Dispense Archivo

Analisi chimico-tossicologica applicata
all’ambito sportivo (antidoping)
Dr. Gianluca Bartolucci
Analisi chimico-tossicologica applicata all'ambito sportivo (antidoping)
• Cenni storici
• Definizione di Doping
• Diffusione delle pratiche doping e sfruttamento dello sport a fini politici
• Istituzione della World Anti-Doping Agency (WADA)
• Codice Wada
• Introduzione alla Spettrometria di Massa
• Applicazioni Anti-Doping
• Si svolsero con cadenza quadriennale dal 776 A.C. al 393 A.C.
• Avevano carattere religioso
• Le competizioni in cui gli atleti si
misuravano erano:
Stadion (gara di corsa, circa 200 m)
Diaulos (corsa sulla distanza doppia
dello Stadion)
Dolicos (corsa di resistenza)
Pugilato
Lotta
Pancrazio
Hoplitodromos (Corsa con le armi)
Pentathlon (Salto in lungo, Lancio del
giavellotto, Lancio del disco, Corsa,
Lotta)
Gare equestri (Corse dei carri e dei
cavalli)
I vincitori delle gare erano fatti
oggetto di ammirazione e immortalati
in poemi e statue
Per questo erano disposti a
ingerire qualsiasi preparato che
potesse aumentare il loro
rendimento fisico, inclusi estratti
di funghi e semi di piante.
… l'importante non è vincere, ma partecipare…
…l'importante nella vita, non è trionfare ma
combattere, non è d'aver vinto ma di essersi ben
battuto.
Thomas J. Hicks vincitore della
maratona olimpica del 1904 (St.
Louis) dopo la squalifica di Fred
Lorz.
Quest’ultimo, approfittando della
nube polvere alzata dai veicoli a
seguito della corsa, coprì la
maggior parte del percorso in auto
per poi scendere a pochi chilometri
dall’arrivo e tagliare il traguardo
come vincitore.
Una volta scoperto dichiarò che si
trattava di uno scherzo.
Lo stesso Hicks,
secondo le
norme vigenti,
sarebbe stato
squalificato.
Durante la corsa i suoi assistenti gli hanno
somministrato due dosi di stricnina, la prima non aveva
dato i risultati sperati, e del brandy
1896: Arthur Linton morì due mesi dopo
aver vinto la Parigi-Bordeaux (580 Km).
La sua morte è stata messa in relazione
all’assunzione di “trimethyl” (cocktail di
stricnina,cocaina …….)
1949: Alfredo Falzini morì dopo la corsa Milano-Rapallo a
causa di assunzione di amfetamine
Coppi dichiarava tranquillamente di fare
uso (ma sotto controllo medico) di
simpamina (un paio di pillole nel finale
delle gare più impegnative) e talvolta di
trattamenti alla stricnina (come in
occasione dei mondiali da lui vinti nel '53)
Anquetil dichiarava che “…solo un pazzo
immaginerebbe che si possa correre in
bicicletta al freddo, al caldo, sotto la
pioggia e in montagna solo con l’acqua…”
Knud Enemark Jensen, durante la
prova della 100 Km di ciclismo a
squadre alle Olimpiadi di Roma nel
1960, collassò, cadde si fratturò il cranio
e fu dichiarato morto poche ore dopo in
un ospedale di Roma. L’autopsia mostrò
la presenza di amfetamine e Roniacol
(un vasodilatatore periferico)
Tom Simpson morì durante
l’ascesa del mont Ventoux nel
Tour de France del 1967. Anche in
questo caso l’autopsia mostrò la
presenza di amfetamine
Il termine Doping probabilmente deriva dalla parola
olandese “Dop” con cui si chiamava una bevanda
alcolica a base di vinacce utilizzate dai guerrieri Zulu,
al fine di migliorare le loro abilità in battaglia.
Il termine è diventato attuale intorno al 20°secolo,
in origine si riferiva alla somministrazione di
farmaci e sostanze di varia natura che potessero
migliorare le prestazioni dei cavalli da corsa.
CODICE ANTI-DOPING
DEL COMITATO OLIMPICO INTERNAZIONALE
Articolo 2:
Il Doping è:
1. l’uso di un espediente (sostanza o metodo) che possa
essere potenzialmente pericoloso per la salute
dell’atleta e/o capace di migliorarne la prestazione, o
2. la presenza nell’organismo dell’atleta di una Sostanza
Proibita o l’evidenza del suo uso o l’evidenza dell’uso di
un Metodo Proibito.
1967 - Prima lista di sostanze proibite
1968 - Analisi Antidoping:
X Giochi Olimpici Invernali di Grenoble
XIX Olimpiade di Mexico City (1 positività)
Atleta svedese vincitore, insieme
alla sua nazionale, della
medaglia di bronzo nel pentatlon
moderno; squalificato perché
positivo all’etanolo.
Dichiarò di aver bevuto un paio
di birre per calmarsi prima della
prova di tiro con la pistola.
Analisi Antidoping
Problem of the detection of anabolic steroids. Gas chromatographic
and mass specific possibilities
By Donike, Manfred
From Sportarzt + Sportmedizin (1975), 26(1), 1-6.
Language: German, Database: CAPLUS
Progress in the analysis, identification and quantification of doping
substances
By Donike, Manfred
From Entwickl. Fortschr. Forensischen Chem., Int. Symp. (1982), 217-27.
Language: German, Database: CAPLUS
Routine determination of anabolic steroids in urine
By Donike, Manfred; Zimmermann, J.; Baerwald, K. R.; Schaenzer, W.;
Christ, V.; Klostermann, K.; Opfermann, G.
From Deutsche Zeitschrift fuer Sportmedizin (1984), 35(1), 14-16, 21-4.
Language: German, Database: CAPLUS
Ben Johnson 100 m: positivo Stanozololo
Florence Griffith 100 m: “negativa” al controllo antidoping
Florence Griffith-Joyner: (Los Angeles, 21
dicembre 1959 – Mission Viejo, 21 settembre
1998) è stata un'atleta statunitense.
