De Nadal

XIV CONVEGNO NAZIONALE
DELLA SOCIETÀ ITALIANA
PER LE RICERCHE
SULLE RADIAZIONI
(S.I.R.R.)
Trieste, 24 - 27 Giugno 2008
Effetto della crio-conservazione
sulla risposta di sistemi biologici a
raggi γ
Viviana De Nadal
INFN-Laboratori Nazionali di Legnaro,
Legnaro-Padova
Per la collaborazione CRIORAD
26 Giugno 2008
CRIORAD
(CRyo-preserved cells
and
IOnizing RAdiation Damage)
V. De Nadal
INFNINFN-LNL
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Partecipanti collaborazione CRIORAD
INFN-Cagliari: INFN-LNF:
A. Brunetti
R. Bedogni
M. Carpinelli
A. Esposito
N. Diaz
P.L. Fiori
B. Golosio
G.L. Masala
P. Oliva
P. Randaccio
S. Santona
INFN-LNGS:
L. Zamai
M. Balata
S. Nisi
M. Laubenstein
Istituto di Istologia ed analisi di
Laboratorio, Università di Urbino:
G. Cugia
V. De Nadal
INFNINFN-LNL
INFN-LNL:
R. Cherubini
V. De Nadal
S. Gerardi
INFN-Pisa:
U. Bottigli
Laboratorio di Patologia Clinica AO
San Salvatore di Pesaro, Pesaro:
F. Centis
M. Valentini
S. Stramigioli
W. Cesarini
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Sia nell’ambito della ricerca che nella pratica clinica, i
sistemi biologici vengono mantenuti per lunghi periodi di
tempo in condizioni di crioconservazione con
rallentamento o arresto delle attività metaboliche cellulari
Sistemi biologici crioconservati per molto tempo sono
esposti a dosi protratte della radiazione del fondo
ambientale (in particolare raggi γ)
I sistemi biologici crioconservati non possono riparare i
danni prodotti dalla radiazione di fondo se non dopo lo
scongelamento con possibile accumulo di danno
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SCOPO DEL LAVORO
Effetto della crio-conservazione sulla risposta di
sistemi biologici a raggi γ
Valutazione della risposta, in termini di vari
end-points biologici, di sistemi biologici diversi mantenuti in
condizioni di crio-conservazione e in condizioni
ambientali normali, a seguito di esposizione a raggi γ in
funzione della dose e del rateo di dose, "mimando"
l'esposizione al fondo naturale per un intervallo
temporale di anni o decine di anni.
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SISTEMI BIOLOGICI
Coltura batterica di E.coli (Cagliari)
Cellule mononucleari di sangue periferico
umano (LNGS)
Cellule V79 di Hamster cinese (LNL)
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Coltura Batterica: E.coli
End-points biologici:
induzione di mutanti
I batteri mutanti sono stati isolati in terreno selettivo
contenente D-Cicloserina.
I batteri vitali sono stati quantificati con il conteggio delle
CFU
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Coltura Batterica: E.coli
I campioni di batteri congelati e non-congelati sono
stati irraggiati con una sorgente gamma
(di 137Cs) a 67 Gy
in dose frazionata
(2 minuti di irraggiamento e 1 di riposo)
Rateo di dose: 2.2 Gy/min
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Peripheral blood mononuclear cells
PBMC
End-points biologici:
processo apoptotico
Il processo apoptotico è stato valutato con citofluorimetria,
subito dopo scongelamento e a 24, 48 e 72 ore
con o senza stimolazione del mitogeno fitoemoagglutinina
(PHA)
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Peripheral blood mononuclear cells
PBMC
I linfociti sia congelati che non congelati sono stati
irradiati con raggi γ (137Cs) a dosi di 0.3 e 3.0 Gy
in dose unica (acuta) e a 0.9 Gy sia in dose
unica che frazionata
(3 dosi intervallate da 3 ore)
Rateo di dose: 3.1 Gy/min
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Cellule V79
End-points biologici:
Sopravvivenza cellulare
La sopravvivenza cellulare è stata determinata sulla
capacità delle cellule di formare colonie di almeno 50
unità
Induzione di mutazioni al locus Hprt
Le cellule mutanti al locus Hprt sono state isolate in
terreno selettivo contenente 6-tioguanina
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Cellule V79
Le cellule V79 ciclanti e congelate sono state
irradiate alle dosi di 0.5, 1 e 3 Gy di raggi γ con
una sorgente di 60Co del CNR-FRAE/INFN-LNL
ad un rateo di dose di 1 Gy/min e con una
sorgente di 137Cs al Dip. di Oncologia
(Università di Padova)
ad un rateo di dose di 3 Gy/min
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RISULTATI
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Coltura Batterica: E.coli
Numero di mutanti per 105 cellule di E. coli
