For Reference Use Only

Transcript

MONOFLUO™ Pneumocystis carinii
IFA Test Kit
32515
Immunofluorescent Antibody Test Kit for the Detection
and Identification of Pneumocystis carinii in Respiratory
Tract Specimens
Fo
For In Vitro Diagnostic Use
efe
rR
ren
Lexicon/Lexique/Glosario/Glossar/Definizione dei simboli/
Léxico/Leksikon/Ordlista ...........................................................2
ce
English........................................................................................4
Français....................................................................................16
Us
Español ...................................................................................29
Deutsch ....................................................................................43
eO
Italiano......................................................................................57
Portuguese...............................................................................71
nly
Dansk .......................................................................................85
Svensk......................................................................................98
References/Bibliographie/Referencias/Literatur/Bibliografia/
Referencer/Referenser ...........................................................110
FOR REFERENCE USE ONLY: DO NOT USE in
place of package inserts provided with each test
kit.
Para uso diag- In-vitronóstico in vitro Diagnostikum
Dispositif
médical de
diagnostic in
vitro
For In Vitro
Diagnostic
Use
Fabricant
Consulter les
instructions
d’utilisation
Manufacturer
Consult
Instructions
for Use
Code du lot
Fecha de
caducidad
Utiliser avant
le
Use by
Batch code
CE-Konformitätskennzeichnung
Conformidad
europea
Conformité
aux normes
européennes
European
Conformity
Verwendbar
bis
Deutsch
Español
Français
nly
Consulte las
instrucciones
de uso
Fabricante
Conformità
europea
Italiano
Fabricante
Consulte as
instruções de
utilização
Consultare le
istruzioni per
l'uso
Gebrauchsanweisung
beachten
Tillverkare
Se bruksanvisningen
Se brugsanvisning
Partinummer
För in vitrodiagnostik
Använd före
Producent
Código do lote Lotnummer
Para utilizaMedicinsk
ção no diagudstyr til in
nóstico in vitro vitro-diagnostik
Utilizar até
Holdbar til
Europeisk
överensstämmelse
Europæisk
overensstemmelse
Conformidade com as
normas
europeias
Fabbricante
Codice del
lotto
Per uso
diagnostico
in vitro
Utilizzare
entro il
Svenska
Dansk
Português
Hersteller
Código de lote Chargenbezeichnung
eO
Us
English
Lexicon/Lexique/Glosario/Glossar/Definizione dei simboli/Léxico/Leksikon/Ordlista
ce
ren
efe
rR
Fo
Límites de
temperatura
Representante autorizado en la
Comunidad
Europea
Reactivo de
tinción
Limites de
température
Représentant
agréé dans la
Communauté
Européenne
Réactif colorant
Milieu de
Montage
Lames de
microscope à
fluorescence
Temperature
Limitation
Authorized
Representative in the
European
Community
Staining
Reagent
Mounting
Media
Fluorescence
Microscopy
Slides
Medio de
montaje
Español
nly
Portaobjetos
para
microscopia
de fluorescencia
eO
Us
Français
Bevollmächtigter in
der Europäischen Union
Zulässiger
Temperaturbereich
Deutsch
Anfärbereagenz
Objektträger
für Fluoreszenz-Mikroskopie
Eindeckmittel
ce
English
ren
Mandatario
autorizzato per
l'Unione Europea
Limiti di
temperatura
Italiano
Meio de
Montagem
Fluorescens
mikroskopislides
Monteringsmiddel
Reagente para FarvningColoração
sreagens
Representante autorizado na
Comunidade
Europeia
Repræsentant
i det
Europæiske
Fællesskab
Objektglas för
fluorescensmikroskopi
Monteringsmedium
Färgningsreagens
Auktoriserad
representant i
Europeiska
gemenskapen
Temperaturbe- Temperaturbegrænsning
gränsning
Limite de
temperatura
Svenska
Dansk
Português
Vetrini per
Lâminas para
microscopia in Microscopia
de Fluofluorescenza
rescência
Soluzione di
montaggio
Reagente
colorante
efe
rR
Fo
INTENDED USE
The MONOFLUO™ Pneumocystis Immunofluorescent Antibody
Test Kit is to be used for the detection of Pneumocystis carinii
cysts and trophozoites in specimens collected from the respiratory tract.
rR
Fo
SUMMARY AND EXPLANATION
Pneumocystis carinii is a unicellular, eucaryotic organism that is
present in the lungs of many mammalian species, including
man. The organism is spread by airborne routes, usually causing asymptomatic infection. Exposure during childhood may
result in mild or subclinical cases, with the organism existing in
latent state through adulthood. In individuals with compromised
immune systems, the organism becomes opportunistic, causing diffuse, interstitial pneumonia.1,2
ren
efe
Individuals at risk for Pneumocystis carinii include premature
infants, individuals with immune deficiency disorders (such as
acquired immunodeficiency syndrome), and those receiving
immunosuppressive drugs such as corticosteroids. Pneumocystis carinii is the most common opportunistic infectious agent in
AIDS patients, with almost 80% suffering from the infection.3,4,5,6
ce
Morphological studies of the organism have revealed three
forms in the life cycle of Pneumocystis carinii: cysts, sporozoites and trophozoites. The thick-walled cysts (4-7 µm in diameter) usually contain eight comma-shaped sporozoites, which
then mature into larger, pleomorphic trophozoites (2-8 µm in
diameter) before encysting to repeat the cycle.1, The cysts, with
their distinct morphologic characteristics, are most frequently
associated with presence of Pneumocystis carinii.
nly
eO
Us
Rapid clinical diagnosis of Pneumocystis carinii is of utmost
importance as the organisms quickly infiltrate lung tissue causing dyspnea, fever, and cough.7 Early detection can facilitate initiation of appropriate treatment and may improve chances of
patient survival.8,9
At present, diagnosis is accomplished through radiologic technique and identification of Pneumocystis carinii cysts and trophozoites by histologic staining of respiratory specimens.
Common staining methods (toluidine blue O, Gomori’s methenamine silver nitrate or Giemsa) reveal cyst walls and/or trophozoites/sporozoites.6,10 Because of the nonspecific nature of
4
these stains, proper identification of the organism may be difficult. A more invasive technique for specimen collection such as
bronchoalveolar lavage is often required to ensure the presence
of Pneumocystis carinii.11
efe
rR
Fo
The use of a direct, fluorescent-antibody procedure with
induced sputum, bronchial wash or bronchoalveolar lavage
samples provides a simple, highly-specific procedure for detection of Pneumocystis carinii.12,13,14,15 The monoclonal antibodies
in the MONOFLUO™ Pneumocystis carinii Immunofluorescence Test Kit are chemically linked to fluorescein isothiocyanate (FITC) to produce a highly specific, direct,
immunofluorescent reagent with a low level of background fluorescence. In addition to binding with Pneumocystis carinii cysts,
the monoclonal antibodies also bind specifically to Pneumocystis carinii trophozoites, sporozoites, and the extracellular matrix.
The test kit is used for the rapid identification of Pneumocystis
carinii cysts and trophozoites directly in patient specimens.
ce
ren
PRINCIPLES OF THE PROCEDURE
The MONOFLUO™ Pneumocystis carinii Staining Reagent contains murine monoclonal antibodies labeled with fluorescein
isothiocyanate (FITC). These antibodies react with all Pneumocystis carinii forms (cysts, sporozoites and trophozoites) and
also with the extracellular matrix present in infected specimens.
Us
nly
eO
Slides are prepared for microscopy from clinical specimens as
described in the Preparation of Clinical Specimens Prior to Fluorescence Staining Section. Following fixation, the slides are
stained with the MONOFLUO™ Pneumocystis carinii Staining
Reagent. The Staining Reagent binds to any Pneumocystis carinii
organisms present in the specimen. A subsequent rinse step
removes unbound Staining Reagent from the specimen. The
slides are then mounted with the MONOFLUO™ Mounting
Medium included in the kit. The Mounting Medium contains an
anti-quencher which increases the length of time slides may be
examined before the fluorescence fades.
When viewed with a fluorescence microscope, infected specimens fluoresce bright apple-green. Stained cysts appear as
large, round-to-elliptical structures found both individually and
in clusters. Sporozoites and trophozoites may also be stained,
appearing as relatively small, crescent-shaped or pleomorphic
5
structures. In addition, the amorphous, extracellular matrix
should also fluoresce brightly. Other organisms and cellular
material from respiratory specimens are counterstained red to
orange-red or gold without characteristic fluorescence of Pneumocystis carinii cysts.
PRODUCT DESCRIPTION
Table 1: Materials Provided
Store reagents at 2-8°C. Slides should be stored at 2-28°C.
Contents
Preparation
R1 • Pneumocystis
carinii Staining
Reagent*
1 Dropper bottle
(2.2 ml)
R2 • Mounting
Medium
1 Dropper bottle
(3.5 ml)
R3 • Fluorescence
Microscopy Slides
24 (2 wells each)
• FITC-labeled monoclonal
antibodies (murine)
• Counterstain (Evans Blue)
• Sodium azide**
• Protein-stabilized buffer
• Buffered glycerol
• Formaldehyde***
• Anti-quencher
Mix gently
before use.
• Fluorescence microscopy
slides
Wipe with lintfree tissue
before use.
ren
efe
rR
Fo
Component
Ready to use as
supplied.
ce
* Volume sufficient for staining 24 individual test wells. **0.1 % sodium azide; ***0.8 %
formaldehyde.
nly
eO
Us
MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED
• Acetone, Reagent Grade, (store in a tightly closed container to prevent absorption of water).
• Deionized water or tap water.
• Slide staining dishes with racks.
• Humidified chamber (such as a covered petri dish containing a moistened paper towel).
• Coverslips, 24 X 40 mm, #1.
• Pasteur pipettes.
• Centrifuge or microfuge.
• 15 ml centrifuge tubes or 1.5 ml microfuge tubes.
• 37±1°C incubator.
• Biological safety cabinet (recommended).
• Fluorescence-quality immersion oil, if needed.
• Fluorescence microscope with 200-250X and 400-630X
magnification, equipped with a filter system for fluorescein isothiocyanate (FITC). A wide variety of filter sets for
reading FITC are available from different manufacturers.
6
Wide band (420-490 nm) or narrow band (470-490 nm)
excitation wavelengths with a 515 nm dichromatic mirror
and a 515 nm barrier filter is advisable. The narrow band
excitation wavelength will diminish background fluorescence. Variations in the wattage, intensity and alignment
of the bulb and differences in type of illuminator and filters
may affect the performance of the test.
• Control slides containing Pneumocystis carinii organisms
(see Preparation of Control Slides Section).
• Paper toweling or aspiration system.
rR
Fo
For Induced Sputum Specimens
• Dithiothreitol (DTT): A liquid preparation of 0.1% (6.5x10-3
moles/l). For example, Stat-Pak™ Sputolysin available
from Caldon Biotech; Use as directed.
• Phosphate Buffered Saline (PBS).
ren
efe
PRECAUTIONS
For in vitro diagnostic use only.
For professional use only.
ce
1. This test should only be performed by personnel who are
properly trained in the handling of clinical specimens that
may contain HIV-1. The slides should be examined by personnel who have experience in reading immunofluorescence
assays.
Us
eO
2. Handle all clinical specimens as potentially infectious material.
nly
3. Procedures that create aerosols should be conducted in a
biological safety cabinet. All materials should be disinfected
after use or prior to disposal.
4. Use good laboratory technique when handling specimens or
the MONOFLUO™ Pneumocystis carinii Immunofluorescence Test Kit reagents. Do not eat, drink or smoke in the
laboratory. Do not mouth pipette. Avoid contaminating the
reagents with microbes or other substances.
5. The Staining Reagent contains Evans Blue, which is an irritant. Avoid spilling or splashing the Staining Reagent on skin
or clothing. Flush any areas which may have come in contact
with the Staining Reagent thoroughly with water.
7
6. The Mounting Medium has 2% formalin that contains 0.8%
formaldehyde, which, according to the United States
National Toxicity Program (NTP), may be reasonably anticipated to be carcinogenic. However, existing data do not
conclusively establish the carcinogenicity of formaldehyde at
the concentrations used in this kit (<1.00%). Avoid spilling or
splashing the Mounting Medium on skin or clothing. Flush
any areas which may have come in contact with the Mounting Medium thoroughly with water.
R: 40-43: May cause sensitization by inhalation and skin
contact. Possible risk of irreversible effects.
rR
Fo
S: 24/25-28-36/37/39: Avoid contact with skin and eyes.
After contact with skin, wash immediately with plenty of
water. Wear suitable protective clothing, gloves and eye/face
protection.
ce
ren
efe
7. The Staining Reagent contains sodium azide. Sodium azide
may react with lead and copper plumbing to form metal
azides that are highly explosive. If the Staining Reagent is
disposed of in the sink, flush plumbing with a large volume of
water to prevent azide buildup.
Xn. Harmful
0.1% NaN3
nly
eO
Us
R: 21/22
Harmful in contact with skin and if swallowed.
S: 24/25-28-36/37/39
Avoid contact with skin and eyes. After contact
with skin, wash immediately with plenty of water.
Wear suitable protective clothing, gloves and eye/
face protection.
8. Clean all reusable items thoroughly between uses.
9. Mix Staining Reagent gently before each test.
10.Use a separate slide for each patient specimen to prevent
any cross-contamination of Pneumocystis carinii organisms.
It is also recommended that each slide be washed separately.
11.Slides should be prepared using acetone fixation. Formalin
fixed slides or ethanol fixed slides are not recommended for
this test.
8
REAGENT STABILITY AND STORAGE
Do not use the kit or any of the components beyond the expiration date. Store Staining Reagent in the dark at 2-8°C.
Store reagents at 2-8°C. Slides should be stored at 2-28°C. If
stored at the specified temperatures, opened or unopened
reagents are stable for the printed shelf life.
PNEUMOCYSTIS CARINII TEST PROCEDURE
rR
Fo
Specimen Collection
Clinical specimens should be freshly collected using standard
methods for obtaining induced sputum, bronchial wash or bronchoalveolar lavage.16,17 The specimen should be processed
immediately. Reserve a portion of the specimen for culture, if
needed.
ren
efe
Preparation of Clinical Specimens Prior to Fluorescence
Staining
Induced Sputum Specimens
ce
1a.Put 2 to 3 ml of sputum in a 15 ml centrifuge tube. Add an
equal volume of dithiothreitol reagent. Vortex the tube and
incubate for 5-10 minutes at 37°C or 15 minutes at room
temperature (RT=15-30°C).
Us
- OR -
nly
eO
1b.If the sample is too viscous to easily transfer to a centrifuge
tube, add an estimated equal volume of dithiothreitol reagent
direct to the collection vessel, stir vigorously to mix, and incubate for 5-10 minutes at 37°C or 15 minutes at room temperature (RT=15-30°C). Transfer to a centrifuge tube as soon as
possible during the incubation and vortex before proceeding.
2. Add a volume of approximately 5 to 6 ml of PBS pH 7.2,
equal to that of the sputum plus DTT combined, to the tube
and thoroughly vortex.
3. Centrifuge at 1500 x G for 5 minutes.
4. Carefully decant or aspirate the supernatant, leaving 0.5 ml
or less of the pellet and supernatant in the tube. Steps 2, 3
and 4 may be repeated, if necessary, to remove all traces of
mucus.
9
5. Resuspend the pellet thoroughly. Using a pipettor, apply one
drop (approximately 25-50 µl) onto a microscope slide provided with the kit. Spread the drop evenly over the well with
the side of a pipet tip taking care not to scratch the slide.
Allow to air dry. A slide warmer at 37°C can be used to hasten the specimen drying.
6. Fix for approximately 10 minutes in acetone. Slides may be
processed immediately or frozen at -20°C for up to one
month before staining.
Bronchial Wash and Bronchoalveolar Lavage Specimens
efe
rR
Fo
Non-mucoid samples such as bronchial washes or bronchoalveolar lavages will probably not require the mucolytic procedure. For these samples, the protocol can begin with
centrifugation, step 3 above, in a 15 ml centrifuge tube or 1.5 ml
microfuge tube.
ce
ren
NOTE: Alternatively, a cytospin centrifuge may be used to prepare slides from induced sputum, bronchial wash or BAL specimens.12 When the cytospin procedure is followed, controls
should be processed in the same manner. Slides prepared with
a cytospin centrifuge are fixed for ten minutes in acetone and
stained as described below in the Fluorescence Staining Procedure Section.
Us
nly
eO
PREPARATION OF CONTROL SLIDES
A positive control slide should be included each time the test is
performed. Bronchial wash and bronchoalveolar lavage specimens are the most suitable for use as a positive control. The
specimens chosen should previously have been confirmed as
positive for Pneumocystis carinii by histological stain. Follow
the procedures outlined in the Preparation of Clinical Specimens Prior to Fluorescence Staining Section. After acetone fixation, the slides may be frozen at -20°C for up to one month.
Alternately, use a known positive sample as a positive control.
For the test to be considered valid, the control slide must stain
appropriately and be interpreted as described in the Evaluation
of Test Results Section.
10
FLUORESCENCE STAINING PROCEDURE
1. If the slides have been frozen, allow them to reach room temperature before proceeding with the staining procedure.
2. Place the slide in a humidified chamber.
3. Add sufficient amount of Pneumocystis carinii Staining
Reagent to each well containing a specimen (2-3 drops) to
cover the specimen, keeping within the boundary of the well.
4. Incubate for 30-35 minutes at 37±1°C. Do not allow the
Pneumocystis carinii Staining Reagent to dry on the slide
during the procedure.
Fo
5. Remove excess Pneumocystis carinii Staining Reagent by
draining the slide onto clean paper toweling or by aspiration.
rR
efe
6. Wash the slide by placing it in a rack and soaking it in deionized
water or tap water for one minute with gentle, intermittent agitation. Remove excess water by draining the slide onto clean
paper toweling or by aspiration.
ren
7. Dry the slide thoroughly by air drying or with a slide warmer
at 37±1°C.
ce
8. Apply one to two drops of Mounting Medium to the slide and
apply a coverslip, being careful to avoid the formation of air
bubbles.
Us
nly
eO
9. Examine the slides within 2-3 hours of staining. After reading, the slides may be stored overnight in the dark at 2-8°C,
or for up to 6 months in the dark at -20°C or lower. Slides
stored in the cold must be allowed to reach room temperature before reading to prevent condensation from obscuring
the sample.
10.For negative results to be valid, confirm by light microscopy
that specimen is present on the slide.
EXAMINATION OF STAINED SLIDES
Scan each well at 200X or greater magnification. If fluorescence
is observed, use 400X or 630X (with immersion oil) magnification to confirm the characteristic staining patterns described in
the Evaluation of Test Results Section. Confirm that specimen is
present on each slide after the completion of the assay.
11
EVALUATION OF TEST RESULTS
1. Specimens infected with Pneumocystis carinii contain large
round-to-elliptical shaped cysts, found both individually and
in clusters, which will be stained bright apple-green. Two or
more well-defined, fluorescing cysts must be observed
for the specimen to be considered positive.
efe
rR
Fo
2. Sporozoites and trophozoites may also be stained. They
appear as small, crescent-shaped or pleomorphic structures. Brightly staining, amorphous, extracellular matrix may
also be present. Specimens containing only brightly-staining,
amorphous material or typical sporozoite and trophozoite
forms should prompt active searching for cysts before a definite diagnosis can be made. In the absence of cysts, the
specimen should be suspected as positive for Pneumocystis carinii, and another specimen should be obtained for
staining.
ren
3. Other organisms and cellular material from respiratory specimens should be counterstained red to orange-red or gold.
4. A specimen is considered negative if characteristic fluorescence, as described above, is not observed.
ce
Us
5. A negative result on an induced sputum should be verified
on a subsequent specimen collected by bronchial wash or
bronchoalveolar lavage.
nly
eO
LIMITATIONS OF THE PROCEDURE
A negative result does not exclude the possibility of Pneumocystis carinii infection in the patient. Sample collection and
preparation are critical steps in the testing procedure. Collecting the sample at an improper time during the course of disease, by an inappropriate method or with improper handling of
the specimen, or misusing the reagents provided can result in
failure to detect Pneumocystis carinii. Diagnosis should be
made in conjunction with clinical symptoms.
Run only one specimen on each slide. Care must be taken to
process, fix, stain, and wash each specimen separately to prevent any possible wash-over of Pneumocystis carinii organisms
to other slides.
12
Excess mucus in specimens may prevent adequate staining.
Certain thick sputum smears may prevent adequate staining.
Care must be taken to make smears as thin as possible. Nonspecific trapping of the Pneumocystis carinii Staining Reagent may
occur if the specimen is not adequately washed.
In order for negative results to be considered valid, the presence of specimen on the slide must be confirmed by light
microscopy.