Palmarès:
Olimpiadi Los Angeles 1984:
Argento 200 metri
Mondiali Oro Roma 1987
Oro 4 x 100 metri
Argento 200 metri
Olimpiadi Seoul 1988:
Oro 100 metri
Oro 200 metri
Oro 4 x 100 metri
Argento 4 x 400 metri
World Record :
100m 10”49 (1988)
200m 21”34 (1988)
¾World Record 800 metri: 1'53"28 (1983)
Evidenze indirette sul doping:
i record che non tramontano mai
¾ 1983 Jarmila Kratochvilova (Cecoslovacchia), 800 metri:
1'53"28
¾ 1985
41"37
2012 Staffetta femminile DDR,
USA, 4x100 metri: 40"82
¾ 1985 Marita Koch (DDR), 400 metri: 47"60
¾ 1986 Jurgen Schult (DDR), lancio del disco: 74,08 m.
¾ 1986 Yuriy Sedykh (URSS), lancio del martello: 86,74 m.
¾ 1987 Natalya Lisovskaya (URSS), lancio del peso: 22,63 m.
¾ 1987 Stefka Kostadinova (Bulgaria), salto in alto: 2,09 m.
Evidenze indirette sul doping:
i record che non tramontano mai
¾ 1988 Staffetta femminile URSS, 4x400 metri: 3’15’’17
¾ 1988 Gabriele Reinsch (DDR), lancio disco: 76,80 m.
¾ 1988 Galina Chistyakova (URSS), salto in lungo: 7,52 m.
¾ 1988 Florence Griffith (USA), 100 e 200 metri: 10"49 e
21"34
¾ 1988 Jackie Joyner-Kersee (USA), eptatlon: 7291 punti
¾ 1990 Randy Barnes (USA), lancio del peso: 23,12 m.
IL CASO DDR
Dopo la caduta del muro di Berlino (1989) agli inizi degli anni ‘90
le autorità della Germania unificata scoprono i file con i nomi degli
oltre 10.000 atleti della Germania dell’Est che avevano ricevuto
sostanze dopanti come parte di un piano governativo segreto
• Sistematica selezione di talenti naturali
che venivano raccolti in speciali scuole
• Realizzato un uso sistematico di
sostanze dopanti
• Nel ’66 inizia l’uso di steroidi anabolizzanti tra gli atleti
maschi
• Olimpiadi di Città del Messico nel ’68: somministrazione di
steroidi alle atlete
• La DDR è seconda nel medagliere olimpico nel ‘76-’80-’88
• A Montreal ’76 la DDR di nuoto femminile vince 11 delle
13 gare in concorso
• La clearance degli steroidi anabolizzanti veniva calibrata
per ciascun atleta di punta, in modo da predire dopo
quante ore dall’ultima somministrazione di testosterone il
rapporto testosterone/epitestosterone (T/E) sarebbe
ritornato nella norma
Frankle WW et al, Clinical Chemistry 1997
Il sistema della DDR fu unico:
• Per il diretto controllo governativo
• Per il sistema di selezione dei talenti
• Per il trattamento di molti atleti senza il
loro consenso
Frankle WW et al, Clinical Chemistry 1997
Heidi Krieger
nata a Berlino, 15 giugno
1966, campionessa
europea getto del peso
1986, DDR
Andreas Krieger
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Caduta del muro di Berlino
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Germania unita
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• Morti tra i ciclisti (1987-1990)
• Nuotatrici cinesi (1992-1994)
• 1998 esplode lo scandalo
doping al Tour de France
La nuotatrice cinese Yuan Yuan: assunzione di
somatotropina (ormone crescita) ai Campionati
del Mondo del 1997
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•
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•
Ormone della crescita (Gh)
IGF 1
Anabolizzanti
Salbutamolo
Eritropoietina
Ferro, Folati, Vitamine
Caffeina
Cortisone
Trasfusione di sangue (omologa)
Lo spagnolo Jesus Manzano, ex
leader della formazione spagnola
Kelme, ha confessato di recente che
in una sola giornata poteva sottostare
anche a dieci – dodici assunzioni di
farmaci diversi. Siamo al limite
dell’accanimento terapeutico
Legge 14 dicembre 2000, n. 376
"Disciplina della tutela sanitaria delle attività sportive e della lotta contro il doping"
Art. 1.
(Tutela sanitaria delle attività sportive. Divieto di doping)
1. …….
2. Costituiscono doping la somministrazione o l’assunzione di farmaci o di sostanze biologicamente o farmacologicamente attive e l’adozione o la sottoposizione a pratiche mediche non giustificate da condizioni patologiche ed idonee a modificare le condizioni psicofisiche o biologiche dell’organismo al fine di alterare le prestazioni agonistiche degli
atleti.
3. Ai fini della presente legge sono equiparate al doping la somministrazione di farmaci o
di sostanze biologicamente o farmacologicamente attive e l’adozione di pratiche mediche
non giustificate da condizioni patologiche, finalizzate e comunque idonee a modificare i
risultati dei controlli sull’uso dei farmaci, delle sostanze e delle pratiche indicati nel
comma 2.
Art. 9.
(Disposizioni penali)
1. … è punito con la reclusione da tre mesi a tre anni e con la multa da lire 5 milioni a lire
100 milioni chiunque procura ad altri, somministra, assume o favorisce comunque l’utilizzo
di farmaci o di sostanze biologicamente o farmacologicamente attive, …
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Articolo 1:
Si definisce doping la violazione di
una o più delle regole indicate
dall’articolo 2.1 all’articolo 2.8 del
Codice.
Articolo 2:
Gli atleti e gli accompagnatori sono responsabili della conoscenza di ciò che
costituisce una violazione delle regole anti-doping e delle sostanze e dei metodi che
sono stati inclusi nella lista delle sostanze e dei metodi vietati.
