Lezione06 - Blast e Fasta

Metodi
euristici di
allineamento
Algoritmi euristici di allineamento
Sono nati insieme alle banche dati, con lo scopo di permettere una ricerca
rapida, anche se meno accurata, utilizzando la similarità a coppie (o
“pairwise”) sulle migliaia di sequenze depositate.
Attualmente i programmi più utilizzati sono:
FASTA: Lipman & Pearson (1985)
Nasce con il nome di FAST-P (ricerca veloce di proteine), ma poi viene adattato per gli acidi
nucleici (FAST-N), quindi riunito in un FAST per tutti, FAST-A, o semplicemente FASTA.
http://www.ebi.ac.uk/Tools/fasta33/index.html
BLAST: Altshul (1990)
Il Basic Local Analysis Search Tool viene pensato
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
FASTA
Il frontend più utilizzato di FASTA è quello disponibile presso la EBI:
l’interfaccia web permette di configurare il programma e di ottenere in
diretta o tramite e-mail i risultati.
Metodo dell’indicizzazione
L’algoritmo implementato in FASTA si basa su una strategia di
indicizzazione delle parole e sul concetto di “Lookup Table”: la proteina
QUERY viene spezzettata in parole di lunghezza ktup (k-tuples) e la
query viene così indicizzata (cioè si memorizzano solo gli indici, non la
coppia).
ELDERILGEVQTFDERIKGD
1.EL
2.LD
14.DE
3.DE
15.ER
4.ER
5.RI
6.IL
7.LG
......
20.GD
ktup = 2
Maggiore è il valore ktup più rapida e meno accurata sarà la ricerca. Per
una proteina a ktup = 2 potrò avere al massimo 202 = 400 combinazioni,
sempre.
Lookup tables e offset (diagonali)
Ogni SUBJECT della banca dati viene pre-indicizzata con la stessa k-tup,
e si procede, data la query e ciascuna subject, alla creazione delle tabelle
degli offset (indice della query meno indice della subject). Le diagonali che
totalizzano il miglior punteggio (in generale almeno 10) vengono registrate.
------------------- QUERY
------------------
------------SUBJECT---------
0
1EL
2LD
3DE
4ER
5RI
6IL
7LG
8GE
9EV
1ER
0
1
2
3
4
5
6
7
8
2RI
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
3IL
-2
-1
0
1
2
3
4
5
6
4LD
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
5
5DE
-4
-3
-2
1
0
1
2
3
4
6EV
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
Total = 3
Offset = 3
Total= 2
Offset = -2
Essendo somme di coppie, il numero di conteggi da fare non è più il
prodotto delle lunghezze, bensì qualcosa di simile alla somma delle due,
con un netto decremento del tempo di calcolo.
Scelta euristica dei subject
I conteggi per calcolare le migliori diagonali sono semplici somme i cui
valori vengono presi da matrici di sostituzione (es. PAM, BLOSUM). Le
migliori diagonali identificano le Best Initial Regions, i cui punteggi sono
definiti Init1.
Query
Query
Subject
Subject
Per ogni subject ho uno score che definisce la similarità media della
query con ogni subject: in pratica, dato un Init1 minimo, vengono scelte in
modo euristico delle sequenze candidate per analisi più approfondite.
Congiungimento delle diagonali
Il passaggio successivo di FASTA è il tentativo di congiungere al
meglio ogni BIR dei subject prescelti utilizzando criteri come:
- Esclusione di eventuali overlap fra regioni
- Punteggio superiore ad un "valore-soglia“
- Punteggi di penalizzazione (es. -16) per i gap
Query
Subject
Subject
Le regioni vengono allungate e avranno un nuovo score, detto InitN.
Questa è una seconda soglia di scelta, alcune sequenze non passeranno
questo test e verranno a loro volta scartate.
Refinement finale con pairwise esaustivo
Alla fine tutta la regione della subject riconosciuta come simile viene
allineata mediante l’algoritmo di Smith & Waterman, tenendo una finestra di
analisi intorno alla diagonale principale abbastanza stretta (< 20 residui).