Fo
If the bronchial wash or bronchoalveolar lavage specimen is
negative, but the patient continues to exhibit symptoms associated with respiratory illness, other etiologic agents should be
suspected and appropriate diagnostic procedures (including
culture) should be performed.
ce
ren
efe
rR
PERFORMANCE CHARACTERISTICS
Three investigators participated in a clinical trial to evaluate the
MONOFLUO™ Pneumocystis carinii Immunofluorescence test.
Clinical specimens were collected from patients who were suspected of having Pneumocystis carinii pneumonia. An induced
sputum specimen was collected from each patient and was
tested in parallel with the MONOFLUO™ (MF) test and by histologic stain (reference method). Two histologic stains were used:
a Wright-Giemsa stain [Diff-Quik™ (DQ)] and toluidine blue O
(TBO).
Us
nly
eO
If the induced sputum was positive with the reference method,
the result was considered indicative of infection with P. carinii. If
the result with the reference method was negative on the
induced sputum specimen, a bronchoalveolar lavage (BAL)
specimen was obtained and tested. If the BAL was positive the
patient was positive for P. carinii. If the BAL was negative the
patient was considered negative for P. carinii. A total of 100
patients were included in the analysis. The results obtained are
shown in Table 2.
Table 2: Patient Results
Sites 1&2
Site 3
Specimen
DQ
MF
TBO
MF
Patients Positive for P.carinii
• by Induced Sputum
• by BA
62
53
9
63
53
10
14
8
6
14
14
6**
13
**These six were positive on induced sputum with the MONOFLUO™ test and were also
positive on the BAL. BAL’s were obtained on the six patients because the TBO result on
the sputum was negative.
The number of patients classified as positive and negative with
the MONOFLUO™ Pneumocystis carinii Immunofluorescence
Test Kit in comparison to the reference test is presented in
Table 3.
Table 3: Comparison of the Result Obtained Using Histologic Stain with the
Result Obtained with the MONOFLUO™ Immunofluorescence Test (Includes
both Induced Sputum and BAL)
Histological Stain
Monofluo™
–
+
–
76
1
rR
Fo
+
0
23
ce
ren
efe
Of the 100 patients tested, 76 were positive for P. carinii and 24
were negative for P. carinii as determined by histologic staining.
The MONOFLUO™ test correctly identified all 76 of the positive
patients and was negative on 23 patients who were negative for
P. carinii. One induced sputum specimen was negative by both the
MONOFLUO™ test and the reference test, but the BAL from this
patient was negative by the reference and positive with the
MONOFLUO™ test.
Us
eO
Based on these clinical data, the performance characteristics of
the MONOFLUO™ Pneumocystis carinii Immunofluorescence
Test Kit were:
nly
Sensitivity = 100%
Specificity = 95.8%
14
CROSS-REACTIVITY
The following bacterial and fungal cultures from culture isolates
and from specimens were tested for cross-reactivity with the
MONOFLUO™ Pneumocystis carinii Immunofluorescence Test Kit
and were found to be nonreactive:
Us
Candida parapsilosis
Candida pseudotropicalis
Candida tropicalis
Cryptococcus neoformans
Histoplasma capsulatum
Saccharomyces cerevisiae
Torulopsis glabrata
Trichosporon spp.
nly
eO
Fungi
Aspergillus niger
Aspergillus flavus
Aspergillus fumigatus
Aspergillus terreus
Aspergillus versicolor
Candida albicans
Candida krusei
Candida guillermondii
Mycobacterium tuberculosis
Mycobacterium kansasii
Mycobacterium avium-intracellulare
Neisseria spp.
Nocardia asteroides
Pepto streptococcus
Proteus mirabilis
Pseudomonas spp.
Rothia dentocariosa
Selenomonas sputigena
Staphylococcus aureus
Staphylococcus spp.
Streptococcus spp.
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus, Groups A,B,C,F,G
Treponema denticola
Veillonella parvula
ce
ren
efe
rR
Fo
Bacteria
Acinetobacter calcoaceticus
Actinomyces israelii
Bacteroides spp.
Bifidobacterium dentium
Campylobacter sputorum
Cardiobacterium hominis
Corynebacterium ulcerans
Eggerthella lenta
Enterobacter cloacae
Escherichia coli
Fusobacterium nucleatum
Haemophilus spp.
Klebsiella pneumoniae
Lactobacillus catenaformis
Legionella pneumophila
Leptotrichia buccalis
Micrococcus luteus
Moraxella lacunata
Moraxella (Branhamella) catarrhalis
15
MONOFLUO™
Pneumocystis carinii IFA Test Kit
Kit de Détection par immunofluorescence pour la mise
en évidence et l'identification du Pneumocystis carinii
dans les échantillons de voies respiratoires.
efe
rR
Fo
INDICATION
Le kit de détection par immunofluorescence Pneumocystis de
MONOFLUO™ est destiné à la mise en évidence des kystes et
trophozoïtes de Pneumocystis carinii dans les échantillons de
voies respiratoires.
ce
ren
SOMMAIRE ET EXPLICATION
Le Pneumocystis carinii est un organisme unicellulaire eucaryote
présent dans les poumons de nombreuses espèces mammifères,
dont l’homme. Il se propage par voies aérogènes, provoquant en
général une infection asymptomatique. Une exposition précoce
peut se traduire par une manifestation inapparente ou subclinique
dans laquelle l’organisme est présent à l’état latent durant l’âge
adulte. Chez les sujets immunodéprimés, le germe devient opportuniste, provoquant une pneumopathie interstitielle diffuse1,2.
eO
Us
nly
Les sujets à risque pour le Pneumocystis carinii comprennent
les prématurés, les personnes souffrant d’un déficit immunitaire
(tel que le syndrome d’immunodépression acquise) et celles
recevant un traitement immunosuppresseur tels que les corticostéroïdes. Le Pneumocystis carinii est l’agent infectieux
opportuniste le plus courant chez les sujets atteints du SIDA,
près de 80 % d’entre eux souffrant de l’infection3,4,5,6.
Des études morphologiques du germe ont révélé que le cycle
du Pneumocystis carinii comprend trois formes : les kystes, les
sporozoïtes et les trophozoïtes. Les kystes à paroi épaisse (4 à
7 µm de diamètre) contiennent en général huit sporozoïtes en
forme de virgule, qui se transforment ensuite en trophozoïtes
pléiomorphes plus gros (2 à 8 µm de diamètre) avant de
s’enkyster pour répéter le cycle1,6. Les kystes, présentant des
16
caractéristiques morphologiques distinctes, sont plus fréquemment associés à la présence du Pneumocystis carinii.
Il est impératif d’établir un diagnostic clinique rapide du Pneumocystis carinii étant donné que ces organismes s’infiltrent rapidement dans le tissu pulmonaire, provoquant dyspnée, fièvre et toux7.
Une détection précoce peut faciliter l’administration d’un traitement approprié et améliorer les chances de survie du patient8,9.
efe
rR
Fo
Actuellement, le diagnostic est assuré par radiographie et
l’identification des kystes et trophozoïtes de Pneumocystis carinii s’effectue par coloration histologique des échantillons respiratoires. Les méthodes de coloration courantes (bleu de
toluidine, nitrate d’argent à la méthénamine de Gomori ou
Giemsa) permettent de révéler les parois des kystes et/ou les
trophozoïtes et sporozoïtes6,10. Ces colorants étant par nature
non spécifiques, une identification précise du germe peut être
difficile. Une technique de prélèvement plus invasive, tel que le
lavage bronchio-alvéolaire, est souvent nécessaire pour confirmer la présence du Pneumocystis carinii11.
ce
ren
L’utilisation d’une technique d’immunofluorescence directe, sur
expectoration induite, lavage bronchique ou bronchio-alvéolaire,
constitue une méthode simple, hautement spécifique, permettant
de détecter le Pneumocystis carinii.12,13,14,15 Les anticorps monoclonaux du kit de détection par immunofluorescence du Pneumocystis carinii de MONOFLUO™ sont liés chimiquement à de
l’isothiocyanate de fluorescéine pour produire un réactif pour
immunofluorescence directe, hautement spécifique, présentant
un faible niveau de fluorescence non-spécifique. Outre leur
capacité à se lier aux kystes de Pneumocystis carinii, les anticorps monoclonaux se lient également de façon spécifique aux
trophozoïtes et sporozoïtes de Pneumocystis carinii et à la
matrice extracellulaire. Le kit de détection est destiné à l’identification rapide des kystes et trophozoïtes de Pneumocystis carinii,
directement dans les échantillons du patient.
nly
eO
Us
PRINCIPES
Le réactif de coloration du kit Pneumocystis carinii de MONOFLUO™ contient des anticorps monoclonaux murins marqués à
l’isothiocyanate de fluorescéine. Ces anticorps réagissent avec
toutes les formes de Pneumocystis carinii (kystes, sporozoïtes
et trophozoïtes), ainsi qu’avec la matrice extracellulaire,
présents dans les échantillons infectés.
17
Des lames de microscope sont préparées à partir d’échantillons
cliniques, comme décrit dans la rubrique intitulée Préparation
des échantillons cliniques avant coloration fluorescente. Une
fois fixées, les lames sont colorées avec le réactif de coloration
du kit Pneumocystis carinii de MONOFLUO™. Ce réactif se lie à
toute forme de Pneumocystis carinii présente dans l’échantillon.
Le rinçage qui suit permet d’éliminer tout réactif non lié à
l’échantillon. Les lames sont ensuite montées à l’aide du milieu
de montage fourni avec le kit MONOFLUO™. Le milieu de montage contient un stabilisateur qui prolonge la durée d’utilisation
des lames avant que la fluorescence ne s'estompe.
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rR
Fo
Sous un microscope à fluorescence, les échantillons infectés prennent une couleur vert-pomme brillant. Les kystes colorés apparaissent comme de grosses structures de forme ronde à elliptique, soit
isolées, soit groupées. Les sporozoïtes et les trophozoïtes peuvent
aussi se colorer, apparaissant comme des structures relativement
petites, en forme de croissant ou pléiomorphes. En outre, la
matrice extracellulaire amorphe peut aussi prendre une couleur
vive. Les autres organismes et matières cellulaires présents dans
les échantillons des voies respiratoires sont contre-colorés en
rouge, rouge orangé ou or, mais ne présentent pas les caractéristiques fluorescentes des kystes de Pneumocystis carinii.
DESCRIPTION DU PRODUIT
Us
Tableau 1 : Matériel fourni
Conserver les réactifs entre 2 et 8° C et les lames entre 2 et 28° C.
Contenu
R1 • Réactif* de
coloration du
Pneumocystis carinii
1 flacon comptegouttes
(2,2 ml)
R2 • Milieu de montage
1 flacon comptegouttes
(3,5 ml)
R3 • Lames pour
microscopieen
fluorescence
24 (2 puits chacune)
• Anticorps monoclonaux
(murins) marqués à
l’isothiocyanate de fluorescéine
• Contre-colorant (bleu Evans)
• Azide de sodium**
• Tampon protéinique
• Glycérol tamponné
• Formaldéhyde***
• Stabilisateur
Mélanger
doucement
avant
utilisation.
• Lames pour microscopie en
fluorescence
Nettoyer avec
un chiffon non
pelucheux
avant emploi.
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Composant
Préparation
Prêt à
l’emploi.
*Volume suffisant pour colorer 24 puits réactionnels individuels. **0,1 % Azide de sodium.
***0.8 % formaldéhyde.
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MATERIEL NECESSAIRE MAIS NON FOURNI
• Acétone pour analyse (à conserver dans un récipient hermétique pour éviter l’absorption d’eau).
• Eau déminéralisée ou eau du robinet.
• Bacs de coloration pour les lames, avec portoirs.
• Chambre humidifiée (boîte de Petri couverte contenant
une serviette en papier humidifiée).
• Lamelles, 24 x 40 mm, n° 1.
• Pipettes Pasteur.
• Centrifugeuse ou micro-centrifugeuse.
• Tubes de centrifugation de 15 ml ou tubes de micro-centrifugation de 1,5 ml.
• Incubateur à 37 ±1° C.
• Hotte de protection biologique (recommandée)
• Huile à immersion pour fluorescence, si nécessaire.
• Microscope à fluorescence avec grossissements de 200 à
250 et de 400 à 630, équipé d’un système de filtres pour
l’isothiocyanate de fluorescéine. Une vaste gamme de filtres sont disponibles pour ce marqueur sur le marché. Il
est recommandé de disposer de longueurs d’onde d’excitation à large bande (420 à 490 nm) ou bande étroite (470
à 490 nm), avec miroir dichromatique de 515 nm et filtre
protecteur de 515 nm. La longueur d’onde à bande étroite
permet de réduire la fluorescence de bruit de fond. Les
variations de puissance, d’intensité et d’alignement de
l’ampoule et les différents types d’illuminateurs et de filtres utilisés peuvent affecter le niveau de performance du
test.
• Lames témoins contenant des germes de Pneumocystis
carinii (cf. Préparation des lames témoins).
• Serviettes en papier ou système d’aspiration.
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eO
Us
Pour les échantillons d’expectoration induite
• Dithiothreitol (DTT): préparation liquide de 0,1 % (6,5 x
10-3 moles/l). Par exemple, Stat-Pak™ Sputolysin, de
Behring Diagnostics. Suivre le mode d’emploi.
• Solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
19
PRECAUTIONS
Réservé aux usages diagnostiques in vitro.
Exclusivement à usage professionnel.
1. La pratique de ce test est réservée au personnel expérimenté en matière de manipulation d’échantillons cliniques
pouvant contenir le virus HIV-1. Les lames doivent être
examinées par un personnel sachant lire les tests par immunofluorescence.
2. Manipuler tous les échantillons cliniques comme s’ils étaient
infectieux.
rR
Fo
3. Les techniques produisant des aérosols doivent être pratiquées dans une hotte de protection biologique. Tous les
matériaux doivent être désinfectés après emploi ou avant
d’être jetés.
ce
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4. Respecter une bonne technique de laboratoire lors de la
manipulation des échantillons ou des réactifs du kit de
détection par immunofluorescence Pneumocystis carinii de
MONOFLUO™. Ne pas manger, boire ni fumer dans le laboratoire. Ne pas pipeter par la bouche. Eviter de contaminer
les réactifs avec des microbes ou d’autres substances.
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Us
5. Le réactif de coloration contient du bleu Evans, substance
irritante. Eviter de répandre ou d’éclabousser le réactif de
coloration sur la peau ou les vêtements. Rincer abondamment avec de l’eau les zones qui ont été mises en contact
avec le réactif de coloration.
nly
6. Le milieu de montage comprend 2 % de formaline contenant
0,8 % de formaldéhyde, substance d’habitude regardé
comme cancérigène. Néanmoins, les informations y connues
n’établissent pas de façon concluant la cancérigènicité du
formaldéhyde à la concentration trouvé dans cette trousse
(<1.00%). Eviter de répandre ou d’éclabousser le milieu de
montage sur la peau ou les vêtements. Rincer abondamment
avec de l’eau les zones qui ont été mises en contact avec le
milieu de montage.
R: 40-43: Peut entraîner une sensibilisation par inhalation et
par contact avec la peau. Risque potentiel d'effets irréversibles.
20
S: 24/25-28-36/37/39: Eviter tout contact avec la peau et les
yeux. En cas de contact avec la peau, rincer immédiatement
avec une grande quantité d'eau. Porter des vêtements, des
gants, des lunettes ou un masque de protection efficaces.
7. Le réactif de coloration contient de l’azide de sodium. Cette
substance peut réagir avec les tuyaux en plomb et en cuivre
pour former des azides métalliques fortement explosifs. Si le
réactif de coloration est évacué dans l’évier, rincer les tuyaux
avec une grande quantité d’eau pour éviter l’accumulation
d’azide.
ce
ren
efe
rR
Fo
Xn: Nocif
0,1 % NaN3
R: 21/22
Nocif par contact avec la peau et par ingestion.
S: 24/25-28-36/37/39
Éviter le contact avec la peau et les yeux. Après contact avec la peau, se laver immédiatement et abondamment avec de l'eau. Porter un vêtement de
protection approprié, des gants et un appareil de protection des yeux/du visage.
8. Nettoyer méticuleusement tous les articles réutilisables
après usage.
9. Mélanger délicatement le réactif de coloration avant chaque
test.
Us
eO
10.Utiliser une lame différente pour chaque échantillon pour
éviter toute contamination croisée des germes de Pneumocystis carinii. Il est également recommandé de laver
séparément chaque lame.
nly
11.Les lames doivent être fixées à l’acétone. Les lames fixées
au formol ou à l’éthanol ne sont pas recommandées pour ce
test.
STABILITE ET CONSERVATION DU REACTIF
Ne pas utiliser le kit ni aucun de ses composants au delà de la
date de péremption. Conserver le réactif de coloration dans
l’obscurité, entre 2 et 8°C.
Conserver les réactifs entre 2 et 8° C et les lames entre 2 et 28°
C. Quand ils sont stockés à la température recommandée, les
réactifs ouverts ou fermés sont stables jusqu'à la date de
péremption.
21
MODE D’EMPLOI DU TEST PNEUMOCYSTIS CARINII
Prelèvement des échantillons
Les échantillons cliniques doivent avoir été prélevés récemment
à l’aide de méthodes standard d’obtention d’expectoration
induite, par lavage bronchique ou bronchio-alvéolaire16,17.
L’échantillon doit être traité immédiatement. Réserver une partie de l’échantillon pour la culture.
Preparation des Echantillons Cliniques Avant Coloration
Fluorescente
Echantillons d’expectoration induite
efe
rR
Fo
1a.Déposer 2 à 3 ml d’échantillon d’expectoration dans un tube
de centrifugation de 15 ml. Ajouter un volume égal de dithiothreitol. Centrifuger le tube et incuber pendant 5 à 10 minutes
à 37° C ou 15 minutes à température ambiante (15 à 30° C).
- OU -
ce
ren
1b.Si l’échantillon est trop visqueux pour être transféré dans un
tube de centrifugation, ajouter un volume estimé égal de
dithiothreitol directement dans le récipient de prélèvement,
agiter vigoureusement pour mélanger et incuber pendant 5 à
10 minutes à 37° C ou 15 minutes à température ambiante
(de 15 à 30° C). Transférer dans un tube de centrifugation
dès que possible durant l’incubation et agiter fortement
avant de traiter.
eO
Us
nly
2. Ajouter dans le tube environ 5 à 6 ml de solution saline tamponnée au phosphate (pH 7,2), de volume équivalent à celui
de l’expectoration et du DTT combinés, et agiter fortement.
3. Centrifuger à 1500 x G pendant 5 minutes.
4. Faire décanter ou aspirer délicatement le surnageant en conservant un volume de 0,5 ml ou moins de culot et de surnageant dans le tube. Répéter les étapes 2, 3 et 4, si nécessaire,
pour éliminer toute trace de muqueuse.
5. Mettre à nouveau le culot en suspension, avec soin. A l’aide
d’une pipette, déposer une goutte (environ 25 à 50 µl) sur
une des lames de microscope fournies avec le kit. Etaler uniformément la goutte sur le puits avec la paroi d’un embout
de pipette, en prenant soin de ne pas rayer la lame. Laisser
22
sécher à l’air. Il est possible d’accélérer le temps de séchage
en chauffant la lame à 37° C.
6. Fixer à l’acétone pendant environ 10 minutes. Les lames
peuvent être traitées immédiatement ou congelées à -20° C
pendant un mois au plus avant la coloration.
Echantillons provenant de lavage bronchique ou bronchioalvéolaire
rR
Fo
Les échantillons non mucoïdes, tels que ceux provenant de lavages bronchiques ou bronchio-alvéolaires ne nécessitent pas, en
général, de traitement mucolytique. Ces échantillons peuvent
être directement centrifugés (étape 3, ci-dessus) dans un tube de
centrifugation de 15 ml ou dans un tube de micro-centrifugation
de 1,5 ml.
ce
ren
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REMARQUE : Une centrifugeuse « Cytospin » peut aussi être
utilisée pour préparer les lames contenant des échantillons
d’expectoration induite, de lavage bronchique ou bronchioalvéolaire12. Lorsque cette méthode est suivie, les témoins
doivent être traités de la même manière. Les lames préparées
avec une centrifugeuse de ce type sont fixées à l’acétone pendant 10 minutes et colorées comme décrit ci-dessous au paragraphe Coloration fluorescente.
nly
eO
Us
PREPARATION DES LAMES TEMOINS
Une lame témoin positive doit être préparée chaque fois que le
test est effectué. Les échantillons de lavage bronchique et bronchio-alvéolaire conviennent le mieux comme contrôle positif. Les
échantillons choisis doivent avoir été confirmés au préalable
comme étant positifs pour Pneumocystis carinii par coloration
histologique. Suivre les consignes décrites au paragraphe Préparation d’échantillons cliniques avant coloration fluorescente.
Après avoir été fixées à l’acétone, les lames peuvent être congelées à -20° C pendant un mois au plus. Il est aussi possible
d’utiliser un échantillon positif connu comme témoin positif. Pour
garantir la validité du test, la lame témoin doit être colorée convenablement et être interprétée conformément au paragraphe Evaluation des résultats des tests.