Costituiscono violazione del regolamento anti-doping:
2.1: la presenza di una sostanza vietata o di un suo metabolita o di un marker nel
campione biologico prelevato all’atleta;
2.2: l’uso o il tentativo di uso di una sostanza vietata o di un metodo vietato;
2.3: il rifiuto di fornire il campione biologico o qualsiasi tentativo di evadere il prelievo
da parte dell’atleta, senza motivata giustificazione;
2.4: la violazione delle regole relative alla disponibilità dell’atleta per controlli fuori
competizione (test a sorpresa);
2.5: la manomissione o il tentativo di manomissione di una qualsiasi parte del controllo
anti-doping;
2.6: il possesso di sostanze vietate o di metodi vietati;
2.7: il traffico di sostanze o metodi vietati;
2.8: la somministrazione o il tentativo di somministrare una sostanza vietata o un
metodo vietato ad un atleta, o aiutarlo, incoraggiarlo, e qualsiasi altro tipo di complicità
che preveda la violazione del regolamento anti-doping.
THE 2009 PROHIBITED LIST
WORLD ANTI-DOPING CODE
Valid 1 January 2009
The use of any drug should be limited
to medically justified indications.
All Prohibited Substances shall be
considered as “Specified Substances”
except Substances in classes S1, S2,
S.4.4 and S6.a, and
Prohibited Methods M1, M2 and M3.
SUBSTANCES AND METHODS
PROHIBITED AT ALL TIMES
(IN- AND OUT-OF-COMPETITION)
S1. ANABOLIC AGENTS
Anabolic agents are prohibited.
1. Anabolic Androgenic Steroids (AAS)
a. Exogenous* AAS, including:
1-androstendiol (5á-androst-1-ene-3â,17â-diol ); 1-androstendione (5á-androst-1-ene-3,17-dione); bolandiol (19-norandrostenediol); bolasterone;
boldenone; boldione (androsta-1,4-diene-3,17-dione); calusterone; clostebol; danazol (17á-ethynyl-17â-hydroxyandrost-4-eno[2,3-d]isoxazole);
dehydrochlormethyltestosterone (4-chloro-17â-hydroxy-17á-methylandrosta-1,4-dien-3-one); desoxymethyltestosterone (17á-methyl-5á-androst-2en-17â-ol); drostanolone; ethylestrenol (19-nor-17á-pregn-4-en-17-ol); fluoxymesterone; formebolone; furazabol (17â-hydroxy-17á-methyl-5áandrostano[2,3-c]-furazan); gestrinone; 4-hydroxytestosterone (4,17â-dihydroxyandrost-4-en-3-one); mestanolone; mesterolone; metenolone;
methandienone (17â-hydroxy-17á-methylandrosta-1,4-dien-3-one); methandriol; methasterone (2á, 17á-dimethyl-5á-androstane-3-one-17â-ol);
methyldienolone (17â-hydroxy-17á-methylestra-4,9-dien-3-one); methyl-1-testosterone (17â-hydroxy-17á-methyl-5á-androst-1-en-3-one);
methylnortestosterone (17â-hydroxy-17á-methylestr-4-en-3-one); methyltrienolone (17â-hydroxy-17á-methylestra-4,9,11-trien-3-one);
methyltestosterone; mibolerone; nandrolone; 19-norandrostenedione (estr-4-ene-3,17-dione); norboletone; norclostebol; norethandrolone;
oxabolone; oxandrolone; oxymesterone; oxymetholone; prostanozol (17â-hydroxy-5á-androstano[3,2-c] pyrazole); quinbolone; stanozolol;
stenbolone; 1-testosterone (17â-hydroxy-5á-androst-1-en-3-one); tetrahydrogestrinone (18a-homo-pregna-4,9,11-trien-17â-ol-3-one); trenbolone
and other substances with a similar chemical structure or similar biological effect(s).
b. Endogenous** AAS when administered exogenously:
androstenediol (androst-5-ene-3â,17â-diol); androstenedione (androst-4-ene-3,17-dione); dihydrotestosterone (17â-hydroxy-5á-androstan-3-one) ;
prasterone (dehydroepiandrosterone, DHEA); testosterone and the following metabolites and isomers: 5á-androstane-3á,17á-diol; 5á-androstane3á,17â-diol; 5á-androstane-3â,17á-diol; 5á-androstane-3â,17â-diol; androst-4-ene-3á,17á-diol; androst-4-ene-3á,17â-diol; androst-4-ene-3â,17ádiol; androst-5-ene-3á,17á-diol; androst-5-ene-3á,17â-diol; androst-5-ene-3â,17á-diol; 4-androstenediol (androst-4-ene-3â,17â-diol); 5androstenedione (androst-5-ene-3,17-dione); epi-dihydrotestosterone; epitestosterone; 3á-hydroxy-5á-androstan-17-one; 3â-hydroxy-5áandrostan-17-one; 19-norandrosterone; 19-noretiocholanolone.
2. Other Anabolic Agents, including but not limited to:
Clenbuterol, selective androgen receptor modulators (SARMs), tibolone,
zeranol, zilpaterol.
Gli steroidi anabolizzanti vengono utilizzati per:
• incrementare la massa, la forza e la potenza muscolare
• sollecitare una maggiore carica agonistica.
Il loro utilizzo a scopo di doping risale ai Giochi Olimpici del 1956.
Tali sostanze sono state vietate dal C.I.O. nel 1974.
Effetti lesivi degli steroidi anabolizzanti includono:
• tossicità a carico del fegato
• tossicità degli apparati cardiovascolare e endocrino
• sviluppo di tumori e disturbi psichiatrici
• diminuzione delle dimensioni dei testicoli e della produzione di sperma
• donne mascolinizzazione (aumento della peluria, ingrossamento della
voce, perdita del tessuto mammario e interruzione del ciclo mestruale
• assunzione da parte di adolescenti può causare l'arresto della crescita
incidendo sullo sviluppo alle estremità delle ossa lunghe.
S2. HORMONES AND RELATED SUBSTANCES
The following substances and their releasing factors, are prohibited:
1. Erythropoiesis-Stimulating Agents (e.g. erythropoietin (EPO),
darbepoietin (dEPO), hematide);
2. Growth Hormone (GH), Insulin-like Growth Factors (e.g. IGF-1),Mechano
Growth Factors (MGFs);
3. Chorionic Gonadotrophin (CG) and Luteinizing Hormone (LH) in males;
4. Insulins;
5. Corticotrophins;
and other substances with similar chemical structure or similar biological effect(s).
