility fractures compared
to osteoporotic patients. We enrolled 37 subjects with
a femoral neck fracture and 47osteoporotic outpatients.
Blood samples are drawing 24h before and after surgery
(Group A) and at the first examination for outpatients
(Group B). All the patients underwent DEXA examination
(T-score <-2.5) to measure BMD. For bone metabolism
were measured Ca, P, vitamin D, PTH, CTX, ALP
and osteocalcin using ECL technology (Modular E,
Roche, Basel, Switzerland). IL-1, IL-6, TNF-α and IL-10
concentrations were evaluated by ELISA assay (R&D
Systems, Inc. Minneapolis, USA). Statistical analysis
were performed using t-test. Statistical differences were
observed in vitamin D, PTH and CTX concentrations.
Group A showed a decrease in Vitamin D (p<0.001)
whereas PTH and CTX were increase (p≤ 0.001).
About cytokine concentrations Group A (before surgery)
showed a significant increase in IL-6, TNF-α and IL-10
(respectively p<0.0001, p<0.0001 and p=0.01) respect
Group B. The different implant used lead to a change,
IL-6 and IL-10 increased after surgery in intramedullary
nail patients Vs prosthesis, significant difference were
respectively p<0.001 and p<0.05. The inflammatory
mediators are involved not only in several aspects of
physiological bone remodeling but also in pathological
bone disorders. The higher cytokines levels observed
in fractured patients suggest an inflammatory condition
which lead to bone weakness, this hypothesis may be
supported by the results obtained in Vitamin D, PTH
and CTX (1). The results obtained in surgery treatment
with prosthesis give a reduction in systemic cytokines
concentrations. Inflammatory cytokines could be used to
identify high-risk fracture patients, further study need to
confirm their role in fracture healing.
Bibliografia
1) Lacativa PG, Farias ML. Osteoporosis and
inflammation. Arq Bras Endocrinol Metabol. 2010
Mar;54(2):123-32
277
PROFILO SIEROPROTEICO NEI PAZIENTI AFFETTI
DA TUMORE AL COLON RETTO
1
1
1
2
D. Vannoni , E. Brogi , S. Giglioni , C. Scapellato , L.
2
1
3
3
Ghezzi , L. Micheli , S. Civitelli , G. Ugolini , R.
1
Leoncini
1
Dip. Medicinia Interna Scienze Endocrino Metaboliche
e Biochimica, Sez. Biochimica, Univ. di Siena, Siena
2
U.O.C. Laboratorio analisi cliniche, AOUS, Pol. Le
Scotte, Siena
3
Dip. Chirurgia, Univ. di Siena, Siena
L’elettroforesi delle sieroproteine rappresenta un metodo
molto utilizzato per l’ausilio alla diagnosi di numerosi
stati patologici, in primis per la ricerca delle componenti
monoclonali nel sospetto di mieloma multiplo o malattie
correlate (1), ma può essere richiesta, anche se
in maniera non strettamente appropriata, negli stati
infiammatori, infezioni acute o croniche, ecc.
Il tumore al colon retto è molto frequente nel mondo
occidentale e la ricerca di metodi predittivi della sua
insorgenza o prognostici, per seguirne il decorso, è di
grande interesse ed attualità.
Lo scopo dello studio è quello di confrontare il profilo
elettroforetico delle sieroproteine di soggetti controllo
(CTR) con quello di soggetti affetti da tumore colon
rettale (PZ), per ricercare anomalie nelle proporzioni
e nella distribuzione delle varie sottoclassi proteiche,
caratteristiche o, quantomeno, indicative della presenza
del tumore.
700 CTR, 350 maschi e 350 femmine (età media
60), erano reclutati tra donatori di sangue, e 100
PZ, 50 maschi e 50 femmine, (età media 70 anni),
erano ospedalizzati presso il Dip. di Chirurgia. I risultati
ottenuti mettono in evidenza notevoli differenze nelle varie
regioni del tracciato elettroforetico. I PZ mostrano una
diminuzione significativa delle proteine totali (p<0.001)
con un decremento dell’albumina (p<0.001), della regione
ß1 (p<0.05) e γ(p<0.01) ed un aumento delle frazioni
α1 (p<0.001), α2 (p<0.001) e ß2 (p<0.001), ovvero
delle proteine della fase acuta, coinvolte nei processi
infiammatori, necrotici e nelle infezioni. Tali variazioni
non sono correlate con lo stato di avanzamento della
patologia. La diminuzione dei livelli di albumina, anch’essa
associata alla presenza di uno stato infiammatorio, fa
presupporre un suo diretto coinvolgimento nella neoplasia
in crescita.
Questo studio rappresenta un tentativo di utilizzo di
questa comune tecnica diagnostica nel tumore colon
rettale, da eseguire sia come test predittivo di screening
o per monitorare l’efficacia del trattamento terapeutico.
Successivamente saranno oggetto di indagine anche altre
patologie neoplastiche.
(1) Kren D.F. Procedures for the evaluation of monoclonal
immunoglobulins. Arch. Pathol. Lab. Med. 1999: 123;
126-32
278
DETERMINAZIONE DEL NT-PROBNP COME
PARAMETRO DI VALUTAZIONE DEL RISCHIO
CARDIOVASCOLARE IN PAZIENTI SOTTOPOSTE A
RADIOTERAPIA TORACICA PER TUMORE DELLA
MAMMELLA SINISTRA : STUDIO RETROSPETTIVO
1
2
3
M.P. D'Errico , M.F. Petruzzelli , L. Grimaldi , R.
1
2
1
Placella , M. Portaluri , A. Monetti
1
U.O. Lab. Analisi d’Urgenza, Osp.”A.Perrino”, Brindisi
2
U.O. Radioterapia, Osp.”A.Perrino”, Brindisi
3
U.O. Fisica Sanitaria, Osp.”A.Perrino”, Brindisi
Sempre più numerose evidenze epidemiologiche provano
che la malattia cardiovascolare è frequentemente
correlata all'aumento della mortalità e morbilità nelle
pazienti sottoposte a radioterapia (RT) per il tumore al
seno dopo trattamento conservativo chirurgico.
Obiettivo del nostro studio retrospettivo è valutare
l’utilizzo della determinazione plasmatica della frazione Nterminale del Peptide natriuretico di tipo B (Nt-pro BNP)
come indicatore di rischio cardiovascolare radioindotto.
Materiali e metodi
Dopo accurata anamnesi sono state reclutate 25 pazienti
sottoposte a RT su mammella sinistra residua o su parete
toracica (età 42-82,media 56,04), escludendo le pazienti
con patologie renali; la determinazione di Nt-proBNP è
stata effettuata in un periodo post radioterapia compreso
tra i 2-22 mesi.
Come gruppo controllo sono state selezionate 6 pazienti
(età 44-71,media 58.5) sottoposte a RT su distretti
corporei non toracici (gruppo NT) in un periodo di 12-40
mesi successivi al trattamento e 12 pazienti oncologiche
(età 39-78,media 58,6) ancora non trattate con RT
(gruppo T0).
La determinazione del Nt-proBNP è effettuata
su analizzatore Roche Cobas con metodica
ECLIA,sensibilità analitica 5 pg/ml,v.n.<125 pg/ml.
Risultati
Tra i 25 casi analizzati 17 pz sono risultate negative
ed 8 pz positive (conc.>125 pg/ml;32% del totale);ad
eccezione di un caso per il quale si è verificato un evento
cardiaco estemporaneo,tutte le pz positive manifestano
l’innalzamento della conc.di Nt-proBNP a partire da 8 mesi
post terapia,in accordo con i dati attualmente disponibili in
letteratura in relazione all’irradiazione toracica.
Nei gruppi controllo tutti i campioni analizzati presentano
conc.di Nt-proBNP nei range di normalità.
Inoltre i valori di Nt-proBNP nelle pz trattate (media
103 pg/ml,mediana 85 pg/ml,1SD 85%) risultano
sensibilmente più alti (p=0.06) rispetto al gruppo controllo
(T0 + NT)(media 62 pg/ml,mediana 65 pg/ml,1SD 59%).
Conclusioni
La determinazione plasmatica del Nt-proBNP puo’
costituire un apprezzabile indice di incipiente patologia
cardiovascolare radioindotta e pertanto risultare utile nel
follow up delle pazienti sottoposte a radioterapia toracica
per tumore alla mammella.
Jingu K.Int.J.Rad.Onc.Biol.Phys. 2007;69:1417-1423
Kozak K.Lung Cancer 2008;62:351-355
527
279
ACE INSERTION/ DELETION POLYMORPHISM AND
LONGEVITY
1
1
3
3
280
APO E ALLELIC VARIANTS IN HEALTHY ELDERLY
PEOPLE
1
1
3
1
B. Lo Sasso , A. Caruso , S. Pinna , A. Mannu , G.
1
1
1
1
Bivona , V. Randazzo , L. Liga , L. Schillaci , R.
2
2
1
3
Tomaiuolo , G. Castaldo , M. Ciaccio , L. Deiana
1
Sezione di Biochimica Clinica e Medicina Molecolare,
Dip. di Biopatologia e Biotecnologie Mediche e Forensi,
Univ. degli Studi di Palermo
2
CEINGE Biotecnologie Avanzate, Naples, Italy, Dip. di
Biochimica e Biotecnologie Mediche , Univ. Federico II,
Naples, Italy
3
Dip. Scienze Biomediche, Univ. di Sassari, Italia
A. Caruso , B. Lo Sasso , E. Canu , C. Bellia , S.
3
1
1
3
Pasella , V. Lapaglia , L. Carnevale , A. Baralla , R.
2
2
1
3
Tomaiuolo , G. Castaldo , M. Ciaccio , L. Deiana
1
Sez. di Biochimica Clinica e Medicina Molecolare, Dip.
di Biopatologia e Biotecnologie Mediche e Forensi, Univ.
degli Studi di Palermo
2
CEINGE Biotecnologie Avanzate, Naples, Italy, Dip. di
Biochimica e Biotecnologie Mediche , Univ. Federico II,
Naples, Italy
3
Dip. Scienze Biomediche, Univ. di Sassari, Italia
Aim: Angiotensin I- Converting Enzyme (ACE) exists
mainly in the endothelial cells of the whole body and
plays an essential role in two physiological systems,
one leading to the production of angiotensin II (potent
vasoconstrictor) and the other to the degradation of
bradykinin. An insertion/deletion (I/D) polymorphism in
intron 16 of the human ACE gene has been reported to be
related to the levels of the circulating enzyme. A possible
relation between ACE polymorphism and longevity has
been studied and remain controversial1-2. Aim of our
study was to compare the frequency of ACE allelic
variants between a population of elderly subjects and
in a control group. Methods: 117 centenarians subjects
recruited from the Sardinia Centenarian AKeA project, and
136 control subjects were recruited and underwent clinical
examination and data collection. ACE polymorphisms
were determined by the polymerase chain reaction (PCR).
Qualitative data were compared between groups by
the #2 test. Results: Our results show a difference of
statistical significance between centenarians and control
group regarding on D/D variant frequency, which is more
represented in centenarians. I/D variant frequency is less
represented in centenarians. Conclusions: Although ACE
gene role in longevity remains controversial and the
sample size needs to be enlarged, our study suggests an
association between ACE polymorphism and longevity.
References :1 JK Yang, YY Gong, L Xie et al.
Lack of genetic association between the angiotensinconverting enzyme gene insertion/deletion polymorphism
and longevity in a Han Chinese population. Journal of the
Renine Angiotensin Aldosterone System, 2009; 10: 1158.
2 F Panza, A D’Introno, C Capurso et al. Lipoproteins,
vascular- related genetic factors and human longevity.
Rejuvenation research, 2007; 10:441- 58.
Introduction: In the quest to understand the biological
basis of human longevity, it can be supposed that
genes and biochemical markers could be implicated in
coronary artery disease (CAD), cerebrovascular disease
(CVD), and Alzheimer’s disease (AD) and may have a
role in human longevity. Among genetic markers, the
apolipoprotein E (APOE) gene has been widely examined
in different studies because of its well-documented
role in AD and vascular diseases. Apolipoprotein E
is a polymorphic glycoprotein that plays an essential
role related to binding to receptors for the uptake of
Chylomicrons and VLDL remnants and of LDL. The
three ApoE major isoforms are E3 (Cys112/Arg158), E4
(Arg112/Arg158) and E2 (Cys112/Cys158). In the healthy
528
population, the presence of ε4/ε4 homozygote genotype
is associated with an increased risk of Alzheimer's
disease (AD)(1). Bennet et coll.(2) conducted a detailed
analysis about relationship of apoE status, lipid levels,
and coronary outcomes. They showed approximately
linear relationships of apoE genotypes (when ordered ε2/
ε2, ε2/ε3, ε2/ε4, ε3/ε3, ε3/ε4, ε4/ε4) with LDL-C levels
and CAD risk. Aim of the study was to verify the
frequencies of APO E allelic variants in a healthy elderly
population. Methods: 71 centenarians subjects (range
100-104 years) and 97 control subjects (range 90-99
years) were recruited from the Sardinia Centenarian
AKeA project and underwent clinical examination and
data collection. ApoE polymorphisms were determined by
Real Time-PCR. Qualitative data were compared between
groups by the #2 test. Results: Our results reveal that
ApoE2 ε2 allele frequency shows a marked increase after
100 years old and confirms the hypothesis that this allele
is related to longevity. Conclusions: Our results confirm
the hypothesis of a probable link between ε2 allele and
longevity and focus the attention on possible mechanisms
underlying this link.
References
1 OY Bang, YT Kwak, IS Joo et al. Important Link
Between Dementia Subtype And Apolipoprotein E: A
Meta-Analysis. Med J, 2003; 44: 401-413.
2 AM Bennet, E Di Angelantonio, Z Ye et al. Association
Of Apolipoprotein E Genotypes With Lipid Levels And
Coronary Risk. JAMA, 2007; 298: 1300-1311.
281
DOSAGGIO DELLA VITAMINA D IN
CHEMILUMINESCENZA (Liaison DIASorin)
E PATOLOGIE CONNESSE. ESPERIENZE E
CONSIDERAZIONI NELLA POPOLAZIONE
BRINDISINA
1
1
1
1
282
NGAL: MARCATORE PRECOCE DI DANNO RENALE
IN CARDIOCHIRURGIA
1
1
M. Scoditti , A. Sanasi , F. Pedali , T. Voi , L. Poci
1
Lab. di Patologia Clinica Territoriale e Tossicologia "A.
Di Summa", Brindisi
La vitamina D è presente in natura in 2 forme:
ergocalciferolo o vitamina D2 presente in pochi
alimenti e calciferolo o vitamina D3 che viene
sintetizzata nella pelle dalla luce solare. Un’adeguata
esposizione al sole garantirebbe l’80% del fabbisogno
di vitamina D. Il restante 20% potrebbe essere
assicurato dall’alimentazione. Considerati i limiti alla
sintesi endogena della vitamina D3 (ridotta esposizione
al sole, uso di creme solari, ecc.) e la scarsa reperibilità
nell’alimentazione possiamo comprendere la ragione
della diffusione della condizione di ipovitaminosi D in
Italia. La forma metabolicamente attiva di vitamina D si
trova in circolo legata alla proteina DBP e che raggiunge
numerosi organi bersaglio su cui agisce legandosi allo
specifico recettore nucleare VDR, in grado di regolare
l’espressione di circa 500 geni. Per questo motivo,
lo status della vitamina D è correlata ad un elevato
rischio di patologie extra-scheletriche, quali ipertensione,
malattie cardiovascolari, cancro, sclerosi multipla, artrite
reumatoide ed altre malattie autoimmuni. Nel Laboratorio
di Patologia Clinica Distrettuale e di Tossicologia “Di
Summa” di Brindisi la vitamina D viene dosata con
lo strumento Liaison Diasorin secondo il metodo della
chemiluminescenza diretta a 2 fasi. Lo scopo del nostro
studio è stato quello di stabilire i nuovi range di riferimento
di vitamina D per la popolazione brindisina. Nel nostro
laboratorio nel 2009 sono stati effettuati 300 dosaggi di
vitamina D. Prima di effettuare questo studio, i valori di
riferimento da noi utilizzati erano 9,0-55,0 ng/ml, valori
non conformi con quanto riportato in letteratura. Infatti, dei
300 dosaggi, 32 risultavano fuori range, in particolare 22
per ipovitaminosi e 10 per ipervitaminosi. I valori superiori
a 49 non sono stati presi in considerazione perché 15
campioni cadono nel range 50- 100 ng/ml e solo 2 sono
maggiori di 100 ng/ml.
Dalla valutazione statistica è emerso che la frequenza più
alta per valori di vitamina D è intorno a 23 ng/ml che è
stato fissato come limite minimo. Il limite massimo, invece,
in accordo con i dati in letteratura, è stato fissato a 100
ng/ml.
Wolf M, Shah A, Gutierrez O, et al.Vitamin D
levels and early mortality among incident hemodialysis
patients.Kidney Int 2007;72:1004 –13
2
1
1
E. Frati , R. Daverio , E. Bignami , G. Marino , F.
2
Ceriotti
1
Terapia Intensiva Cardiochirurgica, Istituto Scientifico
Univ. S. Raffaele, Milano
2
Diagnostica e Ricerca S. Raffaele, Istituto Scientifico
Univ. S. Raffaele, Milano
Scopo: NGAL (Neutrophil Gelatinase-Associated
Lipocalin) è tra i più promettenti nuovi marcatori precoci
di danno renale acuto. NGAL è fisiologicamente espresso
dai neutrofili e da molte cellule epiteliali tra cui le cellule
tubulari renali e la sua espressione a livello renale
aumenta molto in seguito ad insulti di tipo tossico o
ischemico. Questo marcatore può essere misurato sia su
plasma che su urina.
Materiali e Metodi: Sono stati reclutati 27 pazienti (età
63,70±13,011; creatininemia preoperatoria 1,01±0,29;
frazione d’eiezione 56,44±11,20) sottoposti ad intervento
cardiochirurgico ad elevato rischio di insufficienza
renale acuta (interventi combinati, reinterventi) ed è
stato in questi pazienti misurato NGAL urinario prima
dell’induzione dell’anestesia generale, all’arrivo in terapia
intensiva e a distanza di 24 ore.
Risultati: Tra i 27 pazienti analizzati, 5 hanno
sviluppato insufficienza renale acuta secondo il criterio
R di RIFLE, nessuno ha avuto necessità di dialisi
e nessuno è deceduto. L’NGAL urinario basale è
associato al diametro telediastolico all’ecocardiogramma
transesofageo preoperatorio (p=<0,01). L’NGAL urinario
all’arrivo in terapia intensiva è associato alla degenza
ospedaliera postoperatoria (p= 0,043), mentre il valore
a 24 ore dall’intervento è associato alla durata della
degenza in terapia intensiva (p= 0,02) e al picco
postoperatorio di creatinina (p=0,019).
Discussione: Essendo associato al picco postoperatorio
di creatinina e alla durata della degenza in ospedale,
NGAL urinario si conferma anche nella nostra casistica un
promettente marcatore di danno renale acuto.
529
283
PURINE METABOLISM IN COURSE OF RELAPSINGREMITTING MULTIPLE SCLEROSIS: A CASECONTROL STUDY
1
1
1
M.C. Gueli , V. Cusimano , M.A. Mazzola , P.
1
1
Ragonese , G. Salemi
1
Dip. Biomedicina Sperimentale e Neuroscienze Cliniche
(BioNEC), Univ. degli Studi di Palermo
Changes of plasma and cerebrospinal fluid related
to uric acid (UA) and oxypurine concentrations have
been reported in course of relapsing-remitting Multiple
Sclerosis (RRMS). These metabolites have been
explained as markers of oxidative stress or of substained
purine catabolism possibly due to imbalance in ATP
homeostasis.
To compare the plasma concentration of adenine,
guanine, hypoxanthine (HX), xanthine (X) and UA
between RRMS patients in a phase of clinical stability and
healthy controls.
They had not to be habitual smokers, drinkers and
had to avoid foods rich in proteins two days before
of venipuncture. Plasma samples were deproteinized
through a Millipore-Amicon Ultracel and directly injected
onto the HPLC column. The Waters-HPLC with a
Photodiode Array Detector system consisted of a 600E
Pump; Temperature Control Module; Empower TM2 DS;
W-AtlantisT3 column. The mobile phase was potassium
phosphate buffer (pH 2.5) and the optimal wavelength was
254nm.
We actually included 5 patients with RRMS (3 females and
2 males, median age 38 years min 18 max 67; median
disease duration 3 years, min 1 max 40; median EDSS
2.5, min 1,0 max 5,0) and 11 healthy controls. We found in
RRMS patients an increase of mean HX (RRMS 4.31 µM,
controls 2.33 µM, p = 0.0027) and of mean X (RRMS 1.50
µM, controls 1.10 µM, p = 0.027). The t-area of (adenine
+ guanine) was higher in RRMS group, but the difference
was not statistically significant. UA concentration and the
sum of HX + X + UA did not differ between the two groups.
Our preliminary results do not confirm in RRMS patients
a change of UA concentration, in a phase of clinical
stability, but a selective increase of the HX, X, adenine
and guanine. These changes more than expression of an
increased release of HX and X through the adenosine-touric-acid cascade might be the outcome of the accelerated
breakdown of AMP to HX in hypoxic state. We think
that salvage of HX to IMP is reduced as is the further
oxidation of HX and X to UA by a slowdown of the xanthine
oxidase activity. Clearly these speculations await further
experimental investigation.
530
284
AUMENTO DEI LIVELLI PLASMATICI DI
DIMETILARGININA ASIMMETRICA (ADMA)
IN PAZIENTI POST ENDOARTERECTOMIACAROTIDEA
1
2
3
B. Scanu , A. Zinellu , R. Ginanneschi , S.
3
1
1
1
Magliona , S. Pinna , M.A. Pnna , E. Canu , L.
1
1
Deiana , C. Carru
1
2
3
La restenosi è una complicanza che può presentarsi in
seguito ad intervento di endoarterectomia della carotide
(CEA) o ad altro tipo di manipolazione dell’arteria.
Diversi fattori concorrono nel restringimento o nel
blocco della arteria carotidea ma quello considerato
prevalente è causato da un iniziale danno endoteliale, che
vede coinvolti numerosi elementi cellulari nel processo
fibroproliferativo e infiammatorio. Lo scopo del nostro
lavoro è stato quello di indagare la eventuale presenza di
associazione tra i livelli plasmatici di marcatori circolanti di
danno endoteliale quali la arginina dimetilata asimmetrica
(ADMA) plasmatica e il restringimento carotide postopertatorio. Nel nostro studio sperimentale, mediante
l’utilizzo della elettroforesi capillare con detector UV,
abbiamo effettuato le misura delle Arginina, ADMA
e SDMA plasmatiche in 68 pazienti precedentemente
sottoposti ad intervento chirurgico di endarterectomia
carotidea. Sono state effettuate inoltre le determinazione
dei livelli plasmatici della cisteina e della omocisteina.
L’analisi di Pearson’s mostra una correlazione postiviva
tra i livelli di ADMA e il grado di restringimento
della carotide post intervento (r=0.37, P=0.003), dato
confermato anche dal test statistico della analisi
di regressione lineare multipla. I livelli di ADMA
plasmatica erano significativamente associati con la Hcy
(r=0.40, P=0.001) ed in misura minore, anche se non
statisticamente significativa con la Cys (r=0.23, P=0.07).
I nostri dati suggeriscono che il livelli plasmatici di ADMA
sono coinvolti con il grado di restringimento delle carotidi
post-endarterectomia suggerento che questa molecola
potrebbe avere un ruolo importante negli eventi che
portano a restenosi. In conclusione, abbiamo rilevato che
i livelli di ADMA plasmatica sono correlati con il grado
di restringimento carotidea post intervento chirurgico. Il
risultato del nostro studio suggeriscono che focalizzando
l’attenzione sulle modalità di trattamento anche sui
meccanismi coinvolti nell’accumulo dell’ADMA si potrà
beneficiare di una riduzione del restringimento o della
prevenzione della restenosi.
285
SERUM NEUTROPHIL GELATINASE-ASSOCIATED
LIPOCALIN AND CYSTATIN C: ARE THEY
PREDICTIVE BIOMARKERS OF ACUTE KIDNEY
INJURY FOLLOWING PERCUTANEOUS CORONARY
INTERVENTION?
1
1
1
2
M. Dessi , M.T. Caliò , M. Iozzo , V. Bernardo , F.
2
2
1
Tomai , A. Petrolini , G. Federici
1
Dept. Medicine of Laboratory, Tor Vergata University,
Rome
2
Dept. Cardiovascular Sciences, European Hospital,
Rome
Contrast-induced acute kidney injury (CI-AKI) is
associated with prolonged hospital stay and unfavourable
early and late outcome following percutaneous coronary
intervention (PCI). Recent studies have shown that
neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) and
cystatin C (Cys C) are more sensitive than sCr for early
detection of acute changes in renal function. Thus, aim of
this pilot study was to assess whether changes in NGAL
and Cys C serum levels are reliable indicators for an early
diagnosis of CI-AKI following PCI, in patients with normal
or impaired renal function.