23
COLORATION FLUORESCENTE
1. Si les lames ont été congelées, les laisser atteindre la
température ambiante avant d’entreprendre la coloration.
2. Placer la lame dans une chambre humidifiée.
3. Déposer suffisamment de réactif de coloration du Pneumocystis carinii dans chaque puits contenant un échantillon
(2 à 3 gouttes) pour recouvrir ce dernier, en respectant les
limites de contenance du puits.
Fo
4. Incuber pendant 30 à 35 minutes à 37 ±1° C. Ne pas laisser
sécher le réactif de coloration du Pneumocystis carinii sur la
lame pendant l’opération.
rR
5. Eliminer tout réactif de coloration du Pneumocystis carinii en
excès en égouttant la lame sur une serviette en papier propre ou par aspiration.
ce
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6. Laver la lame en la plaçant dans un portoir et en la trempant
dans de l’eau déminéralisée ou de l’eau du robinet pendant
une minute. Agiter légèrement par intermittence. Egoutter à
nouveau la lame sur une serviette en papier propre ou par
aspiration pour éliminer l’excédent d’eau.
7. Sécher soigneusement la lame par séchage à l’air ou par
chauffage à 37 ± 1° C.
Us
eO
8. Déposer une à deux gouttes de milieu de montage sur la
lame et appliquer une lamelle en veillant à éviter la formation
de bulles d’air.
nly
9. Examiner les lames au bout de 2 à 3 heures. Après lecture,
les lames peuvent être conservées jusqu’au lendemain dans
l’obscurité entre 2 et 8° C, ou jusqu’à six mois dans l’obscurité à -20° C ou moins. Les lames conservées au froid
doivent être laissées à la température ambiante avant de
pouvoir être lues pour éviter que la condensation n’obscurcisse l’échantillon.
10.Pour que les résultats négatifs soient valides, la présence de
l’échantillon sur la lame doit être confirmée par observation
en microscopie optique.
24
EXAMEN DES LAMES COLOREES
Examiner chaque puits avec un grossissement de 200 ou plus.
Si de la fluorescence est observée, utiliser un grossissement de
400 ou 630 (avec huile à immersion) pour confirmer les structures caractéristiques de coloration décrites au paragraphe
Evaluation des résultats des tests. Confirmer que l’échantillon
est présent sur chaque lame à l’issue de l’essai.
EVALUATION DES RESULTATS DES TESTS
rR
Fo
1. Les échantillons infectés par le Pneumocystis carinii contiennent de gros kystes de forme ronde ou ovale, soit isolés, soit
groupés, de couleur vert-pomme brillant. Deux kystes ou
plus, fluorescents et bien définis, doivent être observés
pour que l’échantillon soit considéré positif.
ce
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2. Les sporozoïtes et les trophozoïtes peuvent également être
colorés. Ils ont la forme de petites structures pléiomorphes
ou en croissant. La matrice extracellulaire amorphe peut
également apparaître fortement colorée. Les échantillons
contenant seulement des matières amorphes fortement colorées ou des sporozoïtes et trophozoïtes types doivent
inciter à la recherche active de kystes avant de pouvoir
dresser un diagnostic définitif. En l’absence de kyste,
l’échantillon doit être soupçonné positif au Pneumocystis
carinii et un autre échantillon doit être coloré.
Us
eO
3. Les autres germes et matières cellulaires provenant des
voies respiratoires doivent être contre-colorés en rouge à
rouge orangé ou or.
nly
4. Un échantillon est considéré négatif si la fluorescence caractéristique décrite ci-dessus n’est pas observée.
5. Un résultat négatif sur une expectoration induite doit être
vérifié sur un autre échantillon prélevé par lavage bronchique
ou bronchio-alvéolaire.
LIMITES DE LA METHODE
Un résultat négatif n’exclut pas la possibilité d’une infection au
Pneumocystis carinii. Le prélèvement et la préparation des
échantillons constituent des étapes importantes dans la procédure de test. Le prélèvement de l’échantillon à un moment inopportun au cours de la maladie, par une méthode incorrecte ou
25
avec une mauvaise manipulation de l’échantillon, ou l’utilisation
non appropriée des réactifs fournis peuvent compromettre la
détection du Pneumocystis carinii. Un diagnostic doit être
dressé conjointement avec les symptômes cliniques.
Déposer un seul échantillon par lame. Prendre soin de toujours
traiter, fixer, colorer et laver chaque échantillon séparément
pour éviter tout transfert éventuel des germes de Pneumocystis
carinii sur les autres lames.
rR
Fo
Un excès de mucus dans les échantillons risque d’empêcher
une coloration adéquate. Certains frottis d’expectoration trop
épais peuvent empêcher une coloration correcte. Prendre soin
de former des frottis aussi minces que possible. Une rétention
non spécifique du réactif de coloration du Pneumocystis carinii
peut se produire si l’échantillon n’est pas bien lavé.
efe
Pour que les résultats négatifs soient considérés valides, la
présence de l’échantillon sur la lame doit être confirmée par
microscopie optique.
ce
ren
Si l’échantillon de lavage bronchique ou bronchio-alvéolaire est
négatif et si le patient présente toujours des symptômes associés à un trouble respiratoire, d’autres agents étiologiques
doivent être soupçonnés et des méthodes diagnostiques appropriées (y compris culture) doivent être entreprises.
nly
eO
Us
CARACTERISTIQUES DES PERFORMANCES
Trois chercheurs ont participé aux essais cliniques pour évaluer
le test d’immunofluorescence Pneumocystis carinii de MONOFLUO™. Des échantillons cliniques ont été prélevés sur des
patients soupçonnés de souffrir de pneumocystose. Un échantillon d’expectoration induite a été prélevé sur chaque patient et
testé en parallèle à l’aide du test de MONOFLUO™ (MF) et par
coloration histologique (méthode de référence). Deux colorants
histologiques ont été utilisés : un colorant Wright-Giemsa (DiffQuick™ [DQ]) et du bleu de toluidine [BT].
Si l’expectoration induite était positive avec la méthode de
référence, le résultat était considéré indiquer une infection à
P. carinii. Si le résultat avec la méthode de référence était négatif sur l’échantillon d’expectoration induite, un échantillon de
lavage bronchio-alvéolaire était obtenu et testé. Si ce dernier
était positif, le patient était considéré positif pour P. carinii. S’il
était négatif, le patient était considéré négatif pour P. carinii. Un
26
total de 100 patients ont participé à cette étude. Les résultats
obtenus figurent dans le tableau 2.
Tableau 2 : Résultats obtenus sur les patients
Sites 1 & 2
Site 3
Specimen
DQ
MF
TBO
MF
Patients Positifs au P.carinii
• par expectoration induite
• par lavage bronchiaalvéolaire
62
53
63
53
14
8
14
14
9
10
6
6**
Fo
**Ces six étaient positifs sur l’expectoration induite avec le test de MONOFLUO™ et
également positifs sur le lavage bronchio-alvéolaire. Les lavages ont été obtenus sur les
six patients car le résultat au bleu de toluidine sur l’expectoration était négatif.
efe
rR
Le nombre de patients classés positifs et négatifs par le kit de
détection par immunofluorescence Pneumocystis carinii de
MONOFLUO™, en comparaison avec le test de référence, est
présenté dans le tableau 3.
ren
Tableau 3 : Comparaison des résultats obtenus par coloration
histologique et par test d’immunofluorescence de MONOFLUO™
(expectoration induite et lavage bronchio-alvéolaire)
Coloration histologique
Monofluo™
–
0
–
1
23
Us
76
ce
+
+
nly
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Sur les 100 patients testés, 76 étaient positifs et 24 étaient
négatifs pour P. carinii, par coloration histologique. Le test de
MONOFLUO™ a identifié correctement les 76 patients positifs
et se révéla négatif pour 23 des patients négatifs pour P. carinii.
Un échantillon d’expectoration induite était négatif à la fois
avec le test de MONOFLUO™ et avec le test de référence mais
le lavage bronchio-alvéolaire de ce patient était négatif avec le
test de référence et positif avec le test de MONOFLUO™.
A partir de ces données cliniques, les caractéristiques de performance du kit de détection par immunofluorescence Pneumocystis carinii de MONOFLUO™ sont les suivantes:
Sensibilité = 100 %
Spécificité = 95,8 %
27
REACTIONS CROISEES
Les cultures bactériennes et fongiques suivantes, obtenues à
partir d’isolats culturaux et d’échantillons, ont été testées pour
déterminer si elles présentaient une réactivité croisée avec le kit
de détection par immunofluorescence Pneumocystis carinii de
MONOFLUO™. Aucune réaction n’a été observée.
Neisseria spp.
Nocardia asteroides
Pepto streptococcus
Proteus mirabilis
Pseudomonas spp.
Rothia dentocariosa
Staphylococcus spp.
Streptococcus spp.
Streptococcus, Groupes A,B,C,F,G
Treponema denticola
Veillonella parvula
ce
ren
efe
rR
Fo
Bactéries
Bacteroides spp.
Eggerthella lenta
Escherichia coli
Haemophilus spp.
Micrococcus luteus
Moraxella lacunata
Us
Champignons
Aspergillus niger
Aspergillus flavus
Aspergillus terreus
Candida albicans
Candida krusei
nly
eO
Candida tropicalis
Torulopsis glabrata
Trichosporon spp.
28
MONOFLUO™
Pneumocystis carinii
IFA Test Kit
32515
Equipo de análisis para la detección e identificación de
Pneumocystis carinii en muestras de vias respiratorias
mediante anticuerpos inmunofluorescentes.
Fo
ren
efe
rR
USO DESTINADO
El Equipo MONOFLUO™ para el análisis de Pneumocystis
mediante anticuerpos inmunofluorescentes está destinado a
usarse para la detección de quistes y trofozoítos de Pneumocystis carinii en muestras obtenidas de las vías respiratorias.
ce
RESUMEN Y EXPLICACIÓN
El Pneumocystis carinii es un organismo unicelular y eucarionte
que está presente en los pulmones de muchas especies
mamíferas, incluido el hombre. El organismo se disemina a
través del aire y generalmente causa una infección asintomática. La exposición durante la niñez puede producir un
caso leve o subclínico, pudiendo persistir el organismo en
forma latente hasta la edad adulta. En los individuos con
sistema inmunitario comprometido, el organismo se transforma
en oportunista y causa una pneumonía difusa e intersticial.1,2
nly
eO
Us
Entre las personas con riesgo de padecer infección por Pneumocystis carinii se incluyen los lactantes prematuros, personas
con trastornos debidos a la inmunodeficiencia (como el síndrome de inmunodeficiencia adquirida), y las que reciben fármacos inmunosupresores como los corticoides. El
Pneumocystis carinii es el agente causante de infecciones
oportunistas más frecuente en los pacientes con SIDA; casi el
80% padece esta infección.3,4,5,6
Los estudios morfológicos del organismo han revelado tres formas dentro del ciclo vital del Pneumocystis carinii: quistes,
esporozoítos y trofozoítos. Los quistes, tienen una pared gruesa
29
de unos 4-7 µm de diámetro, y generalmente contienen ocho
esporozoítos en forma de coma, que luego maduran y se transforman en trofozoítos pleomorfos más grandes, de unos 2-8 µm
de diámetro, antes de enquistarse para repetir el ciclo.1,6 Los
quistes, con sus características morfológicas distintivas, son las
formas que se asocian más frecuentemente con la presencia de
Pneumocystis carinii.
Fo
Es sumamente importante hacer un diagnóstico clínico precoz
de Pneumocystis carinii, ya que este organismo puede infiltrar
rápidamente el tejido pulmonar y causar dísnea, fiebre y tos.7
La detección precoz puede facilitar el inicio de un tratamiento
apropiado y puede mejorar las probabilidades de supervivencia
del paciente.8,9
ce
ren
efe
rR
Actualmente el diagnóstico se realiza mediante exploración
radiológica e identificación de los quistes y trofozoítos de
Pneumocystis carinii por coloración histológica de muestras de
las vías respiratorias. Los métodos comunes de coloración
(azul de toluidina O, tinción de Gomori con metenamina argéntica, o tinción Giemsa) muestran las paredes de los quistes y/o
los trofozoítos/esporozoítos.6,10 Como estas tinciones son de
naturaleza no específica, puede ser difícil hacer la identificación
correcta del organismo. Muchas veces se requiere el uso de
una técnica más agresiva como el lavado bronquioalveolar,
para asegurar la presencia de Pneumocystis carinii.11
Us
nly
eO
El uso de un procedimiento directo basado en el empleo de
anticuerpos fluorescentes con muestras de esputo inducido,
lavado bronquial o lavado bronquioalveolar permite detectar
Pneumocystis carinii de forma sencilla y altamente específica.12,13,14,15 Los anticuerpos monoclonales del Equipo MONOFLUO™ de análisis con anticuerpos inmunofluorescentes para
Pneumocystis carinii están ligados químicamente con el isotiocianato de fluoresceína (FITC), proporcionando un reactivo
inmunofluorescente altamente específico y directo con poca
fluorescencia de fondo. Además de unirse a los quistes de
Pneumocystis carinii, los anticuerpos monoclonales también se
unen específicamente con los trofozoítos, esporozoítos y con la
matriz extracelular de Pneumocystis carinii. El equipo de análisis se usa para la identificación rápida y directa en las muestras
de los pacientes de quistes y trofozoítos de Pneumocystis carinii.
30
PRINCIPIO DE LA TÉCNICA
El Reactivo colorante MONOFLUO™ para Pneumocystis carinii
contiene anticuerpos monoclonales de origen murino marcados
con isotiocianato de fluoresceína (FITC). Estos anticuerpos
reaccionan con todas las formas de Pneumocystis carinii
(quistes, esporozoítos y trofozoítos) y con la matriz extracelular
presente en las muestras infectadas.
ren
efe
rR
Fo
Las muestras clínicas se extienden en portaobjetos para el
análisis microscópico, de acuerdo con lo descrito en la sección
Preparación de muestras clínicas antes de la coloración fluorescente. Una vez fijadas, las muestras se tiñen con el Reactivo
colorante MONOFLUO™ para Pneumocystis carinii. El Reactivo
colorante se une a todos los organismos de Pneumocystis carinii presentes en la muestra. Después, mediante una fase de
lavado, se elimina el Reactivo colorante que no se unió a la
muestra. Luego se montan las muestras con el Medio de montaje MONOFLUO™ que se incluye en el equipo. El Medio de
montaje contiene un agente estabilizador de fluorescencia que
aumenta la duración de la fluorescencia y permite más tiempo
para el examen de los portaobjetos.
ce
Cuando las muestras infectadas se examinan bajo un
microscopio de fluorescencia, se observa una fluorescencia
brillante de color verde claro. Los quistes teñidos se ven como
estructuras grandes redondas o elípticas que están aisladas o
agrupadas. También pueden colorearse los esporozoítos y trofozoítos, que se ven como estructuras relativamente pequeñas
en forma de media luna o pleomorfas. Además, la matriz
extracelular amorfa muestra una fluorescencia brillante. Los
otros organismos y material celular de las muestras respiratorias quedan teñidos de un color rojo a rojo-anaranjado o
dorado, sin presentar la fluorescencia característica de los
quistes de Pneumocystis carinii.
nly
eO
Us
31
DESCRIPCION DEL PRODUCTO
Tabla 1: Materiales que se suministran
Almacene los reactivos a 2-8°C. Almacene los portaobjetos a 228°C.
Componente
Contenido
Preparación
efe
rR
Fo
R1 • Reactivo
• Anticuerpos monoclonales
colorante
murinos, marcados con FITC
Pneumocystis carinii * • Coloración de contraste de
1 frasco con gotero
(Azul de Evans)
(2,2 ml)
• Azida de sodio**
• Tampón estabilizado con
proteínas
R2 • Medio de
• Glicerol tamponado
montaje
• Formaldehído***
1 frasco con gotero
• Estabilizador de
(3,5 ml)
fluorescencia
R3 • Portaobjetos
• Portaobjetos para
para microscopía de
microscopía de
fluorescencia
fluorescencia
24 (2 pozos cada uno)
Mezde con
suavidad antes
usar.
Listo para usar
Limpie con un
paño sin pelusa
antes de usar
ren
*Volumen suficiente para la coloración de 24 pozos de análisis individuales. **0,1 % Azida
de sodio. ***0.8 % Formaldehído.
ce
MATERIALES NECESARIOS QUE NO SE SUMINISTRAN
• Acetona, de calidad para reactivo. (Almacene en un recipiente bien tapado para evitar la absorción de agua.)
• Agua desionizada o agua del grifo.
• Placas y soportes tipo "rack" para teñir los portaobjetos.
• Cámara húmeda (como una placa de Petri tapada que
contenga una toallita de papel humedecido).
• Cubreobjetos, 24 x 40 mm, N°1.
• Pipetas Pasteur.
• Centrífuga o microcentrífuga.
• Tubos de 15 ml para centrífuga o tubos de 1,5 ml para
microcentrífuga.
• Incubador de 37±1°C.
• Cámara de seguridad para materiales biológicos
(recomendada).
• Aceite de inmersión de calidad para fluorescencia, si se
necesita.
• Microscopio de fluorescencia con aumento de 200-250X
y 400-630X, provisto de un sistema de filtro para el isotiocianato de fluoresceína (FITC). Varios fabricantes ofrecen
nly
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32
Fo
una amplia gama de juegos de filtros para la lectura de
FITC. Se recomiendan longitudes de onda de excitación
de banda ancha (420-490 nm) o banda estrecha (470-490
nm) con un espejo dicromático de 515 nm y un filtro de
barrera de 515 nm. La longitud de onda de excitación de
banda estrecha sirve para disminuir la fluorescencia de
fondo. Las variaciones en la potencia, la intensidad y el
alineamiento del foco luminoso y las diferencias en el tipo
de iluminador y los filtros pueden afectar el rendimiento
del análisis.
• Portaobjetos control con organismos Pneumocystis carinii (ver la sección Preparación de portaobjetos control).
• Toallas de papel o sistema de aspiración.
ren
efe
rR
Para las muestras de esputo inducido
• Ditiotreitol (DTT): una preparación líquida al 0,1% (6,5x103 moles/L). Por ejemplo, Sputolysin Stat-PakTM de
Behring Diagnostics: utilí-cese según las instrucciones.
• Solución fisiológica tamponada con fosfato (PBS).
ce
PRECAUCIONES
Solamente para uso diagnóstico in vitro
Sólo para uso profesional.
nly
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1. Este análisis debe ser realizado solamente por empleados
debidamente capacitados en el manejo de muestras clínicas
que podrían contener el virus de la inmunodeficiencia
humana 1 (HIV-1). Solamente los empleados experimentados en la lectura de análisis inmunofluorescentes deberían
examinar los portaobjetos.
2. Manipule todas las muestras clínicas como si fuera material
potencialmente infeccioso.
3. Use una cámara de seguridad biológica para todos los procedimientos que pudieran crear aerosoles. Todos los materiales deben desinfectarse después de su uso o antes de ser
desechados.
4. Use buenas técnicas de laboratorio cuando trabaje con las
muestras o con los reactivos del Equipo MONOFLUO™ de
análisis inmunofluorescente para Pneumocystis carinii. No
coma, beba ni fume en el laboratorio. No use la boca para
33
pipetear. Evite la contaminación de los reactivos con microbios u otras substancias.
5. El Reactivo colorante contiene Azul de Evans, que es un irritante. Evite salpicar o derramar el Reactivo colorante sobre
la piel o la ropa. En caso de contacto con el Reactivo colorante, lave la zona bien con agua.
rR
Fo
6. El medio de montaje tiene un 2% de formalina que contiene
0,8% de formaldehido, lo que puede razonablemente considerarse ser cancerígeno. No obstante, los datos existentes
no establecen con certidumbre la cancerigenicidad del formaldehído a la concentración usada en este equipo (<1.00%).
Evite salpicar o derramar el Medio de montaje sobre la piel o
la ropa. En caso de contacto con el Medio de montaje, lave
la zona bien con agua.
efe
R: 40-43: Puede producir sensibilización por inhalación y por
contacto con la piel. Riesgo de efectos irreversibles.
ren
S: 24/25-28-36/37/39: Evitar el contacto con la piel y los
ojos. Si ha estado en contacto con la piel, lavar de inmediato
con agua abundante. Usar ropa protectora, guantes, y protección para los ojos y la cara.
ce
7. El Reactivo colorante contiene azida de sodio. La azida de
sodio puede reaccionar con las tuberías de plomo y de
cobre, para formar azidas metálicas que son sumamente
explosivas. Si desecha el Reactivo colorante en el fregadero,
deje correr una gran cantidad de agua para evitar la acumulación de azida en las tuberías.
eO
Us
nly
Xn: Nocivo
0,1 % NaN3
R: 21/22
Nocivo en contacto con la piel y por ingestión.