Eritropoietina (EPO)
• è un ormone prodotto dal rene che agisce stimolando la proliferazione e la
formazione di globuli rossi maturi.
• L’aumento dei globuli rossi comporta un miglioramento della capacità
massimale di captazione dell'ossigeno. In altre parole la maggiore
disponibilità di ossigeno durante lo sforzo muscolare migliorerebbe il
metabolismo energetico (metabolismo aerobico), favorendo l'utilizzo di acidi
grassi e diminuendo la formazione di acido lattico.
• L'assunzione di EPO ricombinante è un metodo doping particolarmente
attraente per l'atleta perchè è molto simile alla forma nativa.
• La sostanza permane per breve tempo nell'organismo, a differenza dei
suoi effetti che persistono per diverse setttimane dopo la sospensione del
trattamento.
• Il ricorso all'EPO comporta rischi non trascurabili per la salute dell'ateta
correlati all'aumento della viscosità del sangue e della pressione arteriosa.
Livelli di ematocrito superiori al 55% possono causare convulsioni,
encefalopatia, trombosi e infarto del miocardio. L'iperviscosità ematica è
particolarmente insidiosa al termine di competizioni che comportano forte
disidratazione.
Ormone della crescita (GH)
• è impiegato a fini anabolizzanti in quanto accresce la massa muscolare e
riduce i depositi di grasso.
• Agisce sull'accrescimento dei tessuti, determina la ritenzione dell'azoto e
favorisce l'incorporazione degli aminoacidi nelle proteine, influisce sul
metabolismo dei carboidrati (aumenta i livelli di glucosio nel sangue) e su
quello dei lipidi.
• Attualmente viene preferito agli steroidi in quanto è difficilmente
accertabile attraverso i controlli anti-doping.
• E’ radicata la convinzione di poter ottenere gli effetti desiderati senza
incorrerre negli effetti secondari degli anabolizzanti steroidei.
• Gli effetti collaterali del GH includono reazioni allergiche, effetti
diabetogeni e acromegalia nel caso di somministrazioni a dosi elevate.
Gonodotropina corionica
• è un ormone prodotto fisiologicamente durante gravidanza.
• In ambito sportivo viene assunta dagli atleti maschi allo scopo di
stimolare il testicolo a produrre ormoni androgeni prima delle prove
atletiche.
• Il testicolo sintetizza sia testosterone che epitestosterone, il rapporto
testosterone/epitetosterone che si riscontra nelle urine rimane invariato o
addirittura diminuisce pur essendo aumentato il livello assoluto di
testosterone (per questo motivo la somministrazione della gonadotropina
corionica è considerata alla stregua di quella del testosterone).
• Previene l'inibizione della funzione testicolare e l'atrofia testicolare
indotta dalla protratta assunzione di androgeni.
• Il suo abuso può causare ginecomastia.
S4. HORMONE ANTAGONISTS AND MODULATORS
The following classes are prohibited:
1. Aromatase inhibitors including, but not limited to:
anastrozole, letrozole, aminoglutethimide, exemestane, formestane, testolactone.
2. Selective estrogen receptor modulators (SERMs) including, but not limited to:
raloxifene, tamoxifen, toremifene.
3. Other anti-estrogenic substances including, but not limited to:
clomiphene, cyclofenil, fulvestrant.
4. Agents modifying myostatin function(s) including but not limited to:
myostatin inhibitors.
S5. DIURETICS AND OTHER MASKING AGENTS
Masking agents are prohibited. They include:
Diuretics, probenecid, plasma expanders (e.g. intravenous administration of
albumin, dextran, hydroxyethyl starch and mannitol) and other substances
with similar biological effect(s).
Diuretics include:
Acetazolamide, amiloride, bumetanide, canrenone, chlorthalidone, etacrynic acid, furosemide, indapamide, metolazone, spironolactone,
thiazides (e.g. bendroflumethiazide, chlorothiazide, hydrochlorothiazide), triamterene, and other substances with a similar chemical structure
or similar biological effect(s) (except drosperinone and topical dorzolamide and brinzolamide, which are not prohibited).
M1. ENHANCEMENT OF OXYGEN TRANSFER
The following are prohibited:
1. Blood doping, including the use of autologous, homologous or heterologous blood or red blood cell
products of any origin.
2. Artificially enhancing the uptake, transport or delivery of oxygen, including but not limited to
perfluorochemicals, efaproxiral (RSR13) and modified haemoglobin products (e.g. haemoglobin-based
blood substitutes,microencapsulated haemoglobin products).
M2. CHEMICAL AND PHYSICAL MANIPULATION
1. Tampering, or attempting to tamper, in order to alter the integrity and validity of Samples collected during
Doping Controls is prohibited. These include but are not limited to catheterisation, urine substitution
and/or alteration.
2. Intravenous infusions are prohibited except in the management of surgical procedures, medical
emergencies or clinical investigations.
M3. GENE DOPING
The transfer of cells or genetic elements or the use of cells, genetic elements or pharmacological agents
to modulating expression of endogenous genes having the capacity to enhance athletic performance, is
prohibited.
Peroxisome Proliferator Activated Receptor δ (PPARδ) agonists (e.g. GW 1516)
and PPARδ-AMP-activated protein kinase (AMPK) axis agonists (e.g. AICAR) are
prohibited.
THE 2009 PROHIBITED LIST
WORLD ANTI-DOPING CODE
Valid 1 January 2009
The use of any drug should be limited
to medically justified indications.
All Prohibited Substances shall be
considered as “Specified Substances”
except Substances in classes S1, S2,
S.4.4 and S6.a, and
Prohibited Methods M1, M2 and M3.
SUBSTANCES AND METHODS
PROHIBITED IN-COMPETITION
S6. STIMULANTS
All stimulants (including both their D- & L- optical isomers where relevant) are prohibited, except imidazole
derivatives for topical use and those stimulants included in the 2009 Monitoring Program*.