We enrolled 36 patients undergoing PCI (M/F 26/10; age
71±10 years), 19 with normal renal function and 17 with
chronic kidney disease (estimated glomerular filtration
rate, eGFR <60 ml/min). NGAL (point-of-care kit–Triage,
Biosite Incorporated), Cys C and sCr were assessed
at baseline and respectively at 6, 12, 24 hours, at 12,
24, 48 hours, and at 24, 48 and 72 hours after PCI.
CI-AKI was defined as a sCr increase ≥ 0.3 mg/dl at
48 hours after PCI. The best NGAL and Cys C cutoffs
for the early identification of patients at risk for CI-AKI
were a concentration > 60 ng/ml at 12 hours (negative
predictive value 86%, positive predictive value 28%) and
respectively, an increase concentration ≥ 10% at 24 hours
(negative predictive value 88%, positive predictive value
50%).
At 48 hours after PCI, CI-AKI (sCr increase ≥ 0.3 mg/
dl) occurred in 8 patients (22%). A statistically significant
association was detected between sCr increase at 48
hours and Cys C increase at 24 hours (p= 0.01), but not
between sCr and NGAL increase at 12 hours (p= 0.3).
Cys C at 24 hours was also predictive of CI-AKI both
in patients with normal renal function (p= 0.07) and in
those with eGFR <60 ml/min (p= 0.05). Conversely, NGAL
at 12 hours failed to predict CI-AKI both in patients with
normal and reduced renal function (p= 0.7 and p= 0.2,
respectively).
Cys C seems to be a reliable marker for the early
diagnosis of CI-AKI in patients undergoing PCI. Further
studies are warranted to establish the role of serum
NGAL in this setting. Devarajan P. Review: neutrophil
gelatinase-associated lipocalin: a troponin-like biomarker
for human acute kidney injury. Nephrology (Carlton). 2010
Jun;15(4):419-28.
286
DOSAGGIO DEL BETA-CTX SIERICO NEI PAZIENTI
AFFETTI DA NEOPLASIE EPITELIALI CON E SENZA
METASTASI OSSEE
1
2
2
3
T. Suppa , G. Lobreglio , S. Circhetta , A.S. Anastasia
1
Lab. Analisi Cliniche, Clinic-Lab, Leverano (Le)
2
U.O. Medicina di Laboratorio, A.O. Card G Panico,
Tricase (Le)
3
U.O. Medicina Nucleare, A.O. Card G Panico, Tricase
(Le)
Backgraund e scopo. I CrossLaps o CTX sono
peptidi costituiti da una seguenza di 8 amminoacidi
(EKAHDGGR) dell'estremità carbossi-terminale della
catena α1 del collagene di tipo 1, che aumentano nel
siero in caso di elevato riassorbimento osseo fisiologico
e/o patologico; i peptidi contenenti l'isomero ß dell'acido
aspartico sono considerati accurati marcatori biochimici di
elevato turnover osseo.
Pertanto abbiamo valutato la concentrazione del ß-CTX
sierico in pazienti affetti da neoplasie epiteliali sottoposti
a scintigrafia ossea per la ricerca di eventuali metastasi
osee, condizione clinica caratterizzata da un elevato
riassorbimento osseo nelle sedi delle lesioni metastatiche.
Materiali e metodi. E' stata valutata la concentrazione
del ß-CTX in 117 pazienti affetti da neoplasie epiteliali.
Tutti hanno eseguito la scintigrafia ossea "whole body"
99
con Tc -HMDP presso il reparto di Medicina Nucleare
dell'A.O. "Card. G. Panico" di Tricase tra Gennaio e
Novembre 2009.
Il dosaggio del ß-CTX è stato effettuato mediante
il saggio "Serum CrossLaps ELISA" (Pantec S.r.L.,
Torino), il cui metodo è basato sull'uso di due anticorpi
monoclonali altamente specifici, diretti contro la sequenza
amminoacidica EKAHD-ß-GGR.
Sono stati infine calcolati gli indici di efficienza diagnostica
VPP, VPN, sensibilità e specificità.
Risultati. La scintigrafia ha evidenziato la presenza di
metastasi ossee in 64 pazienti (54%). La concentrazione
di ß-CTX sierico è risultata elevata (>200 pg/ml) in
62 pazienti con metastasi (96%) e in 8 pazienti
senza metastasi ossee (7%) con sensibilità=0,96,
specificità=0,84, VPN=0,95, VPP=0,88, accuratezza
diagnostica=0,91.
Conclusioni. Dai dati è emerso che la concentrazione
del ß-CTX aumenta in modo statisticamente significativo
in pazienti con metastasi ossee derivanti da neoplasie
epiteliali rispetto ai pazienti oncologici senza neoplasie
ossee. Il dosaggio del ß-CTX, pertanto, potrebbe
costituire un utile marcatore biochimico per la valutazione
della presenza di metastasi ossee nei pazienti affetti da
neoplasie.
Bibliografia. Evidence-based guidlines for the use of
biochemical markers of bone turnover in the selection and
monitoring of bisphosphonate treatment in osteoporosis:
a consensus document of the Belgian Bone Club. Int J
Clin Pract, 2009.
531
287
SIGNIFICATO CLINICO DEL DOSAGGIO DELL'ALFA
FETOPROTEINA IN GRAVIDANZA: STUDIO
PROSPETTICO SU 139.000 GRAVIDANZE AD ESITO
NOTO
1
1
1
D.C. Dall'Amico , C. Bollati , E. Muccinelli , E.
1
1
1
2
Pavanello , V. Guaraldo , I. Dusini , E. Viora , A.
1
2
2
2
Sciarrone , S. Bastonero , E. Gullino , P. Gaglioti
1
SS Screening Anomalie Cromosomiche, Lab. Analisi,
Dip. Diagnostica e Servizi, AO OIRM-Sant'Anna, Torino
2
SSD Ecografia e Diagnosi Prenatale, Dip. Ostetricia e
Neonatologia, AO OIRM-Sant'Anna, Torino
Objective. In recent years the combined test has shown
to be an efficient screening test for Down’s syndrome
and has largely replaced the triple-test which includes
maternal serum alpha-fetoprotein (MS-AFP) estimation
for open spina bifida (OSB) risk evaluation, when
individual level is compared with median level in the
corresponding gestational age and reported as MoM
(Multiple of the Median), adjusted by maternal weight
and race. In the general population 2.5 MoM threshold
gives an efficient screening results (FPR <3%, DR >95%).
Guide lines of both American College and Canadian
Society of Obstetrics and Gynaecology suggest anyhow
to test MS-AFP at 15-18 weeks for OSB. Is it a useful
advice also for Italian women?
Methods. We reviewed results of 39.131 women who
received whole prenatal care (including first trimester
ultrasound examination for gestational age, triple-test
at 15-18 weeks, mid-trimester ultrasound screening for
foetal structural anomalies) in Sant’Anna Hospital since
2003 to 2007. Wallac Perkin Elmer AutoDelfia platforms
and LMS Alpha software were our methods. MS-AFP
≥ 2.5 MoM was reported for 289 women (high risk
group) and 2.0 ≤ MS-AFP ≤ 2.49 MoM for 569 (middle
risk group). No invasive diagnostic test was offered but
diagnostic ultrasound examinations were performed for
everyone, and also uterine artery Doppler in high risk
group. Complete follow up is available for all cases.
Results. All 10 OSB cases were detected. Spontaneous
miscarriages happened in 44 cases, foetal deaths in
4 cases. Pre-eclampsia developed in 50 cases and
newborns had mean weight lower than mean Italian one.
Conclusions. OSB has a low prevalence and ultrasound
examination is a good diagnostic tool in women with high
and middle risk, but MS-AFP ≥ 2.0 MoM identifies a
population with increased risk of obstetric complications.
Positive rate is low (2.2%), and diagnostic test are noinvasive ones, so uterine artery Doppler should be usefully
offered to all women with MS-AFP ≥ 2.0 MoM, to direct
clinical management in a group with high prevalence of
hypertensive disorder.
Reference. Gagnon A, Wilson RD, Audibert F et al.
Society of Obstetricians and Gynaecologists of Canada.
Obstetrical complications associated with abnormal
maternal serum markers analytes. Review. J Obstet
Gynaecol Can. 2008;30(10):918-49.
532
288
ANISAKIDOSI E DOSAGGIO DELLE IGE SPECIFICHE
1
1
1
2
E. Farnocchia , M. D'Anzeo , B. Cinti , S. Veccia , A.
2
1
Giacometti , M. Tocchini
1
Lab. Analisi, A.O.U. Ospedali Riuniti, Ancona
2
Clinica Malattie Infettive, Univ. Politecnica delle
Marche, Ancona
L’Anisakis simplex è un parassita che può infestare
l’uomo a seguito di ingestione di pesce crudo o non ben
cotto. I prodotti ittici dei mari italiani più frequentemente
parassitari sono sardine, acciughe, sgombri, totani,
calamari,.. L’uomo che si ciba di pesci infestati si
comporta da ospite accidentale: la larva non si sviluppa
ulteriormente, ma può rimanere vitale nell’apparato
digerente, invadere e/o penetrare la mucosa gastrica o
intestinale. La manifestazione clinica è riconducibile a
una sindrome del colon irritabile o manifestarsi con dolori
addominali, nausea, vomito e occasionalmente febbre. Si
possono verificare anche casi di reazioni allergiche. La
diagnosi viene confermata con rilievo endoscopico di cisti
del parassita nella mucosa del duodeno.
La ricerca di IgG anti-Anisakis mediante tecniche Elisa
e Western Blot è attualmente in uso solo in pochi centri
specializzati. Più accessibile anche se meno specifica è
la differenziazione e titolazione di IgE anti-Anisakis che
rileva spesso livelli significativi in corso di infestazione.
Presso l’ambulatorio della Clinica Malattie Infettive
di Ancona si sono presentati, in tempi diversi,
due soggetti, un uomo di 54 anni ed una donna
di 63. Entrambi lamentavano malessere e turbe
gastrointestinali; riferivano frequenti pasti a base di pesce
marinato o poco cotto; gli esami ematochimici rilevavano
una modica eosinofilia ed incremento delle IgE totali; il
successivo dosaggio delle IgE specifiche per Anisakis s.
(ImmunoCAP-Phadia) evidenziava valori rispettivamente
di 5,4 kUA/l e 2,2 kUA/l. I pazienti venivano trattati con
Albendazolo al dosaggio di 400 mg, 2 volte al giorno, per
4 settimane, con la conseguente totale scomparsa della
sintomatologia.
Conclusioni: L’utilizzo di una metodica per la
determinazione di anticorpi verso antigeni allergizzanti,
nel caso dell’infestazione da Anisakis, ha svolto anche
un ruolo diagnostico; in attesa di metodi diagnostici
sierologici mirati, il dosaggio delle IgE specifiche potrebbe
essere considerato un esame di primo livello ponendo
l’indicazione all’ indagine endoscopica per conferma
diagnostica.
289
INFEZIONI DA MEZZI IMPIANTABILI E
IGE SPECIFICHE PER ENTEROTOSSINE
STAFILOCOCCICHE
1
1
1
290
ANTI-TNFα THERAPY MODULATES STORED
BODY IRON SERUN MARKERS IN INFLAMMATORY
BOWEL DISEASE PATIENTS
2
E. Farnocchia , M. D'Anzeo , B. Cinti , S. Veccia , A.
2
1
Giacometti , M. Tocchini
1
Lab. Analisi, A.O.U. Ospedali Riuniti, Ancona
2
Clinica Malattie Infettive, Univ. Politecnica delle
Marche, Ancona
Negli ultimi anni a seguito dell’utilizzo sempre più
frequente di mezzi impiantabili (protesi articolari,
vascolari, mammarie, PMK, CVC,…) si osservano spesso
infezioni correlate a tali impianti. Queste infezioni
presentano difficoltà di trattamento non solo dovute
all’ambiente creato dalla presenza del mezzo di sintesi
(biofilm, scarsa diffusibilità locale degli antibiotici), ma
anche alla difficoltà di isolare l’agente causale. Ciò
condiziona il tipo di trattamento a tal punto che spesso si
deve ricorrere ad una terapia empirica. Quando si ottiene
un isolamento colturale, nella maggior parte dei casi sono
coinvolti agenti Gram positivi. Nel caso in cui non si
ottenga alcun isolamento, la terapia è comunque volta
alla copertura dai Gram positivi, soprattutto stafilococchi
e streptococchi. Il trattamento di infezioni streptococciche
non incontra generalmente particolari difficoltà grazie alla
scarsa resistenza agli antibiotici; gli stafilococchi invece,
sviluppano spesso resistenze multiple o le acquisiscono
in corso di trattamento. Da qui la necessità di avere
informazioni specifiche sugli agenti causali, in modo da
poter trattare il paziente con farmaci ben tollerati, meno
costosi e/o somministrabili per o.s.
Caso clinico: Una donna di 75 anni veniva ricoverata
con una infezione di protesi completa del ginocchio
destro: presentava febbre elevata, prurito ed eritema,
accompagnati da modica eosinofilia; veniva effettuato un
PRIST che rilevava un marcato incremento delle IgE totali;
veniva successivamente effettuato il dosaggio di IgE
specifiche verso le tossine stafilococciche (enterotossina
A, B, C e TSST); anche in questo caso il valore
delle IgE risultava marcatamente positivo verso tutte
le 4 enterotossine dosate. Il conseguente trattamento
con farmaci di sicura efficacia verso stafilococchi
multiresistenti portava al progressivo miglioramento della
flogosi locale e alla scomparsa di eritema e febbre.
Conclusioni. La ricerca di anticorpi IgE diretti verso
frazioni antigeniche può in alcuni casi identificare
indirettamente agenti infettivi, soprattutto in casi di
infezioni che si protraggono da tempo, e rivelarsi preziosa
per ottenere informazioni che, in alcuni casi, non vengono
fornite da indagini microbiologiche mirate e spesso
ripetute.
1
1
1
2
R. Rigolini , P. Giubbilini , B. Rampoldi , C. Testa , L.
3
2
4
2
Pastorelli , L. Spina , G.E. Tontini , N. Munizio , C. De
5
3
1
Salvo , M. Vecchi , E. Costa
1
Serv. Med. Lab., IRCCS Polic. San Donato, San
Donato Milanese (MI), Italy
2
Gastroent. and Gastroint. Endoscopy Unit, IRCCS
Polic. San Donato, San Donato Milanese (MI), Italy
3
Dept. Med. and Surgical Scienc., Univ. of Milan, Milan,
Italy
4
Dept. Med. and Surgical Scienc., Univ. of Bologna,
Bologna, Italy
5
Dept. Path., Case Western Reserve Univ. Cleveland,
OH, USA
Aim of the study: Inflammatory Bowel Diseases (IBD),
namely Crohn’s Disease (CD) and Ulcerative Colitis (UC)
are chronic, relapsing conditions characterized by an
imbalance between pro- and anti-inflammatory mediators
within gut mucosa, leading to a chronic intestinal immune
activation. Consequent intestinal inflammation may cause
nutrient malabsorption and chronic loss of blood from gut
mucosa. Thus, IBD patients often present iron deficiency
and alterations of iron markers leading to anemia or other
clinical conditions. Infliximab (IFX) is a chimeric anti-TNFα
monoclonal antibody, currently used as a therapeutic
option in moderate to severe IBD. Indeed effective
in inducing remission or reducing disease activity, the
blockade of TNFα acts at different levels, which are yet
to be fully characterized. Aim of the present study is to
evaluate if IFX therapy exerts direct effects of on stored
body iron in IBD patients.
Materials and methods: Serum was collected from 14
IBD patients (8 CD, 6 UC), before each IFX infusion,
for the first 3 infusions of the therapeutic regimen.
Serum ferritin was determined by a solid-phase twosite chemiluminescent immunometric assay (IMMULITE
2000 – SIEMENS), instead transferrin and CRP levels
were measured by a immunoturbidimetric and iron by
a colorimetric assay (COBAS c – ROCHE/HITACHI
SYSTEMS). Statistical analysis was performed by means
of paired Student’s t test.
Results: Serum iron significantly increased between
the first and the third IFX infusion (36.71±11.98
vs. 48.14±19.51 µg/dl, p<0.05), as well as serum
total transferrin (202.57±43.11 vs. 252.29±39.90 mg/
dl, p<0.01); CRP was significantly reduced (2.06±2.26
vs. 0.49±0.52 mg/dl, p<0.05), while a trend towards
ferritin decrease was detectable, although not significant
(64.14±71.50 vs. 27.50±30.80 ng/ml, p=0.06).
Conclusions: Taken together, our data show that antiTNFα therapy significantly modifies serum markers of
stored body iron, suggesting that, inducing mucosal
healing, IFX may restore iron absorption and reduce
intestinal iron loss, but also it may directly modulate
the cytokine network regulating iron metabolism in the
reticuloendothelial system.
533
291
ANALISYS OF OXIDATIVE BURST ACTIVITY
(PHAGO BURST TEST) IN 20 PATIENTS AFFECTED
BY MULTIPLE CHEMICAL SENSITIVITY (MCS)
1
1
1
M.G. Buccheri , M. Caruso , P.L. Di Giuseppe , A.
1
1
Pennisi , G. Tringali
1
Istituto Ricerca medica Ambientale - Acireale (Catania)
Multiple chemical sensitivity (MCS) is a "chronic, recurring
disease caused by a person's inability to tolerate an
environmental chemical or class of foreign chemicals".
MCS has also been described as a group of "sensitivities
to extraordinarily low levels of environmental chemicals"
appearing "to develop de novo in some individuals
following acute or chronic exposure to a wide variety
of environmental agents including various pesticides,
solvents, drugs, and air contaminants", including those
found in sick buildings.
Various theories have been proposed as a cause
of the MCS syndrome including immunologic, genetic,
toxicologic, psychologic and sociologic factors . MCS
causes negative health effects in multiple organ systems,
and that respiratory distress, recurrent infections,
seizures, cognitive dysfunction, heart arrhythmia, nausea,
headache, and fatigue.
The purpose of this study was to investigate on the
involvement of the immunological mechanism in MCS
syndrome. In particular we studied the capacity of
oxidative burst among leucocytes in order to explain
immunological impairment observed.
Oxidative
burst
was
measured
quantitatively
by
flowcytometry
using
commercial
methods
(PHAGOBURST) in heparinized whole blood drawn from
20 patients (4 men, 16 women, aging: 48 ± 4) and 3
controls (1 men, 2 women, aging: 31± 3).
We found a significant differences between leucocytes
respond in MCS patients to Phorbol 12-Myristate 13Acetate (PMA) vs controls. This founding could explain
recurrent infections (cystitis, mycosis) and autoimmunity
occurring in MCS patients.
Therefore, further research needs to focus on a unique
phenomenological characterization of MCS.
-.Berg ND, Rasmussen HB, Linneberg A, et al. Genetic
susceptibility factors for multiple chemical sensitivity
revisited.. Int J Hyg Environ Health. 213:131-139, 2010
- Andreas Lun, Markus Schmitt and Harald Renz
Phagocytosis and Oxidative Burst: Reference Values for
Flow Cytometric Assays Independent of Age. Clinical
Chemistry 46: 1836-1839, 2000 .
- Wiesmüller GA, Niggemann H, Weissbach W, et al.
Sequence variations in subjects with self-reported multiple
chemical sensitivity (sMCS): a case-control study. J
Toxicol Environ Health A.;71:786-94, 2008.
534
292
VALUTAZIONE DELLA CREATININA SIERICA E DEL
FILTRATO GLOMERULARE CALCOLATO (e-GFR
E CKD-EPI) IN RIFERIMENTO ALLA CLEARANCE
DELLA CREATININA
1
1
1
M. Brogi , F. Morandini , D. De Ninno , G.
1
1
1
1
Materassi , D. Tinalli , C. Rumori , S. Rapi , B.
1
1
Salvadori , A. Ognibene
1
Introduzione
Negli ultimi anni il dibattito in letteratura sugli algoritmi
per il calcolo del filtrato glomerulare (e-GFR) è stato
particolarmente pressante a dimostrazione dell’interesse
per uno strumento di screening della funzionalità renale.
Gli algoritmi utilizzati sono stati largamente valutati ed
in molti laboratori l’e-GFR viene regolarmente refertata
assieme alla misura della creatinina sierica (sCr). Nel
presente studio i valori di e-GFR ottenuti con due
algoritmi, MDRD e CKD-EPI, sono stati confrontati con
i valori della sCr e della Clearance della Creatinina
(ClCr). Quest’ultima è stata assunta come riferimento per
il calcolo della sensibilità e della specificità degli altri
parametri.
Materiali e Metodi
Il calcolo dell’e-GFR è stato eseguito su 9359 soggetti
(4807 maschi, età 56.4±15.8, 4552 femmine, età
55.7±16.5). Su tutti è stata misurata la creatinina nel siero
e nelle urine delle 24 ore e calcolata la ClCr. La misura
della creatinina è stata eseguita con il metodo enzimatico
su Advia 2400 (Siemens). Le formule utilizzate per il
calcolo della e-GFR sono per la CKD-EPI: GFR = 141 x
#
min(Scr/κ,1) x max(Scr/κ, 1) – 1.209 x 0.993
-1.154
età
x (1.018
-0.203
se femmina) e per la MDRD: 186 x (Scr)
x (Età)
x (0.742 se femmina).
Risultati
Il campione studiato è stato diviso in 4 gruppi, maschi e
femmine con età dai 18 ai 65 anni e maschi e femmine con
età >65. Per le femmine del gruppo 18-65 la sensibilità e la
specificità per MDRD, creatininemia e CKD-EPI è risultata
rispettivamente 81% e 91%, 88% e 83%, 79% e 92% Per
i maschi del gruppo 18-65 , 91% e 81%, 96% e 67%, 92%
e 82% rispettivamente .
Per le femmine del gruppo >65 la sensibilità e la
specificità per MDRD, creatininemia e CKD-EPI è risultata
rispettivamente 71% e 89%, 63% e 94%, 73% e 88%. Per
i maschi del gruppo >65, 87% e 85%, 82% e 89%, 89%
e 80% rispettivamente.
Conclusioni
L’utilizzo dell’e-GFR (MDRD e CKD-EPI) offre maggiori
informazioni rispetto alla semplice misura della creatinina
in termini di screening della funzionalità renale. In
particolare la MDRD, peraltro ben conosciuta rispetto alla
CKD-EPI, di recente introduzione, mostra in questo studio
una lieve superiorità in sensibilità nel gruppo 18-65.
293
INDICATORI DI RISCHIO DI EMORRAGIA
INTRACRANICA (ICH) POST-TRAUMATICA IN
SOGGETTI IN TRATTAMENTO CON TERAPIA
ANTICOAGULAMTE ORALE (TAO)
294
EVALUATION OF T-LYMPHOCYTE SUBSETS BY
ABBOTT CELL-DYN SAPPHIRE HAEMATOLOGY
ANALYZER COMPARED WITH FLOW CYTOMETRY
1
1
2
1
1
A. Ognibene , C. Casula , M. Brogi , C. Papi , S.
1
1
2
Stefanelli , G. Salerno , S. Grifoni
1
2
Dip. di Emergenza, A.O.U. Careggi, Firenze
Introduzione
Il trauma cranico rappresenta una delle patologie più
importanti e frequenti nei reparti d'emergenza. Tra i
diversi fattori di rischio la Terapia Anticoagulante Orale
(TAO) ha ricevuto notevole attenzione in letteratura. Lo
scopo del presente studio è di identificare gli indicatori
di rischio di evoluzione della ICH per migliorare la
stratificazione del rischio dei pazienti in trattamento con
Terapia Anticoagulante Orali (TAO) con trauma cranico
minore.
Materiali e Metodi
Le cartelle cliniche di 1.554 pazienti adulti con
trauma cranico minore valutati dal Dipartimento
di Emergenza dell'Azienda Ospedaliero-Universitaria
Careggi da gennaio 2007 a febbraio 2008 sono stati
analizzati retrospettivamente. Tutti i pazienti inclusi nello
studio sono stati sottoposti a esami di laboratorio
all’ammissione incluso l'INR; oltre all’esame anamnestico
tutti hanno effettuato una TAC cranio e i risultato sono stati
messi in relazioni ai diversi indici di rischio.
Risultati
Dei 1410 pazienti inclusi nello studio, 75 (5,2%) erano
trattati con warfarin al momento del trauma. L'INR in
questi soggetti era di 2,37 ± 1,04 (media ±SD) determinato
all’ammissione al Pronto Soccorso. Il valore di INR
è risultato significativamente associato a comparsa di
emorragia intracranica dopo trauma cranico (r = 0,37, p
<0,005).