Query
Query
Subject
Subject
Lo score definitivo deriva quindi da una allineamento pairwise esaustivo,
ed è definito Opt.
Query
Query
Subject
Subject
Fase 1 : Indicizzazione col
metodo lookup table
Fase 2 : Calcolo degli Init1,
generazione delle bits
Query
Query
Subject
Subject
Fase 3: Definizione delle sequenze da
approfondire, calcolo degli InitN
Fase 4 : Smith-Waterman (Opt)
Analisi Monte Carlo per la significatività
Si cerca di valutare quanto il risultato che ottengo è significativo,
considerando l’ipotesi alternativa che il risultato ottenuto sia dovuto al caso.
Il concetto da tenere presente è che il risultato che si ottiene è dovuto agli
aminoacidi che sono disposti in un certo ordine: se cambio l’ordine, lo
score si dovrebbe perdere:
Monte Carlo:
1. Prendere ogni subject, registrare lo score (X)
2. Produrre 100-200 versioni “randomizzate” di questo
3. Allineare ogni random con fasta, registrando gli Opt (y)
4. Calcolare la media (Y) e la deviazione standard (W) degli
score Opt calcolati in 3.
X-Y
5. Standardizzare calcolando lo Z-score Z =
W
Per z < 3 l'omologia NON è statisticamente significativa
Per 3 < z < 6 l'omologia è POSSIBILMENTE statisticamente significativa
Per 6 < z < 10 l'omologia è PROBABILMENTE statisticamente significativa
Per z >10 l'omologia è statisticamente significativa
In ogni caso non si può
definire un p-value
esatto perchè non si
può
sapere
la
distribuzione di Z
La results page di FASTA
Modalità “Show Alignment”
Premendo il bottone “Show Alignments” il risultato si arricchisce di dettagli:
emergono i vari scores (init1, initN, opt, Z-score) dell’euristica, poi anche
lo score dell’esaustiva. Viene poi presentato anche l’allineamento finale.
Il bit score
Tutti gli score S che emergono dalle analisi FASTA (ma è una regola
generale) restano confinati al singolo allineamento, e non sono
comparabili tra allineamenti diversi.
Il sistema dei punteggi (dato dalla matrice di sostituzione e dalle gap
penalties) è però comune per tutti, quindi esiste un modo per convertire
uno score S in un bit score S’ utile per i confronti tra allineamenti diversi.
S' =
λ*S - ln K
ln 2
λ e K sono i due
fattori di
conversione da
utilizzare, e sono
stati calcolati
secondo regole
statistiche precise.
da “Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis” - David W. Mount – CSHL Press
Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)
Il punto di accesso più
utilizzato per eseguire
chiamate BLAST è presso
l’NCBI.
Come per FASTA la
maschera permette di
impostare i parametri di
ricerca e di significatività
minima richiesta.
E’
inoltre
possibile
scegliere
il
tipo
di
algoritmo
BLAST
da
utilizzare.
Indicizzazione in BLAST
Anche BLAST basa la sua euristica sull’indicizzazione, ma introduce una
sofisticazione a livello dei k-tuples, che qui vengono chiamati “word”.
Si inizia con la creazione di un elenco di parole di lunghezza W dalla query
e creazione di “w-mers”, cioè parole di lunghezza W che diano, secondo
una matrice di sostituzione uno score > T se allineati sulla query stessa.
TFDER LSH GVQQTFWECIKGD
VSH = 16
ISH = 14
Word size (W) = 3
LAH = 13
Threshold (T) = 13
LTH = 13
LSH = 13
Per ogni parola vengono generati anche tutti i possibili w-mers, quindi ci
sono molte più parole che in FASTA.
Ricerca delle hits
La ricerca è basata sempre sulle diagonali, ma dato che si hanno molte
words sinonime, verranno segnati dei match positivi (hits) anche se non
sono word identiche.