Stimulants include:
a: Non Specified Stimulants:
Adrafinil; amfepramone; amiphenazole; amphetamine; amphetaminil; benzphetamine; benzylpiperazine; bromantan; clobenzorex; cocaine; cropropamide;
crotetamide; dimethylamphetamine; etilamphetamine; famprofazone; fencamine; fenetylline; fenfluramine; fenproporex; furfenorex; mefenorex;
mephentermine; mesocarb; methamphetamine(D-); methylenedioxyamphetamine; methylenedioxymethamphetamine; pmethylamphetamine; modafinil;
norfenfluramine; phendimetrazine; phenmetrazine; phentermine; 4-phenylpiracetam (carphedon); prolintane.
A stimulant not expressly listed in this section is a Specified Substance.
b: Specified Stimulants (examples):
Adrenaline**; cathine***; ephedrine****; etamivan; etilefrine; fenbutrazate; fencamfamin; heptaminol; isometheptene; levmetamphetamine; meclofenoxate;
methylephedrine****; methylphenidate; nikethamide; norfenefrine; octopamine; oxilofrine; parahydroxyamphetamine; pemoline; pentetrazol;
phenpromethamine; propylhexedrine; selegiline; sibutramine; strychnine; tuaminoheptane
and other substances with a similar chemical structure or similar biological effect(s).
* The following substances included in the 2009 Monitoring Program (bupropion,caffeine, phenylephrine,
phenylpropanolamine, pipradol, pseudoephedrine, synephrine) are not considered as Prohibited Substances.
** Adrenaline associated with local anaesthetic agents or by local administration (e.g. nasal,
ophthalmologic) is not prohibited.
*** Cathine is prohibited when its concentration in urine is greater than 5 micrograms per milliliter.
**** Each of ephedrine and methylephedrine is prohibited when its concentration in urine is greater than 10
micrograms per milliliter.
Gli stimolanti sono impiegati in quanto:
1. aumentano il livello di vigilanza
2. riducono la fatica
3. aumentano l'agonismo e l'aggressività
Effetti indesiderati degli stimolanti:
• breve durata d’azione, bisogna somministrarli subito prima se non
durante la gara
• terminata l’azione determinano un effetto “post-sbornia”
• perdita della capacità di valutazione
• aumento della pressione arteriosa
• aumento della frequenza cardiaca
• emicrania
• se la dose è alta e i fattori esterni sono sfavorevoli si può arrivare alla
morte del soggetto.
S7. NARCOTICS
The following narcotics are prohibited:
Buprenorphine, dextromoramide, diamorphine (heroin), fentanyl and its derivatives, hydromorphone, methadone, morphine, oxycodone,
oxymorphone, pentazocine, pethidine.
S8. CANNABINOIDS
Cannabinoids (e.g. hashish, marijuana) are prohibited.
S9. GLUCOCORTICOSTEROIDS
All glucocorticosteroids are prohibited when administered by oral, intravenous, intramuscular or rectal routes.
In accordance with the International Standard for Therapeutic Use Exemptions, a declaration of use must be
completed by the Athlete for glucocorticosteroids administered by intraarticular, periarticular, peritendinous,
epidural, intradermal and inhalation routes, except as noted below.
Topical preparations when used for auricular, buccal, dermatological (including iontophoresis/phonophoresis),
gingival, nasal, ophthalmic and perianal disorders are not prohibited and neither require a Therapeutic Use
Exemption nor a declaration of use.
SUBSTANCES PROHIBITED IN
PARTICULAR SPORTS
P1. ALCOHOL
Alcohol (ethanol) is prohibited In-Competition only, in the following sports. Detection will be conducted by
analysis of breath and/or blood. The doping violation threshold (haematological values) is 0.10 g/L.
Aeronautic (FAI)
Archery (FITA, IPC)
Automobile (FIA)
Boules (IPC bowls)
Karate (WKF)
Modern Pentathlon (UIPM) for disciplines involving shooting
Motorcycling (FIM)
Ninepin and Tenpin Bowling (FIQ)
Powerboating (UIM)
P2. BETA-BLOCKERS
Unless otherwise specified, beta-blockers are prohibited In-Competition only, in
the following sports.
Aeronautic (FAI)
Archery (FITA, IPC) (also prohibited Out-of-Competition)
Automobile (FIA)
Billiards and Snooker (WCBS)
Powerboating (UIM)
Bobsleigh (FIBT)
Boules (CMSB, IPC bowls)
Bridge (FMB)
Curling (WCF)
Golf (IGF)
Gymnastics (FIG)
Motorcycling (FIM)
Modern Pentathlon (UIPM) for disciplines involving shooting
Ninepin and Tenpin Bowling (FIQ)
Sailing (ISAF) for match race helms only
Shooting (ISSF, IPC) (also prohibited Out-of-Competition )
Skiing/Snowboarding (FIS) in ski jumping, freestyle aerials/halfpipe and
snowboard halfpipe/big air
Wrestling (FILA)
Beta-blockers include, but are not limited to, the following:
Acebutolol, alprenolol, atenolol, betaxolol, bisoprolol, bunolol, carteolol,
carvedilol, celiprolol, esmolol, labetalol, levobunolol, metipranolol,
metoprolol, nadolol, oxprenolol, pindolol, propranolol, sotalol, timolol.
In questo “manuale” è descritto:
• il personale responsabile dei prelievi
dei campioni di sangue e/o urina
• i requisiti dei locali in cui si effettuano
tali procedure
• la procedura di raccolta del campione
da sottoporre a test anti-doping
• le modalità di spedizione del campione
al laboratorio
• pianificazione dei prelievi al di fuori
delle competizioni sportive
• le informazioni che l’atleta deve fornire
alla federazione sportiva di
appartenenza per permettere il prelievo
in qualsiasi momento (“whereabouts”)
1-Notifica del Test
2-Preparazione al
prelievo
3-Scelta del
portacampione
4-Raccolta del
campione sotto
supervisione
5-Scelta Kit
portacampione
6-Suddivisione del
campione nelle
aliquote A e B
7-Controllo tenuta
bottiglie
8-Controllo pH e
densità
9-Raccolta dei dati
dell’atleta
10-Sottoscrizione
dell’atleta
1-Notifica del Test
2-Preparazione al
prelievo
3-Scelta del
portacampione
4-Raccolta del
campione sotto
supervisione
5-Scelta Kit
portacampione
6-Suddivisione del
campione nelle
aliquote A e B
7-Controllo tenuta
bottiglie
8-Controllo pH e
densità
9-Raccolta dei dati
dell’atleta
10-Sottoscrizione
dell’atleta
Il laboratorio accreditato WADA
deve garantire:
• Alta produttività
• Elevata sensibilità analitica
• Rispetto delle norme ISO/IEC 17025
• Risultati legalmente difendibili
Esistono 34 Laboratori accreditati
WADA in tutto il mondo (dati riferiti
al Gennaio 2004)
In Italia:
• Laboratorio Antidoping (Roma)
accreditato WADA
• 3 laboratori regionali (Legge 376/2000)
(Toscana, Piemonte, Veneto)
• Un laboratorio anti-doping accreditato deve essere in grado di
ricercare tutte le sostanze proibite ed i metodi proibiti per cui esista
un test scientificamente accettato e riconosciuto internazionalmente.