Dodici (12/75) dei pazienti in TAO è risultato positivo alla
TAC per emorragia intracranica. La curva ROC costruita
con i valori di INR ha mostrato un Area Under Curve =
0.76 (CI 95% 0.62-0.91 p<0.05) ed in particolare al cut-off
di 2,43 una sensibilità del 90%, una specificità del 66% e
un valore predittivo negativo del 97%.
Conclusioni
Lo studio conferma la forte relazione tra i valori di
INR e la probabilità di emorragia intracranica, come
dimostrato in studi precedenti, l'elevato valore predittivo
negativo dell’INR potrebbe aiutare, insieme ad altri indici,
a escludere emorragie intracraniche in questi soggetti.
1
1
D. Chianese , G. Tammaro , F. Scopacasa , L. Del
2
1
Vecchio , E. Grimaldi
1
Dept. of Biochemistry and Medical Biotechnology,
University Federico II, Naples, Italy.
2
Dept. of Biochemistry and Medical BiotechnologyCEINGE, University Federico II, Naples, Italy.
Up to recent years flowcytometric technology has been
widely used for measurement of the absolute numbers
of T-Lymphocyte subsets. More recently the Cell-DynSapphire automated hematology analyzer uses integrated
optical and fluorescence measurements and automated
procedures for CD3+, CD3+CD4+ and CD3+CD8+
determination without sample manipulation.
In this study the performance of the CD-Sapphire in the
T-Lymphocyte subsets determination was evaluated and
the accuracy of the assay was assessed by comparison
with FACSCalibur flow cytometer as a reference method.
The assay resulted linear in the range tested within the
limit of 28 cells for CD3+, 61 cells for CD3+CD4+ and 24
cells for CD3+CD8+
The precision is similar for that reported for others Tcells measurement systems, including FACSCount and
Tri-Test.
Comparison of CD3+, CD3+CD4+ and CD3+CD8+
T-Lymphocyte analysis showed high coefficient of
correlations (r>0.9) and good agreement between the two
instruments (slope 1.139 1.112 and 1.0166 respectively,
and intercept near to zero).
No significant bias (mean of differences 0.037 0.027
and -0.036 for CD3+ , CD3+CD4+ and CD3+CD8+
respectively) was observed between Cell-Dyn Sapphire
and FACSCalibur across the entire range of counts tested.
The CD Sapphire is a rapid and automated method
and the level of accuracy, precision and Linearity were
sufficiently high. The incorporation of alternatives to
traditional flow Cytometric T-Cell immunophenotyping
methods onto hernatology analyzers afford greater
convenience and enhanced performance.
REFERENCES
1. Johannessen B., et al. Implementation of monoclonal
antibody fluorescence on the Abbott Cell-Dyn Sapphire
hematology analyser, evaluation of lymphoid, myeloid
and platelet markers. Clinical Lab Haematol 2006; 28(2):
84-96
2. Yamane T., et al. T-Lymphocyte subset analysis using
the automated haematology analyser Cell-Dyn 4000 for
patients with haematological disorders. Leuk Lymphoma
2006; 47(3): 503-506
3. Marshall P., et al. Rapid, automated, closed- tube
Quantitation of CD4+ and CD8+ T-cell populations on the
Cell-Dyn 4000. Clin Lab Haematol 2000; 6(3): 137-143
535
295
DOSAGGIO DEGLI OSSALATI URINARI SU AU 400
OLYMPUS
296
CREATININA ENZIMATICA SU AU 600 OLYMPUS
1
1
2
1
1
G. Cangiano , A. Latte , M. Russo , F. Forte , E.
1
1
1
Di Maina , C.I. Pandelli , M.M. D'Ambrosio , M.
3
4
1
Terribile , M. D'Amora , A. Risitano
1
U.O. Lab. di Patologia Clinica - P.O. dei Pellegrini ASL
NA 1
2
U.O. Lab. di Patologia Clinica - Ospedale di Venezia
Azienda ULSS 12 Veneziana
3
U.O. Nefrologia - P.O. dei Pellegrini ASL NA 1
4
U.O. Lab. di Patologia Clinica - P.O. S.M. del Popolo
degli Incurabili ASL Na 1
La valutazione della calciuria e della natriuria, assieme
ad ossaluria e citraturia delle 24 ore risulta indispensabile
per il trattamento e la prevenzione della calcolosi
da ossalato di calcio. La determinazione dell’ossalato
urinario esistente nel commercio viene normalmente
proposta con un kit fotometrico “in manuale”. In
considerazione del discreto numero di determinazioni
urinarie richieste e dall’ U.O. di Nefrologia dell’Ospedale
dei Pellegrini – ASL NA1, col presente lavoro si
mettono in evidenza particolari variazioni metodologiche e
strumentali da adottare sull’analizzatore AU 400 Olympus
al fine di poter automatizzare il dosaggio Trinder della ditta
LTA.
2 mL di urina con pH compreso tra 4.2 e 5.6 vengono
versati in un tubo di purificazione contenente carbone
attivo. Si agita quindi per 5 minuti, si centrifuga e
si raccoglie il sopranatante limpido. Quest’ultimo viene
prelevato dallo strumento che effettua una diluizione
1:5 con tampone EDTA pH 7,0, inserito in posizione
prediluente. Il diluito (50 µL) viene aggiunto a 200 µL di
reattivo 1 (reagente R1 miscelato in parti uguali con il
reagente R2, a seconda del numero di determinazioni e
contenente tampone succinato pH 3,8 e DMAB). Dopo
un’attesa di circa 5 minuti (cicli macchina da 0 a 10: lettura
del bianco), l’analizzatore utilizza 40 µL di reagente 3
(liofilo portato in soluzione con 5 mL di acqua distillata
e contenente ossalato ossidasi, perossidasi, conservanti
e stabilizzanti). La reazione a termine è determinata
rilevando l’assorbanza, sia a 600 che ad 800 nm, tra i cicli
macchina 11 e 27. La linearità del metodo raggiunge 1,4
mmol/L. Nell’intervallo tra 0,03 ed 1,40 mmol/L di ossalati
urinari si evidenzia un profilo di imprecisione con un CV <
5% . Le prove di recupero, effettuate su diluizione scalari
di un campione a titolo elevato di ossalati, evidenziano
valori tra il 100,2 ed il 108,0% (recupero medio del
102,4%). La precisione nella e tra le serie, ottenuta
servendosi di due controlli a titolo noto della ditta LTA,
mostra un CV% < 2%.
Buona è la correlazione tra i valori dosati con la metodica
automatizzata da noi proposta (y) e quelli estrapolati con il
metodo “in manuale” (x) (r = 0,9876; y = 1,0151.x - 0,014).
Zerwekh JE, Drake E, Gregory J, et al: Assay of urinary
oxalate: Six methodologies compared. Clin Chem 1983;
29: 1977.
536
2
1
1
G. Cangiano , A. Latte , M. Russo , F. Forte , E. Di
1
1
1
3
Maina , A. Di Maio , C.I. Pandelli , M. D'Amora , A.
1
Risitano
1
U.O. Lab. di Patologia Clinica - P.O. dei Pellegrini ASL
NA 1
2
U.O. Lab. di Patologia Clinica - Ospedale di Venezia
Azienda ULSS 12 Veneziana
3
U.O. Lab. di Patologia Clinica - P.O. S. Maria del
Popolo degli Incurabili ASL NA 1
Gli aumenti di creatinina ematica si manifestano quando
gran parte del rene è compromesso. La creatinina è
inoltre un parametro con un elevato indice di individualità
e dipende molto dalla massa muscolare, dall’apporto
dietetico e dalle differenze di sesso e di razza. Nonostante
queste limitazioni, la determinazione della creatinina nel
siero e della sua clearance è ampiamente utilizzata
nella clinica. Viene inoltre raccomandato l’utilizzo della
stima della velocità di filtrazione glomerulare (e-GFR)
calcolata utilizzando determinazioni di creatinina con
metodi a sicura tracciabilità IDMS (spettrometria di massa
a diluizione isotopica).
Col presente lavoro si valuta una metodica fotometrica
della ditta Sentinel per il dosaggio della creatinina
enzimatica da noi adattata sull’analizzatore biochimico
AU600 della ditta Beckman Coulter.
Lo strumento preleva 4 µL di siero e li aggiunge a
180 µL di reagente 1 (tampone/enzimi/substrato/ESPMT).
Dopo un’attesa di circa 5 minuti (cicli macchina da 0 a
10), l’analizzatore utilizza 60 µL di reagente 2 (tampone/
enzimi/4-aminoantipirina): il risultato si estrapola dopo 27
cicli macchina con una reazione a termine letta a 540 nm
e con una lunghezza d’onda secondaria di 800 nm.
Il metodo è lineare fino a 60 mg/dL. Nell’intervallo tra
0,2 e 60 mg/dL di creatinina si evidenzia un profilo di
imprecisione con un CV < 3% . Le prove di recupero,
effettuate su diluizione scalari di un campione a titolo
elevato di creatinina, evidenziano valori tra il 97,2 ed il
109,8% (recupero medio del 99,1%).
L’imprecisione nella e tra le serie, ottenuta servendosi di
due controlli a titolo noto della ditta Sentinel, mostra un
coefficiente di variazione inferiore all’1%.
Buona è la correlazione tra i valori dosati con la metodica
enzimatica da noi proposta (y) e quelli estrapolati con
il metodo Jaffé della ditta Beckman Coulter (x) (r =
0,9958; y = 1,0175.x - 0,12). Valori di creatinina dosati
col metodo al picrato alcalino ed inferiori ad 1,2 mg/
dL presentano una sovrastima del 10-20% rispetto alle
determinazioni rilevate col metodo enzimatico, così come
riferito in letteratura.
Myers GL et al. Recommendations for improving serum
creatinine measurement: a report from laboratory working
group of the National Kidney Disease Education Program.
Clinical Chemistry 2006. 52:1,5-18
297
VALUTAZIONE DELLE PRESTAZIONI
ANALITICHE DELLO STRUMENTO NS-PLUS
PER LA DETERMINAZIONE IMMUNOCHIMICA
QUANTITATIVA DELL'EMOGLOBINA FECALE
298
CONFRONTO TRA DUE METODI DI DOSAGGIO
DELLA CREATININA: JAFFÈ vs ENZIMATICO SU
ANALIZZATORE AUTOMATICO AU 2700
1
1
1
1
1
P. Luraschi , I. Bonomi , L. Bressan , A. Tassan , N.
1
Corcione
1
Lab. Medico, Dip. di Prevenzione Medico, ASL Varese
L’ASL della provincia di Varese ha attivato nel 2006 un
programma di screening del carcinoma del colon-retto
sulla popolazione residente (50/69 anni) che prevede
la ricerca, con cadenza biennale, dell’emoglobina (Hb)
fecale in un unico campione. In caso di positività (cutoff 100 ng/mL), i soggetti sono invitati a sottoporsi
ad accertamenti di secondo livello. La misurazione
della Hb fecale è affidata al Laboratorio Medico, che
dall’Aprile 2010 utilizza a tale scopo strumento NSPlus prodotto da Otsuka Electronics e commercializzato
da Alere. Il sistema analitico comprende un dispositivo
monouso che permette il prelievo di una quantità
standardizzata di materiale fecale e la sua diluizione
in un volume predeterminato di tampone. Segue quindi
la misurazione della concentrazione della Hb con
metodo basato su principio immunochimico abbinato alla
spettrofotometria con oro colloidale. Reagenti e dispositivi
monouso sono forniti da Alfresa Pharma Corporation.
Si è ritenuto opportuno effettuare una verifica delle
caratteristiche del sistema analitico mediante valutazione
di linearità, esattezza analitica e imprecisione entro
la serie, impiegando diluizioni seriali di una soluzione
di Hb di concentrazione nota, nel tampone per la
raccolta e conservazione del campione, e imprecisione
tra le serie, analizzando 2 materiali di controllo a
2 livelli di concentrazione. Il metodo ha mostrato
linearità e buon accordo trovato/atteso (regressione
trovato/atteso: pendenza 0.85; intercetta 12.79 ng/mL;
r 0.999) nell’intervallo di concentrazione 40-800 ng/mL.
L’imprecisione entro la serie (CV%) è risultata compresa
tra 1.4% e 6.5% per concentrazione di Hb rispettivamente
di 338 e 784 ng/mL. Al valore di 100 ng/mL, il CV
% calcolato (equazione curva profilo di imprecisione) è
risultato essere pari a 2.9%. Il profilo di imprecisione ha
mostrato la classica curva ad U, con lieve deterioramento
della imprecisione ai due estremi dell’intervallo analitico.
L’imprecisione tra le serie (CV%) è risultata 12.6%
e 9.6% per concentrazione di Hb rispettivamente di
92 e 257 ng/mL. In conclusione le caratteristiche di
attendibilità analitica sono risultate corrispondenti alle
nostre precedenti esperienze, in sostanziale accordo con
i dati dichiarati e adeguate all’utilizzo clinico previsto.
1
C.G. Villa , G. Scarsi
1
Lab. Analisi A.O. San Antonio Abate Gallarate
Il National Kidney Disease Education Program (NKDEP)
raccomanda di calcolare e refertare la velocità di
filtrazione glomerulare (GFR), quale indicatore di
funzionalità renale in quanto è più sensibile rispetto al
semplice dosaggio della creatinina. Quanto più preciso
ed esatto è il valore della creatinina tanto più sarà
affidabile il GFR calcolato. Viene raccomandato (1)
l’utilizzo di calibratori tracciati allo standard internazionale
di riferimento e la sostituzione del metodo di Jaffè
con quello enzimatico che è più specifico. Quest’ultima
raccomandazione trova ancora diverse resistenze legate
principalmente a due fattori: il maggior costo ed
una sottovalutazione dell’inaccuratezza del metodo
colorimetrico.
Scopo del lavoro è quello di confrontare il metodo
colorimetrico Jaffè di dosaggio della creatinina (Beckman
ref OSR 6178) con quello enzimatico (Sentinel ref 17654)
su analizzatore Beckman AU2700. Entrambi i metodi sono
stati calibrati con calibratore (Beckman system calibrator
ref 6630) standardizzato allo standard NIST 909b.
E’ stata eseguita una prova di precisione tra le serie per
il metodo enzimatico (c.v. 3.1% al valore medio di 0,82
mg/dL e c.v. 1,9% al valore medio di 5,99 mg/dL). Per
il metodo Jaffè questa prova mostra valori simili (c.v.
2.5% e c.v. 1,8%). E’ stato altresì fatto un confronto
tra i due metodi su 100 sieri di pazienti (range 0,40
– 10 mg/dL di creatinina), la correlazione è ottima (R
0,998) e la pendenza, forzando l‘intercetta a zero, è
vicina all’unità (0,993); però se si considerano i valori di
creatinina da 0,40 a 2,00 mg/dL, la correlazione peggiora
(R 0,992) e la pendenza della retta, pur rimanendo
attorno all’unità (1,006) mostra una intercetta positiva
(0,075). Questo scostamento sui valori bassi di creatinina
è maggiormente evidente sui valori compresi tra 0,50 e
1,00 mg/dL di creatinina dove in media si supera il 10%.
Queste differenze, imputabili al fatto che il metodo Jaffè
non è specifico per la creatinina, impediscono un esatto
dosaggio della creatinina, soprattutto sui valori critici.
(1) Mauro Panteghini. Enzymatic assay for creatinine time
for action. Clin Chem. Lab Med; 46(4); 567-572
537
299
VALUTAZIONE DI UN METODO
IMMUNOTURBIDIMETRICO DI DOSAGGIO DELLA
CISTATINA C SU AU 640 E SUO IMPIEGO SU
SOGGETTI ANZIANI E DIABETICI
300
VALIDAZIONE DEL SISTEMA EMATOLOGICO
XE-2100 PER L'ESAME CITOMETRICO
AUTOMATIZZATO DEI LIQUIDI CAVITARI
1
1
1
C.G. Villa , G. Scarsi
1
Lab. Analisi A.O. San Antonio Abate Gallarate
La Cistatina C (CysC) è una proteina a basso peso
molecolare proposta come marker di funzionalità renale.
Rispetto alla creatinina la concentrazione nel siero non è
influenzata se non in minima parte dall’età, dal sesso e
dalla massa muscolare.
Scopo di questo lavoro è la valutazione della praticabilità
del metodo immunoturbidimetrico Sentinel (ref 11510A)
per il dosaggio della CysC su analizzatore automatico
Beckman AU 640 con la stima degli intervalli di
riferimento. Inoltre sono state studiate due popolazioni:
i diabetici e gli anziani. I diabetici perché una delle
complicanze più gravi è la nefropatia; gli anziani perché
l’attività renale fisiologicamente diminuisce e la CysC
rispetto alla creatinina non è influenzata dalla massa
muscolare che in tarda età può variare in modo drastico
(1).
Sono state eseguite prove di precisione nella serie e tra
serie:
nella serie : n° replicati 30 c.v. 1,5% al valore medio di
0,59 g/dL e 1,1% al valore medio di 1,88 mg/dL
tra serie: n° replicati 30 c.v. 3,3% al valore medio di 0,60
g/dL e 3,8% al valore medio di 3,08 mg/dL.
Sono stati stimati gli intervalli di riferimento sulla
popolazione sana composta da un campione di 160
donatori AVIS, età 20-60 anni e su 120 pazienti
ambulatoriali età 60-90 anni con valori di creatinina
nei range di riferimento. I dati trovati mostrano che
gli intervalli di riferimento della CysC fino a 60 anni
sono costanti sia nei maschi (range 0,45 – 0,75 mg/
dL) che nelle femmine (range 0,40 – 0,60 mg/dL) per
poi aumentare con l’età (oltre 70 anni range 0,60 –
1,20 mg/dL); questo incremento, non evidenziabile con la
creatinina, è probabilmente dovuto alla perdita fisiologica
della funzionalità renale.
Nei pazienti diabetici con valori di creatinina nel
range di normalità, non troviamo valori di Cistatina C
significativamente diversi rispetto ai soggetti presunti sani.
(1) Sophie Seronie-Vivien, Pierre Delanaye et al. Cystatin
C: current position and future prospects. Clin Chem Lab
Med 2008;46(12):1664–1686
538
1
1
1
S. Buoro , R. Gustinetti , P. Dominoni , C. Galliani , E.
1
1
1
Lochis , C. Salieri , C. Ottomano
1
Lab. di Biochimica Clinica, Osp. Ospedali Riuniti,
Bergamo
Scopo Nella moderna organizzazione di Laboratorio
l’automazione dell’esame citometrico del Liquido Ascitico
(LA) e Pleurici (LP) è un passo obbligato. Questo studio
si propone di validare l’impiego di Sysmex XE-2100
in funzione delle specifiche e dei cut-off patologici
indicati dalle Linee Guida(LG) CLSI H56-A. Materiali. 106
campioni di LA e 20 di LP raccolti in EDTA, cellularità
da 61 a 3364 Elementi Nucleati(EN)/µL (mediana 294/µL)
sono stati analizzati senza pretrattamento su XE-2100 e
al Microscopio con conteggio EN in camera di Nageotte
e classificazione morfologica su citocentrifugato. La
correlazione del conteggio WBC-DIFF di XE-2100 si è
valutata con: coefficiente Pearson r, regressione PassingBablok, Bias Bland-Altman, correlazione Spearman. Su
campioni omogeni costituiti da pool di surnatanti di liquidi
cavitari a cui sono stati aggiunti leucociti da buffy-coat di
sangue intero è stata valutata: Sensibilità Funzionale con
analisi di 5 replicati per campione; Carry-Over secondo
LG ICSH 1994 e Linearità secondo LG EP6-A. Risultati. Il
conteggio WBC-DIFF di XE-2100 verso EN a microscopio
evidenzia: r=0.99; y=0.98x+3.16; Bias –9.5 (IC95% da –
27.2 a +8.1). La percentuale di Other + IG (cellule ad alta
fluorescenza di XE-2100) correla in modo significativo con
la percentuale di macrofagi + cellule mesoteliali + altre
cellule non leucocitarie (r Spearman=0.67; p<0.0001). La
Sensibilità Funzionale (C.V. <20% da grafici di profilo di
imprecisione) è di 29 EN/µL: 50 polimorfonucleati/µL; 66
2
mononucleati/µL; Linearità elevata (R =0.99) nel range
esaminato da 8 a 944 EN/µL; Carry Over <1% nelle 4
serie di campioni analizzati. Conclusioni. La concordanza
del conteggio WBC-DIFF di XE-2100 rispetto al conteggio
EN al microscopio è elevata.I parametri Other% e IG%
sono utili a evidenziare la presenza di macrofagi, cellule
mesoteliali o altre cellule non leucocitarie, a definire
regole standard e relativi reflex test per la validazione del
conteggio. I risultati di Sensibilità Funzionale, Linearità,
Carry Over confermano la possibilità di impiego di
XE-2100 per l’analisi citometrica di LP e LA in funzione
dei cut-off patologici definiti dalle LG CLSI H56-A
Bibliografia
Body
Fluid
Analysis
for
Cellular
Composition;CLSI H56-A Vol.26 No.26
301
VALIDAZIONE DI SYSMEX UF1000 PER L' ESAME
CITOMETRICO AUTOMATIZZATO DEL LIQUIDO
ASCITICO
302
CONTRIBUTO ALLA VALUTAZIONE DEL
COAGULOMETRO COAG 30
1
1
1
1
1
S. Buoro , M.G. Alessio , C. Gavazzeni , C. Galliani , E.
1
1
1
Lochis , P. Filisetti , C. Ottomano
1
Lab. di Biochimica Clinica, Osp. Ospedali Riuniti,
Bergamo
Scopo. In un precedente lavoro (1) è stata validata
l’idoneità di Sysmex UF1000 nel conteggio di leucociti
(WBC) ed Elementi Nucleati Totali (EN: somma dei
conteggi WBC, EC, SRC) presenti nel Liquido Ascitico
(LA) e il supporto dei citogrammi nella valutazione
morfologica della componente cellulare. Questo studio
ha l’obiettivo di valutare: Imprecisione, Sensibilità
Funzionale, Linearità, Carry-over dei conteggi WBC e EN
di UF1000 per l’analisi citometrica di LA in funzione delle
specifiche contenute nella Linee Guida (LG) CLSI H56-A
(2).
Materiali e Metodi. E’ stata valutata: imprecisione totale
(CVTOT) e nei giorni (BTD) secondo LG EP5-A2 con
analisi in duplicato per 20 giorni del controllo Sysmex
UFII; Sensibilità Funzionale con 5 replicati di campioni
a diversa cellularità; Linearità secondo LG EP6-A con
analisi in triplicato di diluizioni seriali di campione a elevata
cellularità in pool di LA privo di cellule; Carry Over secondo
LG ICSH 1994 in serie distinte con quattro campioni a
elevata cellularità (da 425 a 4.010 WBC/µL). Risultati.
Imprecisione: CVTOT è 35,3% per 0,9 WBC/µL; 2,3% per
425 WBC/µL; 1,6% per 785 WBC/µL; 4,7% per 96 EN/µL;
2,0% per 486 EN/µL; 1,6% per 897 EN/µL. BTD è 16,7%
per 0,9 WBC/µL; 0,9% per 425 WBC/µL; 0,5% per 785
WBC/µl; 2,6% per 96 EN/µL; 0,8% per 486 EN/µL; 1,0%
per 897 EN/µL. Sensibilità Funzionale: CV% <10% anche
alle più basse cellularità esaminate (CV=6% per 27 WBC/
2
µL; 5,3% per 32 EN/µL). Linearità elevata (R =1.0) nel
range da 25 a 982 WBC/µL e da 27 e 983 EN/µL, con
deviazione dalla linearità a concentrazioni di 0,7 WBC/µL
e 2,5 EN/µL, carry-over trascurabile (<0,2%)
Conclusioni. I risultati evidenziano ottime prestazioni di
imprecisione, sensibilità funzionale, linearità, carry-over
dei conteggi WBC e EN di UF1000 che, abbinate alla
concordanza dei conteggi rispetto a microscopio ottico
osservata nel precedente studio, confermano il suo
possibile impiego nei percorsi di automazione dell’analisi
citometrica di LA rispetto alle specifiche definite dalle LG
CLSI H56-A.
Bibliografia. 1) MG Alessio, S Buoro et al, "Valutazione
del citofluorimetro Sysmex UF-1000i nello studio del
Liquido Ascitico” atti 41 Congresso SIBIOC Napoli 2009.
2) Body Fluid Analysis for Cellular Composition; CLSI
H56-A Vol.26 No.2
1
1
1
D. Cerasuolo , C. Polese , M. Rizzo , R. Scarano , E.
1
Cavalcanti
1
S. C. Medicina di Laboratorio, I. N. T. Fondazione
Senatore "G. Pascale", Napoli
Scopo del lavoro è stato quello di valutare, nel nostro
Laboratorio, le performances del Coagulometro COAG
30, da poco in commercio, prodotto dalla TND Elettronica
(CE) con la collaborazione esperta della ICD Partners di
Napoli. Il COAG 30 ha una produttività di circa 100 PT/
normali/ora, può supportare fino a 22 reagenti in linea,
è provvisto di sensori di livello per campioni, reagenti e
acqua di carico e scarico. Le misurazioni avvengono a
temperatura costante e controllata su 3 canali di lettura
e con azzeramento della miscela reagente/campione.