Non-congelati
Congelati
Exp.1
43 +/- 12
15 +/- 7
Exp.2
70 +/- 26
36 +/- 7
Exp.3
48 +/- 25
24 +/- 13
Exp.4
83 +/- 31
24 +/- 10
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Peripheral blood mononuclear cells
Percentuale di morte cellulare specifica di PBMC congelati dopo
irraggiamento con singola dose di 0.3 e 3 Gy di raggi γ
senza e con stimolazione mitogenica (PHA)
Cell death of frozen lymphocytes
Cell death of frozen lymphocytes
100
90
80
70
60
0,3 Gy frozen
lymphocytes
50
3,0 Gy frozen
lymphocytes
40
30
20
10
0
Percentage of specific cell death
Percentage of specific cell death
100
90
80
70
0,3 Gy frozen
lymphocytes
60
50
40
3,0 Gy frozen
lymphocytes
30
20
10
0
24h -PHA
48h -PHA
72h -PHA
Time of incubation
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24h +PHA
Senza PHA
48h +PHA
72h +PHA
Time of incubation
Con PHA
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Confronto della percentuale di morte cellulare specifica tra
PBMC non-congelati e congelati dopo irraggiamento con
singola dose di 0.9 Gy o con dose frazionata di 3x0.3 Gy
0,9 Gy dose radiation
0,9 Gy dose radiation
100
90
80
70
fractionated
dose fresh
Lymphocytes
60
50
fractionated
dose frozen
lymphocytes
40
30
20
10
0
Percentage of specific cell death
Percentage of specific cell death
100
90
80
70
single dose
fresh
lymphocytes
60
50
singole dose
frozen
lymphocytes
40
30
20
10
0
24h -PHA
48h -PHA
72h -PHA
24h -PHA
Time of incubation
48h -PHA
72h -PHA
Time of incubation
Senza PHA
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Con PHA
0,9 Gy radiation
percentage of specific cell death
100
90
80
fractionated
dose fresh
lymphocytes
70
60
50
fractionated
dose frozen
lymphocytes
40
30
20
10
0
24h +PHA
48h +PHA
72h +PHA
Time of incubation
Percentage of specific cell death
0,9 Gy radiation
100
90
80
Single dose
fresh
lymphocytes
70
60
50
single dose
frozen
lymphocytes
40
30
20
10
0
24h +PHA
48h +PHA
72h +PHA
Time of incubation
I PBMC irraggiati in crioconservazione presentano una morte cellulare
specifica minore rispetto ai PBMC irraggiati non-congelati
indipendentemente dal
frazionamento della dose e dalla stimolazione mitogenica
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Cellule V79
Curve di sopravvivenza cellulare di cellule V79
non-congelate e congelate
media - cell proliferanti
media - cell congelate
1
SF
SF
1
Model: lin
Chi^2 = 0.84838
R^2
= 0.95738
alfa
0.23672
Model: lin
Chi^2 = 0.54729
R^2
= 0.6277
±0.03111
alfa
0,1
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0.13582
±0.0573
0,1
0,0
0,5
1,0
dose (Gy)
1,5
2,0
2,5
3,0
dose (Gy)
Media 3-4 exp.
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Induzione di mutazioni al locus Hprt in cellule V79
non-congelate e congelate
5
media - cell proliferanti
media - cell congelate
4
4
3
3
-5
MF (x 10 )
-5
MF (x 10 )
5
2
1
0
2
1
0
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0,0
0,5
dose (Gy)
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
dose (Gy)
Media 3 exp.
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CONCLUSIONI
I risultati ottenuti dalle tre linee di ricerca:
sono coerenti tra loro
sembrano suggerire un effetto protettivo della
crioconservazione contro i danni indotti da radiazione
Date le differenze tra le 3 linee di ricerca
(sistemi biologici, end-points valutati
e facilities di irraggiamento γ),
l’effetto protettivo non può essere attribuito al
metodo sperimentale.
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21
Referenze bibliografiche:
GERMAN E.:
'Cool' crystals: macromolecular cryocrystallography and radiation damage.
Curr Opin Struct Biol. 2003 Oct;13(5):545-51. Review.
TAUXE R.V.;
Food safety and irradiation: protecting the public from foodborne infections.
Emerg Infect Dis. 2001;7(3 Suppl):516-21.
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Software per il
“conteggio automatico delle
colonie cellulari”
cellulari
Il prototipo del sistema di conta automatico, realizzato, è basato principalmente su
algoritmi di region-growing per l’estrazione delle regioni d’interesse dell’immagine
(ROI), di una rete neurale di Sanger per la caratterizzazione di tali regioni e da un
classificatore. La classificazione finale migliore è fornita da una rete neurale feedforward (FF-NN) con un errore sulla conta del 2% su un campione di 150 piastre
Petri.
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