Oltre all’urina deve essere in grado, in proprio o con il supporto di
altra struttura, di eseguire analisi su campioni di sangue (ematocrito,
conta reticolocitaria, conc. emoglobina, ecc.).
• Inoltre deve assicurare una valida CATENA di CUSTODIA del
campione che comprende:
-Tracciabilità (dalla ricezione, aliquotazione, fino al rapporto di
analisi)
- Corretta conservazione
- Anonimato
Minimum Required Performance Levels
Che cos’è la Spettrometria di Massa ?
pe07677_
Che cos’è la Spettrometria di Massa ?
Joseph John Thomson, influenzato dagli studi di
Maxwell e dalla scoperta dei raggi X, dedusse che i
raggi catodici erano composti da particelle di carica
negativa, che chiamò corpuscoli, e che sono oggi
noti come elettroni (1897).
Tale scoperta gli consentì di
vincere il Nobel in fisica nel 1906
Che cos’è la Spettrometria di Massa ?
Forza di Lorenz
In fisica si chiama forza di Lorentz la forza che agisce su un oggetto
elettricamente carico che si muove in un campo magnetico. La forza di Lorentz è
sempre diretta perpendicolarmente rispetto alla direzione del moto.
B
v
z
F
Forza di Lorenz
In fisica si chiama forza di Lorentz la forza che agisce su un oggetto
elettricamente carico che si muove in un campo magnetico. La forza di Lorentz è
sempre diretta perpendicolarmente rispetto alla direzione del moto.
B
La spettrometria di massa
B
zz
Forza di Lorenz
Fcentripeta = Bzv
mv 2
Fcentrifuga =
r
mv2
= Bzv
r
m Br
=
z
v
La spettrometria di massa
Uno spettrometro di massa è uno strumento in grado di
misurare la massa di una molecola dopo che essa è stata
ionizzata.
In realtà la grandezza che viene misurata non è la massa
molecolare, ma il rapporto massa/carica degli ioni che si formano
dalla molecola in esame.
Uno spettrometro di massa può essere immaginato come un
sistema a scatole chiuse, ognuna delle quali svolge una funzione.
Spettrometro di Massa
Turbo pumps
Diffusion pumps
Rotary pumps
Ecc…
Sistema in alto vuoto
Ingresso
Sample Plate
Target
HPLC
GC
Solids probe
Sorgente
Ionica
MALDI
ESI
IonSpray
FAB
APCI
EI/CI
Filtro di
Massa
TOF
Quadrupole
Ion Trap
Mag. Sector
FTMS
Detector
Microch plate
Electron Mult.
Hybrid Detec.
Data
System
PC’s
UNIX
Mac
Spettrometro di Massa
PC
Componenti di uno Spettrometro di Massa
Nota che la sorgente ionica non sempre è posizionata all’interno del
compartimento sotto vuoto dello spettrometro. Esistono infatti sorgenti ioniche che
operano a pressione atmosferica (Elettrospray, APCI, ecc…)
La spettrometria di massa
Uno dei requisiti fondamentali dell’analita da analizzare è che esso si
trovi in fase gassosa. Per questo i primi sistemi spettrometrici erano in
grado di analizzare solo composti volatili.
Con lo sviluppo tecnologico della tecnica è diventato invece possibile
analizzare anche sostanze in fase liquida o addirittura solida.
Secondo lo schema visto in precedenza, un’analisi di massa si svolge
secondo le seguenti tappe:
1) Introduzione del campione nel sistema
2) Produzione degli ioni
3) Separazione degli ioni in base al loro rapporto m/z
4) Rivelazione
Il progresso tecnologico della strumentazione analitica ha permesso di abbassare
drasticamente il limite di sensibilità delle analisi, consentendo quindi di rilevare
molecole sempre meno abbondanti.
Quantità da misurare
Peso (g)
n° di molecole *
Tecnica analitica
Milligram (mg)
10-3
1018
1016
NMR
Microgram (µg)
10-6
1015
1013
IR, UV
Nanogram (ng)
10-9
1012
1010
FID, NPD, UV,
FL,
Picogram (pg)
10-12
109
107
MS
Femtogram (fg)
10-15
106
104
MS
Attogram (ag)
10-18
103
101
MS
Leptogram (lg)
10-21
100
100
??
Yoctogram (yg)
10-24
<1
<1
??
*: per un MW di circa 300 Steroide
*: per un MW di circa 30.000 Proteina
Elevata sensibilità analitica
Ionizzazione Elettronica
Adatto per composti piccoli (< 800-1200 Da), volatili e termicamente stabili.
Le molecole gassose sono “bombardate” da un fascio di elettroni ad alta energia
(70 eV). L’interazione dell’analita con gli elettroni può essere sufficientemente
energetica da eccitarla e, tornando al suo livello fondamentale, perdere un
elettrone, formando un catione radicale.
M + e- Æ M+ · + 2e-
Ionizzazione Elettronica:
Schema di frammentazione
La spettrometria di massa: Quadrupolo
Ionizzazione Elettronica:
Frammentazione del Metanolo
CH3OH + 1 e- Æ CH3OH+ · + 2 eL’energia così impartita e l’instabilità
dello ione molecolare possono
causarne la rottura in frammenti più
piccoli. Il metanolo ad esempio può
frammentare in diversi modi, dando
origine sempre ad un frammento
carico e uno che rimane neutro:
CH3OH+.(molecular ion)
(or) CH3OH+.(molecular ion)
CH2OH+(fragment ion) + H.