La valutazione della qualità analitica di tale strumento,
ha previsto per ogni test (PT, aPTT e Fibrinogeno) la
determinazione dell' Imprecisione intraserie e tra serie
nonchè la Correlazione con il Coagulometro BCS XP
(Siemens) in nostra dotazione. Reagenti, calibratori e
controlli impiegati su entrambi gli analizzatori erano tutti
della ditta Siemens. L'Imprecisione intraserie è stata
ottenuta analizzando 2 Pool di plasma a due diversi livelli
(A e B) eseguendo per ciacun test 20 determinazioni e
calcolando Media, DS e CV%. L'Imprecisione tra serie è
stata valutata analizzando un Pool di plasma in duplicato
per 20 giorni eseguendo la stessa analisi statistica. Per la
Correlazione sono stati analizzati, contemporaneamente,
su entrambi gli analizzatori, 40 campioni di plasma a
differenti livelli di attività e concentrazione. L'analisi dei
dati è stata effettuata mediante Regressione lineare.
I risultati ottenuti per l'Imprecisione intraserie sul Pool A
sono stati per il PT: Media 112% e CV 3.9%; per l'aPTT:
Media 37" e CV 4.9%; per il Fibrinogeno: Media 4.1 g/L e
CV 2.3%. Sul Pool B per il PT: Media 78% e CV 3.3%; per
l'aPTT: Media 39" e CV 2.5%; per il Fibrinogeno: Media
5.6 g/L e CV 6.2%.
L'Imprecisione tra le serie ha fornito per il PT: Media 96%
e CV 6.2%; per l'aPTT: Media 37" e CV 3.9% e per il
Fibrinogeno: Media: 3.7 g/L e CV 6.2%.
I risultati relativi alla Correlazione sono soddisfacenti,
mostrando valori di r che variano da 0.955 a 0.987.
539
303
EVALUATION OF SENTINEL TOTAL ACID
PHOSPHATASE AND NON PROSTATIC ACID
PHOSPHATASE ASSAY ON BECKMAN COULTER
AU SERIES CLINICAL CHEMISTRY ANALYZERS
304
VALUTAZIONE DI UN NUOVO TEST DI TERZA
GENERAZIONE PER IL DOSAGGIO DEL PTH IN
AUTOMAZIONE
1
1
1
1
A. Cugini , F. Vespasiani , M. Valdambrini , L. De
1
2
2
Angelis , E. Bianchi , G. Fumagalli
1
Sentinel CH. SpA, Milano
2
Osp. di Circolo di Melegnano, Vizzolo Predabissi
1
1
M.B. Franci , B. Lucani , M.S. Campagna , A.
1
1
Calabrò , R. Nuti
1
Medicina Interna I, Univ. degli Studi di Siena
’
L Insufficienza Renale Cronica comporta la perdita della
’
Objective: Evaluation of Total Acid Phosphatase (ACP)
and Non Prostatic Acid Phosphatase (ACP-NP) assay
(from SENTINEL CH.) on Beckman Coulter AU400
and AU2700 was performed in compliance with quality
specifications based on biological variability, according to
Ricos.
Materials/Instruments: ACP measurement is based on the
hydrolysis in acid medium of α-naphtylphosphate to αnaphtol and phosphate. α-naphtol reacts with diazo-2chloro-5-toluene (Fast Red TR salt), forming an azo dye
compound. Prostatic acid phosphatase activity, inhibited
by tartrate, is calculated by subtraction between ACP and
ACP-NP.
Study Design: All study protocols were based on CLSI
standard. To meet analytical specifications based on
biological variation (TE<10.5%) at clinical decision level
(4.7 U/L) the following acceptance criteria were adopted:
for Total Imprecision CV<=4%; linearity bias ±5%; method
comparison was performed by comparing the results of
paired patient serum samples on AU400 vs. Hitachi 912
and on AU640 vs. AU2700. On Board reagent stability and
calibration stability were also evaluated.
Results-ACP: Overall CV was 2.7% at 19.86 U/L on
AU400 and 1.8% at 8.8 U/L on AU2700. Method
Comparison: A) AU400 vs Hitachi 912: n = 60, slope
= 0.99, intercept = 0.29 U/L, r = 0.997; B) AU640 vs.
AU2700: n = 60, slope = 0.97, intercept = 0.17 U/L, r =
0.998. Linearity was found from 0.2 up to 72.6 U/L. LOD
was 0.13 U/L. ACP-NP: Overall CV was 3.2% at 11.63 U/
L for AU400 and 4.0% at 4.58 U/L for AU2700. Method
Comparison: A) AU400 vs. Hitachi 912: n = 70, slope =
1.04, intercept = 0.28U/L, r = 0.998; B) AU640 vs AU2700:
n = 60, slope = 0.93, intercept = -0.33 U/L, r = 0.987. Assay
was linear from 0.2 up to 32.0 U/L. LOD was 0.14. Up
to 7 days for reagent stability and 3 days for Calibration
stability were found.
Conclusion: Performance of Sentinel CH. ACP and ACPNP assays on Beckman Coulter AU Series instruments
did meet the acceptance criteria based on Biological
Variation database specification, allowing the use of the
assay on clinical laboratory routine.
540
capacità di regolare correttamente l omeostasi fosfocalcica. Il ridotto assorbimento intestinale del calcio,
secondario alla ridotta sintesi di 1,25-OH Vitamina
D da parte del rene, induce un aumento della
secrezione di PTH tale da determinare quella condizione
di iperparatiroidismo secondario che rappresenta una
’
temibile complicanza dell IRC.
Nei pazienti con IRC è importante monitorare i livelli
della molecola intatta PTH 1-84 utilizzando metodiche
che limitino le interferenze dei frammenti, specialmente
quelli C-terminali che sono di incerto significato clinico.
In particolare nei pazienti in emodialisi tali frammenti si
accumulano in concentrazioni molto elevate che vengono
a loro volta rilevati dalla totalità dei tests diagnostici di
seconda generazione attualmente in commercio.
Scopo del lavoro è valutare la nuova metodica DiaSorin
LIAISON 1,84-PTH CLIA a confronto con la metodica
IRMA DiaSorin N-tact PTH in uso nel Ns. laboratorio da
diversi anni.
114 campioni di plasma EDTA (59 da pazienti dializzati/
nefropatici e 45 da pazienti di altri reparti ospedalieri)
sono stati centrifugati entro 30 min e congelati a –
°
20 C. Le due metodiche dello studio utilizzano anticorpi
specifici per le due regioni N-terminale e C-terminale della
molecola di PTH. Il metodo IRMA utilizza un anticorpo
policlonale contro la regione 39-84 legato in fase solida
e un secondo anticorpo specifico per la regione 1-34
®
marcato con Iodio125. Il test CLIA Liaison 1,84-PTH è un
dosaggio modificato di tipo sandwich in due steps a due
siti che utilizza due anticorpi monoclonali per la cattura e
il rilevamento della molecola PTH 1-84. L’utilizzo di questi
anticorpi assicura che venga rilevato solo il PTH 1-84 e
non presenta reattività crociata con alcun frammento (p.e.
il 7-84 o altri).
L’analisi statistica di confronto ha evidenziato una
correlazione altamente significativa ( y = 1,36 x + 2,6 ;
R = 0,997) tra la metodica CLIA e la metodica IRMA. In
considerazione del fatto che la metodica CLIA si realizza
in totale automazione, essa consente inoltre una gestione
ottimale del campione e dei tempi di refertazione.
Endres, D.B. and R. Villanueva, CLINICAL CHEMISTRY,
37(2):162, (1991)
305
VALUTAZIONE DEI LIVELLI DI OMOCISTEINA
MEDIANTE SISTEMI ACL TOP, HPLC ED FPIA.
WORK IN PROGRESS
2
1
1
306
STEROID PROFILING FOR CONGENITAL
ADRENAL HYPERAPLSIA (CAH) USING ULTRAPERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHYTANDEM MASS SPECTROMETRY
1
S. Vitale , C. Bellia , G. Bivona , C. Migliorisi , R.
1
1
2
2
Raineri , L. Carnevale , S. Meli , M.F. Massenti , F.
2
1
Vitale , M. Ciaccio
1
Sez. di Biochimica Clinica e Medicina Molecolare, Dip.
Di Biopatologia e Biotecnologie Mediche e Forensi,
Università degli Studi di Palermo
2
Lab. Centralizzato Analisi Chimico-Cliniche, A.O.U.P.,
Palermo
Introduzione:L’omocisteina è considerato un fattore
di rischio indipendente per patologie aterosclerotiche,
cardiovascolari, trombotiche, neurodegenerative e
metaboliche (1-2). Scopo del presente lavoro è
stato, valutare un nuovo metodo immunologico di
agglutinazione competitiva che dosa l’omocisteina totale
in campioni di sangue raccolti in citrato, comparandolo
con i metodi cromatografici ed immunoenzimatici classici.
Materiali e Metodi: Campioni di sangue prelevati
random da soggetti non omogenei per patologia,
sesso ed età sono stati sottoposti ad analisi, per
la valutazione dei livelli di omocisteina plasmatica,
con cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC
Perkin-Elmer), FPIA (AxSym Abbott) e ACL TOP
(Instrumentation Laboratory). Risultati e Conclusioni: I
risultati preliminari non hanno messo in evidenza valori di
omocisteina plasmatica significativamente diversi con le
tre metodiche, confermando i dati presenti in letteratura
di concentrazioni lievemente minori con la metodica
cromatografica. (ACL TOP, 14.95 µMol/L; FPIA 14.73
µMol/L; HPLC 13.43 µMol/L).
Bibliografia
1) C. Bellia, G. Bivona, .B Lo Sasso et al. Effect of
vitamin supplementation on Hyperhomocysteinemia and
cardiovascular risk reduction. Biochimica Clinica, 2010;
34: 187-93.
2) F. Blanco-Vaca, R. Arcelus, F. Gonzales-Sastre et al.
Comparison of the Abbott IMx and a High Performance
Liquid Chromatography Method for Measuring Total
Plasma Homocysteine. Clinical Chemistry and Laboratory
Medicine, 2000; 38: 327-9.
1
3
3
4
C. Rossi , L. Calton , H. Brown , A.M. Wallace , F.
1
5
1
1
Petrucci , O. Porzio , C. Di Ilio , P. Sacchetta , A.
5
3
Urbani , M. Morris
1
Ce.S.I., Fond. Univ. “G. d’Annunzio”, Chieti
2
Dip. Sc. Biom., Univ. “G. d’Annunzio”, Chieti e Pescara
3
Clin. Oper. Group, Waters Corporation, Atlas Park,
Manchester, UK
4
Dep. Clin. Bioc., Glasgow Royal Infirm., Glasgow,
Scotland, UK
5
Dip. Med. Int., Univ. Tor Vergata, Roma
6
Dip. Med. Lab., Polic. Univ. Tor Vergata, Roma
7
Lab. Enz., Fac. Farm., Univ. “G. d’Annunzio”, Chieti e
Pescara
8
CERC, IRCCS-Fond. S. Lucia, Roma
CAH is caused by inherited defects in steroid
biosynthesis.Hormonal imbalances are reflected in
decreased levels of aldosterone and cortisol and
excessive secretion of 17-hydroxyprogesterone (17-OHP)
and androstenedione.Diagnosis of CAH is based on
the quantification of 17-OHP, usually by immunoassay.
Compared with other neonatal screening tests, the
specificity of screening for 21-CAH by immunoassays
is low. In this contest the use of liquid chromatography
coupled to a tandem mass spectrometer (LC/MS/
MS) would be ideal as it provides an opportunity to
address some of the current test limitations and allows
the quantification of more than one marker of the
disease in a single measurement process. We developed
two simple methods using ultra performance liquid
chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC/MS/
MS) in positive electrospray ionisation mode and
multiple reaction monitoring acquisition:the first method
[1] to determine the levels of 17-OHP, cortisol, 21deoxycortisol,11-deoxycortisol, and androstenedione in
serum,and the second one to measure simultaneously
17-OHP, cortisol and androstenedione.In the second
method, due to the lack of dried blood spot calibrators
and quality controls a response in terms of concentration
was possible only for 17-OHP, while cortisol and
androstenedione were investigated qualitatively by the
use of peak areas in reference to the stable deuterated
internal standard. Reference ranges for each analyte
were defined by analysis of samples from unaffected
individuals.The present methods were compared with
radioimmunoassay for 17-OHP. Both the assays were
linear over each analyte concentration range with all
coefficient of determination (R2) >0.997.Inter and intraday precision of the assay was better than 10%CV
across the analytical range. Both the method provided
good linearity, sensitivity and precision and demonstrated
that tandem mass spectrometry is appropriate for the
measurement of steroids in routine clinical laboratories.[1]
Rossi et al (2010). Clin Chim Acta 411:222-8.
541
307
IDROCARBURI POLICICLICI AROMATICI (IPA),
TECNICHE DI ANALISI A CONFRONTO
1
1
308
VALUTAZIONE DEL SISTEMA ADVIA 2400
(SIEMENS) PER DOSAGGIO LDH E ALBUMINA NEI
LIQUIDI CAVITARI
1
A. D'Andrea , A. Mastrone , L. Brunasso Cattarello , G.
1
1
1
1
D'Amico , C. Carpenito , R.A. Salvo , M. Vincenti
1
Area Chimico-Clinica, Centro Regionale Antidoping
"Alessandro Bertinaria" Orbassano - Torino
Gli IPA sono composti ubiquitari che si formano durante
i processi di combustione incompleta e per pirolisi di
materiale organico. Sono, inoltre, presenti in numerosi
settori lavorativi sotto forma di polveri e di vapori liberi o
adsorbiti su particolato aerodisperso. Esistono, pertanto,
esposizioni agli IPA sia professionali che non.
Si riscontra un crescente interesse da parte della
letteratura scientifica alla ricerca di nuovi metodi
per l’analisi del marcatore di esposizione attualmente
adottato, rappresentativo della classe degli IPA, l’1idrossipirene urinario (1-OH-Py), metabolita del pirene.
In letteratura esistono molti articoli che descrivono le
procedure di estrazione e di analisi cromatografica, ma
esistono pochi lavori di comparazione fra le varie tecniche
per valutare quale possieda le migliori prestazioni.
Lo scopo di questo lavoro è stato, quindi, quello di
confrontare i vari metodi di estrazione/purificazione,
cromatografici e di determinazione dell’1-OH-Py per
valutare una metodica rapida, accurata e precisa da
utilizzare per la stima dell’esposizione dei lavoratori a
rischio di contaminazione. Per valutare quale sia il metodo
con le migliori prestazioni sono stati utilizzati i criteri di
validazione dell’UNI EN ISO 17025:2005 con approccio di
tipo olistico. I metodi valutati sono stati: GC-MS; HPLCMS/MS e HPLC con rivelatore fluorimetro (HPLC-FLUO).
L’ottimizzazione ha messo in luce che tutti i metodi valutati
sono selettivi. La GC-MS risulta possedere una migliore
linearità rispetto agli altri due metodi.
La precisione intermedia risulta abbastanza buona e
simile per i tre metodi: i coefficienti di variazione
percentuale risultano tutti minori o uguali al 15% (CV
%HPLC-FLUO 12,87% vs CV%HPLC-MS/MS 14,79% vs
CV%GC-MS 15,00%).
I LOD determinati risultano uguali per tutte le metodiche
(0,25 ng/mL). I LOQ invece risultano minori per GC-MS
e HPLC-FLUO (0,5 ng/mL) e maggiore per HPLC-MS/MS
(0,75 ng/mL).
Dai risultati ottenuti si può concludere che il metodo con le
prestazioni migliori risulta la GC-MS tuttavia l’HPLC MS/
MS presenta buone prestazioni con il vantaggio di avere
una preparativa del campione più semplice e più sicura,
in quanto priva della derivatizzazione.
Bibliografia: Buratti M et al.2000, Kakimoto K et al.2007
542
1
1
1
1
S. Buoro , M. Parimbelli , P. Amboni , P. Zilio , C.
1
Ottomano
1
Lab. Analisi Chimico Cliniche , A. Osp.Ospedali Riuniti,
Bergamo
Scopo.
Il dosaggio della Latticodeidrogenasi: Piruvato-Lattato
(LDH) e la Ratio nel liquido pleurico (LP) e dell’albumina
(ALB) e il gradiente per i liquido ascitico (LA) sono utili per
inquadrare la natura del versamento. I metodi impiegati
nel sistema ADVIA 2400 (Siemens) sono validati per i
dosaggi su siero o plasma. L’obiettivo di questo studio è
la valutazione (effetto matrice ed imprecisione) di ADVIA
2400 per questi dosaggi su LP e LA secondo le specifiche
contenute nella Linee Guida (LG) CLSI C49-A.
Materiali e Metodi.
Sono analizzati in replicato 9 campioni di LA, 2 di LP
(con LDH compreso fra 86 e 789 U/L e ALB fra 806 e
3171 mg/dL) e 3 di siero (con LDH fra 327 e 611 U/L e
ALB tra 2903 e 4062 mg/dL) come campioni interi e a 9
concentrazioni scalari con fisiologica. I dati ottenuti sono
valutati con test di regressione, minimi quadratici e limiti
di confidenza. L’imprecisione dei metodi per LDH e ALB
è valutata con 40 ripetizioni in 2 serie analitiche su 2 pool
a diversa concentrazione di ciascun liquido e siero.
Risultati.
I risultati dei dosaggi scalari di LDH e ALB dei
campioni evidenziano un’elevata correlazione rispetto alle
concentrazioni attese con coefficiente di R=1 con y=1x
+0 (IC95%) rispettivamente con p<0.05 e p<0.0001.
L’imprecisione (CV) rilevata nei pool per il dosaggio di: 1)
LDH nel LP è di 1.26% e 0.85% con valori medi di 196 e
746 U/L, nel LA è di 2.56% e 0.71% con valori medi di 113
e 286 U/L, nel siero è di 1.37% e 0.64% con valori medi
di 171 e 772 U/L. 2) ALB nel LP è di 0.95% a 0.74% con
valori medi di 1468 e 1779 mg/dL, nel LA è di 1.44% e
0.64% con valori medi di 363 e 2782 mg/dL, nel siero è di
0.97% e 0.84 % con valori medi di 716 e 2993 mg/dL.
Conclusione.
I risultati evidenziano che le performance analitiche del
sistema ADVIA 2400 sono preservate nell’analisi di LA
e LP, confermando l’applicabilità rispetto alle specifiche
definite dalle LG C49-A, con l’assenza di effetto matrice
nei dosaggi di LDH e ALB per LA e LP (p<0.05 e p<0.001
IC95%) e l’imprecisione che risulta sovrapponibile a quella
rilevata nel Siero.
Bibliografia.
Analysis of body Fluids in Clinical Chemistry, IFCC C49A Vol.27 No.14
309
COMPARAZIONE DI CINQUE METODI ANALITICI
PER LA DETERMINAZIONE DELL’OMOCISTEINA
1
1
1
1
V. Bianchi , A. Lanati , F. Martino , S. Piccinini , A.
1
1
2
3
1
Pinca , G. Sida , M. Demicheli , M. Vidali , C. Arfini
1
Lab. Analisi, Dipartimento di Patologia Clinica, A.O. SS.
Antonio e Biagio e C. Arrigo, Alessandria
2
Lab. di Ematologia, Dipartimento Oncoematologico,
A.O. SS. Antonio e Biagio e C. Arrigo, Alessandria
3
Introduzione e scopo. L’enorme interesse per la
valutazione della omocisteina come fattore di rischio
cardiovascolare ha determinato lo sviluppo di un
numero crescente di metodi analitici su analizzatori
semiautomatizzati e automatizzati in alternativa al metodo
di riferimento cromatografico in HPLC. In questo studio
abbiamo confrontato 4 metodi analitici con il metodo in
HPLC attualmente in uso presso la nostra Struttura.
Pazienti e Metodi. I livelli di omocisteina sono stati
determinati in 145 pazienti consecutivi utilizzando la
seguente strumentazione 1) AxSYM e 2) IMx (Abbott
Diagnostics); 3) ADVIA Centaur (Siemens Healthcare
Diagnostics); 4) kit enzimatico (Axis-Shield Diagnostics)
su ADVIA 2400; 5) Homocysteine kit by HPLC (Bio-Rad).
Risultati. I livelli di omocisteina misurati con i differenti
metodi erano rispettivamente (mediana, IQR, min-max):
13.6 µmol/l (9.9-21.5, 4.6-113.0) per AxSYM, 19.6 µmol/
l (10.1-29.3, 4.1-83.8) per IMx, 15.4 µmol/l (11.8-26.0,
6.5-93.0) per ADVIA Centaur, 12.8 µmol/l (9.5-19.6,
3.7-90.0) per Axis-Shield, 11.2 µmol/l (7.5-17.6, 1.8-74.6)
in HPLC. La pendenza della retta di regressione di
Passing e Bablok ed il bias medio (analisi di BlandAltman) nel confronto con il metodo di riferimento in HPLC
era: 1.23 (95%IC 1.15-1.32) e 4.0 (95% delle differenze
tra -8.1 e 16.1) per AxSYM, 1.26 (95%IC 1.19-1.33) e 6.2
(95% diff. tra -2.2 e 14.5) per IMx, 1.39 (95%IC 1.24-1.56)
e 6.4 (95% diff. tra -5.8 e 18.6) per ADVIA Centaur, 1.21
(95%IC 1.12-1.31) e 3.0 (95% diff. tra -5.1 e 11.0) per
Axis-Shield. Utilizzando un cut-off di omocisteinemia di 15
µmol/l, la frequenza di positivi era rispettivamente 31.7%
con il metodo di riferimento in HPLC, 43.4% (concordanza
coppie con HPLC 86.7%, k di Cohen=0.72) per AxSYM,
55.6% (conc. 88.9%, k=0.78) per IMx, 53.1% (conc.
77.6%, k=0.56) per ADVIA Centaur, 35.0% (conc. 93.5%,
k=0.85) per Axis-Shield.
Conclusioni. Tra i metodi esaminati, il kit Axis-Shield
presenta una buona concordanza con il metodo di
riferimento, potendo rappresentare un’alternativa in
Laboratori con importante carico di lavoro che quindi
necessitano di un’elevata automazione per l’analisi
dell’omocisteina.
Bibliografia: La'ulu et al. Performance characteristics
of six homocysteine assays. Am J Clin Pathol. 2008,
130(6):969-75.
310
EVALUATION OF A NEW QUANTITATIVE
IMMUNOTURBIDIMETRIC LATEX DETERMINATION
OF HUMAN HEMOGLOBIN IN FECES ON
AUTOMATED ANALYZER
1
1
1
1
M. La Motta , C. Bitella , I. D'Agnese , G. Longo , R.
1
1
Lucini , F. Rota
1
Sentinel CH., Milano
Introduction: A new quantitative immunoturbidimetric latex
determination of human hemoglobin (h-Hb) in feces
(FOB Gold NG) was evaluated on Hitachi Modular-P
System. The scope of the study was to verify analytical
performances and the compliance of the assay with the
FDA guidelines. Methods: The new FOB Gold NG assay,
SENTINEL CH., is an immunoturbidimetric assay, based
on an antigen-antibody agglutination reaction between
the h-Hb contained in the sample and the polyclonal
antibodies anti-human Hb coated on the surface of
polystyrene particles. In presence of h-Hb an agglutination
is formed and measured at 570 nm. The signal is
proportional to the concentration of h-Hb contained in
the sample. Hitachi Modular-P System is a randomaccess analyzer. Modified CLSI protocols were adopted.
Acceptance criteria as total imprecision were ≤4.5% for
negative samples (≤100 ng/mL) and ≤5.0% for positive
samples (>100 ng/mL). Inaccuracy goal was set to ≤10%.
Results: Limit of Detection was 9.5 ng/mL. Limit of
Quantitation was 13.9 ng/mL. Total imprecision (39 days)
gave CV% at ≤100 ng/mL lower than 4.5%, and CV% at
>100 ng/mL lower than 5.0%. Calibration and Reagents
was stable up to 39 days on board of instrument.
The reaction was linear from 13 ng/mL up to 747 ng/
mL. The comparison vs. on market product (on 131
samples) gave R = 0.989. No prozone was observed up
to 36750 ng/mL. The assay recognized the following hHb variants: Hb S, Hb C, Hb A2, Hb D. Hemoglobins
from animal origin (bovine, pig, rabbit, horse, fish, sheep,
chicken goat) did not interfere up to 2500 ng/mL. Bilirubin
(250 µg/dL), ascorbic acid (100 µg/dL) BSA (40 g/L),
BaSO4 (80 µg/mL) iron (1000 µg/dL) did not interfere.