In ogni caso gli indici fanno riferimento alla word vera della query, non dei
suoi sinonimi. Ottengo così una lista di proteine in cui è stata trovata una
corrispondenza con i frammenti della query.
---------------------------- QUERY
------------------------------
------------SUBJECT---------
0
1 ELEV-EIDL-DI
2 LDLE-VEVD-ID
3 DEED
4 EREK-DRDK
5 RIKL-RLRV-KI
6 ILIV-IILI-VL
7 LDVD-ID
8 DEED
9 EVEI-ELDV-DL
1EK
0
1
2
3
4
5
6
7
8
2KI
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
3IL
-2
-1
0
1
2
3
4
5
6
4LD
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
5
5DE
-4
-3
-2
1
0
1
2
3
4
6EV
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
Total = 2
Offset = -2
Total = 6
Offset = 3
Estensione senza gap – gli HSP
Una volta che le varie hits sono state trovate, BLAST inizia a congiungerle.
IN questa fase NON è previsto l’inserimento di gap. L’allungamento si
ferma quando lo score del tratto scende sotto una seconda soglia, detta S
(se è alta l’allungamento sarà minore).
A questo punto si è individuato un HSP (High-scoring Segment Pair).
In realtà anche se lo score scende sotto S, ma solo per alcuni residui, e
poi risale, l’HSP può ancora allungarsi. Il parametro X dice la quantità di
perdita di score massima tollerabile se si prosegue con l’allungamento
dell’HSP.
hit
Query:83
Subject:48
hit
hit
LMVAISNVGTDTLSHLEAQNKIKSASHNLSLTLQKSK
+++AIS GT+++SH +AQ++IK+AS+ L L + ++
VILAISGFGTESMSHADAQDRIKAASYQLCLKIDRAE
HSP
BLAST ha dunque 4 parametri fondamentali:
W: word size, maggiore è il numero, minore è il numero di parole
generate, minore è il tempo di esecuzione. Ma la sensibilità decresce
sensibilmente.
T: threshold, minore è il numero, maggiore è il numero di w-mers
inclusi nella lista, maggiore è il tempo di esecuzione. Si ha però un
incremento di sensibilità.
S: score, minore è il numero, maggiore sarà la lunghezza degli HSP
X: maggiore è il numero, più estesamente sarà osservato l’intorno di
una HSP, aumentando il tempo di esecuzione.
La statistica di BLAST
Ciò che rende BLAST uno strumento molto efficace è l’impronta statistica
su cui si basa il parametro S, che in questo caso agisce su allineamenti
locali senza gap. La statistica degli score in questo caso è nota e si basa
su un modello di casualità che dipende dalla composizione del database in
cui si cerca e dalla matrice di sostituzione usata.
Dato un S in fatti è possibile prevedere quanti HSP di quella lunghezza m
si osservano in una banca dati della stessa grandezza di quella vera ma
composta da proteine casuali. Questo numero è definito E (expected),
secondo
E = K m n e -λS
=> è molto più semplice pensare
in termini di E che non in termini di
S, quindi in realtà non si imposta S
ma E.
m e n indicano l’ampiezza dell’HSP e della
banda dati, rispettivamente
K e λ sono fattori di scala che dipendono dal
sistema di scoring utilizzato
La distribuzione degli scores
Supponiamo di avere fatto un allineamento tra due sequenze, e di avere
uno score S.
Un modo per sapere se lo score è significativo, è quello di generare N
sequenze casuali della stessa lunghezza, allinearle, calcolare la media e la
deviazione standard degli scores ottenuti (Monte Carlo).
Se implicitamente si assume che essi
abbiano una distribuzione normale, si può
calcolare la p(S) integrando
In realtà, solo quelli che danno qualcosa di
biologicamente
rilevante
vanno
presi,
eliminando gli score “peggiori”. Questo
provoca una deviazione dalla “normalità” e
definisce la “distribuzione dei valori estremi”.
La results page di BLAST – Graphic summary
Se BLAST riconosce
una similarità ampia
con una o più famiglie
proteiche
note,
lo
indica in modo grafico.