CH3+(fragment ion) + .OH
Lo schema di frammentazione è
caratteristico per ogni molecola
Ricerca in Libreria
La spettrometria di massa
194
100
109
55
50
0
15
10
28
20
30
67
42
44
40 50
82
94
70
60
70
80
122
136
150
O
N
N
O
FBI
Most Wanted
165
179
90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210
N
N
Caffeina
Risultati legalmente difendibili
La spettrometria di massa:
Tecniche di Acquisizione
. MS in scansione di ioni:
“impronta digitale”, alta specificità
Adatta alla ricerca qualitativa di sostanze proibite solo
durante le competizioni (sensibilità 0.5-1.0 ppm)
. MS in ioni selezionati (SIM):
. MS/MS e MSn
. MS in alta risoluzione (HR-MS)
. MS in rapporto isotopico (IR-MS)
Confronto tra Metodi di Acquisizione
SCAN e SI
Urinary androgen profile
And
Etio
GC/MS SCAN 145:550 Th
(TMS)
11-OHA
5b,3a
Epit
5a,3a
Test
DHEA
I.S.
11-OHE
DHT
16.50
17.00
17.50
18.00
18.50
19.00
19.50
20.00
20.50
21.00
21.50
22.00
22.50
23.00
La spettrometria di massa:
Tecniche di Acquisizione
. MS in scansione di ioni:
. MS in ioni selezionati (SIM):
acquisizione solo di uno o più ioni
rappresentativi della molecola
Adatta alla ricerca quali-quantitativa di sostanze proibite
(sensibilità 1-10 ppb)
. MS/MS e MSn
. MS in alta risoluzione (HR-MS)
. MS in rapporto isotopico (IR-MS)
Confronto tra Metodi di Acquisizione
SCAN e SI
Urinary androgen profile
And
GC/MS SIM
(TMS)
Etio
5b,3a
I.S.
11-OHA
Epit
Test
5a,3a
11-OHE
DHEA
DHT
15.00
15.50
16.00
16.50
17.00
17.50
18.00
Informazioni Spettrali con Acquisizioni in SI
Urinary androgen profile
And
Etio
GC/MS SIM
(TMS)
241 256
432
315
405 420 434
m/z-->
5b,3a
325
415
522
0
m/z-->
I.S.
11-OHA
Epit
Test
5a,3a
11-OHE
DHEA
DHT
15.00
15.50
16.00
16.50
17.00
17.50
18.00
La spettrometria di massa:
Tecniche di Acquisizione
. MS in scansione di ioni:
. MS in ioni selezionati (SIM):
. MS/MS e MSn :
si seleziona uno ione rappresentativo
dell’analita, si sottopone a frammentazione, si
analizzano gli ioni prodotto
Sensibile, selettiva e specifica adatta all’analisi qualiquantitativa sia in screening che in conferma (0.5-1.0 ppb)
. MS in alta risoluzione (HR-MS)
. MS in rapporto isotopico (IR-MS)
Cooks’ Theory
MSn
MAGNITUDE
SIGNAL
°
°
NOISE
S/N
°
°
°
°
°
°
°
°
1
2
3
NUMBER OF GATES
4
Busch K.L., Cooks G.
“Tandem Mass
Spectrometry” Ed. Mc
Lafferty Wiley, N.Y. 1983, 11
Analisi GC-MS-EI di campioni di Vongole
kCounts
135
100%
Scan 100:300 Th
80
75%
169
50%
107
189
152
198
25%
60
284
115
212
234
264
0%
100
150
200
250
m/z
40
20
19.00
19.25
19.50
19.75
20.00
minutes
Analisi GC-MS/SIS-EI di campioni di Vongole
284
100%
Counts
75%
SIS 280:300
Th
50%
600
25%
0%
100
150
200
250
m/z
400
200
0
19.00
19.25
19.50
19.75
20.00
minutes
Analisi GC-MS/MS-EI di campioni di Vongole
212
kCounts
100%
MS/MS CID 284 Th ±1422.5 Th
75%
Non Resonant
177
50%
2.0
284
25%
247
120
154
193
165
204
264
239
0%
100
150
200
250
m/z
1.0
0.5
19.00
19.25
19.50
19.75
20.00
minutes
Analisi GC-MS-EI di campioni di Vongole
Metodi a confronto
kCounts
80
Scan 100:300 Th
60
S/N (P/P) = 1
40
20
Counts
SIS 280:300 Th
600
400
200
S/N (P/P) = 3
0
1
kCounts
2.0
MS/MS CID 284 Th ± 2.5 Th
Non Resonant
S/N (P/P) = 48
1.0
0.0
19.00
19.25
19.50
19.75
20.00
minutes
La spettrometria di massa:
Tecniche di Acquisizione
. MS in scansione di ioni:
. MS in ioni selezionati (SIM):
. MS/MS e MSn :
. MS in alta risoluzione (HR-MS) :
sfrutta la separazione di ioni la cui
differenza di massa è minore dell’unità
di Da
Sensibile e selettiva adatta all’analisi quali-quantitativa in
conferma (0.1-0.5 ppb)
. MS in rapporto isotopico (IR-MS)
Risultati dell’analisi di screening di un campione di urina positiva al
metabolita del Metandienone (2 ng/mL)
(da Schanzer et al., J. Chromatogr. B 687, 1996)
La spettrometria di massa:
Tecniche di Acquisizione
. MS in scansione di ioni:
. MS in ioni selezionati (SIM):
. MS/MS e MSn :
. MS in alta risoluzione (HR-MS) :
. MS in rapporto isotopico (IR-MS) :
Sfrutta l’ossidazione completa della
sostanza organica (es. CO2 ) e misura il
rapporto tra gli ioni di uguale formula
bruta ma diverso composizione isotopica
Impiegato per la conferma di assunzioni di sostanze endogene
(es. Testosterone)
Sono riportati tutti i criteri per la
corretta identificazione di un analita.