Human myoglobin showed a cross-reactivity of about
25%. Conclusion: The new SENTINEL FOB Gold NG
assay did meet the predefined acceptance criteria and
the obtained performances were in agreement with FDA
recommendations; the assay did recognize all the hHb variants and was not affected by cross-reactivity vs.
animal Hb. The method is specific for human hemoglobin
and no restricted diet is required. Literature: Review
criteria for assessment of Qualitative Fecal Occult Blood
In Vitro Diagnostics Devices. Guidance for Industry and
FDA staff. Food and Drugs Administration; August 8,
2007.
543
311
EVALUATION OF A NEW QUANTITATIVE
IMMUNOTURBIDIMETRIC LATEX DETERMINATION
OF HUMAN HEMOGLOBIN IN FECES ON A HIGH
TRHOUGH-PUT CLINICAL CHEMISTRY ANALYSERS
AND ON A LOW TRHOUGH-PUT BENCH DEDICATED
ANALYSERS
1
1
1
1
M. La Motta , C. Bitella , I. D'Agnese , G. Longo , R.
1
1
Lucini , F. Rota
1
Introduction: Colon rectal cancer is the fifth most common
form of cancer in the United States and the third leading
cause of cancer-related death in the Western world.
The risk of developing colorectal cancer increases with
age. Most cases occur to the people with age between
60-70, while cases before age 50 are rare. Measurement
of the human Hemoglobin (h-Hb) in stool is the base
of large national screening program and of routinary
demand. Both conditions benefit from the availability of
assays adaptable to High through-put analyzers and to
small analyzers. Scope: The study was aimed to verify
analytical performances of a new immunoturbidimetric
assay on a high through-put analyzer and on a dedicated
low through-put analyzer. Methods: FOB GOLD NG,
SENTINEL CH., is based on the reaction between the hHb contained in the sample and polyclonal antibodies antihuman Hb coated on the surface of polystyrene particles,
which forms a turbidity measured at 570 nm. The signal
is proportional to the concentration of h-Hb contained
in the sample. Architect c16000 is a high through-put
analyzer (1600 tests/hour), while SentiFOB is a dedicated
top-bench analyzer (90 tests/hour). Acceptance criteria:
Acceptance criteria for total imprecision were ≤7% for
negative samples (≤100 ng/mL) and ≤5% for positive
samples (>100 ng/mL). In comparison to on-market
method, R must be ≥0.95 and slope must be between
0.90-1.10. Results: Architect c16000: LOQ 16.0 ng/mL;
Total Imprecision Max CV% 3.1; Measuring Range from
16 to 735 ng/mL; Method Comparison: n = 163, r =
0.998; Reagents and Calibration were stable up to 40 days
on board; no prozone effect was observed up to 36300
ng/mL. SentiFOB: LOQ 15.8 ng/mL; Total Imprecision
Max CV% 6.6; Measuring Range from 20 to 797 ng/
mL; Method Comparison: n = 65, r = 0.997; Reagents
and Calibration were stable up to 15 days; prozone
effect was not observed up to 10850 ng/mL. Conclusion:
Obtained data proved that the SENTINEL FOB Gold NG
assay can be a valuable diagnostic tool both in large
screening programs and in lab situation characterized by
low demand. Literature: Review criteria for assessment
of Qualitative Fecal Occult Blood In Vitro Diagnostics
Devices. Guidance for Industry and FDA staff. Food and
Drugs Administration; August 8, 2007.
544
312
EVALUATION OF A NEW COLLECTION TUBE FOR
THE DETERMINATION OF HUMAN HEMOGLOBIN IN
FECES SAMPLES
1
1
1
1
G. Longo , C. Bitella , I. D'Agnese , M. La Motta , R.
1
1
Lucini , F. Rota
1
Introduction: Colon rectal cancer is the fifth most common
form of cancer in the United States and the third leading
cause of cancer-related death in the Western world. Large
prevention national screening programs, based detection
of Hemoglobin (h-Hb) in stool, requires collection devices
to be easy-to-use and fully suitable for lab automation.
Scope: The study was aimed at verifying performances
of a new collection device in terms of sampling
reproducibility, safety of the use, stability of h-Hb after use
and adaption to large clinical chemistry analyzers.
Material: The FOB Gold Tube NG is a new collection
device designed, validated and manufactured on a
fully automated assembling, filling and labeling line by
SENTINEL CH.
Methods: Stability after use were investigated by using
modified CLSI protocols. A % recovery of >90% against
first measurement was deemed acceptable.
Results:
Safety of use: the wrong use of the device is prevent
and enhanced by the presence of a safety seal. No
leakage or alteration of the device were observed after
stress thermal trial and stress mechanical trials simulating
adverse shipment conditions.
Stability after use: 50 feces samples were sampled and
tested after 6 days. The median recovery was 91% (-6 ng/
mL) at +2 +8 °C and 61% (-23 ng/mL) at room temperature
against initial measurement.
Sampling reproducibility: Device was designed to sample
and solubilize 10 mg of stool sample in 1.7 ml buffer. Three
samples at different consistency was prepared. Repeated
sampling of the same sample gave a device-to-device
variation of +/-1.8, +/-1.4 and +/-1.3 mg as SD on the three
consistency levels respectively (total variation: +/-1.9 mg
as SD).
Automation: Device was designed to meet CLSI AUTO1–
A and AUTO2-A2 guidelines. Dimensions were in
compliance in terms of length and outer diameter. The
device was accepted, processed and barcode identified
by all major clinical chemistry analyzers.
Conclusion:
Safety of the use and adaptability to all Clinical chemistry
analyzers data support the use of SENTINEL FOB Gold
Tube NG as collection device for screening program.
Literature: CLSI Guideline “Laboratory Automation:
Specimen Container/Specimen Carrier; Approved
Standard” Volume 20 Number 29 Approved December
2000.
313
DETERMINAZIONE SU DIMENSION VISTA DELLA
APTOGLOBINA: CONFRONTO CON UN ALTRO
METODO NEFELOMETRICO
1
1
314
VALUTAZIONE DI UN NUOVO ADDITIVO PER LA
RACCOLTA E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE
PER LA DETERMINAZIONE DELL' OMOCISTEINA
PLASMATICA
1
C. Lo Cascio , A. Ariberti , M.G. Anselmi , M.
1
1
Marini , M.S. Graziani
1
Lab. Analisi Chimico Cliniche ed Ematologiche, Osp.
Civile Maggiore, A.O.U. Integrata Verona
La determinazione dell’aptoglobina, proteina di trasporto
dell’emoglobina libera, viene utilizzata nella diagnosi e
nel monitoraggio dell’emolisi, in particolare dell’emolisi
intravascolare, ambito nel quale la sua misura su un
analizzatore di chimica clinica operativo h24 può risultare
di interesse.
Scopo del lavoro è la valutazione, attraverso il confronto
con un metodo nefelometrico già in uso, delle prestazioni
della determinazione nefelometria di aptoglobina su
Dimension Vista .
Materiali e Metodi
Campioni di plasma o siero di 69 soggetti, residui dalla
routine giornaliera.
Reagente HAPT (Siemens) applicato su Dimension
VISTA (Siemens), reattivo HPT (Beckman-Coulter),
applicato su nefelometro Immage 800 (BeckmanCoulter), entrambi calibrati con calibratore fornito dalla
ditta produttrice del reagente, standardizzato CRM470.
Controlli di qualità Liquicheck Immunology Control (BioRad).
Risultati
I controlli di qualità presentano una variabilità accettabile
(CV da 2.9% a 4.6%) e rientrano nei valori attesi sulla base
del confronto con altri utilizzatori. Soddisfacenti risultano
anche le prove di recupero.
La correlazione Vista-Immage nell’ambito di misura
analizzato (0-4 g/L) è: y = 1.011x + 0.1375 (r^2 = 0.9778).
Il bias mediano di Dimension rispetto a Immage è 11%
con un bias maggiore per valori <1g/L.
Discussione
La correlazione tra i due metodi risulta soddisfacente
anche se si evidenzia un bias elevato per basse
concentrazioni dell’analita, questo peraltro non influenza
la classificazione dei campioni indosabili (minima
concentrazione refertata 0.06 g/L e 0.077 g/L
rispettivamente su Immage e Vista) che risultano tali per
entrambi i metodi.
Si può quindi affermare che la misura di aptoglobina su
Vista presenta prestazioni paragonabili a quelle offerte dal
metodo precedentemente in uso, con il vantaggio di poter
essere utilizzato anche in regime di urgenza.
Bibliografia
Dati F, Schumann G, Thomas L, Aguzzi F. et al.
Consensus of a group of professional Societies and
Diagnostic Companies for interim reference ranges for 14
proteins in serum, based on the standardisation against
the IFCC/BCR/CAP Reference Material (CRM 470). Eur J
Clin Chem Clin Biochem 1996;34:517-20
1
1
1
1
S. Persichilli , J. Gervasoni , F. Iavarone , C. Zuppi , B.
2
Zappacosta
1
Lab. Analisi I, Policlinico A. Gemelli, Roma
2
Lab. e Servizi, Centro di Ricerca e Formazione ad Alta
Tecnologia nelle Scienze Biomediche Giovanni Paolo II,
Univ. Cattolica del Sacro Cuore, Campobasso
L’iperomocisteinemia è un fattore di rischio indipendente
per numerose patologie
Dopo il prelievo, l’omocisteina dagli eritrociti viene
rilasciata nel plasma provocando un aumento dei valori
(fino al 10% dopo un'ora dal prelievo, fino al 75% a 24 ore
da prelievo). L’uso di anticoagulanti come EDTA e il citrato
inibisce tale incremento, ma è necessario conservare i
campioni in ghiaccio e separare il plasma in tempi brevi.
Recentemente sono stati progettati nuovi dispositivi
contenenti
particolari
additivi
che
stabilizzano
l’omocisteina dopo il prelievo.
Scopo di questo lavoro è valutare la stabilità
dell’ omocisteina utilizzando il nuovo dispositivo
KABEVETTE® Vacuum per la raccolta del campione.
Per lo studio sono stati arruolati 5 volontari reclutati tra
il personale del laboratorio. Per ogni soggetto sono stati
eseguiti 5 prelievi rispettivamente in provette contenenti
EDTA, citrato, eparinato, senza anticoagulante e nella
provetta kabevette®. I campioni sono stati aliquotati
in 4 frazioni denominate tempo 0,1,2,3 corrispondenti
a 0,1,6,24 ore e lasciati a temperatura ambiente. Le
frazioni corrispondenti al tempo 0 sono state centrifugate
immediatamente e sierate mentre le altre aliquote sono
state sierate ai tempi indicati nel protocollo. Tutti i
campioni sono stati conservati a -80°C fino al momento
dell’analisi
Il dosaggio dell’omocisteina è stato eseguito
contemporaneamente su tutti i campioni, con metodo
HPLC-MS/MS.
I risultati confermano che la mancata centrifugazione
e refrigerazione del campione dopo il prelievo induce
un significativo aumento della concentrazione di
omocisteina. In particolare per il siero e per l’eparinato si è
osservato un incremento pari al 10% a 1 ora dal prelievo,
pari a circa il 30% a 6 ore e superiore al 50% a 24 ore.
I campioni conservati in EDTA e in citrato risultano più
stabili ma l’incremento risulta comunque significativo.
Il nuovo sistema sottovuoto contenente lo stabilizzante
mantiene costante la concentrazione di omocisteina a T
ambiente per 24 ore.
L’utilizzo di questi sistemi fornisce una garanzia di qualità
pre-analitica e una semplificazione della fase preanalitica
soprattutto quando la centrifugazione non può avvenire in
tempi rapidi.
545
315
ANALYTICAL EVALUATION OF FIRST-LINE
THYROID TESTING ON THE IMMULITE 2000 AND
THE UNICEL DXI 800
1
1
2
2
R. Aloe , C. Gnocchi , R. Minelli , G. Robuschi , R.
1
3
3
Musa , C. Bonaguri , G. Lippi
1
S.S.Dip. Biochimica elevata automazione Dip.
Patologia e Med. Laboratorio, A.O.U. Parma
2
Sez. Endocrinologia, Dip.Onco-ematologico internistico,
A.O.U. Parma
3
U.O. Diagnostica Ematochimica, Dip. Patologia e Med.
Laboratorio, A.O.U. Parma
Background
Diagnosis of thyroid disorders is a challenging process
that encompasses several aspects, including clinical
evaluation, blood and imaging testing as well as fine
needle aspiration biopsies and other tests. According
to most recent guidelines and recommendations, firstline thyroid testing includes Thyroid Stimulating Hormone
(TSH), free Triiodothyronine (fT3) and free Thyroxine
(fT4).
Materials and Methods
To evaluate and compare analytical performances of two
widely used immunoassays analyzers which also include
thyroid testing, 40 samples collected from healthy blood
donors were tested in duplicate on Immulite 2000 (Imm,
Medical Systems) and DxI 800 (DxI, Beckman Coulter),
and 193 samples (116 males, 77 females) were tested on
DxI to determine fT3 and Ft4 reference ranges.
Results
Imprecision was: 2.6% (95%IC: 0.2-10.4%) Imm TSH
vs 1.7% (95%IC: 0-6.6%) DxI TSH; 2.7% (95%IC:
0.4-12%) Imm fT3 vs 4.3% (95%IC: 0.4-10.5%) DxI
fT3; 1.7% (95%IC: 0-8%) Imm fT4 vs 1.0% DxI fT4
(95%IC: 0-11.2%). As such, DxI imprecision fulfilled the
imprecision desirable specification for all analytes (TSH
9%, FT3 4% fT4 2.9 respectively), while that of the Imm
was slightly greater than expected for fT3. Correlation (r )
between instruments was also excellent for all analytes,
being 0.974 (p<0.001) for TSH (Imm=1.29*DxI -0.02),
0.822 (p< 0.001) for fT4 (Imm=0.95*DxI+0.37), but it was
only modest and marginally significant (r= 0.291; p=0.034)
for fT3, respectively. Nevertheless, Bland and Altman plot
analysis comparing DxI versus Imm values revealed a
mean bias of -24% (95%IC: from -7 to -41%) for TSH,
-13% (95%IC: from 13 to -39%) for fT3 and -40% (95%IC:
from -23 to -56%) for fT4, respectively. Reference ranges
obtained with non-parametric method (CLSI 28-A3) for
DxI were: fT3 from 2.578 (90%IC 2.51-2.69) to 3.931
(90%IC 3.78-4.07); fT4 from 0.65 (90%IC 0.62-0.67) to
1.121 (90%IC 1.06-1.22).
Discussion
Taken together, these results demonstrate that although
the analytical performances of the two analyzers are
satisfactory or even excellent, the comparability is modest,
highlighting the need for a major standardization or
harmonization of test results.
546
316
VERIFICA DELL’ALLINEAMENTO TRA
STRUMENTAZIONI PER IL DOSAGGIO
DELL’EMOGLOBINA GLICATA
1
1
1
F. Cappellini , M. Bertona , S. Signorini , P.
1
2
Mocarelli , P. Brambilla
1
Servizio Univ. di Medicina di Laboratorio
2
Dip. di Medicina Sperimentale (DIMS), Facoltà di
Medicina e Chirurgia, Univ. degli Studi Milano Bicocca,
Monza-Brianza
Introduzione:
L’uso di più analizzatori in parallelo al fine di
aumentare la produttività e per un backup più semplice
è molto frequente nei laboratori ospedalieri. Questa
organizzazione inserisce una fonte ulteriore di variabilità
analitica per contenere la quale occorre controllare
periodicamente l’allineamento strumentale per assicurare
performance analitiche sovrapponibili sia in termini di
precisione che di accuratezza.
Presso il Laboratorio Analisi dell’Ospedale di Desio
la valutazione della concentrazione di emoglobina
glicata (Hb A1c) viene effettuata su 3 strumentazioni
HPLC HA-8160 (Menarini), due delle quali di recente
acquisizione. Scopo del presente lavoro è stato quello
di verificare l’allineamento tra i 3 analizzatori per
garantire la commutabilità dei risultati indipendentemente
dall’analizzatore utilizzato.
Materiali e metodi:
Sono stati analizzati 30 campioni di sangue intero con
concentrazioni di Hb A1c tra 28 mmol/mol e 132 mmol/
mol. Da ogni campione sono state prodotte 3 aliquote,
ognuna è stata analizzata contemporaneamente in doppio
su ciascun strumento. Si è scelto di utilizzare come limiti
di accettabilità per la verifica dell’allineamento i valori
suggeriti da “The RCPA Chemical Pathology QAP Group”:
A1c < 86 mmol/mol: ± 6 mmol/mol; A1c > 86 mmol/mol:
±5%.
I dati ottenuti sono stati valutati utilizzando la
rappresentazione grafica delle differenze di Bland e
Altman confrontando le tre possibili combinazioni di
confronti tra i 3 strumenti.
Risultati:
Per tutti e 3 gli analizzatori sono stati ampiamente
soddisfatti i criteri di accettabilità delle performance
analitiche suggerite dal gruppo di consenso.
Conclusioni:
L’esperienza ci porta a concludere che i tre analizzatori
sono perfettamente allineati tra di loro in modo
da consentirne l’uso casuale garantendo la piena
commutabilità dei risultati prodotti.
Resta da valutare la frequenza ottimale con cui eseguire
le verifiche dell’allineamento.
Bibliografia:
- J. Calleja. Parallel Processing and Maintaining Adequate
Alignment between Instruments and Methods. Clin
Biochem Rev. 2008 Vol 29 Suppl.
- http://www.rcpaqap.com.au/chempath/ - RCPA Quality
Assurance Programs
317
CORRELAZIONE TRA UN DOSAGGIO HBSAG
QUANTITATIVO ED UNO SEMIQUANTITATIVO. DUE
SISTEMI A CONFRONTO
318
CONFRONTO TRA DUE SISTEMI PER LA
DETERMINAZIONE DELLA VES IN SANGUE/EDTA
1
1
1
1
1
G.A. Moscato , I. Batini , O. Marsi , D. Pieri , B.
1
1
1
1
Grandi , S. Passeri , C. Novi , I. Guarducci , G.
1
Pellegrini
1
Lab. Analisi Chimico-Cliniche, A.O.U. Pisana, P.O.
Cisanello, Pisa
Scopo: Obiettivo dello studio è stato la valutazione
della correlazione tra il metodo in uso presso il
nostro Laboratorio, l’Architect HBsAg quantitativo-Abbott
e il dosaggio Vitros HBsAgES semiquantitativo-Ortho
Clinical Diagnostics, di ultima generazione e di recente
commercializzazione. Metodologia: Sono stati selezionati
260 campioni, 171 negativi e 89 reattivi al dosaggio
Architect HBsAg.Il profilo di imprecisione del dosaggio
Vitros HBsAgES è stato eseguito secondo le linee guida
del protocollo CLSI EP5a2,su due livelli di controllo,
per 20 giorni in doppio, su due diversi sistemi Vitros
3600.Risultati: La correlazione tra i due dosaggi si
è dimostrata molto soddisfacente ed è stata pari al
99,61%. Sui 260 campioni testati,si è riscontrato un solo
risultato discrepante ,con reattività al limite per Architect
HBsAg,negativo con Vitros HBsAg ES e riconfermato
negativo ad un dosaggio successivo su entrambe i
sistemi.La precisione del metodo Vitros HBsAgES si
è dimostrata molto buona con CV % (interassay ed
inter-analizzatore) di 26.9 sul controllo negativo (media
0.14 S/CO)e del 5% sul controllo positivo basso (media
3.93 S/CO). Considerazioni conclusive: Il dosaggio Vitros
HBsAgES ha dimostrato, un’eccellente discriminazione
nella popolazione dei campioni negativi (media 0.12 e
mediana 0.14 verso un cut-off, dichiarato, di 1.0 ed una
zona grigia tra 0.89 e 0.99 S/CO). Sulla popolazione
dei campioni positivi, il metodo Vitros, alla luce di questi
dati preliminari, sembra aver evidenziato una più ampia
estensione del range di misura. Le buone performance
del dosaggio Vitros HBsAgES, ci hanno spinto a voler
approfondire altri aspetti, che saranno oggetto di un
prossimo lavoro, circa la linearità del metodo, test
di recupero oltre ad un profilo di precisione su pool
di sieri.Bibliografia:CLSI. Statistical Quality Control for
Quantitative Measurements: Principles and Definitions;
Approved Guideline - Third Edition. CLSI document C24A3 [ISBN 1-56238-613-1]. CLSI, 940 West Valley Road,
Suite 1400, Wayne, PA 19087-1898 USA, 20 - Dufour DR.
Clinical Chemistry 52:1457-59 (2006). Hepatitis B Surface
Antigen (HBsAg) Assays-Are They Good Enough for Their
Current Uses? - World Health Organization (WHO) 2nd
International Standard for HBsAg, NIBSC code: 00/588
1
1
1
F. Pini , L. Paoli , B. Barlettani , R. Campigli , L.
1
Faggiani
1
Lab. Analisi, Sez. Ematologia e Coagulazione, P. O. di
Piombino, Piombino (LI)
La VES è un test utilizzato come marcatore generico
di fase acuta, che consiste nel diluire 4 parti di sangue
con una parte di citrato di sodio, e nel registrare di
quanto sedimentino le emazie nel periodo di un’ora,
all’interno di un tubo di vetro di dimensioni definite. In anni
recenti sono stati sviluppati sistemi in grado di eseguire
la VES su sangue indiluito anti-coagulato in EDTA. Il
primo strumento disponibile sul mercato è stato il Test-1
(Alifax), sulle cui performance sono state pubblicate
valutazioni dai risultati contrastanti, che addirittura ne
mettono in dubbio la capacità di fornire risultati riferibili
alla VES. Recentemente è stato sviluppato lo strumento
Ves-Matic Cube 30 (DIESSE Diagnostica Senese SpA),
che esegue il test misurando la sedimentazione delle
emazie direttamente nel tubo da emocromo, mediante
un nuovo sistema di lettura optoelettronico. Dal momento
che nel nostro laboratorio è in uso uno strumento
Test-1, abbiamo voluto eseguire una valutazione del VesMatic Cube 30 e del Test-1 in confronto alla classica
metodica di Westergren. Con le tre metodiche sono
stati analizzati 174 campioni in modo da coprire tutto
il possibile ambito di misura della VES (1 – 140 mm/
h), considerando come “gold standard” la metodica di
Westergren. I risultati sono stati analizzati statisticamente
utilizzando il pacchetto software MedCalc (MedCalc ,
Belgio), ottenendo i seguenti risultati:
Regressione di Passing – Bablok
Test-1: y = 4,53 + 1,53 x
Ves-Matic Cube 30: y = -2,00 + 1.00x
la pendenza della retta di regressione si discosta
sensibilmente da 1 nel caso del Test-1
Analisi di Bland – Altman
Test-1 vs Westergren: limiti d’accordo -54,9 - 25,6 mm/h,
bias = -14,7 mm/h
Ves-Matic Cube 30 vs Westergren: : limiti d’accordo -17,9
- 23,2 mm/h, bias = 2,6 mm/h
Come si nota dai dati sopra riportati, l’intervallo dei limiti
d’accordo del Test-1 è circa il doppio di quello del VesMatic Cube 30.Il coefficiente di correlazione di Spearman
è risultato pari a 0,85 (CI 95% 0,80 – 0,88, p<0,0001) per
il Test-1 e pari a 0,91 (CI 95% 0,85 – 0,94, p <0,0001)
per il Ves-Matic Cube 30. Concludendo, il sistema VesMatic Cube 30 fornisce risultati di VES sensibilmente più
correlati con la metodica di riferimento rispetto a al Test-1,
i cui risultati talvolta si discostano troppo dal valore di VES
reale.
547
319
COMPARISON OF NEW TOSOH G8 HIGHPRESSURE LIQUID CHROMATOGRAPHY
WITH THE SEBIA CAPILLARYS CAPILLARY
ELECTROPHORESIS AND TOSOH G7 IN THE
EVALUATION OF HEMOGLOBINOPATHIES
320
MISURAZIONE DELLA VELOCITA' DI
ERITROSEDIMENTAZIONE ATTRAVERSO VES
MATIC CUBE 80 IN RELAZIONE AI LIVELLI DI
PROTEINE PLASMATICHE INFIAMMATORIE
1
1
2
1
1
G.L. Salvagno , G. Lippi , F. Bellorio , B. Cirulli , M.
1
1
1
Gelati , E. Danese , G.C. Guidi
1
2
Italy
Background. Detection of structural hemoglobin (Hb)
variants and thalassemias has become increasingly
important in clinical laboratories because the early
diagnosis of variants such as sickle disease
or β-thalassemia major has important therapeutic
consequences early in life. The aim of this study
was to compare the analytical performances of new
HPLC system Tosoh G8 according to the manufacturer's
specifications with the HPLC system Tosoh G7 and
automated capillary zone electrophoresis (CE). Than we
evaluated the ability of the new G8 and CE to detect the
most common variants.