S: 24/25-28-36/37/39
Evítese el contacto con los ojos y la piel. En caso de
contacto con la piel, lávese inmediata y abundantemente con agua. Úsense indumentaria y guantes
adecuados y protección para los ojos/la cara.
8. Limpie todos los artículos reutilizables cada vez que los use.
9. Mezcle el Reactivo colorante suavemente antes de cada
análisis.
34
10.Use un portaobjetos diferente para cada muestra de
paciente, para evitar la contaminación cruzada con organismos Pneumocystis carinii. También se recomienda lavar
cada portaobjetos independientemente.
11.Prepare los portaobjetos con fijación de acetona. No se
recomienda fijar las muestras con formalina ni etanol para
este análisis.
ESTABILIDAD Y ALMACENAMIENTO DE LOS REACTIVOS
No use el equipo ni ningún componente después de la fecha de
caducidad. Almacene el Reactivo colorante en la oscuridad a
temperatura entre 2-8°C.
Fo
efe
rR
Conserve los reactivos a 2-8°C. Los portaobjetos deben mantenerse entre 2-28°C. Los reactivos cerrados o abiertos, si se
almacenan a la temperatura especificada, se mantienen estables
durante la vida útil impresa en la etiqua.
PROCEDIMIENTO PARA EL ANÁLISIS DE PNEUMOCYSTIS
CARINII
ren
ce
Obtención de la muestra
Emplee muestras clínicas recién obtenidas mediante métodos
estándar para la obtención de esputo inducido, lavado bronquial o lavado bronquioalveolar.16,17 Procese la muestra inmediatamente. Reserve una parte de la muestra para el cultivo.
Us
eO
Preparación de Muestras Clínicas Antes de la Coloración
Fluorescente
Muestras de esputo inducido
nly
1a.Coloque 2 a 3 ml de esputo en un tubo de centrífuga de 15
ml. Agregue igual volumen de reactivo de ditiotreitol. Agite el
tubo en un vórtex e incube durante 5 a 10 minutos a 37°C o
15 minutos a temperatura ambiente (15 a 30°C).
— o alternativamente —
1b.Si la muestra es tan viscosa que resulta difícil colocarla en
un tubo de centrífuga, agregue un volumen que estime igual
del reactivo de ditiotreitol al recipiente de obtención de la
muestra, revuelva bien para efectuar la mezcla, e incube
35
durante 5 a 10 minutos a 37°C o 15 minutos a temperatura
ambiente (15 a 30°C). Transfiera la mezcla a un tubo de centrífuga lo antes posible durante la incubación y agite en un
vórtex antes de seguir adelante.
2. Agregue al tubo un volumen de aproximadamente 5 a 6 ml
de PBS a pH 7,2, igual al volumen de la mezcla de esputo
con DTT, y mezcle bien con el vórtex.
3. Centrifugue a 1500 x G durante 5 minutos.
Fo
4. Decante cuidadosamente o aspire el sobrenadante, dejando
0,5 ml o menos del precipitado y sobrenadante en el tubo.
Puede repetir los pasos 2, 3 y 4 si fuera necesario, para eliminar todo el moco.
ren
efe
rR
5. Vuelva a suspender bien el material centrifugado. Con un
pipeteador, coloque una gota (aproximadamente 25-50 µl)
sobre uno de los portaobjetos para microscopía proporcionados en el equipo. Con un lado de la punta de una pipeta,
distribuya la gota de forma homogénea en todo el pocillo,
vigilando no rayar el portaobjetos. Deje secar al aire. Puede
usarse un calentador de portaobjetos a 37°C para acelerar el
secado de la muestra.
ce
6. Fije con acetona durante aproximadamente 10 minutos.
Puede procesar los portaobjetos inmediatamente o congelarlos a -20°C y conservarlos por un período de hasta un
mes, antes de la coloración.
eO
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Muestras de lavado bronquial y lavado bronquioalveolar
nly
Las muestras con poco moco como los lavados bronquiales y
lavados bronquioalveolares no suelen precisar el tratamiento
mucolítico. Para estas muestras, el protocolo puede comenzar
con la centrifugación, que es el paso 3 de más arriba, en un
tubo de centrífuga de 15 ml o un tubo de microcentrífuga de
1,5 ml.
NOTA: Alternativamente, puede usarse una centrífuga
“cytospin” para preparar las muestras de esputo inducido,
lavado bronquial o lavado bronquioalveolar.12 Cuando se usa el
procedimiento cytospin, hay que procesar los controles de la
misma manera. Los portaobjetos preparados con una centrífuga cytospin se fijan durante diez minutos en acetona y se tiñen
36
como se describe más adelante en la sección Procedimiento de
coloración fluorescente.
efe
rR
Fo
PREPARACIÓN DE PORTAOBJETOS CONTROL
Debe incluirse un portaobjetos de control positivo cada vez que
se realice el análisis. Las muestras de lavado bronquial o lavado
bronquioalveolar son las más apropiadas para usar como control positivo. Use muestras en las que la presencia de Pneumocystis carinii se haya demostrado previamente por tinción
histológica. Siga los procedimientos indicados en la sección
Preparación de muestras clínicas antes de la coloración fluorescente. Después de la fijación con acetona, puede congelar
los portaobjetos a -20°C durante hasta un mes. Alternativamente, use una muestra de positividad conocida, como control
positivo. Para que el análisis sea considerada válida, el portaobjetos control debe teñirse bien e interpretarse según se
describe en la sección Evaluación de los resultados del análisis.
PROCEDIMIENTO DE COLORACIÓN FLUORESCENTE
ce
ren
1. Si los portaobjetos han estado congelados, deje que alcancen temperatura ambiente antes de proceder con el procedimiento de tinción.
2. Coloque el portaobjetos en una cámara húmeda.
eO
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3. Agregue el Reactivo colorante para Pneumocystis carinii en
cada pocillo con muestra (2 -3 gotas), en una cantidad suficiente para cubrir la muestra pero sin rebasar los límites del
pocillo.
nly
4. Incube durante 30-35 minutos a 37±1°C. No permita que el
Reactivo colorante para Pneumocystis carinii se seque sobre
el portaobjetos durante la incubación.
5. Elimine el exceso de Reactivo colorante para Pneumocystis
carinii; puede dejar escurrir el líquido del portaobjetos sobre
una toalla de papel limpia o aspirar el líquido.
6. Lave el portaobjetos; colóquelo sobre un soporte y remójelo
en agua desionizada o agua del grifo durante un minuto, con
agitación intermitente suave. Elimine el exceso agua; puede
dejar escurrir sobre una toalla de papel limpia o aspirar el
agua.
37
7. Seque el portaobjetos bien, al aire o con un calentador de
portaobjetos a 37±1°C.
8. Aplique una a dos gotas de Medio de montaje al portaobjetos y coloque un cubreobjetos, procurando evitar que se formen burbujas de aire.
Fo
9. Examine los portaobjetos dentro de 2-3 horas después de la
coloración. Después de la lectura, puede almacenar los portaobjetos hasta el día siguiente en la oscuridad a 2-8°C, o
hasta 6 meses en la oscuridad a -20°C o menos. Si guarda
los portaobjetos en un ambiente frío, permita que alcancen
la temperatura ambiente antes de leerlos, para evitar que la
condensación empañe la muestra.
rR
10.Para que los resultados negativos sean válidos, confirme la
presencia de muestra en el portaobjetos mediante
microscopía de luz.
ce
ren
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EXAMEN DE LOS PORTAOBJETOS COLOREADOS
Examine cada pocillo con aumento de 200X o más. Si se
observa fluorescencia, use el aumento de 400X ó 630X (con
aceite de inmersión) para confirmar el patrón de tinción característico que se describe en la sección Evaluación de los
resultados del análisis. Confirme la presencia de la muestra en
cada portaobjetos después de completar el análisis.
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EVALUACIÓN DE LOS RESULTADOS DEL ANÁLISIS
nly
eO
1. Las muestras infectadas con Pneumocystis carinii contienen
grandes quistes redondos o elípticos, aislados o en grupos,
que se tiñen de color verde claro brillante. Para que la
muestra pueda considerarse positiva, deben observarse
dos o más quistes bien definidos y fluorescentes.
2. También pueden teñirse los esporozoítos y trofozoítos. Se
ven como estructuras pequeñas en forma de media luna o
pleomorfas. Además, puede observarse la matriz extracelular amorfa, con coloración brillante. Si una muestra contiene
solamente material amorfo de coloración brillante o formas
típicas de esporozoítos y trofozoítos, debe comenzarse una
búsqueda activa de quistes antes de llegar a un diagnóstico
definitivo. En ausencia de quistes, debe sospecharse que la
muestra es positiva para Pneumocystis carinii, y debe obtenerse otra muestra para la coloración.
38
3. Los otros organismos y material celular de las muestras respiratorias deben teñirse con coloración de contraste de color
rojo a rojo-anaranjado o dorado.
4. Se considera que una muestra es negativa si no se observa
la fluorescencia característica descrita anteriormente.
5. Si el resultado para una muestra de esputo inducido es negativo, debe verificarse con una muestra posterior, obtenida
por lavado bronquial o lavado bronquioalveolar.
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efe
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Fo
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
Un resultado negativo no excluye la posibilidad de que un
paciente esté infectado con Pneumocystis carinii. La obtención
y preparación de la muestra son pasos de importancia crítica
del procedimiento. Si la muestra se obtiene en un momento
inapropiado durante el curso de la enfermedad, mediante un
método inadecuado, si la muestra no se maneja correctamente
o los reactivos proporcionados no se usan correctamente,
puede fracasar la detección de Pneumocystis carinii. El diagnóstico debe hacerse conjuntamente con los síntomas clínicos.
ce
Analice solamente una muestra por portaobjetos. Procure procesar, fijar, teñir y lavar cada muestra independientemente para
evitar el arrastre de organismos Pneumocystis carinii a otros
portaobjetos.
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eO
Us
El exceso de moco en las muestras puede causar problemas
con la coloración. Ciertos frotis gruesos de esputo no pueden
colorearse adecuadamente. Procure hacer un frotis muy delgado. Si la muestra no se lava correctamente, puede producirse un atrapamiento no específico del Reactivo de
coloración para Pneumocystis carinii.
Para que los resultados negativos sean válidos, hay que confirmar la presencia de muestra en el portaobjetos mediante
microscopía de luz.
Si la muestra de lavado bronquial o lavado bronquioalveolar es
negativa pero el paciente sigue manifestando síntomas asociados con una enfermedad respiratoria, debe sospecharse algún
otro agente etiológico y efectuar los procedimientos de diagnóstico correspondientes (incluyendo el cultivo).
39
RENDIMIENTO DEL ANALISIS
Tres investigadores participaron en un estudio clínico para evaluar la prueba MONOFLUO™ de inmunofluorescencia para
Pneumocystis carinii. Se obtuvieron muestras clínicas de
pacientes sospechosos de padecer neumonía por Pneumocystis carinii. Se obtuvo una muestra de esputo inducido de cada
paciente y se analizó paralelamente con el análisis de MONOFLUO™ (MF) y mediante coloración histológica (método de referencia). Se usaron dos coloraciones histológicas: un colorante
Wright-Giemsa (Diff-QuikTM, o DQ) y azul de toluidina O (TBO).
ren
efe
rR
Fo
Si la muestra de esputo inducido resultó positiva con el método
de referencia, se consideró que el resultado indicaba presencia
de infección por P. carinii. Si el resultado fue negativo con el
método de referencia y muestra de esputo inducido, se obtuvo
una muestra de lavado bronquioalveolar (BAL) y se analizó. Si el
resultado con muestra BAL fue positivo, el paciente se consideró positivo para P. carinii. Si el resultado con muestra BAL fue
negativo, el paciente se consideró negativo para P. carinii.
Hubo un total de 100 pacientes incluidos en el análisis. Los
resultados obtenidos se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2: Resultados de pacientes
ce
Sitios 1 y 2
53
62
9
TBO
MF
63
14
14
53
8
14
10
6
6**
nly
Pacientes positivos para
P.carinii
• Por esputo inducido
• Por lavado
bronquioalveolar
Sitio 3
MF
eO
DQ
Us
Specimen
**Estos seis fueron positivos con el esputo inducido empleando el sistema de
MONOFLUO™ y también fueron positivos con la muestra de lavado bronquioalveolar. Las
muestras BAL se obtuvieron en los seis pacientes porque el resultado TBO con muestra
de esputo fue negativo.
En la Tabla 3 se presenta el número de pacientes clasificados
como positivos o negativos con el Equipo MONOFLUO™ de
análisis inmunofluorescente para Pneumocystis carinii, en comparación con la prueba de referencia.
40
Tabla 3: Resultados obtenidos con coloración histológica en
comparación con resultados obtenidos con el análisis de
inmunofluorescencia MONOFLUO™ (incluye muestras de esputo y de
lavado bronquioalveolar).
Coloración histológica
+
–
+
76
1
–
0
23
Monofluo™
ren
efe
rR
Fo
De los 100 pacientes estudiados, 76 fueron positivos para
P. carinii y 24 fueron negativos para P. carinii según se determinó mediante la coloración histológica. El análisis de MONOFLUO™ identificó correctamente a los 76 pacientes positivos y
fue negativo para 23 de los pacientes negativos para P. carinii.
Una muestra de esputo inducido dio resultado negativo con el
análisis de MONOFLUO™ y con el metodo de referencia, pero
el lavado bronquioalveolar de este paciente dio resultado negativo con el método de referencia y positivo con el análisis de
MONOFLUO™.
ce
Sobre la base de estos datos clínicos, las características de
rendimiento del Equipo MONOFLUO™ de prueba inmunofluorescente para Pneumocystis carinii fueron:
Us
nly
eO
Sensibilidad = 100%
Especificidad = 95,8%
41
REACTIVIDAD CRUZADA
Se estudiaron los siguientes cultivos de bacterias y hongos provenientes de aislados de cultivos y de muestras, para determinar la reactividad cruzada con el Equipo MONOFLUO™ de
análisis inmunofluorescente para Pneumocystis carinii. Se
encontró que no hubo reacción con:
Bacterias
Mycobacterium avium-intracellular
Neisseria spp.
Nocardia asteroides
Pepto streptococcus
Proteus mirabilis
Pseudomonas spp.
Rothia dentocariosa
Staphylococcus spp.
Streptococcus spp.
Streptococcus, Grupos A,B,C,F,G
Treponema denticola
Veillonella parvula
ce
ren
efe
rR
Fo
Bacteroides spp.
Eggerthella lenta
Escherichia coli
Haemophilus spp.
Micrococcus luteus
Moraxella lacunata
Us
Hongos
Candida tropicalis
Torulopsis glabrata
Trichosporon spp.
nly
eO
Aspergillus niger
Aspergillus flavus
Aspergillus terreus
Candida albicans
Candida krusei
42
MONOFLUO™
32515
Immunofluoreszenz-Antikörper-Testsatz zur Erkennung
und Bestimmung von Pneumocystis carinii in Proben
aus dem Atmungstrakt
Fo
efe
rR
VERWENDUNGSZWECK
Der Pneumocystis Immunofluoreszenz-Antikörper-Testsatz von
MONOFLUO™ dient zur Bestimmung von Pneumocystis cariniiZysten und Trophozoiten in Proben aus dem Atmungstrakt.
ce
ren
ZUSAMMENFASSUNG UND ERKLÄRUNG
Bei Pneumocystis carinii handelt es sich um einen einzelligen,
eukaryonten Organismus, der in den Lungen vieler Säugetierarten und im Menschen vorkommt. Der Organismus wird nur
auf dem Luftweg übertragen und verursacht gewöhnlich
asymptomatische Infektionen. Eine Aussetzung während der
Kindheit kann zu milden oder subklinischen Fällen führen, bei
denen der Organismus in latentem Stadium selbst im Erwachsenen-alter noch besteht. In Personen mit einem gestörten
Immunsystem verursacht der opportunistische Organismus
eine diffuse, interstitielle Pneumonie.1,2
nly
eO
Us
Zu den durch Pneumocystis carinii gefährdeten Personen
gehören Frühgeborene, Personen mit einer Immundefizienz
(z.B. AIDS) und jene, die immunosuppressive Medikamente wie
z.B. Kortikosteroide nehmen. Pneumocystis carinii ist der am
häufigsten auftretende Erreger opportunistischer Infektionen bei
AIDS -Patienten, von denen knapp 80% an der Infektion
leiden.3,4,5,6
Morphologische Studien des Organismus haben drei Stadien im
Lebenszyklus der Pneumocystis carinii ergeben: Zysten, Sporozoiten und Trophozoiten. Die dickwandigen Zysten (4-7 µm
Durchmesser) enthalten gewöhnlich acht kommaförmige
43
Sporozoiten, die dann zu größeren, pleomorphen Trophozoiten
(2-8 µm Durchmesser) heranreifen, bevor sie wieder Zysten
bilden und den Zyklus erneut durchlaufen.1,6 Die Zysten mit
ihren bestimmten morphologischen Merkmalen werden am
häufigsten mit dem Vorkommen von Pneumocystis carinii in
Verbindung gebracht.
Eine schnelle klinische Diagnose von Pneumocystis carinii ist
äußerst wichtig, da die Organismen rasch das Lungengewebe
infiltrieren und Dyspnoe, Fieber und Husten verursachen.7 Eine
frühe Erkennung kann die Einleitung einer geeigneten Behandlung erleichtern und die Überlebenschancen des Patienten
erhöhen.8,9
Fo
ce
ren
efe
rR
Derzeitig erfolgt die Diagnose mittels radiologischer Verfahren
und Nachweis von Pneumocystis carinii -Zysten und Trophozoiten in histologischen Färbungen von respiratorischen Proben.
Die herkömmlichen Färbemethoden (Toluidinblau O, Gomoris
Methenamin-Silbernitrat oder Giemsa) machen Zystenwände
und / oder Trophozoiten/ Sporozoiten6,10 sichtbar. Aufgrund der
unspezifischen Natur dieser Färbungen ist eine genaue Bestimmung der Organismen möglicherweise schwierig. Ein eher invasives Verfahren der Probensammlung wie z.B. eine
bronchoalveolare Lavage ist oft notwendig, um das Vorhandensein von Pneumocystis carinii festzustellen.11
eO
Us
Die Verwendung eines direkten Fluoreszenz-Antikörperverfahrens mit induziertem Sputum, Bronchial-oder bronchoalveolaren
Lavageproben stellt ein einfaches, extrem genaues Verfahren
zur Ermittlung von Pneumocystis carinii dar.12,13,14,15
nly
Die monoklonalen Antikörper im Pneumocystis carinii Immunofluoreszenz-Antikörper-Testsatz von MONOFLUO™ werden
chemisch mit Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) verbunden, um
ein äußerst spezifisches, direktes Immunofluoreszenz Reagens
mit niedriger Hintergrundfluoreszenz zu bilden. Die monoklonalen Antikörper binden sich nicht nur an Pneumocystis carinii-Zysten, sondern auch speziell an Pneumocystis cariniiTrophozoiten, Sporozoiten und die extrazelluläre Matrix. Der
Testsatz dient zur schnellen Erkennung von Pneumocystis carinii Zysten und Trophozoiten direkt in den Patientenproben.
44
VERFAHRENSPRINZIPIEN
Das Färbereagens für Pneumocystis carinii von MONOFLUO™
enthält murine monoklonale Antikörper, die mit FluoresceinIsothiocyanat (FITC) markiert sind. Diese Antikörper reagieren
mit Pneumocystis carinii in allen Stadien (Zysten, Sporozoiten
und Trophozoiten) und auch mit der extrazellulären Matrix in
infizierten Proben.
ren
efe
rR
Fo
Aus den klinischen Proben werden Präparate zur Mikroskopie
vorbereitet. Hierbei sind die Hinweise im Abschnitt über die
Vorbereitung klinischer Proben vor einer Fluoreszenzfärbung zu
beachten. Nach der Fixierung werden die Präparate mit dem
Färbereagens für Pneumocystis carinii von MONOFLUO™
gefärbt. Das Färbereagens verbindet sich mit allen in der Probe
vorhandenen Pneumocystis carinii -Organismen. Als nächstes
werden die ungebundenen Färbereagensreste von der Probe
abgespült. Hiernach werden die Präparate mit dem im Testsatz
von MONOFLUO™ enthaltenen Fixiermedium versehen. Das
Medium enthält einen Zusatz zum Verhindern von Quenching,
der das Verbleichen der Fluoreszenz verzögert und somit den
Zeitraum, in dem die Präparate betrachtet werden können, verlängert.
ce
Bei der Betrachtung mit einem Fluoreszenz-Mikroskop erscheinen die infizierten Proben mit einer hellen, fluoreszierenden
apfelgrünen Farbe. Gefärbte Zysten erscheinen als große,
runde oder ovale Strukturen, sowohl als einzelne Erscheinung
als auch in Gruppen. Sporozoiten und Trophozoiten können
ebenfalls gefärbt werden und erscheinen als relativ kleine, halbmondförmige oder pleomorphe Strukturen. Die amorphe, extrazelluläre Matrix sollte ebenfalls deutlich fluoreszieren. Andere
Organismen und Zellmaterial von respiratorischen Proben werden rot bis orangerot bzw. goldfarben ohne die charakteristische Fluoreszenz von Pneumocystis carinii Zysten
gegengefärbt.
nly
eO
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45
PRODUKTBESCHREIBUNG
Tabelle 1: Mitgelieferte Materialien
Die Reagenzien bei 2-8°C lagern. Die Objektträger bei 2-28°C lagern.