E’ presente poi un
summary grafico che
permette di esplorare
velocemente i primi
100 hits mostrandoli
allineati
con
la
sequenza query.
La results page di BLAST – Descriptions
BLAST include nel suo output un riassunto testuale delle sequenze che
sono state trovate: per ognuna mostra un link (in questo caso ad Entrez
Protein), il nome, lo score (in bits) e L’Expect value, secondo cui i risultati
sono ordinati.
La results page di BLAST – Alignments
Sotto alle descrizini inziano i risultati veri e propri, ossia gli HSP: oltre alle
note viste nelal descrizione, vengono riportate le identità, le similarità
(Positives) e i gaps inseriti, se ce ne sono. Notare come gli allineamenti
servano come “spiegazione” del risultato: il risultato è che la proteina è
stata identificata, non è stata allineata…
BLAST si è arricchito nel tempo
BLAST è stato recentemente implementato con un two-hit method, che
prevede che l’estensione delle HSP possa avvenire solo se due hits
indipendenti si verifichino entro un numero di residui A, senza gaps in
mezzo. Sono nate inoltre varie versioni specializzate:
blastp: cerca similarità in banche dati proteiche a partire da un a query
di amino acidi.
blastn: cerca similarità in banche dati di nucleotidi a partire da una query
di nucleotidi.
blastx: cerca similarità in banche dati proteiche a partire da una query di
nucleotidi che viene tradotta in tutti i frame.
tblastn: cerca similarità in banche dati di nucleotidi a partire da una
query di amino acidi, traducendo in amino acidi tutti i subject della banca
dati, in tutti frame.
tblastx: cerca similarità in banche dati di nucleotidi a partire da una
query di nucleotidi, traducendo in amino acidi tutti i subject della banca
dati
BLAST si è arricchito nel tempo
gapped-blast: porta avanti la fase di estensione delle HSP considerando
la possibilità di inserzione dei gap.
PSI-BLAST: effettua una ricerca iterativa utilizzando le HSP per generare
dei profili caratteristici della query.
PHI-BLAST: estensione di PSI-BLAST per la ricerca in banca dati di
pattern proteici più che di query esatte.
BL2SEQ: adattamento di blast per l’allineamento a coppie
MegaBLAST: può concatenare molte queries tra loro per minimizzare il
tempo di esecuzione dovuto a sequenze query troppo lunghe (è adatto a
sequenze nucleotidiche molto simili tra loro)
FASTA o BLAST ?
Gli algoritmi usati in BLAST e FASTA sono simili come strategia, ma
molto diversi nei contenuti.
Il fatto che Fasta indicizzi le query in modo esatto lo porta a ridurre di
molto il numero di subject su cui lavorerà in seguito, e questo è una tappa
limitante che BLAST non ha a causa dei w-mers.
Però Blast crea i w-mers basati su una matrice quindi può accadere che
match esatti diano meno score S di match non esatti:
es. secondo la Blosum62
- il match perfetto AIS-AIS dà score 12
- lo score inesatto LSH-MSH dà score 14
=> il secondo è premiato più del primo
Scelte consapevoli
Per ricerche in banche dati nucleotidiche, l’indicizzazione in w-mers simili
ha poca rilevanza. Le basi infatti non sono mai “con caratteristiche chimico
fisiche simili”…
Il valore W di default di BLAST per i nucleotidi è 11, il che lo porta a non
riconoscere sequenze che condividano in modo esatto meno di 11 basi, è
questo è un limite grosso (ma quello è il default…).
Fasta è molto più tollerante per sequenze che presentano gaps, visto che
già nelle prime fasi prevede il loro inserimento, mentre BLAST li inserisce
solo in fase di allungamento.
⇒ FASTA è più adatto a ricerche in banche dati nucleotidiche
⇒ BLAST è più adatto a ricerche in banche dati proteiche
Anche se questa regola è un po’ troppo arbitraria...