Materials and Methods. Forty consecutive samples
(fifteen of which with variants) of whole blood collected in
EDTA were sent to our laboratory for routine evaluation of
hemoglobinopathies. Each sample was assessed by the
two HPLC systems and CE at the same time. Results were
finally expressed as geometric mean (GM) ± the standard
error of the mean (SEM).
Results. In 26 samples lacking a hemoglobin variant,
there was good agreement between the techniques for
assessing HbA, HbA2 and HbF. HbA had a mean value
of 81.9% (SEM, 0.4%) by G7, 82.2% (SEM, 0.4%) by
G8 and 96.4% (SEM, 0.3%) by CE. The HbA2 values
were 3.0% (SEM, 0.3%) by G7, 3.1% (SEM, 0.2%) by G8
and 3.0% (SEM, 0.2%) by CE, whereas that of HbF were
0.8% (SEM, 0.2%) by G7, 0.7% (SEM, 0.2%) by G8 and
0.2% (SEM, 0.2%) by CE. The nonparametric regression
according to the method of Passing & Bablok and
the relative Spearman’s correlation coefficient showed
excellent performance both for HbA2 (HPLC G8 = 0.93
x HPLC G7+0.30; r= 0.999, p<0.001; CE = 0.77 x HPLC
G7+0.63; r= 0.91, p<0.001) and HbF quantification (HPLC
G8 = 1.01 x HPLC G7-0.05; r= 0.97, p<0.001; CE= 1.03
x HPLC G7-0.56; r= 0.95, p<0.001). Both HPLC G8 and
CE identified accurately the 15 variants (12 Hb S, 1 HbE,1
HbJ and 1 HbSC).
Conclusions. We conclude that, on the basis of the
analytical performance and the technical features of new
HPLC Tosoh G8 assay and the CE, they are suitable
assays for the rapid quantification and accurate evaluation
of Hemoglobin Variants.
548
1
3
2
H. Cerutti , C. Muzzi , M. Meloni , C. Scapellato , A.
1
1
1
Cortelazzo , E. Furlani , R. Guerranti
1
Dip. di Medicina Interna, Scienze Endocrino
Metaboliche e Biochimica , Sez. di Biochimica Univ.
degli Studi di Siena
2
U.O.C. Lab.Analisi AOUS Az.Osp.Universitaria Senese
3
Diesse Ricerche Srl
L’International
Council
for
Standardization
in
Haematology considera il metodo Westergren la
procedura di riferimento per la misurazione della Velocità
di Eritrosedimentazione (VES). Recentemente è stato
introdotto, come nuovo strumento di misurazione della
VES, un metodo chiuso ed automatizzato: VES Matic
Cube 80 (DIESSE SpA, Siena, Italia).
Questo sistema determina la VES direttamente nelle
provette di prelievo in EDTA, utilizzate dai conta globuli,
quindi in totale assenza di elementi reflui e aerosol.
Lo strumento legge l’Eritrosedimentazione grazie ad un
sistema optoelettronico innovativo caratterizzato da un
raggio a luce bianca LED ad alta energia con foto-sensori
analogici.
Lo scopo di questo studio è quello di mettere a
confronto le misurazioni della VES attraverso il metodo
Westergren e VES Matic Cube 80 in 248 pazienti
affetti da diverse malattie e valutare la capacità di
entrambi i metodi di riflettere uno stato infiammatorio
determinando la correlazione tra l’aumento dei livelli di
proteine plasmatiche infiammatorie e i valori di VES
ottenuti. In ciascun campione sono state misurate le
proteine totali, l’albumina, la proteina C-reattiva e altre
proteine infiammatorie.
I risultati ottenuti con VES Matic Cube 80 hanno
dimostrato una buona correlazione (y = 0.955x - 0,205,
r² = 0,816, p <0,05) con quelli ottenuti con il metodo
Westergren. Gli stessi risultati sono stati ottenuti anche
considerando il coefficiente di correlazione di Spearman
(0,951, 95% CI, 0,937-0,961, con p <0.0001) e l'analisi
attraverso Passing and Bablock con un’equazione di
regressione lineare (y = 0,9153x - 0,5763) con buona
pendenza e intercetta. L’analisi di Bland-Altman mostra
un basso bias positivo (1,2 mm/h) indicando che i valori
ottenuti con VES Matic Cube 80 sono poco inferiori a quelli
misurati con metodo Westergren.
I risultati provano che i valori di VES ottenuti con il metodo
DIESSE mostrano una buona correlazione con i livelli
di proteine infiammatorie, avvalorando la tesi che VES
Matic Cube 80 offre una veloce e sicura determinazione
della VES, assicurando precisione e una molto buona
correlazione con il metodo di riferimento; inoltre meglio
riflette la presenza di processi infiammatori nei pazienti
con malattie infiammatorie acute e croniche.
321
POCT DI NUOVA GENERAZIONE: PICCOLO XPRESS
1
1
1
1
C. Cosma , N. Vajente , D. Faggian , R. Venturini , M.
1
1
1
Padova, Italia
La strumentazione point-of-care è in rapida espansione
per la pressione a produrre risultati in tempi sempre più
rapidi, e per le scelte di consolidamento ed integrazione
che inducono a ridimensionamenti del numero e del
repertorio analisi dei laboratori.
Il Piccolo® Xpress (Abaxis, Inc., Union City, CA), è
uno strumento compatto e portatile il cui funzionamento
prevede l’uso di Dischi Reagenti (tecnologia in chimica
secca) che raggruppano fino a 14 tests correlati tra
loro per il quadro clinico da indagare. In 12 minuti
da 100µl di sangue intero, plasma o siero, si ottiene
un pannello di risultati dipendente dal tipo di Disco
Reagente. Sono state valutate le prestazioni di 2 Dischi
Reagenti: Comprehensive Metabolic (CM) (Na, K, Cl,
Ca, Crea, Glu, AST, ALT, Alb, ALP, tBIL, TP, tCO2,
BUN, eGFR), su 50 campioni di plasma litio-eparina
con richiesta di profili biochimici generali; Hepatic(H)
(Alb, ALP, ALT, AST, tBIL, dBIL, TP), su 25 campioni .
I risultati sono stati confrontati con quelli ottenuti su
Modular Analytics DP (MADP) (Roche Diagnostic GmbH,
Mannheim) utilizzato per le indagini di routine la cui
qualità è monitorata attraverso CQI e schemi specifici
di VEQ. Le caratteristiche d’imprecisione valutate su 2
livelli di controlli Liquid Unassayed Multiqual (Bio-Rad
Laboratories, Irvine, CA), evidenziano CVcompresi tra
0.05% (Na, Multiqual Level 2) e 9.79% (Crea, Multiqual
Level 1) per CM, e tra 0.69% (TP, Multiqual Level 2) e
11.07% (tBIL, Multiqual Level 1) per H.
L’analisi secondo Passing-Bablok (CI 95%) che confronta
i risultati di MADP vs CM evidenzia bias costanti
statisticamente significativi per : Cl=11.30 (1.00÷21.70),
Glu=0.1 (0.10÷0.35), AST=5.13 (3.08÷7.22), ALT=10.16
(8.16÷11.30), tBIL=3.65 (3.20÷4.00); e bias proporzionali
per: Ca=1.22 (1.11÷1.36), AST=0.89 (0.84÷0.94),
ALT=0.81 (0.76÷0.89), tBIL=0.81 (0.77÷0.85), BUN=0.88
(0.85÷0.92). Risultati analoghi e per gli stessi analiti
(AST, ALT, tBIL) si ottengono dal confronto MADP vs
H, con un bias proporzionale anche per ALP (0.88;
0.80-0.91). L’innovativa tecnologia dei dischi reagenti, le
buone prestazioni analitiche, l’operatività per pannelli di
tests congruenti clinicamente, le piccole dimensioni e la
grande praticità rendono il piccolo Xpress un valido ed
interessante analizzatore POCT di nuova generazione.
322
DOSAGGIO DEL D-DIMERO CON METODO
IMMUNOTURBIDIMETRICO AD ALTA SENSIBILITA',
DATI PRELIMINARI
1
1
1
D. Cerasuolo , F. Di Paola , L. Rossi , E. Cavalcanti
1
1
Scopo del lavoro è stato quello di valutare, nel
nostro Laboratorio, le performances di un metodo
immunoturbidimetrico, potenziato al latice, altamente
sensibile, per il dosaggio del D-Dimero (Innovance DDimero, Siemens Diagnostici).
L'Imprecisione nella serie, sul nostro sistema (BCS XP,
Siemens Diagnostici), è stata condotta analizzando un
pool di plama a livello patologico (2,1 mg/L), eseguendo
20 determinazioni, per tre giorni consecutivi e calcolando
Media, DS e CV% (CV 0,6%).
Per il calcolo dell'Imprecisione tra serie sono stati
analizzati un Plasma di Controllo a livello Normale
(Innovance D-Dimero Controllo 1) ed uno a livello
Patologico (Innovance D-Dimero Controllo 2) in duplicato
per 15 giorni, eseguendo la stessa analisi statistica. I
CV ottenuti sono rispettivamente 6,7% e 3,7%. Per il
calcolo dei Valori di Riferimento sono stati analizzati 60
campioni di plasma, da donatori afferenti alla Medicina
Trasfusionale. I risultati ottenuti mostrano una Media di
0,28 mg/L, con un intervallo compreso tra 0,17 e 0,75. Si
ritiene pertanto utile, se tali dati verranno confermati su un
maggior numero di campioni, portare il cut-off da 0,55 a
0,65 mg/L.
E' noto che tale test, utilizzato per escludere la presenza
di TEV, ha un alto Valore Predittivo Negativo, risultando
positivo in corso di numerose patologie. Nei pazienti
oncologici, soggetti frequentemente a processi settici/
infettivi o sottoposti ad interventi chirurgici invasivi, con
alta probabilità di sviluppare processi tromboembolici, un
unico valore non può essere significativo. Dai nostri dati
preliminari si evince che, in corso di processivi infettivi, in
15 pazienti esaminati il valore di D-Dimero è compreso tra
2,5 e 5,0 mg/L.
Al fine di valutare il rischio di TEV, è pertanto necessario
eseguire determinazioni seriate durante il periodo di
degenza oltre che avvalersi di indagini strumentali.
549
323
VALUTAZIONE DELLO SCREENING
AUTOMATIZZATO STANDARD PER IMMAGINI DEL
SEDIMENTO URINARIO VERSUS LA CITOLOGIA
TRADIZIONALE
324
VALUTAZIONE DI UN METODO
IMMUNONEFELOMETRICO PER IL DOSAGGIO
DELL'OMOCISTEINA PLASMATICA
1
1
1
1
1
R. Anderlini , F. Torricelli , G. Patelli , L. Giampaolo , C.
2
2
2
1
Magnani , N. Bigiani , O. Raisi , A.M. Cenci
1
Dip.,Pat.Clin.Corelab,Nuovo Osp. Civile S.AgostinoEstense (NOCSAE) AUSL di Modena
2
U.O Citopatologia Osp.Mirandola AUSL di Modena
Obiettivi: Il ritrovamento casuale di cellule alte vie/
atipiche nel sedimento urinario eseguito in automazione
mediante acquisizione d'immagine digitale offre occasioni
di riconoscimento di quadri significativi anche durante
il monitoraggio di pazienti con eteroplasie. L’esame
morfologico standard di urine estemporanee con
analizzatore IL IRIS iQ200 segnala la presenza
di cellule“sospette”da revisionare che nella nostra
esperienza hanno trovato conferma in citodiagnostica.
Materiali e metodi: Dalle urine fresche della routine interna
(4 ospedali) ed esterna (tutta la provincia) di pazienti di
entrambi i sessi, da 9 a 88 anni, afferenti al laboratorio
BLU (1°semestre 2010), sono state selezionate quelle
di 30 pazienti: 5 portatori con citodiagnosi di k-vescica,
diversi per tipo istologico, infiltrazione e terapie; 6
conosciuti per altre neoplasie in diagnosi e/o in follow
up; 4 con sospetto K vescica; 15 portatori di displasie/
stati infiammatori delle vie urinarie. Nell’indagine condotta
con microscopia computerizzata mediante rete neurale le
immagini non ascritte a categorie previste (NSE o UNCL)
seguivano la revisione degli operatori a video e/o al MO
(campo chiaro, 400X) e i campioni significativi per cellule
atipiche, venivano inviati alla Sezione di Citopatologia.
Risultati e conclusioni: buona corrispondenza tra riscontri
in automazione e citologia standard delle urine con
segnalazione strumentale e revisione delle immagini non
correttamente classificate dalla rete neurale. In questo
modo si sono confermati 2 k vescica pre-intervento,
3 dopo ureteroileostomia in pregresso k della vescica,
6 dovuti a manovre strumentali, 4 lesioni uroteliali
misconosciute con conferma citodiagnostica. Questa
positiva esperienza preliminare traccia un percorso volto
al riconoscimento di elementi esfoliati nelle urine e
può suggerire atipie da avviare ad approfondimenti
motivati e interdisciplinari per accelerare le diagnosi. Un
simile approccio in automazione si ipotizza anche in
altri campi diagnostici di citologia esfoliativa, garantendo
tracciabilità ed archiviazione immagini particolarmente
utili nei follow up. I casi studiati possono, infine, contribuire
alla realizzazione di un archivio immagini di cellule tipiche
e atipiche utili alla formazione del personale.
550
2
1
D. Cerasuolo , M. Cilento , F. Di Paola , R.
1
1
Quaranta , E. Cavalcanti
1
2
U. O. C. Medicina di Laboratorio, P. O. San Paolo, A. S.
L. Napoli 1 Centro
L'omocisteina è da tempo riconosciuta come importante
fattore di rischio trombotico ed i pazienti oncologici
sviluppano, con una frequenza piuttosto elevata,
complicanze tromboemboliche legate sia alla malattia di
base che alla chemioterapia (1). In tali pazienti pertanto
è di fondamentale importanza eseguire tutte le indagini
necessarie alla valutazione del rischio. Per il dosaggio
dell'omocisteina, l'HPLC in fase inversa, con rilevazione
fluorimetrica, rappresenta il metodo di riferimento (2),
ma non disponendo, nel nostro Laboratorio, di tale
strumentazione, abbiamo valutato le performances
analitiche di un metodo immunonefelometrico potenziato
al latice per tale dosaggio (N Latex HCY - Siemens
Diagnostici). La metodica è stata applicata al Nefelometro
BN ProSpec (Siemens Diagnostici) secondo le indicazioni
della Ditta produttrice. Abbiamo quindi effettuato il
confronto dei risultati con quelli ottenuti con metodo
HPLC. Lo studio dell'Imprecisione nella serie, sul nostro
sistema, è stato condotto analizzando un Pool di
plasma a livello normale (14.5 µmol/L), eseguendo 20
determinazioni e calcolando Media, DS e CV%, (CV =
1.95%). Per il calcolo dell'Imprecisione tra serie sono
state analizzate aliquote congelate a - 20°C del medesimo
pool per 15 giorni, eseguendo la stessa analisi statistica,
ottenendo un CV = 2.95%. Il confronto tra metodi è
stato effettuato analizzando 40 campioni di plasma da
pazienti ricoverati, anticoagulati con EDTA, raccolti in
modo random. I campioni, subito dopo l'arrivo, sono stati
centrifugati, separati, divisi in due aliquote e congelati
a - 20°C prima delle sedute analitiche. L'analisi della
regressione lineare indica che il metodo Nefelometrico
mostra un'ottima correlazione con quello HPLC (y=0.817x
+0.60, r=0.991, p<0.00001) nell'intervallo di valori studiati
da 5 a 204 µmol/L. Il metodo studiato, pertanto è
idoneo all'utizzo nei Laboratori che non dispongono di
strumentazione dedicata.
Bibliografia
1. Mecully K.S. Homocysteine and vascular disease. Nat.
Med. 1196,2:386-309
2. Gowacki R., Bald E. -J. Chromatogr. 2009,
877:3400-3404
325
VELOCITA' DI FILTRAZIONE GLOMERULARE
CALCOLATA CON L'EQUAZIONE CKD-EPI
VS L'EQUAZIONE MDRD: L'ESPERIENZA
DELL'AZIENDA OSPEDALIERA S. M. NUOVA DI
REGGIO EMILIA
1
1
2
2
326
CONFRONTO FRA DUE DIFFERENTI METODI
PER LA DETERMINAZIONE QUALITATIVA
DELL’ANTIGENE DI SUPERFICIE DELL’EPATITE
B (HBsAg) IN CAMPIONI DI SIERO SUL SISTEMA
AUTOMATICO VITROS ECi
1
1
1
A. Parisoli , L. Belloni , T. Lusenti , M. Corradini , S.
2
1
Pasquali , C. Dotti
1
Lab. Analisi Chimico Cliniche e di Endocrinologia, A.O.
S.M.Nuova di Reggio Emilia.
2
O.U. Nefrologia e Dialisi, A.O. S.M.Nuova di Reggio
Emilia.
L. Tomasicchio , A. Viniero , A.M. Rutigliano , V.
1
1
1
Masellis , R. Luce , F. Di Serio
1
A.O.U. Policlinico, Bari
Introduzione e scopo: l’equazione MDRD a “quattro
variabili” per la stima della velocità di filtrazione
glomerulare (GFR), usata di routine per la valutazione
della funzionalità renale, mostra limiti di precisione e
ingenera una sottostima agli alti valori di GFR.
Scopo dello studio è quello di confrontare la
classificazione della GFR calcolata con la nuova
equazione CKD-EPI (Ann Inter Med 2009; 150: 604-12)
rispetto all’equazione MRDR su un ampio numero di
campioni analizzati presso il Laboratorio Analisi Chimico
Cliniche e di Endocrinologia dell’Azienda Ospedaliera
S.M. Nuova di Reggio Emilia.
Disegno dello studio: il calcolo della GFR con le due
equazioni è stato eseguito sui prelievi di 62.820 pazienti
ambulatoriali (27.348 maschi e 35.472 femmine) afferenti
al nostro laboratorio di età compresa tra i 18 e 70 anni (età
media 50.2 anni). Dallo studio sono stati esclusi soggetti
di età inferiore ai 18 anni e i non caucasici. La creatinina
sierica è stata misurata mediante il metodo cinetico
Jaffè IDMS tracciabile (Modular , Roche Diagnostics,
Mannheim, Germany).
Risultati: 923 campioni (4.5%) classificati in stadio III
secondo la formula MDRD risultavano in stadio II secondo
l’equazione CDK-EPI. 12619 campioni (32%) classificati
in stadio II secondo la formula MDRD risultavano in stadio
I secondo l’equazione CDK-EPI. Il numero di pazienti non
risultava differente per le classi di GFR da 15 a 29 mL/
utilizza la tecnologia MicroWell per la determinazione
qualitativa dell’HbsAg sierico: dei 5 anticorpi monoclonali
anti HBs utilizzati, due sono biotinilati e tre sono marcati
con HRP. Le wells sono coattate con streptoavidina.
Secondo quanto dichiarato dall’azienda, la specificità del
test è = 99.88%; la sensibilità, determinata analizzando
diluizioni seriali del WHO 2nd International Standard
è <0.10 IU/mL; la sensibilità al valore di cut-off (cutoff =1) è = 0.066 IU/mL. Scopo del nostro lavoro è
stato quello di valutare la concordanza dei risultati per
presenza/assenza dell’HBsAg in campioni di siero, testati
in duplicato con il nuovo metodo di dosaggio e il metodo
preesistente (VITROS HBsAg).
Metodo. 228 campioni di siero, afferenti in regime di
routine al nostro laboratorio, sono stati analizzati su
strumentazione Vitros ECi con entrambi i metodi (VITROS
HBsAg e VITROS HBsAg ES).
Risultati. In 217 campioni i metodi hanno prodotto risultati
concordanti (n.120 positivi; n. 97 negativi). Per i restanti
campioni (n.11) si ottenevano valori borderline con il
metodo VITROS HbsAg (unità S/CO da 0.96 a 1.38).
Quando testati con il metodo VITROS HBsAg ES, dieci
campioni risultavano negativi (unità S/CO ES <0.9) ed uno
positivo (unità S/CO ES >1).
Conclusioni. I nostri dati preliminari evidenziano una
concordanza dei risultati = 95% e una maggiore
specificità del metodo VITROS HBsAg ES rispetto al
dosaggio VITROS HBsAg per valori prossimi al cut-off. I
risultati necessitano di conferma con metodi di biologia
molecolare.
2
2
min/1.73m e <15 mL/min/1.73m .
Discussione e conclusioni: i dati da noi ottenuti
concordano con quelli già riportati in letteratura, indicando
una maggiore accuratezza della formula CKD-EPI rispetto
alla MDRD nello screening della funzionalità renale
nell’ambito di una popolazione senza patologia accertata.
Infatti si riduce significativamente la percentuale di
pazienti erroneamente classificati in stadio III, suscettibili
di ulteriori indagini nefrologiche.
Introduzione e scopo del lavoro. Il nuovo metodo di
dosaggio VITROS HBsAg ES (Ortho Clinical Diagnostics),
è un metodo in chemiluminescenza potenziata che
TM
551
327
PRELIMINARY EVALUATION OF THE DRI®ETG
IMMUNOASSAY FROM THERMO FISHER
SCIENTIFIC ON THE ABBOTT ARCHITECT
C8000 CLINICAL CHEMISTRY ANALYZER BY
COMPARISON TO LC/MS
1
2
3
L. Germagnoli , J. Schumacher , B. Wilhelm , S.
1
4
Cingari , M. Boettcher
1
Lab. Unilabs Ticino. Breganzona, Switzerland
2
Centro Residenziale Cagiallo, Switzerland
3
Thermo Fisher Scientific, Clinical Diagnostics,
Estavayer-le-Lac, Switzerland
4
LOD Medizin Service, Dassau, Germany
Ethyl Glucuronide (EtG) is a ethanol direct metabolite,
which is formed in the liver by conjugation of ethanol
with glucuronic acid. EtG is present in various body
materials, but it is usually measured in urine samples
and a positive finding of EtG proves that the person
was exposed to ethanol. EtG is detected in urine with
a dose dependant manner and it can be detected in
urine until 80 hours from the last ingestion. Due to its
features, EtG seems to be suitable for monitoring alcoholic
patients in rehabilitation who are obliged to stay in total
abstinence. The reference method to measure EtG is
LC/MS, but an immunoassay was recently introduced
which can be applied on automated instruments. This
will permit a wider use of the EtG into the clinical
environment by a cost saving method and with fast results.
The first aim of our work was to verify the performance
of an EtG immunoassay in a clinical setting made by
patients in an alcohol withdrawal program monitored by
Centro Residenziale Ingrado Cagiallo. These patients
were lodged, but were permitted to stay at home during
the week end. EtG measurements were done by the
DRI ® EtG enzyme immunoassay from Thermo Fisher
Scientific, Microgenics GmbH, on an Abbott Architect
c8000 analyzer. Confirmatory analysis was done by LCMS/MS in LOD Medizin Service, Dassau. Preliminary
results were obtained from 10 patients from whom
samples were taken on Monday morning right after they
returned back to Cagiallo. In some cases consecutive
samples were taken the following (6 to 9). In total
78 samples were measured. The judgment about the
actual abstinence was made an expert MD. Confirmatory
analysis was made for 21 urine samples. The second aim
will be also to evaluate the performance of a lower cut-off
for EtG (100 ng/mL) compared to the widely accepted cutoff of 500 ng/mL. The results obtained are:
medium concentration in the patients 133 ng/ml, range
0-2000 ng/ml
The comparison analysis with LC/MS method is:
Deming regression Architect = 1.28 LC/MS + 31.97
correlation coefficient 0.9647
Passing – Bablok regression Architect = 1.30 LC/MS +
29.53 correlation coefficient 0.9773
These results suggest that the reagent can be used on
Architect analyzer.
Boettcher M, Brck O, Helander A. Evaluation of new
immunoassay for urinary ethyl glucuronide testing.
Alcohol Alcohol 2008; 43: 46-8
552
328
MISURA DELL’NT-ProBNP: DUE METODI A
CONFRONTO
1
1
1
1
P. De Vita , M. Brogi , R. Girolami , V. Sbolgi , R.
1
1
1
1
Palumbo , A. Ognibene , S. Rapi , B. Salvadori
1
Introduzione: La determinazione dei peptici natriuretici
ha assunto negli ultimi anni un’importanza sempre
maggiore sia nella diagnosi differenziale tra scompenso
cardiaco e malattie polmonari che per il monitoraggio
e la stratificazione del rischio dei pazienti affetti da
scompenso cardiaco (1) con un conseguente incremento
delle metodiche disponibili per la loro determinazione.
Scopo di questo lavoro è stato quello di confrontare
i valori dell’NT-ProBNP forniti dal metodo metodo
immunoenzimatico in chemiluminescenza (CLEIA)
Pathfast (Mitsubishi, Giappone) rispetto al metodo
enzimatico in immunofluorescenza (ELFA) utilizzato nella
routine del laboratorio (VIDAS-Biomerieux, Francia).