Inhalt
Vorbereitung
R1 • Pneumocystis
carinii Färbereages*
1 Tropfflasche
(2,2ml)
• FITC-markierte
monoklonale Antikörper
(murin)
• Gegenfärbung (Evans
Blau)
• Antikörper (murin)
• Natriumazid**
• Protein-stabilisierter
Puffer
• Gepuffertes Glycerol
• Formaldehyd***
• Zusatz zum Verhindern
von Quenching
• Fluoreszenz-Mikroskopie
Objektträgere
Vor Gebrauch
vorsichtig mischen
R2 • Fixiermedium
1 Tropfflasche
(3,5 ml)
Gebrauchsfertig
geliefert.
Vor Gebrauch mit
einem fusselfreien
Tuch abwischen.
ren
R3 • FluoreszenzMikroskopie-Objektträger
24 (je 2 Vertiefungen)
efe
rR
Fo
Komponente
* Menge reicht zur Färbung von 24 einzelnen Proben. **0,1 % Natriumazid. ***0.8 %
Formaldehyd.
ce
•
•
•
•
nly
•
•
•
•
eO
•
•
•
Us
•
ZUSÄTZLICH ERFORDERLICHE, ABER
NICHT MITGELIEFERTE MATERIALIEN
Azeton, Reagensqualität, (in einem dicht verschlossenen
Behälter lagern, damit kein Wasser absorbiert wird)
Deionisiertes oder Leitungswasser
Färbeschalen und Gestelle
Feuchte Kammer (z.B. eine Petri-Schale mit einem angefeuchteten Papierhandtuch und Deckel)
Deckgläser, 24 x 40 mm, Nr.1
Pasteur-Pipetten
Zentrifuge oder Mikrozentrifuge
15 ml Zentrifugenröhrchen oder 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen
37±1°C Inkubator
Biologische Sterilbank (empfohlen)
Immersionsöl von Fluoreszenzqualität, bei Bedarf
Fluoreszenzmikroskop mit 200-250facher und 400630facher Vergrößerung, mit einem Filtersystem für Fluorescein-Isothiocyanat (FITC). Zum Ablesen der FITC46
Fo
Werte steht eine Vielzahl von Filtersätzen verschiedener
Hersteller zur Verfügung. Breitband- (420-490 nm) oder
Schmalband- (470-490 nm) Exitationswellenlängen mit
einem 515 nm dichromatischen Spiegel und ein 515 nm
Sperrfilter werden empfohlen. Die Schmalband-Exitationswellenlänge verringert die Hintergrundfluoreszenz.
Schwankungen in der Leistung, Intensität und Ausrichtung der Lichtquelle und die unterschiedlichen Illuminatoren und Filter können die Testergebnisse beeinflussen.
• Kontrollpräparate mit Pneumocystis carinii-Organismen
(siehe den Abschnitt über die Vorbereitung von Kontrollpräparate)
• Papierhandtücher oder Aufsaugsystem
ren
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rR
Für induzierte Sputum-Proben
• Dithiothreitol (DTT): Eine vorbereitete Flüssigkeit von
0,1% (6.5x10-3 Mol/l). Beispielsweise Stat-Pak™ Sputolysin erhältlich von Behring Diagnostics: Gemäß Anleitung
verwenden.
• Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS)
ce
VORSICHTSMASSNAHMEN
Nur zur in vitro Diagnostik
Nur für den Laborgebrauch.
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1. Dieser Test darf nur von Personal ausgeführt werden, das im
Umgang mit klinischen Proben, die möglicherweise HIV-1
enthalten, geschult ist. Die Präparate müssen von Personal
geprüft werden, das Erfahrung bei der Auswertung von
Immunofluoreszenzpräparaten hat.
2. Alle klinischen Proben wie potentiell infektiöses Material
behandeln.
3. Verfahren, bei denen Aerosole entstehen, sollten auf einer
biologischen Sterilbank ausgeführt werden. Alle Materialien
müssen nach Gebrauch oder vor der Entsorgung desinfiziert
werden.
4. Beim Umgang mit den Proben oder den Reagenzien des
Pneumocystis carinii Immunofluoreszenz-Testsatzes von
MONOFLUO™ die üblichen sicheren Laborverfahren
beachten. Im Labor sollte weder gegessen oder getrunken,
noch geraucht werden. Die Pipette nicht mit dem Mund
47
berühren. Die Reagenzien möglichst nicht mit Mikroben oder
anderen Substanzen in Berührung bringen.
5. Das Färbereagens enthält Evans Blau, einen Reizstoff.
Möglichst nicht auf die Kleidung oder Haut verschütten oder
spritzen. Alle Bereiche, die möglicherweise mit dem Färbereagens in Kontakt gekommen sind, mit Wasser gründlich
abwaschen.
efe
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Fo
6. Das Fixiermedium enthält 2% Formalin, das seinerseits aus
0,8% Formaldehyd besteht, der wahrscheinlich krebserzeugend sein kann. Trotzdem, die vorhandene Daten bewäheren
nicht die Karzinogenizität des Formaldehydes bei den
Konzentrationen, die in diesem Testsatz benützt werden
(<1.00%). Das Fixiermedium möglichst nicht auf die Haut
oder Kleidung verschütten oder spritzen. Alle Stellen, die mit
dem Fixiermedium in Kontakt gekommen sind, mit Wasser
gründlich abspülen.
R: 40-43: Sensibilisierung durch Einatmen und Hautkontakt
möglich. Irreversibler Schaden möglich.
ren
ce
S: 24/25-28-36/37/39: Berührung mit den Augen und der
Haut vermeiden. Bei Berührung mit der Haut sofort mit viel
Wasser abwaschen. Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung, Schutzhandschuhe und Schutzbrille/Gesichtsschutz tragen.
Us
Xn: Gesundheitsschädlich
0,1% NaN3
nly
eO
7. Das Färbereagens enthält Natriumazid. Natriumazid kann mit
Blei- und Kupferleitungen reagieren und hochexplosive Metallazide bilden. Wenn das Färbereagens im Waschbecken
entsorgt wird, mit viel Wasser nachspülen, damit sich kein
Azid ansammeln kann.
R: 21/22
Gesundheitsschädlich bei Berührung mit der Haut
und beim Verschlucken.
S: 24/25-28-36/37/39
Berührung mit den Augen und der Haut vermeiden. Bei
Berührung mit der Haut sofort abwaschen mit viel
Wasser. Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung,
Schutzhandschuhe und Schutzbrille/Gesichtsschutz
tragen.
48
8. Alle wiederverwendbaren Teile nach jeder Verwendung
gründlich reinigen.
9. Das Färbereagens vor jedem Test vorsichtig mischen.
10.Für jede Patientenprobe einen separaten Objektträger verwenden, um eine Kreuzkontaminierung der Pneumocystis
carinii-Organismen zu verhindern. Es empfiehlt sich auch,
jedes Präparat separat zu waschen.
11.Die Objektträger sind mit Azetonfixiermittel vorzubereiten.
Mit Formalin oder Ethanol fixierte Objektträger sind für diesen Test nicht geeignet.
rR
Fo
REAGENSSTABILITÄT UND LAGERUNG
Den Satz und seine Bestandteile nicht über das angegebene
Haltbarkeitsdatum hinaus verwenden. Das Färbereagens im
Dunkeln bei 2-8°C lagern.
ren
efe
Die Reagenzien bei 2-8°C, die Objektträger bei 2-28°C lagern.
Bei der angegebenen Temperatur gelagert sind angebrochene
und noch ungeöffnete Reagenzien bis zum Ablauf des aufgedruckten Verfalldatums stabil.
DAS PNEUMOCYSTIS CARINII-TESTVERFAHREN
ce
nly
eO
Us
Probenahme
Klinische Proben sollten unter Anwendung der Standardmethoden zur Probennahme mit induziertem Sputum, Bronchialoder bronchoalveolarer Lavage16,17 genommen und sofort verarbeitet werden. Einen Teil der Proben zum Anlegen einer Kultur
reservieren.
Die Vorbereitung Klinischer Proben vor der
Fluoreszenzfärbung
Proben mit induziertem Sputum
1a.2 bis 3 ml Sputum in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen füllen.
Dieselbe Menge Dithiothreitol-Reagens hinzugeben. Die
Röhrchen vortexen und 5-10 Minuten bei 37°C oder 15
Minuten bei Zimmertemperatur (ZT=15-30°C) inkubieren.
— ODER —
49
1b.Wenn die Probe zu viskös ist und sich nicht leicht in ein Zentrifugenröhrchen transferieren läßt, etwa die gleiche Menge
Dithiothreitol-Reagens direkt in das Sammelgefäß geben, gut
umrühren zum Mischen und 5-10 Minuten bei 37°C oder 15
Minuten bei Zimmertemperatur (ZT=15-30°C) inkubieren.
Sobald wie möglich während der Inkubationszeit in ein Zentrifugenröhrchen transferieren und vor der weiteren Verarbeitung vortexen.
2. Circa 5 bis 6 ml PBS pH 7,2, d.h. eine der Sputum-DTTKombination entsprechende Menge, zum Röhrchen hinzufügen und gründlich vortexen.
Fo
3. 5 Minuten lang bei 1500 G zentrifugieren.
efe
rR
4. Den Überstand vorsichtig abgießen oder absaugen und
maximal 0.5 ml Pellet und Überstand im Röhrchen lassen.
Die Schritte 2, 3 und 4 können nach Bedarf wiederholt werden, um alle Mukusspuren zu beseitigen.
ce
ren
5. Das Pellet gründlich resuspendieren. Mit einer Pipette einen
Tropfen (ca. 25-50 µl) auf einen Objektträger tropfen, der im
Testsatz mitgeliefert wird. Den Tropfen mit der Seite einer
Pipettenspitze gleichmäßig über die Vertiefung verteilen.
Dabei ist darauf zu achten, daß der Objektträger nicht
verkratzt wird. An der Luft tocknen lassen. Zum schnelleren
Trocknen der Probe kann ein Wärmegerät mit einer Temperatur von 37°C verwendet werden.
Us
nly
eO
6. Circa 10 Minuten in Azeton fixieren. Die Präparate können
sofort verarbeitet oder vor der Färbung bis zu einen Monat
lang bei -20°C gelagert werden.
Mit bronchialer und bronchoalveolarer Lavage gewonnene
Proben
Bei nichtmukoiden Proben, wie Bronchial- oder bronchoalveolaren Lavageproben ist wahrscheinlich kein mukolytisches Verfahren erforderlich. Für diese Proben kann das Protokoll mit der
Zentrifugierung wie im vorstehenden Schritt 3 beginnen, wobei
von einem 15 ml Zentrifugenröhrchen oder 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen ausgegangen wird.
HINWEIS: Als Alternative kann auch eine Zytospin-Zentrifuge
zur Vorbereitung der Präparate von Proben verwendet werden,
die mit induziertem Sputum, Bronchial-oder bronchoalveolarer
50
Lavage12 gewonnen wurden. Wird das Zytospin-Verfahren verwendet, müssen die Kontrollen auf dieselbe Art und Weise verarbeitet werden. Die mit einer Zytospin-Zentrifuge vorbereiteten
Präparate werden 10 Minuten lang in Azeton fixiert und wie
nachstehend im Abschnitt über die Fluoreszenz-Färbung beschrieben gefärbt.
ce
ren
efe
rR
Fo
VORBEREITUNG DER KONTROLLPRÄPARATE
Jeder Test sollte ein positives Kontrollpräparat einschließen.
Bronchial- und bronchoalveolare Lavageproben eignen sich am
besten als positive Kontrollen. Die ausgewählten Proben sollten
vorher bereits durch histologische Färbung als Pneumocystis
carinii-positiv befunden worden sein. Nach dem im Abschnitt
über die Vorbereitung von klinischen Proben vor der Fluoreszenz-Färbung beschriebenen Verfahren vorgehen. Nach der
Azetonfixierung können die Präparate bis zu einen Monat lang
bei -20°C eingefroren werden. Es kann jedoch auch eine
bekanntermaßen positive Probe als positive Kontrolle verwendet werden. Damit der Test als gültig gilt, muß das Kontrollpräparat richtig gefärbt sein und sich gemäß dem im Abschnitt
über die Auswertung der Testergebnisse beschriebenen Verfahren interpretieren lassen.
DAS FLUORESZENZ-FÄRBEVERFAHREN
eO
Us
1. Tiefgefrorene Präparate vor dem Färben erst Zimmertemperatur erreichen lassen.
2. Das Präparat in eine feuchte Kammer legen.
nly
3. In jede Vertiefung eine ausreichende Menge Pneumocystis
carinii Färbereagens geben (2-3 Tropfen), um die Probe zu
bedecken. Dabei die Vertiefung nicht überfüllen.
4. 30-35 Minuten bei 37±1°C inkubieren. Das Pneumocystis
carinii-Färbereagens während des Verfahrens nicht auf dem
Präparat antrocknen lassen.
5. Das überschüssige Pneumocystis carinii-Färbereagens vom
Präparat auf ein sauberes Papierhandtuch ablaufen lassen
oder aufsaugen.
6. Zum Abwaschen das Präparat eine Minute lang in einem
Gestell in deionisiertes bzw. Leitungswasser eintauchen und
ab und zu vorsichtig hin- und herbewegen. Das überschüs51
sige Wasser seitlich vom Präparat auf ein sauberes Papierhandtuch ablaufen lassen oder aufsaugen.
7. Das Präparat sorgfältig an der Luft trocknen lassen oder mit
einem Präparat-Wärmer bei 37±1°C trocknen.
8. Einen oder zwei Tropfen Fixiermedium auf das Präparat
auftragen und ein Deckglas auflegen. Dabei darauf achten,
daß sich keine Luftblasen bilden.
rR
Fo
9. Die Präparate 2-3 Stunden nach der Färbung untersuchen.
Nach der Auswertung können die Präparate über Nacht im
Dunkeln bei 2-8°C oder bis zu 6 Monate im Dunkeln bei
-20°C oder kälter gelagert werden. Im Kalten gelagerte Präparate müssen erst Zimmertemperatur erreichen, bevor sie
abgelesen werden können, da sonst Kondensation die Probe
verschleiert.
efe
10.Zur Bestätigung der Gültigkeit negativer Ergebnisse mittels
Lichtmikroskopie prüfen, ob eine Probe auf dem Präparat
vorhanden ist.
ce
ren
UNTERSUCHUNG DER GEFÄRBTEN PRÄPARATE
Jede Vertiefung mit mindestens 200-facher Vergrößerung
absuchen. Wird eine Fluroreszenz festgestellt, die Probe unter
einer 400- bis 630-fachen Vergrößerung (mit Immersionsöl)
betrachten, um die typischen Färbemuster zu bestätigen. Nach
Abschluß des Tests prüfen, ob auf jedem Präparat eine Probe
vorhanden ist.
eO
Us
AUSWERTUNG DER TESTERGEBNISSE
nly
1. Mit Pneumocystis carinii infizierte Proben enthalten große
rundliche bis ovale Zysten, einzeln oder in gruppenförmiger
Anordnung, die leuchtend apfelgrün gefärbt erscheinen. Erst
wenn zwei oder mehr gut definierte fluoreszierende Zysten in der Probe festgestellt werden, gilt die Probe als
positiv.
2. Sporozoiten und Trophozoiten können auch gefärbt werden.
Sie erscheinen als kleine halbmondförmige oder pleomorphe
Strukturen. Es kann auch eine stark gefärbte amorphe extrazelluläre Matrix vorhanden sein. Bei Proben mit ausschließlich hellgefärbtem amorphen Material oder typischen
Sporozoit- und Trophozoitformen sollte zunächst aktiv nach
52
Zysten gesucht werden, bevor eine definitive Diagnose erfolgen kann. Sind keine Zysten vorhanden, sollte die Probe als
wahrscheinlich Pneumocystis carinii-positiv gelten und eine
weitere Probe zur Färbung entnommen werden.
3. Andere Organismen und Zellmaterial aus respiratorischen
Proben sollten rot bis orangerot bzw. goldfarben
gegengefärbt sein.
4. Eine Probe gilt als negativ, wenn keine der vorstehend beschriebenen charakteristischen Fluoreszenzen festgestellt
werden.
rR
Fo
5. Ein negatives Ergebnis bei einem induziertem Sputum sollte
anhand einer weiteren Probe, die mittels Bronchial- oder
bronchoalveolarer Lavage gewonnen wurde, bestätigt werden.
ce
ren
efe
BESCHRÄNKUNGEN DES VERFAHRENS
Ein negatives Ergebnis schließt die Möglichkeit einer Pneumocystis carinii-Infektion des Patienten nicht aus. Die
Probenahme und -vorbereitung sind kritische Schritte für den
Test. Die Probenahme zu einer ungeeigneten Zeit während des
Krankheitsverlaufs, die Verwendung einer ungeeigneten Methode oder der falsche Umgang mit den Proben, sowie der
Mißbrauch der mitgelieferten Reagenzien kann dazu führen,
daß Pneumocystis carinii nicht erkannt wird. Die Diagnose sollte
in Verbindung mit den klinischen Symptomen erfolgen.
Us
nly
eO
Nur eine Probe pro Präparat verwenden. Jede Probe separat
verarbeiten, fixieren, färben und waschen, damit eine mögliche
Übertragung von Pneumocystis carinii-Organismen auf andere
Präparate vermieden wird.
Überschüssiger Mukus in den Proben kann beim Färben stören.
Bestimmte dicke Sputumausstriche verhindern womöglich eine
ausreichende Färbung. Die Ausstriche möglichst dünn halten.
Wenn die Probe nicht ausreichend gewaschen wird, kann es zu
einer unspezifischen Erfassung des Pneumocystis carinii-Färbereagens kommen. Um die Gültigkeit eines negativen Ergebnisses zu bestätigen, muß das Vorhandensein einer Probe auf
dem Präparat mit Lichtmikroskopie bestätigt werden.
Falls die Bronchial- oder bronchoalveolare Lavageprobe negativ
ist, der Patient aber weiterhin Symptome einer respiratorischen
53
Erkrankung aufweist, sollte ein anderes ätiologisches Agens
vermutet und entsprechende Diagnoseverfahren eingeleitet
werden (einschließlich Anlegen einer Kultur).
rR
Fo
LEISTUNGSMERKMALE
Drei Forscher nahmen an einem klinischen Versuch zur Beurteilung des Pneumocystis carinii -Immunofluoreszenztests von
MONOFLUO™ teil. Es wurden klinische Proben von Patienten
genommen, die aller Wahrscheinlichkeit nach an einer Pneumocystis carinii-Pneumonie litten. Jedem Patienten wurde eine
Probe von induziertem Sputum entnommen, die parallel mit
dem MONOFLUO™ (MF) Test und mit dem histologischen Färbeverfahren (Bezugsmethode) getestet wurde. Es wurden zwei
histologische Färbungen verwendet: eine Wright-Giemsa Färbung [Diff-Quik™ (DQ)] und Toluidinblau O (TBO).
ce
ren
efe
Wenn das induzierte Sputum mit der Bezugsmethode positiv
war, galt das Ergebnis als Zeichen für eine Infektion mit
P. carinii. Wenn das mit der Bezugsmethode für die induzierte
Sputumprobe erzielte Ergebnis negativ war, wurde eine bronchoalveolare Lavageprobe (BAL) entnommen und getestet.
Wenn die BAL-Probe positiv war, bedeutete dies, daß der
Patient P. carinii-positiv war. Bei negativem BAL galt der Patient
als P. carinii-negativ. Die Analyse umfaßte insgesamt 100
Patienten. Die Ergenisse sind in Tabelle 2 aufgeführt.
Us
Tabelle 2: Testergebnisse an Patienten
P.carinii-positive Patienten
• durch induziertes Sputum
• durch BAL
62
53
9
Stelle 3
MF
TBO
MF
63
53
10
14
8
6
14
14
6**
nly
DQ
eO
Stelle 1&2
Probe
**Diese sechs wurden mit dem induzierten Sputumverfahren des MONOFLUO™-Tests
und mit dem BAL-Verfahren als positiv ermittelt. Die BALs für die sechs Patienten
erfolgten aufgrund des negativen TBO-Ergebnisses auf dem Sputum.
Die Zahl der Patienten, die mit dem Pneumocystis carinii-Immunofluoreszenz-Testsatz von MONOFLUO™ im Vergleich zum
Bezugstest als Pneumocystis carinii-positiv oder -negativ
befunden wurden, ist in Tabelle 3 angegeben.