Tranne i primo paragrafo, che riporta i
criteri cromatografici d’identificazione,
il documento specifica le condizioni
minime e le tolleranze che si devono
applicare per identificare un analita
con la spettrometria di massa, nelle
varie tecniche d’acquisizione
Analisi Antidoping: Androgeni naturali
Analisi Antidoping: Anabolizzanti
Metandienone (Dianabol): metabolismo urinario umano
Analisi Antidoping: Androgeni naturali
Urinary endogenous steroids
Androsterone
“Parametri Sospetti”
Etiocholanolone
5a-androstane-3a,17b-diol
man
woman
>4
>4
And/T
< 20
< 40
Conc. T (ng/mL)*
> 130
> 60
5b-androstane-3a,17b-diol
5a-androstane-3b,17b-diol
T/E
Dehydroepiandrosterone
Epiandrosterone
5a-androstandione
5-androsten-3b,17b-diol
Epitestosterone
Dihydrotestosterone
4-androstendione
* conc. correct for a density equal to
1.020
Testosterone
11b-hydroxyandrosterone
11b-hydroxyetiocholanolone
Pregnandiol (5b-pregnan-3a,20a-diol)
Pregnantriol (5b-pregnan-3a,17a,20a-triol)
Analisi Antidoping: Rapporto T/EpiT
50
40
Orientals
Reference
Frequency %
30
20
10
0
0
1
2
3
4
T/E
5
6
7
Analisi Antidoping: Rapporto T/EpiT
T/EpiT > 4 (nella frazione dei
coniugati glucuronici) indica una
potenziale assunzione di
testosterone
Veriche
- dati pregressi sull’atleta (se
disponibili)
- EpiT Glucuronide/EpiT Solfato
- profilo degli androgeni
- test longitudinale
Analisi Antidoping: Rapporto T/EpiT
μHPLC/MS analysis of testosterone and epitestosterone
as glucuronides and sulphates
(Bowers and Sanaullah, J. Chromatogr. B 687, 1996)
Analisi Antidoping: Rapporto T/EpiT
Test Longitudinale
Date
Sample 1
Sample 2
Sample 3
Sample 4
Reference
ranges
(male)
19.04.99
03.05.99
20.05.99
23.06.99
Spec. grav.
(g/cm3)
1.008
1.018
1.013
1.021
AND (ng/mL)
4202,0
7056,6
10275,2
5447,4
835 – 6881
ETIO (ng/mL)
2415,6
3785,3
6339,3
2553,0
655 – 5497
142,6
294,3
566,7
321,8
4,6 – 118,4
TEST (ng/mL)
70,8
138,5
242,3
136,0
1,9 – 143,8
5aA3aD (ng/mL)
70,4
210,1
233,9
131,1
13,2 – 173,3
5bA3aD (ng/mL)
266,6
387,3
563,1
276,2
18,4 – 572,8
AND/ETIO
1,7
1,9
1,6
2,1
0,5 – 2,9
TEST/EPI (*)
0,5
0,6
0,5
0,5
0,1 – 5,4
AND/TEST
59,3
50,9
42,4
40,1
21,7 – 1269
AND/EPI
29,5
24,0
18,1
16,9
26,6 – 426,7
0,3
0,5
0,4
0,5
0,1 – 1,6
EPI (ng/mL)
5aA3aD/5bA3aD
Campionato del Mondo Pallavolo Maschile 1998
Volley: assolto l' azzurro Rosalba Era
"positivo" per cause naturali
Volley: assolto l' azzurro Rosalba Era "positivo" per
cause naturali Niente doping, ma soltanto una naturale
produzione elevata di epitestosterone (negli esami
superava i 200 ng / ml) dovuta a condizioni fisiologiche:
si e' conclusa cosi' la vicenda di Simone Rosalba (nella
foto), il pallavolista azzurro trovato positivo a un
controllo antidoping (e alle controanalisi) al termine dell'
incontro dei quarti Jugoslavia - Italia dei Mondiali in
Giappone dello scorso anno, poi vinti dagli azzurri. La
notizia e' stata comunicata ieri al presidente federale
Carlo Magri, dopo gli accertamenti del presidente della
commissione medica della Fivb. "Sono felice dell' esito
di questa vicenda - ha detto Magri -. Noi, comunque,
non avevamo mai avuto dubbi sulla "pulizia" del
giocatore
Analisi Antidoping: IRMS
endocrinological
study
-30
-28
-26
-24
positive
sample
δ %°
Testosterone: metabolic pathway
Cholesterol
-24,4-24,0
Pregnenolone
-22
-30
-28
-26
-24
Isotopic Ratio
13C/12C
Pregnandiol
-24,2
-24,0
17α-OH-Progesterone
(metabolite)
-22
-30
Androstenedione
-29,1
CH3
-28
-26
OH
CH 3
-25,1
-24
-22
-30
O
Androstandiols
Testosterone
-29,2
-29,8
-28
-26
-24
-25,0
-25,9
Androsterone
Etiocolanolone
-22
Analisi Antidoping: Caso BALCO
H5C2 OH
C CH
H5C2 OH
CH2 CH3
H2
O
O
Gestrinon
Nel 2007 la
velocista
americana Marion
Jones, vincitrice a
Sydney di 3 ori e
2 bronzi,
confessa
l’assunzione di
THG. Revoca dei
titoli
Nel 2005 il
Tetrahydrogestrinon
velocista
americano Tim
Montgomery,
viene
squalificato per
due anni e
privato dei titoli e
record del
mondo sui 100m
piani
EPO (Eritropoietina)
Glicoproteina MW ˜ 30 – 34 KDalton
166 AA: (MW 18 KDalton) + 4 catene polisaccaridiche
Ricombinante: diverso grado di glicazione
EPO
EPO (Eritropoietina)
r-EPO
Patients treated Tour de France
1998
with r-EPO
Natural
EPO
Healthy volunteer
(Lasne F., de Ceaurriz J.: Nature, 405, 2000)
Novel Erythropoiesis Stimulating Protein (NESP)
A: rhEPO
B: negative urine
C: positive urine
D: NESP