Materiali e Metodi: 103 campioni di siero
(range=20-20721pg/mL) pervenuti al laboratorio per la
determinazione del NT-proBNP sono stati analizzati in
parallelo con i due metodi sopracitati. La correlazione tra i
due metodi è stata valutata mediante regressione lineare
ed analisi di Bland-Altmam.
Risultati: la regressione lineare nel confronto tra i due
metodi è risultata: y = 1.39 x +118.25. Il coefficiente di
correlazione di Pearson ha fornito un valore di r2=0.982.
L’analisi secondo Blend Altman ha mostrato uno scarto
dalla media inferiore al 10% nel 51% dei campioni ed
inferiore al 20% nel 71%.
Discussione: nonostante una buona correlazione fra i
risultati, confermata anche dalla verifica degli scarti, i dati
evidenziano una netta differenza nei valori assoluti con
una sovrastima di circa il 40% per il metodo Pathfast.
1) Clerico A, Fontana M, Zyw L, Passino C, Emdin M. Clin
Chem 2007;53:813-22
329
CORRELAZIONE FRA L’INDICE DI EMOLISI
DEGLI STRUMENTI ADVIA 2400 (SIEMENS) E LA
CORRISPONDENTE CONCENTRAZIONE DI HB
MISURATA CON METODO SPETTROFOTOMETRICO
DI HARBOE
330
PREVENZIONE, SORVEGLIANZA E CONTROLLO
DELLA MALNUTRIZIONE NEL PAZIENTE
RICOVERATO: L’ESPERIENZA DELL’ASL 4
CHIAVARESE NEGLI ANNI 2006-2009
1
1
2
2
2
B. Salvadori , T. Rondelli , R. Notaro , M. Sica , G.
1
1
1
1
Materassi , D. De Ninno , F. Morandini , A. Ognibene
1
2
Unità di Genetica e Trasferimento Genico - Core
Research Laboratory - Istituto Toscano Tumori, Firenze.
Introduzione
Il rilascio di sostanze dai globuli rossi (emolisi) per
rottura meccanica durante il prelievo o per manipolazione
del campione può alterare la concentrazione sierica di
alcuni analiti ed interferire con le metodiche analitiche.
Quindi la conoscenza del grado di emolisi per esami
di chimica clinica è essenziale per valutare la corretta
determinazione delle sostanze la cui concentrazione ne
risulta influenzata (ad es. potassio, LDH ed altri enzimi
cellulari). Inoltre la quantificazione di Hb sierica può
essere utile nel monitoraggio delle forme di emolisi
intravascolare e per valutare la concentrazione di Hb
libera nelle sacche di emocomponenti.
Questo lavoro si propone di verificare la corrispondenza
del “Hemolytic Index” (HI) fornito dagli analizzatori Advia
2400 (Siemens) e la concentrazione di Hb sierica.
Materiali e Metodi
L’Advia 2400 stima l’emolisi del campione misurando sul
siero le assorbanze a 571 e 596 nm e calcolando, sulla
base di una formula proprietaria, l’indice HI.
La concentrazione di Hb è stata determinata in duplicato
sullo spettrofotometro Genesys 10 Bio (Spectronic) col
classico metodo di Harboe (Scand J Clin Lab Invest
1959;11:66) che utilizza la “correzione di Allen” (Clin
Chem 1984; 30:627) per escludere interferenze da
bilirubina, albumina e lipidi, secondo la formula: Hb (mg/
L)= 167,2*A 415 – 83,6*(A 380 +A 450 ) corretta per la
diluizione 1:10 del siero in carbonato di sodio 0,1 mg/ml.
HI e concentrazione di Hb sono stati determinati su 81
campioni di siero.
Risultati
Il valore medio di HI era 39.1 (DS 42.12). La
concentrazione di Hb determinata sugli stessi campioni
era in media 37.9 mg/dL (DS 39.8). I valori di HI e Hb
2
sono risultati linearmente correlati (R =0,99, y = 0.9411x
+ 1.0684). L’analisi di Bland-Altman mostra un bias medio
di 1.235 con 95% CI da 0.13 a 2.34; il bias è maggiore per
valori di HI ed Hb con concentrazioni Hb >150 mg/dl.
Conclusioni
La buona correlazione tra valore di HI e concentrazione
di Hb nel range studiato permette di utilizzare questo
parametro nella valutazione dell’attendibilità dei risultati
di esami di laboratorio che possono variare anche
notevolmente a causa di questa interferenza.
1
1
1
G. Devoto , V. Marrè , S. Massaro , F. Deiana , C.
1
2
2
Devoto , F. Gallo , C. Marchello
1
Lab. Analisi, ASL 4 Chiavarese, Lavagna
2
Dietetica e Nutrizione, ASL 4 Chiavarese, Lavagna
Scopo del presente lavoro è la valutazione
dell’applicazione dell’algoritmo diagnostico per la
prevenzione,
sorveglianza
e
correzione
della
malnutrizione nel Paziente Istituzionalizzato. Presso l’ASL
4 Chiavarese dall’anno 2005 è attiva la Struttura Semplice
di Dietetica composta da N° 1 Medico, N°1 Biologo
Nutrizionista e N°1 Dietista, per la gestione delle
Problematiche Nutrizionali sia per Pazienti Ricoverati
sia per Pazienti Ambulatoriali (Anoressia, Bulimia). Il
protocollo diagnostico prevede, sulla scorta di un lavoro
preliminare, l’applicazione di un Algoritmo Diagnostico
all’atto del ricovero, comprendente una valutazione
clinica dello stato nutrizionale del Paziente tramite il
metodo Subjective Global Assessment (S.G.A.) e la
determinazione della Prealbumina.Materiali e Metodi:
all’atto del ricovero è valutato lo stato nutrizionale del
Paziente tramite il S.G.A. e qualora il Paziente fosse
classificato a rischio di malnutrizione o francamente
malnutrito viene eseguita la determinazione della
Prealbumina quale fotografia del profilo biochimico
nutrizionale. In questi gruppi di Pazienti vengono
poste in atto tutte le misure terapeutiche e di
assistenza, suggerite dai Nutrizionisti e, a distanza
di 7 giorni vengono rideterminate le concentrazioni
sieriche della Prealbumina quale parametro di efficacia
degli interventi effettuati. Abbiamo registrato negli
anni 2006-2009 in quanti Pazienti è stato applicato
tale algoritmo diagnostico nei Reparti di Degenza
dell’ASL 4 Chiavarese.Risultati: abbiamo registrato un
incremento di applicazione dell’algoritmo così suddiviso
per numero di Pazienti studiati: Reparti Medici (280,
350, 342, 340), Reparti Chirurgici (23,40,31,58),
Neurologia (24,30,60,71), Rianimazione (66,88,42,76),
RSA (250,340, 290,367).
Discussione e prospettive:i nostri dati dimostrano
un graduale ma lento incremento dell’applicazione
dell’algoritmo diagnostico per la valutazione dello stato
nutrizionale nei Reparti di degenza. Nel 2010, in
collaborazione con la Struttura di Dietetica, stiamo
sviluppando un progetto aziendale coinvolgente 15
Strutture Residenziali per Anziani e Disabili del nostro
territorio presso le quali verrà applicato tale protocollo
diagnostico.
553
331
LA PREVENZIONE DEGLI INFORTUNI NEL
LABORATORIO
1
2
G. Magrì , M. Doria
1
Certificazione Qualità e Accreditamento ASL1 IM
2
SPP ASL1 IM
La prevenzione degli infortuni nel Laboratorio Analisi
costituisce un importante obiettivo, in quanto produce
importanti ricadute sull’organizzazione stessa. La
gestione della sicurezza con modelli UNI EN ISO9001/
OHSAS 18001 può costituire un investimento per
la gestione del Laboratorio e per tutto l’indotto. Un
sistema di prevenzione non idoneo,può portare ad una
sottovalutazione di tutte le buone norme comportamentali
da parte degli operatori con un aumento degli infortuni
e una lievitazione dei costi diretti e indiretti. L’INAIL ha
previsto riduzioni delle tariffe per le strutture che attuano
miglioramenti al disopra dei limiti stabiliti dalla legge.
Anche il Laboratorio Analisi dell’ASL 1 Imperiese si è
posta l’obiettivo di contrastare gli infortuni sul lavoro, a
tale fine la Gestione Qualità del Laboratorio si è resa
promotrice di un sistema di gestione della sicurezza
che si avvale, oltre che dell’operato del Servizio di
Prevenzione e Protezione aziendale, anche di quanto
realizzato all’interno dell’Azienda sulla base del Manuale
della Qualità Aziendale ISO 9001:2008.Il risultato atteso
è la diminuzione degli infortuni e la riduzione della polizza
denominata “oscillazione per prevenzione”.L’obiettivo
s’intende realizzato effettuato almeno un intervento tra
quelli tra quelli indicati nella Sez.A del modulo OT24 INAIL
o, almeno tre interventi tra quelli indicati nelle restanti
sezioni del modulo, di cui almeno uno nel settore della
formazione. Sistema Qualità del Laboratorio ha compilato
nel modulo OT24 INAIL i punti 2,16,21,22 relativi a
procedure in grado di contribuire alla riduzione il rischio
di infortuni in Laboratorio. In particolare siamo intervenuti
con esito positivo:sulle punture accidentali (il 70% di tutti
gli infortuni a rischio biologico e il 25-29% di tutti gli
infortuni)e a tale scopo i centri prelievo del laboratorio
Analisi,sono stati dotati di aghi muniti dei dispositivi
di sicurezza; sulle misure di prevenzione per il ridurre
il rischio da movimentazione manuale dei carichi.Una
maggiore sicurezza per i lavoratori non costituisce solo un
beneficio per i diretti interessati,ma è garanzia di migliori
prestazioni e risparmio economico.
554
332
FUNCTIONAL IMPAIRMENT IN VIDEO TERMINAL
OPERATORS IS RELATED TO LOW-GRADE
INFLAMMATION
1
1
1
F. La Farina , S. Riondino , F. Martini , R.
1
1
1
1
D'Alessandro , L. Polce , P. Ferroni , F. Guadagni
1
Dip. di Medicina di Laboratorio & Biotecnologie
Avanzate , IRCCS San Raffaele, Roma
Background Work-related musculoskeletal disorders
(WMSDs) are pathologies associated with exposure to
risk factors in the workplace. Progressive functional
impairments develop with chronic repetitive tasks possibly
involving inflammatory mediators (Carp SJ et al. Clin Sci
2007;112:305).
Objectives To analyze systemic pro-inflammatory
changes in relation to the possible occurrence of pain and
disability in video terminal operators (VTOs) undergoing
upper extremity repetitive stress.
Methods Pain assessments, classification and grade of
impairment relied on self-report measures of intensity,
sensory characteristics, responses, and coping to pain.
To this purpose, questionnaires were administered to
21 VTOs and to 21 matched controls. The inflammatory
status of the enrolled subjects was analyzed by testing
of serum high sensitive C-reactive protein (hsCRP) as
well as systemic levels or monocyte expression of proinflammatory cytokines interleukin-6 (IL-6) and tumour
necrosis factor-alpha (TNF).
Results Serum levels of both cytokines were significantly
increased in VTOs compared to control subjects
(p=0.005 for TNF and p=0.004 for IL-6). TNF levels
significantly correlated to IL-6 (p=0.019), which, in turn,
was associated to increased hsCRP (p=0.012). VTOs
with mild/moderate disability had higher serum hsCRP
(p=0.001) and IL-6 (p=0.035) levels than VTOs without
disabilities. Monocyte stimulatory TNF expression was
particularly robust in individuals with mild/moderate
disability. The increased monocyte expression of TNF was
independently associated to increased IL-6 expression
that, in turn, was an independent predictor of increased
systemic hsCRP levels together with the presence of mild/
moderate functional impairment and weekly commitment
to the display screen.
Conclusions The results obtained in the present study
indicated the occurrence of a low-grade inflammatory
condition in VTOs with mild/moderate disability and
confirm a role for inflammatory mediators in the biological
processes that underlie musculoskeletal disorders by
repetitive stress. The correct recognition of such a
response might allow the identification of apparently
healthy individuals at higher risk of developing WMSDs.
Partially supported by Italian Ministry of Health, Grant
RFIN06-PMS/40/06.
333
VALUTAZIONE DEL TRITEST IN UNA POPOLAZIONE
AMBULATORIALE CON ELEVATA INCIDENZA DI
MIGRANTI
1
1
1
334
OSMOLALITA' PLASMATICA MISURATA E
CALCOLATA IN PAZIENTI NORMO-, IPO- E
IPERSODIEMICI
1
1
1
1
A. Romero Alvarez , M. Mercadanti , G. Lippi
1
U.O Diagnostica Ematochimica, Dip. Patologia e
M. Vidali , G. Sulas , E. Beltrami , G. Bellomo
1
Introduzione
La trisomia 21 è la più frequente anomalia cromosomica
neonatale, con incidenza stimata di un caso su 800 nati.
Il tri-test è un test biochimico di screening che determina
tre analiti di origine fetale e/o fetoplacentare, valutati tra la
La valutazione dell’osmolalità plasmatica gioca un
ruolo chiave in molte situazioni cliniche, in particolare
nella medicina di emergenza, nel post-operatorio, nel
paziente con patologie renali, endocrine e con alterazioni
idroelettrolitiche. In questo lavoro abbiamo comparato i
valori di osmolalità misurata e calcolata in pazienti normo-,
ipo- e ipersodiemici.
L’osmolalità plasmatica è stata misurata, tramite
abbassamento del punto crioscopico (Advanced
Osmometer mod. 3300, A. De Mori, Milano) in
150 pazienti ospedalizzati, suddivisi in iposodiemici
(<125mEq/l, n=50), normosodiemici (135-145mEq/l,
n=50) e ipersodiemici (>155mEq/l, n=50). L’osmolarità
è stata calcolata utilizzando 3 differenti algoritmi:
1) Osm=2x[Na+] + glucosio/18 + AzotUr/2.8; 2)
Osm=(1.86x[Na+]) + glucosio/18 + AzotUr/2.8 + 9; 3)
Osm=(1.86x[Na+] + glucosio/18 + AzotUr/2.8)x1.09. Il gap
osmolare è stato derivato come differenza tra osmolalità
misurata e calcolata.
L’osmolalità misurata nel campione e nei 3 sottogruppi
(ipo-, normo- e iper-) era rispettivamente 314.4 mOsm/
Kg (DS 40.1), 276.3 (DS 21.4), 305.8 (DS 13.5), 361.4
(DS 21.9). Il gap osmolare medio nel campione e nei
3 sottogruppi, e l’intervallo al 95% (media ± 2DS), era
rispettivamente: 12.7 mOsm/l (da -8.3 a 33.7), 14.5 (da
-4.4 a 33.3), 13.4 (da -12.5 a 39.2), 10.2 (da -6.3 a 26.7)
con l’algoritmo 1; 23.3 (da 2.5 a 44.1), 22.3 (da 3.6 a 41.1),
23.9 (da -1.9 a 49.6), 23.8 (da 7.0 a 40.5) con l’algoritmo
2; 7.0 (da -14.2 a 28.2), 9.2 (da -8.9 a 27.5), 8.4 (da
-17.6 a 34.4), 3.2 (da -12.8 a 19.3) con l’algoritmo 3. La
frequenza di pazienti con gap osmolare >10 mOsm/l (cutoff ampiamente citato in letteratura e utilizzato in clinica)
nei differenti gruppi (ipo-, normo- e iper-) era: 58%, 54% e
40% (alg. 1), 94%, 96% e 92% (alg. 2), 42%, 25% e 12%
(alg. 3).
L’osmolalità calcolata non può mai sostituire quella
misurata; al contrario, l’utilizzo combinato dei due
parametri può fornire informazioni preziose per
l’inquadramento diagnostico del paziente. Tuttavia,
in considerazione dell’ampia distribuzione e della
dipendenza dall’algoritmo impiegato, l’utilizzo del gap
osmolare impone cautela. L’algoritmo 3 meglio si accorda
con quanto ci si attenderebbe sulla base dei meccanismi
fisiopatologici dell’iper- e dell’iposodiemia.
a
a
15 e la 18 settimana gestazionale.
Materiali e metodi
Sono stati esaminati i referti per tritest prodotti nell’anno
2009. I risultati sono stati valutati sulla base dell’etnia
(italiana I, straniera S) e dell’età anagrafica secondo
tre fasce di età (<25; 25-35; >35 anni). Le indagini
biochimiche (alfafetoproteina, gonadotropina corionica
beta, estriolo non coniugato) sono state eseguite su
Immulite 2000 (Medical Systems). L’elaborazione del
rischio è stato determinata con il programma Prisca.
Risultati
Nel 2009 sono stati eseguiti 737 tritest (343 gestanti I
e 373 S provenienti in parte dal Nord Africa e dall’ Est
Europa; 21 di etnia sconosciuta). Le gravide con età <25
anni erano 226, di cui 67 I e 149 S, 459 rientravano nella
fascia 25-35 anni (244 I, 205 S), 52 avevano oltre 35 anni
(32 I, 19 S). Gli indici di rischio per difetti del tubo neurale e
per trisomia 18 risultavano nella norma. L’indice di rischio
per trisomia 21 risultava aumentato in 13 casi (1.76%): 4
gestanti avevano un indice elevato (>1:50), per le restanti
il rischio era distribuito da 1:89 a 1:232. Sei gestanti erano
italiane (1.7%), una di età <25 anni, 5 nella fascia 25-35
anni; 7 gravide erano straniere (1.8%), di cui tre con età
compresa fra 25-35 anni e quattro >35 anni.
Discussione
I nostri dati evidenziano l’elevata incidenza di popolazione
non autoctona (50.6%) che accede al laboratorio pubblico
per eseguire il tritest, con netta differenziazione rispetto
alle gestanti italiane per quanto riguarda le fasce d’età.
Il 39.9% delle straniere era di età <25 anni contro
il 19.5% delle italiane, mentre nella fascia >35 anni
le italiane rappresentano il 9.3% contro il 5.1% delle
straniere. A fronte di questa eterogeneità in base all’età,
la percentuale di positività del rischio per trisomia
21 è invece sovrapponibile nei due gruppi. Ulteriori
studi potranno confermare questo rilievo e determinare
l’influenza dell’età e dell’etnia nel rischio di trisomia 21.
555
335
e-GFR: EQUAZIONI DI PREDIZIONE A CONFRONTO
SU UNA POPOLAZIONE CAMPIONE E
RICLASSIFICAZIONE DELLE CKD
1
1
2
A. Anesi , A.L. Tornesello , M. Farina , C.
1
1
1
1
Fontanella , L. Cerutti , C. Brera , M. Marchini , A.
1
1
1
Stringa , E. Gerola , S. Pittalis
1
U.S.C. Laboratorio Analisi, A.O. della Provincia di Lodi
2
U.S.C. Nefrologia e Dialisi, A.O. della Provincia di Lodi
Introduzione.
Persistono
ad
oggi
incertezze
sull’individuazione e corretta stratificazione dei pazienti
ambulatoriali nell’ambito dei cinque stadi delle malattie
renali croniche (CKD). A sostegno dell’implementazione
del filtrato glomerulare (e-GFR) stimato con CKD-EPI
proposta da Levey si confronta l’effetto della sua
applicazione su una popolazione campione rispetto alla
MDRD.
Materiali e Metodi. Il calcolo dell’eGFR è stato determinato
su 38543 pazienti (18695 maschi e 19848 femmine) di
età compresa tra 20 e 70 anni afferenti ai punti prelievo
dell’A.O. della Provincia di Lodi. La creatinina sierica è
stata dosata su analizzatori Beckman Coulter DXC800
con il metodo cinetico di Jaffè e standardizzata IDMS. Il
confronto tra l’e-GFR stimato con le due equazioni è stato
effettuato sia sulla popolazione generale che nelle classi
di età: 20-39, 40-59, 60-70 anni. Per ognuna di esse è
stata calcolata la frequenza dei singoli stadi delle CKD.
Risultati. Con la CKD-EPI vs MDRD si osserva una
differente distribuzione delle CKD, in particolare dei primi
tre stadi. L’applicazione della nuova formula, determina
infatti un aumento del 17,39% di pazienti nello stadio 1
(62% vs 44,7%); una riduzione del 16,02% nello stadio 2
(31,7% vs 47,8%); una riduzione dell’1,31% nello stadio
3 (3,6% vs 4,9%) e nessuna variazione significativa
negli stadi 4 e 5. Nelle classi di età comprese tra i
20-39 e i 40-59 anni si osserva un aumento di 1/3 dei
pazienti con stadio 1 (16,6% vs 12,3% e 29,2% vs 19.8%,
rispettivamente); una riduzione di 1/3 dei pazienti con
stadio 2 (2,5% vs 6,8% e 14,6% vs 23%, rispettivamente)
e di 1/5 di quelli con stadio 3 (0,07% vs 0,13% e 0,71% vs
1,17%, rispettivamente). Nella classe over 60 le differenze
rispettivamente riscontrate per gli stadi 1-3 sono state:
11,11% vs 9,06%; 18,8% vs 20,28% e 3,63% vs 4,22%.
Discussione e Conclusioni. L’utilizzo della formula CKDEPI sembrerebbe non solo migliorare l’efficienza di
screening nei pazienti under 60 anni per le classi 1
e 2 delle CKD, ma anche ridurre il numero di visite
ambulatoriali nefrologiche inappropriate nei pazienti over
60 classificati erroneamente con la MDRD entro lo stadio
3, minimizzando lo spreco economico e favorendo un
migliore utilizzo delle risorse destinate alla prevenzione.
556
336
DETERMINAZIONE DEI NEUROTRASMETTITORI
AMINOACIDICI NEI FLUIDI BIOLOGICI IN
ELETTROFORESI CAPILLARE
1
2
3
4
M. Sanna , A. Zinellu , G.A. Deiana , S. Manca , R.
4
4
1
1
Ginanneschi , S. Magliona , B. Scanu , E. Pisanu , L.
1
1
Deiana , C. Carru
1
2
Porto Conte Ricerche Srl, Tramariglio, Alghero,
Sassari, Italy
3
Dip. Di Neuroscienze E Scienze Materno Infantili, Univ.
di Sassari
4
Negli ultimi anni, il ruolo dei neurotrasmettitori aminoacidi
(NAA) nella funzione del sistema nervoso è stato
sottoposto ad una ricerca sempre più intensa. Tra
gli aminoacidi che hanno un ruolo importante tra i
neurotrasmettitori ricordiamo l’ Alanina (Ala), l'acido
glutammico (Glu), l’acido aspartico (Asp), la Serina
(Ser), la Taurina (Tau) e la glicina (Gly). Inoltre,
l'alterazione dei livelli dei NAA nei liquidi biologici
possono essere sintomatici di eventi patologici. È stata
recentemente osservata la correlazione tra i livelli
plasmatici di glutammato, alanina e serina e la gravità
della depressione. Inoltre, è stato notato che il Glu
ha importanti implicazioni nella malattia dell’Alzeimer,
nell'epilessia e nella schizofrenia. I livelli plasmatici di
taurina sono stati trovati alterata nei pazienti PD. I NAA
sono presenti nel plasma, nelle cellule e, in tracce, in
tutti i liquidi biologici, ma la loro determinazione nelle
complesse matrici biologiche ne rende difficile la loro
quantificazione. Per questo motivo abbiamo deciso di
mettere a punto un nuovo metodo in elettroforesi capillare
(CE) con il laser a fluorescenza indotta (LIF) con la
quale vengono risolti i campioni in meno di 12 minuti
usando un tampone fosfato (18 mmol/L ; pH 11.6). L'uso
di alte temperature (100°C) durante la derivatizzazione
del campione permette di ridurre drasticamente i tempi di
reazione a 20 minuti rispetto alle 6-14 ore descritte per la
reazione tra la FITC e gli AA a temperatura ambiente. Per
dimostrare la sua vasta gamma di applicazioni il metodo
è stato applicato per l'analisi di NAA nel plasma umano
e in altri tipi di campioni, come globuli rossi, urine, le
cellule in coltura, liquido cerebrospinale, saliva e umor
vitreo, evitando così la limitazioni tipiche degli altri metodi
normalmente adatte solo in uno o due tipi di matrice.
337
LA VALUTAZIONE DEL “TEST COMBINATO”: I
RISULTATI DI 3 ANNI DI LAVORO NELL'AZIENDA
USL 1 DI MASSA E CARRARA
1
1
1
338
EGFR: CREATININA, CIFRE SIGNIFICATIVE E
DIFFERENZA CRITICA (DCR). STUDIO SU UN
GRUPPO CAMPIONARIO DEL BACINO D'UTENZA
TEATINO
1
M. Panichi , M. Mosti , R. Bruzzi , G. Del Frate , E.
1
1
2
2
Mangia , C. Menconi , A. Santucci , A. Kemeny
1
Lab Analisi Chimico Cliniche e Microbiologiche, Osp.