54
Tabelle 3: Vergleich der mit dem histologischen Färbeverfahren
erzielten Ergebnisse mit denen aus dem MONOFLUO™
Immunofluoreszenz-Test (für induziertes Sputum und BAL)
Histologische Färbung
+
–
+
76
1
–
0
23
Monofluo™
efe
rR
Fo
Von den 100 mit dem histologischen Färbverfahren getesteten
Patienten waren 76 P. carinii-positiv und 24 -negativ. Der
MONOFLUO™-Test identifizierte alle 76 der positiven Patienten
und war bei 23 P. carinii-negativen Patienten auch negativ. Eine
induzierte Sputumprobe wurde von beiden Verfahren, dem
MONOFLUO™-Test und dem Bezugstest negativ befunden,
aber der BAL dieses Patienten war beim Bezugsverfahren negativ und beim MONOFLUO™-Test positiv.
ce
ren
Anhand dieser klinischen Daten wurden die Leistungsmerkmale
des Pneumocystis carinii Immunofluoreszenz-Tests wie folgt
dargestellt:
Sensitivität: 100 %
Spezifität: 95,8 %
nly
eO
Us
55
KREUZREAKTION
Folgende Bakterien- und Pilzkulturen von Kulturisolaten und
Proben wurden mit dem Pneumocystis carinii-Immunofluoreszenz-Testsatz von MONOFLUO™ auf Kreuzreaktionen
getestet und für nichtreaktiv befunden:
Neisseria spp.
Nocardia asteroides
Pepto streptococcus
Proteus mirabilis
Pseudomonas spp.
Rothia dentocariosa
Staphylococcus spp.
Streptococcus spp.
Streptococcus, Gruppen A,B,C,F,G
Treponema denticola
Veillonella parvula
ce
ren
efe
rR
Fo
Bacterien
Bacteroides spp.
Eggerthella lenta
Escherichia coli
Haemophilus spp.
Micrococcus luteus
Moraxella lacunata
Fungi
Aspergillus niger
Aspergillus flavus
Aspergillus terreus
Candida albicans
Candida krusei
nly
eO
Us
Candida tropicalis
Torulopsis glabrata
Trichosporon spp.
56
MONOFLUO™
32515
Kit di analisi ad immunofluorescenza anticorpale per la
rilevazione di Pneumocystis carinii in campioni prelevati
dalle vie respiratorie
Fo
ren
efe
rR
USO PREVISTO
Il kit di analisi ad immunofluorescenza anticorpale per la rilevazione di Pneumocystis carinii MONOFLUO™ va usato per
rilevare la presenza di cisti e trofozoiti da Pneumocystis carinii in
campioni prelevati dalle vie respiratorie.
ce
SOMMARIO E SPIEGAZIONE
Pneumocystis carinii è un organismo eucariote unicellulare presente nei polmoni di molte specie di mammiferi, incluso l’uomo.
Tale organismo si diffonde per via aerea, causando normalmente un’infezione asintomatica. L’esposizione a tale organismo durante l’infanzia può portare a casi moderati o subclinici
con l’organismo in stato latente fino all’età adulta. In individui
immunocompromessi, l’organismo diventa opportunista, causando una polmonite interstiziale diffusa1,2.
eO
Us
nly
Gli individui a rischio per Pneumocystis carinii includono i neonati prematuri, gli individui affetti da deficienze immunologiche
(come la sindrome da immunodeficienza acquisita), e quelli sottoposti a terapia a base di farmaci immunosoppressivi, quali i
corticosteroidi. Pneumocystis carinii è il più comune agente
infettivo opportunista nei pazienti affetti da AIDS: circa l’80% di
essi è infatti colpito da tale infezione3,4,5,6.
Studi morfologici sull’organismo hanno rivelato tre forme nel
ciclo vitale di Pneumocystis carinii: cisti, sporozoiti e trofozoiti.
Le cisti, dotate di una parete spessa (4-7 µm di diametro), contengono generalmente otto sporozoiti falciformi, che in seguito
maturano in trofozoiti polimorfi di dimensioni maggiori (2-8 µm
57
di diametro) prima di incistarsi per ripetere il ciclo1,6. Le cisti,
con le loro particolari caratteristiche morfologiche, sono quasi
sempre associate alla presenza di Pneumocystis carinii.
La veloce diagnosi clinica di Pneumocystis carinii è di estrema
importanza poiché tale organismo si infiltra rapidamente nel
tessuto polmonare causando dispnea, febbre e tosse7. La rilevazione precoce può agevolare il tempestivo inizio del trattamento appropriato ed aumentare quindi le possibilità di
sopravvivenza del paziente8,9.
ren
efe
rR
Fo
Attualmente, la diagnosi viene effettuata attraverso la tecnica e
l’identificazione radiologica delle cisti e dei trofozoiti di Pneumocystis carinii mediante la colorazione istologica di campioni
prelevati dalle vie respiratorie. I più comuni metodi di colorazione (blu di toluidina O, nitrato d’argento di metenammina di
Gomori o Giemsa) rilevano la presenza di pareti cistiche e/o di
trofozoiti/sporozoiti6,10. A causa della natura non specifica di tali
colorazioni, la corretta identificazione dell’organismo può risultare difficile. Una tecnica più invasiva per il prelievo del campione, come il lavaggio bronchioalveolare, è spesso necessaria
per confermare la presenza di Pneumocystis carinii11.
ce
La procedura a fluorescenza anticorpale diretta su campioni di
escreato indotto, lavanda bronchiale o lavaggio bronchioalveolare, è semplice ed altamente specifica per la rilevazione di
Pneumocystis carinii12,13,14,15. Gli anticorpi monoclonali contenuti
nel kit di analisi ad immunofluorescenza anticorpale per la rilevazione di Pneumocystis carinii MONOFLUO™ sono chimicamente legati ad isotiocianato di fluoresceina (FITC) per produrre
un reagente diretto, altamente specifico ed immunofluorescente
con un basso livello di fluorescenza di fondo. Oltre a legarsi alle
cisti da Pneumocystis carinii, gli anticorpi monoclonali si legano
specificamente anche ai trofozoiti, agli sporozoiti ed alla
matrice extracellulare di Pneumocystis carinii. Il kit di analisi
viene utilizzato per la rapida identificazione delle cisti e dei trofozoiti di Pneumocystis carinii direttamente nei campioni clinici.
nly
eO
Us
58
PRINCIPI DELLA PROCEDURA
Il reagente colorante per Pneumocystis carinii MONOFLUO™
contiene anticorpi monoclonali murini marcati con isotiocianato
di fluoresceina (FITC). Questi anticorpi reagiscono con tutte le
forme di Pneumocystis carinii (cisti, sporozoiti e trofozoiti) nonché con la matrice extracellulare presente nei campioni infetti.
efe
rR
Fo
I vetrini vengono preparati per l’esame al microscopio con campioni clinici secondo le modalità descritte nella sezione
Preparazione dei campioni clinici prima della colorazione a fluorescenza. Dopo la fissazione, i vetrini vengono colorati con il
reagente colorante per Pneumocystis carinii MONOFLUO™. Il
reagente colorante si lega a tutti gli organismi di Pneumocystis
carinii presenti nel campione. Il successivo lavaggio rimuove il
reagente colorante in eccesso dal campione. I vetrini vengono
quindi montati con il mezzo di montaggio MONOFLUO™
incluso nel kit. Il mezzo di montaggio contiene una sostanza
preservante che aumenta la durata del periodo in cui è possibile
esaminare i vetrini prima che la fluorescenza svanisca.
ce
ren
Quando esaminati mediante un microscopio a fluorescenza, i
campioni infetti emettono una fluorescenza di colore verde mela
brillante. Le cisti colorate appaiono come grandi strutture da
tonde a ovali, sia singole che in gruppi. È possibile che anche
gli sporozoiti e i trofozoiti vengano colorati, ed appaiano come
strutture relativamente piccole, falciformi o polimorfe. Inoltre, è
probabile che la matrice extracellulare amorfa emetta
anch’essa una fluorescenza brillante. Gli altri organismi e la
materia cellulare dei campioni ottenuti dalle vie respiratorie vengono sottoposti a colorazione di contrasto da rossa a rossoarancio o oro senza la caratteristica fluorescenza delle cisti da
Pneumocystis carinii.
nly
eO
Us
59
DESCRIZIONE DEL PRODOTTO
Tabella 1: materiali forniti
Conservare i reagenti alla temperatura di 2-8°C. I vetrini vanno
conservati a 2-28°C.
Componente
Contenuto
Preparazione
R1 • Reagente colorante*
per Pneumocystis carinii
1 flacone contagocce (2,2
ml)
efe
rR
Fo
• Anticorpi murini
monoclonali marcati con
FITC
• Colorazione di contrasto
(blu Evans)
• Azoturo di sodio**
• Tampone stabilizzato con
proteine
R2 • Mezzo di montaggio • Glicerolo tamponato
1 flacone contagocce
• Formaldeide**
(3,5 ml)
• Preservante
R3 • Vetrini per microscopio • Vetrini per microscopio a
a fluorescenza
fluorescenza
24 (da 2 pozzetti)
Mescolare
delicatamente
prima dell'uso.
Fornito pronto
per l'uso.
Passare prima
con un panno
privo di
Lanugine
ren
* Volume sufficiente per la colorazione di 24 pozzetti di analisi. **0,1 % Azoturo di sodio.
***0.8 % Formaldeide.
ce
MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI
• Acetone ultrapuro (conservare in un contenitore ermeticamente chiuso per evitare l’assorbimento di acqua).
Us
• Acqua deionizzata o acqua di rubinetto.
eO
• Piastre per la colorazione dei vetrini con rastrelliere.
nly
• Camera umidificata (ad esempio una piastra di Petri
coperta contenente una salvietta di carta umida).
• Vetrini coprioggetto, 24 X 40 mm, n. 1.
• Pipette Pasteur.
• Centrifuga o minicentrifuga da banco
• Provette per centrifuga da 15 ml o provette per minicentrifuga da banco da 1,5 ml.
• Incubatore a 37±1°C.
• Cappa per la sicurezza biologica (consigliata).
• Olio per immersione per microscopio a fluorescenza, se
necessario.
60
• Microscopio a fluorescenza con ingrandimenti di 200250X e 400-630X, dotato di sistema di filtraggio per l’isotiocianato di fluoresceina (FITC). Una vasta gamma di filtri
per la lettura dell’FITC è disponibile da diversi produttori.
Si consigliano lunghezze d’onda di eccitazione a banda
larga (420-490 nm) o a banda stretta (470-490 nm) con
uno specchio dicromatico di 515 nm e un filtro barriera da
515 nm. La lunghezza d’onda di eccitazione a banda
stretta diminuisce la fluorescenza di fondo. Variazioni di
wattaggio, intensità e allineamento del bulbo e differenze
del tipo di illuminatore e dei filtri possono influire sul rendimento del test.
rR
Fo
• Vetrini di controllo contenenti organismi di Pneumocystis
carinii (vedere la sezione Preparazione dei vetrini di controllo).
• Salviette di carta o sistema di aspirazione.
efe
ren
Per campioni di escreato indotto
• Ditiotreitolo (DTT): una preparazione liquida allo 0,1%
(6,5x10-3 moli/l). Ad esempio, Stat-Pak™ Sputolysin della
Behring Diagnostics: usare secondo le istruzioni.
ce
• Soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS).
eO
Us
PRECAUZIONI
Esclusivamente per uso diagnostico in vitro.
Sólo para uso profesional.
nly
1. Questo test va eseguito unicamente da personale debitamente addestrato nella manipolazione di campioni clinici
potenzialmente infetti con il virus HIV-1. I vetrini vanno esaminati da personale qualificato per la lettura di immunodosaggi
a fluorescenza.
2. Trattare tutti i campioni clinici come potenzialmente infetti.
3. Le procedure che possono creare aerosol vanno eseguite in
una cappa per la sicurezza biologica. Dopo l’uso o prima
dell’eliminazione, tutti i materiali vanno disinfettati.
4. Attenersi alle corrette prassi di laboratorio per la manipolazione dei campioni o dei reagenti del kit di analisi ad immunofluorescenza per la rilevazione di Pneumocystis carinii
MONOFLUO™. Non mangiare, bere o fumare nel laborato61
rio. Non pipettare a bocca. Evitare la contaminazione dei
reagenti con microbi o altre sostanze.
5. Il reagente colorante contiene blu Evans, una sostanza irritante. Evitare di spandere o schizzare il reagente colorante
sulla cute o gli abiti. Le aree venute a contatto con il reagente
colorante vanno sciacquate abbondantemente con acqua.
rR
Fo
6. Il mezzo di montaggio contiene formalina al 2%, contenente
a sua volta formaldeide allo 0,8%, il che può ragionevolmente si considerare èssere cancerogeno. Tuttavia, i dati
esistentes non stabiliscono conclusivamente la cancerogenicità di formaldeide alla concentrazione usata in questo kit
(<1.00%). Evitare di spanderlo o schizzarlo sulla cute o sugli
abiti. Le aree venute a contatto con il mezzo di montaggio
vanno sciacquate abbondantemente con acqua.
efe
R: 40-43: Può provocare sensibilizzazione per inalazione e
per contatto con la pelle. Possibilità di effetti irreversibili.
ren
S: 24/25-28-36/37/39: Evitare il contatto con gli occhi e con
la pelle. In caso di contatto con la pelle lavarsi immediatamente e abbondantemente con acqua. Usare indumenti protettivi ,guanti e protezioni adatte per gli occhi e il viso.
ce
7. Il reagente colorante contiene azoturo di sodio. Questa sostanza può reagire con le tubature in rame o piombo dando
luogo alla formazione di azidi metallici altamente esplosivi.
Qualora si smaltisca il reagente colorante attraverso le tubature di scarico versandolo in un lavandino, accompagnarlo
con una grande quantità d’acqua per evitare la formazione di
azidi metallici.
eO
Us
nly
Xn: Nocivo
0,1% NaN3
R: 21/22
Nocivo a contatto con la pelle e per ingestione.
S: 24/25-28-36/37/39
Evitare il contatto con gli occhi e con la pelle. In caso
di contatto con la pelle lavarsi immediatamente ed
abbondantemente con acqua. Usare indumenti protettivi e guanti adatti e proteggersi gli occhi/la faccia.
8. Tutti i materiali riutilizzabili vanno accuratamente puliti tra un
uso e l’altro.
62
9. Prima di ciascun test, mescolare delicatamente il reagente
colorante.
10.Usare un vetrino separato per ciascun campione del
paziente per evitare la contaminazione crociata degli organismi diPneumocystis carinii. Si raccomanda inoltre di lavare
ciascun vetrino separatamente.
11.I vetrini vanno preparati fissandoli con acetone. I vetrini fissati con formalina o etanolo non sono consigliati per questo
test.
rR
Fo
STABILITÀ E CONSERVAZIONE DEI REAGENTI
Non utilizzare il kit o alcuno dei suoi componenti oltre la data di
scadenza. Conservare il reagente colorante al buio alla temperatura di 2-8°C.
ren
efe
Conservare i reagenti alla temperatura di 2-8°C. I vetrini vanno
conservati a 2-28°C. Se conservati all temperatura indicata, i
reagenti aperti sono stabili per la durata di immagazzinaggio
stampigliata.
PROCEDURA DEL TEST PER LA
RILEVAZIONE DI PNEUMOCYSTIS CARINII
ce
eO
Us
Raccolta del campione
I campioni clinici vanno raccolti impiegando metodi standard
per l’ottenimento dell’escreato indotto, della lavanda bronchiale
o del lavaggio bronchioalveolare16,17. I campioni vanno analizzati
immediatamente. Conservare una parte del campione per effettuarne la coltura.
nly
Preparazione dei Campioni Clinici Prima della Colorazione a
FluorescenzaCampioni di escreato indotto
1a.Porre da 2 a 3 ml di escreato in una provetta per centrifuga
da 15 ml. Aggiungere un uguale volume di reagente al
ditiotreitolo. Agitare la provetta mediante vortex e incubarla
per 5-10 minuti a 37°C o per 15 minuti a temperatura ambiente (15-30°C).
— OPPURE —
63
1b.Se il campione è eccessivamente viscoso e il suo trasferimento in una provetta per centrifuga risulta difficile, aggiungere un volume approssimativamente uguale di reagente al
ditiotreitolo direttamente al contenitore di raccolta, mescolare energicamente, e incubare per 5-10 minuti a 37°C o per
15 minuti a temperatura ambiente (15-30°C). Effettuare il
trasferimento in una provetta per centrifuga non appena possibile durante l’incubazione e agitare mediante vortex prima
di procedere.
2. Aggiungere un volume di PBS a pH 7,2 pari a quello
dell’escreato e del DTT combinati (5 o 6 ml circa), alla
provetta e agitare bene mediante vortex.
Fo
3. Centrifugare a 1500 x G per 5 minuti.
efe
rR
4. Far decantare con attenzione o aspirare il supernatante, lasciando 0,5 ml o meno di pellet e supernatante nella provetta.
Se necessario, i passaggi 2, 3 e 4 possono essere ripetuti
per rimuovere tutte le tracce di muco.
ce
ren
5. Risospendere bene il pellet. Mediante una pipettatatrice,
dosare una goccia (circa 25-50 µl) su uno dei vetrini da
microscopio forniti con il kit. Distribuire la goccia uniformemente sul pozzetto utilizzando il lato di una punta per pipetta
e facendo attenzione a non graffiare il vetrino. Essiccare
all’aria. Per sveltire l’essiccamento del campione, è possibile
utilizzare un apposito dispositivo riscaldante per vetrini a
37°C.
eO
Us
nly
6. Fissare per circa 10 minuti con acetone. I vetrini possono
essere analizzati immediatamente o congelati a -20°C per un
periodo massimo di un mese prima di effettuare la colorazione.
Campioni di lavanda bronchiale e lavaggio bronchioalveolare
È possibile che i campioni non mucosi, come le lavande bronchiali o i lavaggi bronchioalveolari, non richiedano la procedura
mucolitica. Per questi campioni, il trattamento può avere inizio
con la centrifuga (passaggio 3 sopra descritto), in una provetta
per centrifuga da 15 ml o una provetta per minicentrifuga da
banco da 1,5 ml.
NOTA: in alternativa, è possibile utilizzare una centrifuga per
cytospin per preparare i vetrini con i campioni di escreato
64
indotto, lavanda bronchiale o BAL12. Qualora si segua la procedura di cytospin, i controlli vanno analizzati nella stessa maniera. I vetrini preparati con una centrifugaper cytospin vengono
fissati per dieci minuti con acetone e colorati come descritto di
seguito, nella sezione Procedura di colorazione a fluorescenza.
ren
efe
rR
Fo
PREPARAZIONE DEI VETRINI DI CONTROLLO
Un vetrino di controllo positivo va analizzato con ogni test. I
campioni di lavanda bronchiale e lavaggio bronchioalveolare
sono i più idonei per essere utilizzati come controllo positivo. I
campioni prescelti devono essere precedentemente risultati
positivi per Pneumocystis carinii mediante colorazione istologica. Attenersi alle procedure descritte nella sezione Preparazione dei campioni clinici prima della colorazione a fluorescenza.
Dopo la fissazione con acetone, i vetrini possono venir congelati ad una temperatura di -20°C per un periodo massimo di un
mese. In alternativa, utilizzare, come controllo positivo, un campione notoriamente positivo. Per la validità del test, il vetrino di
controllo deve riportare l’opportuna colorazione ed essere interpretato secondo le modalità descritte nella sezione Valutazione
dei risultati dell’analisi.
ce
PROCEDURA DI COLORAZIONE A FLUORESCENZA
Us
1. Se i vetrini sono stati congelati, stabilizzarli a temperatura
ambiente prima di dare inizio alla procedura di colorazione.
2. Collocare il vetrino in una camera umidificata.
eO
nly
3. In ciascun pozzetto contenente un campione (2-3 gocce),
dosare una quantità di reagente colorante per Pneumocystis
carinii sufficiente per coprire il campione, facendo attenzione
a mantenerla entro il pozzetto.
4. Incubare per 30-35 minuti alla temperatura di 37±1°C.
Durante la procedura, evitare l’essiccamento del reagente
colorante per Pneumocystis carinii sul vetrino.
5. Asportare il reagente colorante per Pneumocystis carinii in
eccesso facendolo colare dal vetrino su una salvietta di carta
pulita o mediante aspirazione.
6. Lavare il vetrino collocandolo in una rastrelliera ed immergendolo in acqua deionizzata o acqua di rubinetto per un
minuto, ed agitandolo delicatamente in modo intermittente.
65
Asportare l’acqua in eccesso facendo colare il vetrino su una
salvietta di carta pulita o mediante aspirazione.
7. Asciugare completamente il vetrino all’aria o utilizzando un
apposito dispositivo riscaldante a 37±1°C.