Carrara, USL1, Massa e Carrara
2
UU.OO. Ostetricia e Ginecologia Azienda USL 1 di
Massa e Carrara
Il test combinato è un test di screening prenatale, eseguito
nel I° trimestre di gravidanza, basato sulla combinazione
della traslucenza nucale (NT) con il dosaggio dei livelli
plasmatici di free beta hCG, PAPP-A correlati con altri
fattori (età, peso, razza,fumo, diabete, fivet).
Questo esame fornisce un indice di rischio per la donna
sulla probabilità di essere portatrice di un feto affetto
da una specifica condizione o malattia permettendo
di indirizzare verso un percorso diagnostico invasivo
soltanto gestanti con un rischio superiore al cut-off.
In tre anni il test combinato è stato eseguito su 4526
gestanti, con una età media alla data del prelievo di 30,6
anni, di cui 713 (15,7%) con età > 35aa e 3813 (84,3%)
con età <35 aa.
La determinazione dell'età gestazionale mediante
misurazione della distanza vertice sacro, la misurazione
in triplo della NT e il prelievo ematico sono stati eseguiti
presso gli ambulatori di ginecologia dell'ASL 1 di Massa e
Carrara in due sedute programmate settimanali.
Il dosaggio della free beta hCG e della PAPP_A
è stato eseguito con strumentazione automatica in
chemiluminescenza (IMMULITE).
L'elaborazione dell'indice di rischio è stata effettuata
con software dedicato (PRISCA 4.0 Typolog Software)
adottando il cut-off di 1:250 .
Attualmente l'intero processo, incluso la consegna del
referto, viene effettuato nell'arco della mattinata.
Sul totale di 4526 gestanti, 249 sono risultate positive,
di cui 233 “falsi positivi” e 16 “veri positivi” ed 1 “falso
negativo”.
La percentuale dei falsi positivi risulta del 5,1 %, in linea
con il limite del 5 % imposto dall' UK National Screening
Committe e l'OAPR (Odds of Being Affected with Positive
Result).
La sensibilità del test è risultata essere del 94,11%, la
specificità del 94,83%, con un valore predittivo positivo
pari al 6,4% ed un valore predittivo negativo del 94,5%.
Considerando le 711 gestanti sopra i 35 anni, la sensibilità
è risultata del 100%, la specificità dell' 84,4%, con un
valore predittivo positivo del 4,3% ed un valore predittivo
negativo del 100%.
Di queste 711 gestanti soltanto 249 hanno eseguito
l'amniocentesi , mentre le restanti 462, pur essendo
candidate in base al solo fattore età, hanno evitato
l'esame invasivo.
1
1
C. De Fazio , C. Romano
1
Lab. di Patologia Clinica 1, P.O. SS. Annunziata, Chieti
Il nostro lavoro, in collaborazione con la Cl. Nefrologica,
aveva come scopo quello di un’analisi descrittiva del
eGFR del bacino di utenza di nostra appartenenza .
Abbiamo estratto dal LIS oltre 50.000 dati (gennaioaprile 2010) di creatinina mg/dL (chimica secca Vitros
IDMS) e dati anagrafici, che impostati in un foglio excel
appositamente creato da noi, sono stati utilizzati per
calcolare eGFR ( formula MDRD abbreviata )(1).
I dati sono stati filtrati per escludere i casi che non
potevano essere utilizzati , quindi abbiamo ulteriormente
affinato il calcolo ponendo il valore della creatinina ad una
e due cifre decimali per valutare se ci fosse una differenza
statistica significativa nel calcolo dell’eGFR.
Il test statistico non parametrico ( test Wilcoxon
z=-16; p=0.00; n=38.000) ci ha indicato una differenza
significativa fra i due gruppi campionari.
Inoltre abbiamo utilizzato lo stesso procedimento delle
cifre decimali per valutare la variazione del eGFR in uno
stesso soggetto con valori crescenti di creatinina sulla
seconda cifra decimale.
Il risultato ottenuto è stato valutato sia rispetto al valore
di eGFR che della Dcr (differenza critica basata sulla
Variabilità biologica).
Abbiamo utilizzato valori compresi fra 1,16 e 1,24 di
creatinina (M-64 anni) e, se l’approssimazione è al primo
decimale (1,2), il eGFR verrebbe sempre uguale a 60,95,
mentre utilizzando entrambe le cifre decimali il eGFR varia
da 63,39 a 58,69 con una differenza di – 7,93 %; la
differenza della creatinina è del 6,5%, inferiore alla Dcr
della creatinina (12%).
Se il test di Wilcoxon e la nostra prova dimostrano la
differenza sull’uso delle cifre decimali della creatinina
nella determinazione del eGFR rimane da valutare
l’impatto sulla valutazione clinica che sarà il prossimo
passo in collaborazione con il reparto di clinica
nefrologica.
(1) Andrew S., Levey, MD ; e altri A More Accurate
Method To Estimate Glomerular Filtration Rate from
Serum Creatinine: A New Prediction Equation
557
339
QUANDO IL RISPETTO DI UNA CONDIZIONE
PREANALITICA DI UN TEST DI LABORATORIO
“CARATTERIZZA “ UNA ORGANIZZAZIONE
COMPLESSA : IL CASO DELLA RICERCA DEL
SANGUE OCCULTO E LO SCREENING DEI TUMORI
DEL COLON RETTO
2
1
2
R. Corradini , G. De Girolamo , F. Rossi , F.
3
1
Torricelli , C.A. Goldoni
1
Servizio di Epidemiologia - Dip. di Sanità Pubblica AUSL di Modena
2
Programma Aziendale Screening Colon Retto -AUSL di
Modena
3
Dip. Patologia Clinica-NOCSAE -AUSL di Modena
La ricerca del sangue occulto rappresenta il test di 1
livello in molti programmi di screening dei tumori del
colon retto in ambito nazionale. Per questo motivo negli
ultimi anni l’attenzione si è particolarmente concentrata
sulle prestazioni analitiche del test e sulla necessità
di prevenire la degradazione della emoglobina fecale
conseguente a condizioni di conservazione (tempo e
temperatura) non ottimali .
Recentemente è stata dimostrato come in alcune
organizzazioni, nelle stagioni più calde, si possa verificare
un calo significativo del valore della concentrazione media
di emoglobina nelle feci con una possibile conseguente
riduzione della percentuale dei pazienti Fobt positivi da
avviare all’indagine colonscopica di approfondimento.
Nella nostra organizzazione il reclutamento della
popolazione bersaglio avviene lungo l’arco di tutto l’anno
ad eccezione di 3 settimane in agosto e 2 settimane
natalizie .
Si può quindi dire che il campione fecale venga raccolto,
consegnato e trasportato in tutte le stagioni .
Ci siamo proposti di verificare se anche nella nostra realtà,
caratterizzata dalla presenza di numerosi punti prelievo
sparsi sul territorio e da due soli laboratori che effettuano
l’analisi, ma con tempi stimati fra consegna del campione
ed analisi di 1-2 giorni, potesse essere evidenziata la
medesima tendenza .
Ad una prima valutazione dei dati( 139070 FOBT
eseguiti di cui 33705 in giu-ago) di uno studio
osservazionale retrospettivo(2005-2010) condotto sulla
nostra popolazione non sembra emergere un significativo
decremento estivo né del valore di emoglobina fecale
(Hb media nell’anno 49.41 ng/ml vs 48.46 media estiva)
né della percentuale di pazienti positivi (5.93 annuale vs
5.51% estate).
Riteniamo opportuno un ulteriore approfondimento dei
dati con particolare riguardo alla più puntuale correlazione
fra temperatura ambientale e esito del test prendendo
anche in considerazione tutte le variabili sia organizzative
che individuali in nostro possesso che possono
influenzare l’esito del test e confondere l’effetto supposto
della temperatura.
Bibliografia
Grazzini G.et al.Influence of seasonal variations
in ambient temperatures on performance of
immunochemical faecal occult blood test for colorectal
cancer screening :observational study from the Florence
district. Gut(2010).doi10.1136/gut.2009.200873
558
340
VALUTAZIONE EFFICACIA DELLA FORMULA CKDEPI COMPARATA ALLA FORMULA MDRD
1
1
1
V. Granero , M.R. Cavallo , E. Magnano , M.
1
1
1
1
Ostorero , D. Fortunato , E. Richetta , M. Lasina , G.l.
1
2
3
4
Crudo , A. Marciello , G. La Valle , M. Cavallo
1
Lab. Analisi di Pinerolo ASL TO3
2
Nefrologia Pinerolo ASL TO3
3
Direzione Sanitaria Osp. Riuniti di Pinerolo
4
Medico di Medicina Generale
Scopi ed Obiettivi
La malattia renale cronica (MRC) rappresenta un
problema di salute pubblica di prima grandezza.
Si stima che nella popolazione adulta un individuo su 10
abbia un’insufficienza renale moderata (espressa come
Filtrato Glomerulare (FG) minore o uguale di 60 ml/kg/m’
x 1,73 m2 ed evidenza di danno renale) cioè una funzione
renale dimezzata o più che dimezzata rispetto alla norma.
È pertanto evidente che l’individuazione precoce dei
pazienti a rischio di avanzata compromissione funzionale
renale rappresenta un importante mandato sanitario sulla
base del quale è possibile stratificarne il livello con
semplici indagini laboratoristiche (esame delle urine,
stima del filtrato glomerulare) che consentano azioni di
prevenzione.
Tra le indagini di screening su vasta scala la creatinina
(CRE) rappresenta indubbiamente il biomarcatore più
adatto perché facilmente standardizzabile, con basso
costo, eseguita in tutti i laboratori, ma non può essere
impiegata come stima del FG in quanto dipendente da età,
sesso, peso corporeo ed etnia.
Materiali e Metodi
Utilizzando il dosaggio della CRE sierica effettuata con
metodica Jaffè ricalibrata IDMS su Unicel DxC 800
Beckman Coulter, abbiamo rielaborato e confrontato le
formule MDRD e CKD-EPI per la valutazione del FG su
10.000 campioni che ci sono pervenuti in Laboratorio
durante il primo semestre 2010: 5.500 di esterni e 4.500
di ricoverati in area medica.
Successivamente, attraverso audit clinici con i MMG e i
Nefrologi abbiamo valutato i risultati.
Risultati
I dati sono stati stratificati in base ad età, sesso e valore
di FG (secondo MDRD) e comparati con la formula CKDEPI. Dal confronto è emerso che: per valori di FG inferiore
a 60, come già ampiamente dimostrato dalla letteratura,
l’equazione CKD-EPI correla meglio con la valutazione
clinica nella stima del FG; la formula MDRD sottostima il
FG in soggetti con funzionalità renale ed è inadeguata per
pazienti con gradi modesti di riduzione di FG.
Considerazioni Conclusive
In accordo con le Direzioni delle strutture di area medica
e di Presidio si procederà pertanto a refertare la e-GRF
utilizzando la formula CKD-EPI a partire dal primo ottobre
2010.
Bibliografia
A.S.Levey et al Ann Internal Med 2009
341
VALUTAZIONE DEL SISTEMA AUTOMATICO
SEDIMAX PER LO SCREENING DELLE
BATTERIURIE
1
1
1
1
S. Signorelli , R. Falbo , M.R. Sala , N. Venturi , P.
1
1
2
Mocarelli , P. Brambilla , P. Brambilla
1
Servizio Universitario di Medicina di Lab. Osp. di Desio,
Desio (MI)
2
DIMS, Medicina e Chirurgia, Univ. Milano Bicocca
Introduzione: Le infezioni delle vie urinarie (IVU) di
origine batterica sono tra le patologie infettive di più
comune riscontro. Il gold standard diagnostico delle
batteriurie è l’esame colturale, indagine che comporta
un notevole carico di lavoro e un elevato numero di
campioni che risultano negativi. Scopo dello studio è stato
quello di valutare le potenzialità del sistema SediMAX
(Menarini) come metodo di screening automatizzato delle
batteriurie al fine di sottoporre ad esame colturale solo i
campioni positivi. L’applicazione di questo metodo oltre ad
ottimizzare i processi analitici per la gestione delle IVU nel
laboratorio, consentirebbe di ridurre i tempi di risposta e
di migliorare l’impatto diagnostico sul paziente.
Materiali e metodi: Tra novembre 2009 e gennaio 2010
sono stati raccolti 1014 campioni di urina mitto intermedio
con richiesta di esame colturale. Tutti i campioni sono
stati sottoposti alla normale routine di semina su terreno
in piastra differenziale cromogeno CPS3 (Biomerieux)
e contemporaneamente processati con l’analizzatore
automatico Sedimax. I parametri considerati per la
valutazione sono stati la quantificazione dei batteri (>10
HPF) e la conta dei leucociti (>4 HPF). Il confronto tra i
due metodi è stato effettuato utilizzando come riferimento
4
l’esame colturale positivo con carica > 10 CFU/ml.
Risultati: Sono stati esclusi dallo studio 58 campioni che
presentavano al sedimento un sovraffollamento cellulare.
Dei 953 campioni inclusi nello studio 176 (18,5 %)sono
risultati positivi all’esame colturale e 777 (81,5%) negativi.
I risultati ottenuti con il sistema Sedimax sono stati i
seguenti: 492 (51,6%) campioni positivi e 461 negativi
(48,4%). Gli indici statistici di sensibilità e specificità sono
risultati rispettivamente 98,3% e 59,3 %, mentre il VPN è
pari al 99,3 % e il VPP è pari al 35,4 %.
Conclusioni: L’elevato valore di sensibilità e di VPN
ottenuti, oltre alla bassa percentuale di falsi negativi
(0.3%),indicano che il sistema SediMAX può essere
utilizzato per lo screening delle batteriurie. Per
ridurre il numero di falsi positivi è fondamentale la
corretta interpretazione da parte dell’operatore dell’esame
microscopico eseguito con lo strumento automatico.
342
AN INTEGRATED METABOLOMIC APPROACH
REVEALS OBESITY-RELATED DERANGEMENTS IN
KEY METABOLIC PATHWAYS IN HUMANS
1
2
3
R. Calvani , J. Gervasoni , G. Capuani , S.
2
3
4
Persichilli , A. Tomassini Miccheli , A. Iaconelli , B.
5
2
4
3
Zappacosta , C. Zuppi , G. Mingrone , A. Miccheli
1
Centro di Medicina dell'Invecchiamento, Dip. di Scienze
Gerontologiche, Geriatriche e Fisiatriche, Univ. Cattolica
del Sacro Cuore, Rome, Italy
2
Lab. Analisi I, Policlinico A. Gemelli, Rome, Italy
3
Dip. di Chimica, Univ. “La Sapienza”, Rome, Italy
4
Dip. di Medicina Interna, Univ. Cattolica del Sacro
Cuore, Rome, Italy
5
Centro di Ricerca e Formazione ad Alta Tecnologia
nelle Scienze Biomediche Giovanni Paolo II, Univ.
Cattolica del
Obesity is a complex multifactorial disease involving
genetic and environmental factors and influencing several
different metabolic pathways. Sophisticated metabolomic
analytical platforms and informatics tools have been
developed to study the metabolic phenotype of a
patient at the global level through both targeted and
untargeted analysis of molecules present in cells, tissues
or organisms. In this pilot study, we propose an integrated
metabolomic approach through complementary platforms
1
( H NMR, HPLC and LC-MS/MS of biofluids) to better
characterize the metabolic profile of morbidly obese
patients and the metabolic derangements in some key
pathways that occur in this peculiar pathology.
Urine and plasma samples from 15 morbidly obese
insulin-resistant (body mass index >40; homeostasis
assessment model of insulin resistance >3) male patients
and 11 age-matched controls were collected, frozen
1
and analyzed by high-resolution H NMR spectroscopy,
HPLC and LC-MS/MS; the resulting data were subjected
to multivariate statistical analysis (principal component
analysis and partial least squares discriminant analysis).
Untargeted NMR-based metabolomic analysis allowed
us to identify a urinary obesity-associated metabolic
phenotype (metabotype) that differs from that of lean
controls with gut microflora-associated metabolites (such
as hippuric acid, trigonelline, 2-hydroxyisobutyrate) being
the prominent contributors to this difference.
Targeted HPLC and LC-MS/MS-based analysis of
plasmatic metabolites involved in transmethylation
and transsulfuration processes revealed significant
differences between obese and lean subjects, with low
levels of homocysteine and glutathione characterizing the
morbidly obese phenotype.
The integration of multivariate mathematical models built
from both targeted and untargeted metabolomic analysis
allowed us to describe a metabolic profile of obese
patients and to find suggestive correlations between
urinary and plasmatic metabolites.
559
343
SCREENING BIOCHIMICO PRENATALE DEL PRIMO
TRIMESTRE: ESPERIENZA MULTICENTRICA
1
2
1
1
M. Brugua , A. Pettinari , F. Pasquini , V. Scocco , M.
1
Tocchini
1
Lab. Biochimica Clinica e Microbiologia. Azienda
Ospedali Riuniti Ancona
2
Lab. Citogenetica e genetica molecolare Azienda
Ospedali Riuniti Ancona
Negli ultimi anni lo screening biochimico su sangue
materno, per selezionare le gestanti con un rischio
aumentato di avere un feto affetto da Sindrome di Down
o da una patologia cromosomica, ha avuto un notevole
impulso. Il Test combinato in cui si tiene conto dell'età
materna, translucenza nucale e dosaggio ematico di freebeta HCG e PAPP-A nel primo trimestre rimane una delle
strategie migliori.(1)
Materiali e metodi
Tra il 01/01/2003 e il 31/12/2009 sono state esaminate
7450 donne in gravidanza (età media 32,8) seguite
presso gli ambulatori Ostetrico ginecologici dell’Ospedale
Riuniti di Ancona, Jesi e Fermo. I campioni di
sangue sono stati raccolti tra la 10 e 14 settimane
di gestazione. Le settimane sono state calcolate
mediante misurazione ecografia del CRL. I livelli di
free-HCG# e di PAPP-A nel sangue materno sono
stati analizzati mediante metodo immunoenzimatico in
chemiluminescenza (Medical Systems, Italia).
I dosaggi sono stati trasformati in multipli di mediana
(MoM) usando Prisca Typolog e corretti in base al peso,
alla razza, all’abitudine al fumo, al diabete e ad un
eventuale fecondazione in vitro. Il cut off di rischio per la
Trisomia 21è stato fissato a 1/350 a termine.
Risultati
Delle 7450 donne screenate sono risultate positive
399 (5.3%).325 (81,4%) ra le pazienti positive hanno
eseguito approfondimento diagnostico (amniocentesi o
villocentesi). Tra queste 23 presentavano anomalie
cromosomiche ed in particolare 15 un feto affetto da
Trisomia 21, 2 da Trisomia 18, tre triploide, 1 da Trisomia
13, 1 Xq e 1 da sindrome di Turner.
Non si sono avuti falsi negativi. Le prestazioni del test
sono state le seguenti: DR=100% FPR=5% OAPR=1:94,7
OANR=1:7051
Conclusioni
Il test combinato ha permesso di identificare non
solo trisomie 21 e 18 ma anche altre aneuploidie
cromosomiche. Il 50% delle gravide che presentavano feti
affetti avevano una età inferiore a 35 anni questo ci porta
a considerare la giusta utilità dello screening combinato
nelle donne più giovani. Solo il 13,4% delle donne con
età > 35 anni risultavano positive al test, evitando così
all’ 86.6% di queste gravide di sottoporsi ad una diagnosi
prenatale invasiva.
(1) Malone FD et al. First and Second Trimester
Evaluation of Risk (FASTER) trial: principal results of the
NICHD multicenter Down syndrome screening study. Am
J Obstet Gynecol. 2003;189:S56
560
344
EVALUATION OF OXIDATIVE STRESS IN
ERYTROCYTES OF PATIENTS WITH POLYCYSTIC
OVARY SYNDROME
1
1
1
3
C. Cosma , D. Faggian , P. Hoxha , C. Fiore , G.
4
4
4
4
Donà , L. Bordin , E. Tibaldi , G. Clari , D.
2
1
Armanini , M. Plebani
1
Dept.. of Laboratory Medicine, Univ. of Padua, Italy
2
Dept. of Medical and Surgical Sciences, Univ. of
Padua, Italy
3
Dept. of Gynecological and Surgical Sciences, Univ. of
Padua, Italy
4
Dept. of Biological Chemistry, Univ. of Padua, Italy
Patients with polycystic ovary syndrome (PCOS)
have insulin resistance and hyperinsulinemia. Studies
have evidenced that PCOS is associated with an
inflammatory status and a deficiency of chiroinositolcontaning phosphoglycan, a mediator of insulin action.
Administration of D-chiroinositol was able to increase
the insulin action and improve the ovulatory function.
The aim of this study was to investigate a possible
inflammatory role of erythrocytes in this disease in vitro,
to measure the Tyr-phosphorylation level of erythrocytes
band 3 after diamide treatment. Diamide is known to
induce alteration in the erythrocytes membrane, which, in
presence of pre-existing pathological conditions, triggers
higher Tyr-phosphorylative response. We analyzed the
effect of inositol on both basal and diamide-treatment
conditions, on erythrocytes from patients suffering from
PCOS. None of the patients were taking any drugs nor had
any other inflammatory disease in the past three months.
Blood was collected in fasting conditions and erythrocytes
were washed and incubated in their autologous plasma
at 20% hematocrit for 24h at 35°C, in presence or
absence of 2 mM inositol. 1,5mM diamide was then
added and incubation was prolonged for further 30
min. Membranes were recovered, analyzed by Western
blotting and immunorevealed with anti P-Tyr antibodies.
Our results show that diamide induces higher band 3
Tyr-P level in erythrocytes from patients (185%±20%
compared to subject controls), indicating pre-existing
oxidative assault in all cases of PCOS. Pre-treatment with
inositol significantly reduced diamide-induced band 3 TyrP level in PCOS, thus resembling control samples, whose
Tyr-P was only slightly modified by inositol pre-treatment.
This study has confirmed that women with PCOS do
have an inflammatory status involving also circulating
erythrocytes and that inositol treatment greatly improves
erythrocytes response to oxidative assault. This effect is
not genomic and maybe it is superimposed to the known
genomic inflammatory parameters related to aldosterone
and to other substances.
345
ESPERIMENTI PRELIMINARI PER LA VALUTAZIONE
DEI CAMPIONI ITTERICI ANCHE IN CASO DI
EMOLISI
1
1
1
2
P. Brunori , P. Masi , L. Faggiani , L. Villani , M.
4
3
3
3
3
Tronchin , C. Laube , A. Leoni , M. Demi , A. La Gioia
1
Lab. Analisi, Osp. Villamarina, Piombino (LI)
2
Lab. Analisi, Osp. Cecina (LI)
3
Lab. Analisi, Spedali Riuniti Livorno
4
Abbott Diagnostics-Roma
La misurazione della bilirubinemia (Bil) è spesso
ostacolata dalla contemporanea presenza di emolisi
(H) come fattore interferente. L'entità dell' interferenza
dipende non solo dal valore di H ma anche da quello di
Bil (1). Nei moderni analizzatori automatici la presenza
di H può essere quantificata attraverso un opportuno
test, detto di interferenza, il cui valore blocca o lascia
passare il risultato di Bil. La misurazione di Bil, però,
riveste particolare importanza ed urgenza nei neonati a
causa dei possibili problemi scatenati dall’ittero. In questi
pazienti la ripetizione del prelievo, molto difficoltosa a
causa del ridotto calibro ematico e della bassa volemia,
riproduce spesso il problema. Per tentare di limitare questi
inconvenienti abbiamo approfondito l’effetto di H sulla
misurazione di Bil, partendo da pool di plasma di campioni
non emolisati con vari gradi di ittero. Per ottenere una
emolisi standardizzabile campioni non itterici venivano
emolisati manualmente. Aliquote fisse (1/10 del volume
totale) di plasma emolisato a diverse concentrazioni
venivano aggiunte a corrispondenti aliquote itteriche
(9/10). Il valore misurato del grado di emolisi (H mis)
e della bilirubinemia (Bil H mis) veniva confrontato con
il valore ottenuto senza interferente (Bil° con aggiunta
1/10 fisiologica). I dati dimostrano che il rifiuto di un
campione emolisato deve tenere conto non solo del
grado di H mis, ma anche del valore Bil H mis in quanto
l’interferenza risente anche del valore Bil°. L’analisi
secondo regressione lineare delle curve di decadimento
BilHmis vs H mis (modello: BilH mis = Bil° + m x Hmis) mostra
tale correlazione (pendenza = (9±3) x 10-3 mg/dL) anche
se il processo inverso (calcolare Bil° da Hmis e BilHmis)
risulta difficoltoso per i valori alti di Hmis. Utilizzando il
modello delle curve di livello in cartografia è stata però
costruita (Fig 2) una mappa del livello di interferenza I% in
base ad Hmis e BilHmis. Con questa possiamo posizionare
un paziente e stimare qualitativamente il suo Bil° da
BilHmis ed Hmis.
561

42° Congresso Nazionale SIBioC

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