8. Applicare una o due gocce di mezzo di montaggio sul vetrino
ed applicare quindi un vetrino coprioggetto, facendo attenzione ad evitare la formazione di bollicine d’aria.
rR
Fo
9. Esaminare i vetrini entro 2 o 3 ore dalla colorazione. Dopo la
lettura, è possibile conservare i vetrini per la notte alla temperatura di 2-8°C (al buio) o per un periodo massimo di 6
mesi ad una temperatura di -20°C o inferiore (al buio). È necessario consentire la stabilizzazione a temperatura ambiente
dei vetrini congelati prima di procedere alla lettura per evitare
l’oscuramento del campione da parte della condensa.
efe
10.Per la validità dei risultati negativi, confermare mediante
microscopia luminosa la presenza del campione sul vetrino.
ce
ren
ESAME DEI VETRINI COLORATI
Esaminare ciascun vetrino ad un ingrandimento di 200X o più.
Se viene osservata la fluorescenza, il vetrino va esaminato ad
un ingrandimento di 400X o 630X (con olio per immersione) per
confermare i caratteristici pattern di colorazione descritti nella
sezione Valutazione dei risultati dell’analisi. Dopo il completamento dell’analisi, confermare la presenza del campione su
ciascun vetrino.
eO
Us
VALUTAZIONE DEI RISULTATI DELL’ANALISI
nly
1. I campioni infetti con Pneumocystis carinii contengono cisti
di grandi dimensioni di forma tonda o ovale, sia singole che
in gruppi, con colorazione verde mela brillante. Due o più
cisti ben definite e fluorescenti devono essere presenti
affinché il campione sia da considerarsi positivo.
2. Anche gli sporozoiti e i trofozoiti possono risultare colorati.
Essi appaiono come piccole strutture polimorfe o falciformi.
Può inoltre essere presente della matrice extracellulare
amorfa e a colorazione brillante. Prima di poter effettuare
una diagnosi sicura nel caso di campioni contenenti unicamente materiale amorfo o forme tipiche di sporozoiti e trofozoiti a colorazione brillante, è necessario procedere
66
attivamente alla ricerca di cisti. In assenza di cisti, la positività del campione per Pneumocystis carinii va sospettata, ed
un ulteriore campione va raccolto e sottoposto a colorazione.
3. Altri organismi e materiale cellulare dai campioni prelevati
dalle vie respiratorie vanno sottoposti a colorazione di contrasto dal rosso al rosso-arancio o oro.
4. Un campione è considerato negativo se la caratteristica fluorescenza, come descritta in precedenza, non viene osservata.
rR
Fo
5. Un eventuale risultato negativo ottenuto da un campione di
escreato indotto va verificato su un ulteriore campione di
lavanda bronchiale o lavaggio bronchioalveolare.
ce
ren
efe
LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA
Un risultato negativo non esclude la possibilità di infezione da
Pneumocystis carinii nel paziente. La raccolta e la preparazione
del campione sono estremamente importanti per la procedura
di analisi. La raccolta del campione in un momento non adatto
durante il decorso della malattia, l’utilizzazione di un metodo
non idoneo per la sua raccolta, la manipolazione inadeguata del
campione o l’uso improprio dei reagenti forniti possono impedire la rilevazione di Pneumocystis carinii. La diagnosi va effettuata alla luce di un più ampio quadro clinico.
Us
nly
eO
Analizzare solamente un campione su ciascun vetrino. È necessario analizzare, fissare, colorare e lavare ciascun campione
separatamente per evitare la possibile contaminazione di altri
vetrini con Pneumocystis carinii.
Un eccesso di muco nei campioni può impedire l’adeguata colorazione. Alcuni strisci di escreato denso possono impedire
l’adeguata colorazione. È necessario prendere le opportune
misure per rendere gli strisci il più sottili possibile. Se il campione non viene adeguatamente lavato, si può avere l’intrappolamento non specifico del reagente colorante per Pneumocystis
carinii.
A conferma della validità di un risultato negativo, la presenza
del campione sul vetrino va confermata mediante microscopia
luminosa.
67
Se il campione di lavanda bronchiale o lavaggio bronchioalveolare fornisce un risultato negativo, ma il paziente continua ad
accusare i sintomi associati alla malattia respiratoria, è bene
sospettare altri agenti eziologici ed eseguire altre procedure
diagnostiche (inclusa la coltura).
efe
rR
Fo
CARATTERISTICHE DI RENDIMENTO
Tre centri hanno preso parte ad uno studio clinico per la
valutazione del kit di analisi ad immunofluorescenza per la rilevazione di Pneumocystis carinii MONOFLUO™. Campioni
clinici sono stati raccolti da pazienti con sospetta polmonite da
Pneumocystis carinii. Da ciascun paziente è stato raccolto un
campione di escreato indotto, che è stato analizzato mediante il
test MONOFLUO™ (MF) e, parallelamente, mediante colorazione istologica (metodo di riferimento). Sono state utilizzate due
colorazioni istologiche: una colorazione Wright-Giemsa [DiffQuik™ (DQ)] e il blu di toluidina O (TBO).
ce
ren
Nei casi in cui il campione di escreato indotto è risultato positivo con il metodo di riferimento, il risultato è stato considerato
indicativo dell’infezione da P. carinii. Se il risultato fornito dal
campione di escreato indotto mediante il metodo di riferimento
è risultato negativo, si è ottenuto ed analizzato un campione di
lavaggio bronchioalveolare (BAL). Se il BAL è risultato positivo,
il paziente è stato considerato positivo per P. carinii. Se il BAL è
risultato negativo, il paziente è stato considerato negativo per
P. carinii. Un totale di 100 pazienti ha preso parte allo studio. I
risultati ottenuti sono schematizzati nella Tabella 2.
Centri 1 e 2
nly
eO
Us
Tabella 2: risultati sui pazienti
Centro 3
Campione
DQ
MF
TBO
MF
Pazienti positivi per P.carinii
• escreato indotto
• BAL
62
53
9
63
53
10
14
8
6
14
14
6**
**Questi sei pazienti sono risultati positivi con l’escreato indotto analizzato con il test
MONOFLUO™; sono risultati positivi anche con il BAL. I BAL sono stati ottenuti da questi
sei pazienti poiché il risultato TBO dell’escreato era negativo.
Il numero di pazienti classificati come positivi e negativi con il
kit di analisi ad immunofluorescenza per la rilevazione di Pneu-
68
mocystis carinii MONOFLUO™ in rapporto al test di riferimento
è riportato nella Tabella 3.
Tabella 3: confronto tra i risultati ottenuti mediante la colorazione
istologica ed i risultati ottenuti mediante il test ad
immunofluorescenza MONOFLUO™ (include sia i campioni di
escreato indotto che BAL)
Colorazione istologica
+
–
+
76
1
–
0
23
Monofluo™
Fo
ce
ren
efe
rR
Dei 100 pazienti analizzati, 76 sono risultati positivi per P. carinii
e 24 sono risultati negativi per P. carinii, come determinato
mediante la colorazione istologica. Il test MONOFLUO™ ha
identificato correttamente tutti i 76 pazienti positivi e ha fornito
risultati negativi per i 23 pazienti negativi per P. carinii. Un campione di escreato indotto è risultato negativo sia mediante il test
MONOFLUO™ che mediante il test di riferimento, ma il BAL di
questo paziente è risultato negativo con il metodo di riferimento
e positivo con il test MONOFLUO™.
eO
Us
Alla luce di questi dati clinici, le caratteristiche del rendimento
del kit di analisi ad immunofluorescenza per Pneumocystis carinii MONOFLUO™ sono:
Sensibilità = 100%
Specificità = 95,8%
nly
69
REATTIVITÀ CROCIATA
Le seguenti colture batteriche e micotiche ottenute da isolati e
da campioni sono state sottoposte ad analisi per determinare la
reattività crociata con il kit di analisi ad immunofluorescenza per
la rilevazione di Pneumocystis carinii MONOFLUO™ e sono
risultate non reattive.
Neisseria spp.
Nocardia asteroides
Pepto streptococcus
Proteus mirabilis
Pseudomonas spp.
Rothia dentocariosa
Staphylococcus spp.
Streptococcus spp.
Streptococcus, Gruppi A,B,C,F,G
Treponema denticola
Veillonella parvula
ce
ren
efe
rR
Fo
Batteri
Bacteroides spp.
Eggerthella lenta
Escherichia coli
Haemophilus spp.
Micrococcus luteus
Moraxella lacunata
Us
Funghi
Aspergillus niger
Aspergillus flavus
Aspergillus terreus
Candida albicans
Candida krusei
nly
eO
Candida tropicalis
Torulopsis glabrata
Trichosporon spp.
70
MONOFLUO™
32515
rR
Fo
Dispositivo de Teste de Anticorpos por
Imunofluorescência para Detecção e Identificação da
Pneumocystis carinii em Amostras do Tracto
Respiratório
ren
efe
APLICAÇÃO
O Dispositivo de Teste de Anticorpos por Imunofluorescência
MONOFLUO™ Pneumocystis destina-se a utilização na
detecção de quistos e trofozoites de Pneumocystis carinii em
amostras recolhidas no tracto respiratório.
ce
RESUMO E EXPLICAÇÃO
Pneumocystis carinii é um organismo eucariótico unicelular que
está presente nos pulmões de muitas espécies de mamíferos,
incluindo o homem. O organismo é transmitido pelas vias respiratórias, causando normalmente uma infecção assintomática. A
exposição durante a infância pode resultar em casos ligeiros ou
subclínicos, mantendo-se o organismo em estado latente ao
longo da idade adulta. Em indivíduos com sistemas imunes
comprometidos, o organismo torna-se oportunístico, causando
pneumonia intersticial difusa.1,2
nly
eO
Us
Os indivíduos de risco para Pneumocystis carinii incluem os
bebés prematuros, indivíduos com perturbações de deficiência
imune (tais como o síndroma de imunodeficiência adquirida) e
doentes submetidos a tratamento com fármacos imunodepressores, tais como corticosteróides. Pneumocystis carinii é o
agente de infecção oportunista mais comum nos doentes com
SIDA, sendo que quase 80% sofrem esta infecção.3,4,5,6
Os estudos morfológicos do organismo revelaram três formas
no ciclo de vida do Pneumocystis carinii: quistos, esporozoites
71
e trofozoites. Os quistos de parede espessa (4-7 µm de
diâmetro) contêm normalmente oito esporozoites em forma de
vírgula, que depois maturam para trofozoites pelomórficos de
maiores dimensões (2-8 µm de diâmetro), antes de enquistarem
para repetir o ciclo.1,6 Os quistos, com as suas características
morfológicas distintas, estão, na maioria dos casos, associados à presença de Pneumocystis carinii.
Fo
Um rápido diagnóstico clínico de Pneumocystis carinii revela-se
da maior importância, já que os organismos rapidamente infiltram o tecido pulmonar, causando dispneia, febre e tosse.7
Uma detecção precoce pode facilitar a instituição de um tratamento apropriado e assim melhorar as hipóteses de sobrevivência do doente.8,9
ce
ren
efe
rR
Presentemente, o diagnóstico é realizado através de técnica
radiológica e identificação de quistos e trofozoites de Pneumocystis carinii por coloração histológica de amostras do
tracto respiratório. Os métodos de coloração habituais (azul de
toluidina O, nitrato de prata de metenamina de Gomori ou
Giemsa) revelam paredes quísticas e/ou trofozoites/esporozoites.6,10 Dada a natureza não específica destes corantes, a identificação correcta do organismo pode tornar-se difícil. Uma
técnica mais invasiva para recolha de amostras, tal como a lavagem bronco-alveolar revela-se, muitas vezes, necessária para
assegurar a presença de Pneumocystis carinii.11
Us
nly
eO
A utilização de um procedimento directo de anticorpos fluorescentes, com amostras de saliva induzida, lavagem brônquica
ou lavagem broncoalveolar proporciona um procedimento simples e altamente específico para detecção de Pneumocystis
carinii.12,13,14,15 Os anticorpos monoclonais no Dispositivo de
Teste de Imunofluorescência MONOFLUO™ Pneumocystis carinii são quimicamente ligados a isotiocianato de fluoresceína
(FITC) para produzir um reagente imunofluorescente directo,
altamente específico, com um nível reduzido de fluorescência
de fundo. Para além de se ligarem a quistos de Pneumocystis
carinii, os anticorpos monoclonais também se ligam especificamente a trofozoites, esporozoites de Pneumocystis carinii e à
matriz extracelular. O dispositivo de teste é utilizado para a
identificação rápida de quistos e trofozoites de Pneumocystis
carinii, directamente em amostras de doentes.
72
PRINCÍPIOS DO PROCEDIMENTO
O Agente de Coloração MONOFLUO™ Pneumocystis carinii
contém anticorpos monoclonais de murino, marcados com isotiocianato de fluoresceína (FITC). Estes anticorpos reagem com
todas as formas de Pneumocystis carinii (quistos, esporozoites
e trofozoites) e também com a matriz extracelular presente nas
amostras infectadas.
ren
efe
rR
Fo
Preparam-se lâminas para microscopia a partir de amostras
clínicas, como se descreve na secção Preparação de Amostras
Clínicas Antes da Coloração de Fluorescência. Após a fixação,
as lâminas são coradas com o Reagente de Coloração
MONOFLUO™ Pneumocystis carinii. O Reagente de Coloração
liga-se a quaisquer organismos Pneumocystis carinii presentes
na amostra. Uma operação de enxaguamento seguinte permite
eliminar o Reagente de Coloração não ligado da amostra. As
lâminas são então fixadas com o Meio de Fixação MONOFLUO™ incluído no dispositivo. O Meio de Fixação contém um
anti-extintor que prolonga o período de tempo em que as lâminas podem ser examinadas antes de a fluorescência desaparecer.
ce
Quando observadas ao microscópio de fluorescência, as
amostras infectadas são visíveis com fluorescência em verde
maçã claro. Os quistos corados são estruturas de grande
dimensão, redondas a elípticas, que podem ser vistas individualmente ou em cachos. Os esporozoites e trofozoites também
podem sofrer coloração, surgindo sob a forma de estruturas
pleomórficas relativamente pequenas, em quarto crescente.
Além disso, a matriz extracelular amorfa deverá também apresentar-se com fluorescência intensa. Outros organismos e
material celular das amostras respiratórias são contra-corados
de vermelho a vermelho alaranjado ou dourado, sem a fluorescência característica dos quistos Pneumocystis carinii.
nly
eO
Us
73
DESCRIÇÃO DO PRODUTO
Quadro 1: Materiais Fornecidos
Conservar os reagentes a 2-8°C. As lâminas devem ser conservadas a 2-28°C.
Conteúdo
Preparação
R1 • Agente de Coloração
Pneumocystis carinii *
1 Frasco conta-gotas
(2.2 ml)
• Anticorpos monoclonais
marcados com FITC
(murino)
• Contra-corante (Azul de
Evans)
• Azida de sódio**
• Tampão de proteína
estabilizada
• Tampão de glicerol
• Formaldeído***
• Anti-extintor
• Lâminas de microscópio
de fluorescência
Misturar
lentamente
antes de usar.
Fo
Componente
efe
rR
R2 • Meio de Fixação
1 Frasco conta-gotas (3.5
ml)
R3 • Lâminas de
Microscópio de
Fluorescência
24 (2 poços cada)
Fornecido
pronto a utilizar.
Limpar com
tecido sem fios
antes de usar.
ren
*Volume suficiente para coloração de 24 poços de teste individuais. **Azida de Sódio
0,1% ***Formaldeído 0.8%
ce
MATERIAL NECESSÁRIO MAS NÃO FORNECIDO
• Acetona, Nível de Reagente, (conservar em recipiente
devidamente fechado para evitar a absorção de água).
Us
• Água desionizada ou água da torneira.
eO
• Discos de coloração de lâminas com suportes tipo
“rack”.
nly
• Câmara de humidificação (tais como placa de Petri
coberta contendo uma folha de papel humedecida).
• Lamelas de cobertura, 24 X 40 mm, #1.
• Pipetas Pasteur.
• Centrifugadora ou microcentrifugadora.
• Tubos de centrifugação de 15 ml ou tubos de microcentrifugação de 1,5 ml.
• Incubadora a 37±1°C.
• Cabina de segurança biológica (recomendada).
74
• Óleo de imersão
necessário.
de
qualidade
fluorescente,
se
rR
Fo
• Microscópio de fluorescência com ampliação de 200250X e 400-630X, equipado com um sistema de filtro
para isotiocianato de fluoresceína (FITC). Existe grande
variedade de conjuntos de filtros para leitura de FITC, de
diferentes fabricantes. Aconselha-se a utilização de comprimentos de onda de excitação de banda larga (420-490
nm) ou banda estreita (470-490 nm), com um espelho
dicromático de 515 nm e um filtro de barreira de 515 nm.
O comprimento de onda de excitação de banda estreita
permite reduzir a fluorescência de fundo. Variações na
potência em watts, na intensidade e no alinhamento da
lâmpada, bem como diferenças no tipo de iluminação e
nos filtros, podem afectar o desempenho do teste.
efe
• Lâminas de controlo contendo organismos Pneumocystis
carinii (ver a secção Preparação das Lâminas de Controlo).
ren
• Papel absorvente ou sistema de aspiração.
ce
Para Amostras de Saliva Induzida
• Ditiotreitol (DTT): Preparação líquida de 0,1%
eO
Us
• (6.5x10-3 moles/l). Por exemplo, Stat-Pak™ Sputolysin
disponível na Caldon Biotech; Seguir as instruções de utilização.
• Solução Salina em Tampão de Fosfato (PBS).
nly
PRECAUÇÕES
Utilização exclusiva no diagnóstico in vitro.
Apenas para utilização profissional.
1. Este teste deve ser realizado por técnicos com a devida formação no manuseamento de amostras clínicas susceptíveis
de conter HIV-1. As lâminas deverão ser examinadas por
técnicos com experiência na leitura de ensaios de imunofluorescência.
2. Todas as amostras clínicas devem ser consideradas como
material potencialmente infeccioso.
75
3. Os procedimentos que dêem origem à formação de aerossóis deverão ser conduzidos em cabina de segurança
biológica. Todos os materiais deverão ser desinfectados
após utilização ou antes da sua eliminação.
4. Utilizar uma técnica laboratorial correcta no tratamento de
amostras ou de reagentes do Dispositivo de Teste de imunofluorescência MONOFLUO™ Pneumocystis carinii. Não
comer, beber ou fumar dentro do laboratório. Não pipetar
com a boca. Evitar a contaminação dos reagentes por
micróbios ou outras substâncias.
rR
Fo
5. O Reagente de Coloração contém Azul de Evans, que é um
produto irritante. Evitar derramar ou salpicar o Reagente de
Coloração sobre a pele ou o vestuário. Quaisquer áreas que
entrem em contacto com o Reagente de Coloração deverão
ser cuidadosamente irrigadas com água.
ce
ren
efe
6. O Meio de Montagem possui formalina a 2% que contém
formaldeído a 0,8%, de acordo com o Programa Nacional de
Toxicidade (NTP) dos Estados Unidos pode ser razoavelmente previsto como sendo carcinogénico. No entanto, os
dados actualmente existentes não estabelecem, de forma
conclusiva, a carcinogenicidade do formaldeído às concentrações usadas neste dispositivo (<1.00%). Evitar derramar
ou salpicar o Meio de Fixação sobre a pele ou o vestuário.
Quaisquer áreas que entrem em contacto com o Meio de
Fixação deverão ser cuidadosamente irrigadas com água.
Us
eO
R: 40-43: Pode causar sensibilização por inalação e contacto com a pele. Possível risco de efeitos irreversíveis.
nly
S: 24/25-28-36/37/39: Evitar o contacto com a pele e os
olhos. Em caso de contacto com a pele, lavar imediatamente com água abundante. Usar vestuário adequado,
luvas e protectores para olhos/rosto.
7. O Reagente de Coloração contém azida de sódio. A azida de
sódio pode reagir com as canalizações em chumbo ou
cobre, formando azidas metálicas que são altamente explosivas. Se for necessário eliminar o Reagente de Coloração
pela canalização, irrigar o cano de despejo com água abundante por forma a impedir a formação de azidas.
76
Xn: Nocivo
0,1% NaN3
R: 21/22
Nocivo em contacto com a pele e por ingestão.
S: 24/25-28-36/37/39
Evitar o contacto com a pele e os olhos. Após contacto com a pele, lavar imediata e abundantemente
com água. Usar vestuário de protecção, luvas e equipamento protector para os olhos/face adequados.
8. Limpar meticulosamente todos os componentes reutilizáveis, no fim de cada utilização.
Fo
9. Misturar lentamente o Reagente de Coloração antes de cada
teste.
efe
rR
10.Utilizar uma lâmina separada para cada amostra de doente,
por forma a evitar qualquer contaminação cruzada de organismo Pneumocystis carinii. É igualmente recomendável que
cada lâmina seja lavada em separado.
ren
11.As lâminas deverão ser preparadas por meio de fixação com
acetona. Para este teste não são recomendáveis lâminas fixadas com formalina ou com etanol.
ce
ESTABILIDADE E ACONDICIONAMENTO DO REAGENTE
Não utilizar o dispositivo ou qualquer dos componentes após o
termo do prazo de validade. Guardar o Reagente de Coloração
a 2-8°C, ao abrigo da luz.
Us
nly
eO
Guardar os reagentes a 2-8°C. As lâminas deverão ser conservadas a 2-28°C. Quando conservados às temperaturas especificadas, os reagentes abertos ou não abertos mantêm-se
estáveis até ao termo do prazo de validade indicado.
PROCEDIMENTO DE TESTE PNEUMOCYSTIS CARINII
Recolha de Amostras
As amostras clínicas devem ser colhidas recentemente, utilizando os métodos habituais para obtenção de saliva induzida,
lavagem brônquica ou lavagem broncoalveolar.16,17 A amostra
deve ser processada imediatamente. Reservar uma porção da
amostra para cultura, se necessário.
77
Preparação das Amostras Clínicas Antes da Coloração por
Fluorescéncia
Amostras de Saliva Induzida
1a.Colocar 2 a 3 ml de saliva num tubo de centrifugação de 15
ml. Adicionar igual volume de reagente ditiotreitol. Agitar o
tubo e incubar durante 5-10 minutos a 37°C ou 15 minutos à
temperatura ambiente (RT=15-30°C).
– OU –
ren
efe
rR
Fo
1b.Se a amostra for demasiado viscosa para ser facilmente
transferida para um tubo de centrifugação, adicionar igual
volume calculado de reagente ditiotreitol directamente no
recipiente de recolha, agitar vigorosamente para misturar e
incubar durante 5-10 minutos a 37°C ou 15 minutos à temperatura ambiente (RT=15-30°C). Transferir para um tubo de
centrifugação o mais rapidamente possível durante a incubação e agitação, antes de prosseguir.
ce
2. Adicionar um volume de aproximadamente 5 a 6 ml de PBS
pH 7.2, igual ao da saliva mais DTT combinados, para o
tubo, e agitar correctamente.
3. Centrifugar a 1500 x G durante 5 minutos.
eO
Us
4. Decantar ou aspirar cuidadosamente o sobrenadante, deixando 0,5 ml ou menos da película e sobrenadante no tubo.
Se necessário, pode-se repetir os passos 2, 3 e 4 para eliminar quaisquer vestígios de muco.
nly
5. Ressuspender cuidadosamente a película. Utilizando um
pipetador, aplicar uma gota (aproximadamente 25-50 µl)
numa lâmina de microscópio, fornecida juntamente com o
dispositivo. Espalhar uniformemente a gota sobre o poço,
com o lado de uma ponta de pipeta, tendo o cuidado de não
riscar a lâmina. Deixar secar ao ar. Pode utilizar-se um secador de lâminas a 37°C para acelerar a secagem da amostra.
6. Fixar durante aproximadamente 10 minutos em acetona. As
lâminas podem ser processadas imediatamente ou congeladas a -20°C por um prazo até um mês, antes de se proceder
à coloração.
78
Amostras de Lavagem Brônquica e Lavagem Broncoalveolar
Amostras não mucóides, como as lavagens brônquicas ou
broncoalveolares, não requerem provavelmente o procedimento mucolítico. Para estas amostras, o protocolo pode
começar com a centrifugação, passo 3 em cima, num tubo de
centrifugação de 15 ml ou num tubo microfugo de 1,5 ml.
rR
Fo
NOTA: Em alternativa, pode utilizar-se um centrífugo de citospina para preparar as lâminas de amostras de saliva induzida,
lavagem brônquica ou BAL 12. Se for seguido o procedimento
com citospina, os controlos deverão ser processados da
mesma maneira. As lâminas preparadas com um centrífugo de
citospina são fixadas durante dez minutos em acetona e coradas como abaixo descrito, na secção Procedimento de Coloração por Fluorescência.
ce
ren
efe
PREPARAÇÃO DAS LÂMINAS DE CONTROLO
É necessário incluir uma lâmina de controlo positivo de cada
vez que o teste é realizado. As amostras de lavagem brônquica
e lavagem broncoalveolar são as mais adequadas para utilização como controlo positivo. As amostras seleccionadas
deverão ser previamente confirmadas para Pneumocystis carinii por coloração histológica. Siga os procedimentos descritos
na secção Preparação das Amostras Clínicas Antes da Coloração por Fluorescência. Após a fixação com acetona, as
lâminas podem ser congeladas a -20°C por um período até um
mês. Em alternativa, utilize uma amostra reconhecidamente
positiva como controlo positivo. Para que o teste seja considerado válido, a lâmina de controlo deverá apresentar-se devidamente corada e ser interpretada como se descreve na secção
Avaliação dos Resultados do Teste.
nly
eO
Us
PROCEDIMENTO DE COLORAÇÃO POR FLUORESCÊNCIA
1. Se as lâminas tiverem sido congeladas, aguarde até que
estabilizem à temperatura ambiente antes de prosseguir
com o procedimento de coloração.
2. Coloque a lâmina na câmara de humidificação.
3. Adicione quantidade suficiente de Reagente de Coloração
Pneumocystis carinii em cada poço que contenha a amostra
79
(2-3 gotas) para cobrir a amostra, embora mantendo-se
dentro dos limites do poço.
4. Incubar durante 30-35 minutos a 37±1°C. Não deixar que o
Reagente de Coloração Pneumocystis carinii seque sobre a
lâmina durante o procedimento.
5. Retire o excesso de Reagente de Coloração Pneumocystis
carinii escorrendo a lâmina sobre papel absorvente limpo ou
por aspiração.
Fo
6. Proceda à lavagem da lâmina colocando-a num suporte e
mergulhando-a em água desionizada ou água da torneira,
durante um minuto, fazendo-se acompanhar de uma ligeira
agitação intermitente. Retire a água em excesso, escorrendo
a lâmina sobre papel absorvente limpo ou por aspiração.
rR
7. Seque cuidadosamente a lâmina ao ar ou por meio de um
secador de amostras a 37±1°C.
ren
efe
8. Aplique uma a duas gotas de Meio de Fixação na lâmina e
coloque uma lamela de cobertura, tendo o cuidado de evitar
a formação de bolhas de ar.
ce
9. Examine as lâminas no prazo de 2-3 horas após a coloração.
Depois de efectuar a leitura, as lâminas podem ser guardadas, de um dia para o outro, ao abrigo da luz, à temperatura
de 2-8°C, ou por um período até 6 meses, ao abrigo da luz,
a -20°C ou mais baixo. As lâminas guardadas no frio
deverão aguardar até estabilizarem à temperatura ambiente,
antes de se proceder à leitura, por forma a impedir que a
condensação obscureça a amostra.
eO
Us
nly
10.Para que os resultados negativos sejam válidos, confirme
por microscopia de luz se essa amostra está presente na
lâmina.
ANÁLISE DAS LÂMINAS CORADAS
Observe cada poço com uma ampliação de 200X ou mais elevada. Se observar fluorescência, utilize uma ampliação de 400X
ou 630X (com óleo de imersão) para confirmar os padrões de
coloração característicos, descritos na secção Avaliação dos
Resultados do Teste. Confirmar se a amostra está presente em
cada lâmina, após completar o ensaio.
80
AVALIAÇÃO DOS RESULTADOS DO TESTE
1. As amostras infectadas com Pneumocystis carinii contêm
grandes quistos de forma redonda a elíptica, observados
tanto em isolado como em cachos, que surgirão corados de
verde maçã claro. Para que a amostra seja considerada
positiva deverão ser observados dois ou mais quistos
fluorescentes bem definidos.
efe
rR
Fo
2. Os esporozoites e trofozoites também podem ser corados.
Apresentam-se sob a forma de pequenas estruturas pleomórficas ou em quarto crescente. Uma matriz extracelular amorfa,
de coloração intensa, poderá estar igualmente presente. As
amostras contendo apenas material amorfo de coloração
intensa ou formas esporozoites e trofozoites características,
deverão levar a uma investigação activa para detecção de
quistos, antes de se poder traçar um diagnóstico definitivo.
Na ausência de quistos, a amostra deverá ser considerada
suspeita como positiva a Pneumocystis carinii, e outras
amostras deverão ser obtidas por coloração.
ce
ren
3. Os outros organismos e material celular das amostras respiratórias deverão ser contra-corados de laranja avermelhado
ou de dourado.
4. Uma amostra é considerada negativa se não se observar
qualquer fluorescência característica, como acima descrito.
Us
eO
5. Um resultado negativo numa amostra de saliva induzida
deverá ser confirmado numa outra amostra recolhida por
lavagem brônquica ou lavagem broncoalveolar.
nly
LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO
Um resultado negativo não exclui a possibilidade de infecção
por Pneumocystis carinii no doente. A colheita e a preparação
das amostras constituem operações de extrema importância
no procedimento de teste. Recolher uma amostra num
momento incorrecto no decurso da doença, utilizando um
método não apropriado ou um manuseamento incorrecto da
amostra, ou ainda a utilização incorrecta dos reagentes fornecidos, pode resultar na incapacidade em detectar Pneumocystis
carinii. O diagnóstico deverá ser traçado em conjunto com os
sintomas clínicos.
81
Processar apenas uma amostra em cada lâmina. É necessário
cuidado no processamento, coloração e lavagem de cada
amostra em separado, por forma a impedir qualquer possível
transvasamento de organismos Pneumocystis carinii para outras lâminas.
O muco em excesso nas amostras pode impedir uma coloração
adequada. Certos esfregaços de saliva espessa podem impedir
uma coloração adequada. É necessário ter o cuidado de efectuar os esfregaços o mais fino possível. Poderá ocorrer uma
captação não específica de Reagente de Coloração Pneumocystis carinii se a amostra não for adequadamente lavada.
rR
Fo
Para que os resultados negativos possam ser considerados válidos, a presença de amostras na lâmina deverá ser confirmada
por microscopia de luz.
ren
efe
Se a amostra de lavagem brônquica ou lavagem broncoalveolar
for negativa mas o doente continuar a apresentar sintomas
associados a doença respiratória, dever-se-á suspeitar de outros agentes etiológicos e encetar então os procedimentos de
diagnóstico apropriados (incluindo a cultura).
ce
CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO
Três investigadores participaram num ensaio clínico para avaliar o teste de imunofluorescência MONOFLUO™ Pneumocystis
carinii. Amostras clínicas foram recolhidas de doentes suspeitos de apresentarem pneumonia Pneumocystis carinii. Uma
amostra de saliva induzida foi recolhida de cada doente e submetida a teste, em paralelo com o teste MONOFLUO™ (MF) e
por coloração histológica (método de referência). Utilizaram-se
duas colorações histológicas: uma coloração Wright-Giemsa
[Diff-Quik™ (DQ)] e azul de toluidina O (TBO).
nly
eO
Us
Se a saliva induzida era positiva com o método de referência, o
resultado era considerado indicativo de infecção com P. carinii.
Se o resultado com o método de referência era negativo sobre
a amostra de saliva induzida, recolhia-se uma amostra de lavagem broncoalveolar (BAL) para que fosse testada. Se a BAL
fosse positiva, o doente era positivo para P. carinii. Se a BAL
fosse negativa, o doente era considerado negativo para
P. carinii. Um total de 100 doentes foram incluídos na análise.
Os resultados obtidos são apresentados no Quadro 2.
82
Quadro 2: Resultados dos Doentes
Locais 1 e 2
Amostra
Doentes positivos para
P.carinii
• por Saliva Induzida
• por BAL
Local 3
DQ
MF
TBO
MF
62
63
14
14
53
9
53
10
8
6
14
6**
**Estes seis resultados foram positivos para saliva induzida com o teste MONOFLUO™ e
foram igualmente positivos para BAL. As amostras por BAL foram obtidas nos seis
doentes porque o resultado TBO na saliva foi negativo.
rR
Fo
O número de doentes classificados como positivos e negativos
com o Dispositivo de Teste de Imunofluorescência MONOFLUO™
Pneumocystis carinii, em comparação com o teste de referência,
são apresentados no Quadro 3.
ren
efe
Quadro 3: Comparação do Resultado obtido Utilizando Coloração
Histológica com o Resultado Obtido com o Teste de
Imunofluorescência MONOFLUO™ (Inclui Saliva Induzida e BAL)
Coloração Histológica
+
–
+
76
1
–
0
ce
Monofluo™
23
Us
nly
eO
Dos 100 doentes testados, 76 eram positivos para P. carinii e
24 eram negativos para P. carinii, tal como determinado por
coloração histológica. O teste MONOFLUO™ identificou correctamente todos os 76 doentes positivos e foi negativo em 23
doentes, que eram negativos para P. carinii. Uma amostra de
saliva induzida foi negativa tanto para o teste MONOFLUO™
como para o teste de referência, mas a BAL deste doente foi
negativa tanto pelo teste de referência como pelo teste
MONOFLUO™.
Com base nestes dados clínicos, as características de desempenho do Dispositivo de Teste de Imunofluorescência MONOFLUO™ Pneumocystis carinii são as seguintes:
Sensibilidade = 100%
Especificidade = 95.8%
83
REACTIVIDADE CRUZADA
As seguintes culturas de bactérias e fungos, recolhidas de isolados de cultura e de amostras, foram testadas quanto à reactividade cruzada, com o Dispositivo de Teste de
Imunofluorescência MONOFLUO™ Pneumocystis carinii , e
foram consideradas como sendo não reactivas:
ce
Candida tropicalis
Torulopsis glabrata
Trichosporon spp.
nly
eO
Us
Fungos
Aspergillus niger
Aspergillus flavus
Aspergillus terreus
Candida albicans
Candida krusei
Neisseria spp.
Nocardia asteroides
Pepto streptococcus
Proteus mirabilis
Pseudomonas spp.
Rothia dentocariosa
Estafilococos spp.
Estreptococos spp.
Estreptococos, Grupos A,B,C,F,G
Treponema denticola
Veillonella parvula
ren
efe
rR
Fo
Bactérias
Bacteroides spp.
Eggerthella lenta
Escherichia coli
Haemophilus spp.
Micrococcus luteus
Moraxella lacunata
84
MONOFLUO™
Pneumocystis carinii IFA-testsæt
32515
Immunfluorescerende antistoftestsæt til konstatering
og identifikation af Pneumocystis carinii i prøver fra
åndedrætsorganerne
Fo
ren
efe
rR
FORMÅL
MONOFLUO™ Pneumocystis Immunofluorescent Antibody
Test Kit skal bruges til konstatering af Pneumocystis cariniicyster og -tropozoider i prøver, der er taget fra åndedrætsorganerne.
ce
OVERSIGT OG FORKLARING
Pneumocystis carinii er en encellet, eukaryotisk organisme, der
findes i lungerne hos mange pattedyr, herunder mennesker.
Organismen spredes gennem luften og fremkalder normalt en
asymptomatisk infektion. Eksponering i barndommen kan
resultere i milde eller subkliniske tilfælde, hvor organismen er
latent hos den voksne. Hos personer med svækkede immunsystemer, bliver organismen opportunistisk og fremkalder diffus, interstitial lungebetændelse.1,2
eO
Us
nly
Personer med risiko for Pneumocystis carinii omfatter for tidligt
fødte børn, personer med svækket immunsystem (f.eks. AIDS)
og personer, der får immunosuppressiv medicin som f.eks. kortikoider. Pneumocystis carinii er det mest almindelige opportunistiske, inficerende stof hos AIDS-patienter, hvor næsten 80 %
lider af denne type infektion.3,4,5,6
Morfologiske undersøgelser af organismen har afsløret tre
former for livscyklusser hos Pneumocystis carinii: cyster, sporozoider og trophozoider. De tykvæggede cyster (4-7 µm i diameter) indeholder normalt otte kommaformede sporozoider, som
derefter modnes til større, pleomorfiske trophozoider (2 – 8 µm i
diameter), før de indkapsler sig og cyklussen gentages.1,6 Cys85
terne med deres markante morfologiske egenskaber er oftest
forbundet med forekomsten af Pneumocystis carinii.
En hurtig klinisk diagnose af Pneumocystis carinii er af største
vigtighed, eftersom organismerne hurtigt infiltrerer lungevævet
og fremkalder åndenød, feber og hoste.7 En tidlig konstatering
kan lette igangsættelsen af den rette behandling og øge
chancerne for patientens overlevelse.8,9
efe
rR
Fo
I øjeblikket stilles diagnosen med en radiologisk teknik og identifikation af Pneumocystis carinii-cyster og -trophozoider ved
hjælp af histologisk farvning af prøver fra åndedrætsorganerne.
Almindelige farvningsmetoder (toluidinblåt O, Gomoris methenaminsølvnitrat eller Giemsa) afslører cystevægge og/eller trophozoider/sporozoider.6,10 På grund af disse farvningernes
uspecifikke natur er det svært at opnå en korrekt identifikation
af organismen. En mere invasiv teknik til prøvetagning som
f.eks. bronchoalveolær udskylning er ofte påkrævet for at
påvise forekomsten af Pneumocystis carinii med sikkerhed.11
ce
ren
Brugen af en direkte, fluorescerende antistofprocedure med
prøver ved hjælp af induceret spyt, bronchial vask eller bronchoalveolar udskylning har vist sig at være en simpel og meget
specifik procedure til konstatering af Pneumocystis carinii.12,13,14,15 I MONOFLUO™ Pneumocystis carinii Immunofluorescence Test Kit oprettes der en kemisk forbindelse mellem de
monoklonale antistoffer og fluorescein isothiocyanat (FITC) for
at frembringe en meget specifik, direkte immunofluorescerende
reagens med lav baggrundsfluorescens. Foruden at binde sig til
Pneumocystis carinii-cyster binder de monoklonale antistoffer
sig også specifik til Pneumocystis carinii-trophozoider, sporozoider og den ekstracellulære matrix. Testsættet bruge til hurtig og
direkte identifikation af Pneumocystis carinii-cyster og -trophozoider i patientprøver.
nly
eO
Us
PRINCIPPER FOR PROCEDUREN
MONOFLUO™ Pneumocystis carinii-farvningsreagens indeholder murine, monoklonale antistoffer med fluorescein isothiocyanat (FITC). Disse antistoffer reagerer med alle Pneumocystis
carinii-former (cyster, sporozoider og trophozoider) og med den
ekstracellulære matrix, der findes i de inficerede prøver.
Der forberedes plader til mikroskopi af kliniske prøver som
beskrevet i afsnittet Forberedelse af kliniske prøver før fluore86
scensfarvning. Efter fikseringen farves pladerne med MONOFLUO™ Pneumocystis carinii-farvningsreagens. Farvningsreagensen binder sig til enhver Pneumocystis carinii-organisme i
prøven. En efterfølgende skylning fjerne ubundet farvningsreagens fra prøven. Pladerne monteres derefter med det
MONOFLUO™-monteringsmedium, som følger med sættet.
Monteringsmediet indeholder en anti-quencher, der øger det tidsrum, hvor pladerne kan undersøges, før fluorescensen svinder.
efe
rR
Fo
Når de inficerede prøver ses i et fluorescensmikroscop, fremstår de som lyst æblegrønne. Farvede cyster vises som store,
runde eller elliptiske strukturer, der både er placeret i klynger og
enkeltvis. Sporozoider og trophozoider kan også farves og
fremstår som forholdsvis små, halvmåneformede eller pleomorfiske strukturer. Derudover skal den amorfe, ekstracellulære
matrix også have en svagt fluorescerende lys. Andre organismer og andet cellulært materiale fra prøver fra åndedrætsorganerne får baggrundsfarven rød, orangerød eller guld uden
Pneumocystis carinii-cysternes karakteristiske fluorescens.
ren
PRODUKTBESKRIVELSE
Tabel 1: Medfølgende materialer
ce
Opbevar reagenser ved 2-8°C. Pladerne skal gemmes ved
2-28°C.
Indhold
R1 • Pneumocystis cariniifarvningsreagens*
1 dråbeflaske
(2,2 ml)
• FITC-mærkede,
monoklonale antistoffer
(murine)
• Baggrundsfarve (Evans
Blue)
• Natriumazid**
• Proteinstabiliseret buffer
• Bufret glycerol
• Formaldehyd***
• Anti-quencher
• Plader til
nly
R3 • Plader til
24 (2 brønde hver)
Bland forsigtigt
før brug.
eO
R2 • Monteringsmedium
1 dråbeflaske (3,5 ml)
Forberedelse
Us
Komponent
Klar til brug ved
levering.
Tør af med en
fnugfri serviet
før brug.
*Tilstrækkelig mængde til farvning af 24 særskilte testbrønde. **0,001% natriumazid.
***< 0,04% formaldehyd.
87
KRÆVEDE MATERIALER, DER IKKE MEDFØLGER
• Acetone, reagensgrad (opbevar i en tæt tillukket beholder
for at forhindre optagelse af vand).
• Deioniseret vand eller almindeligt vand fra vandhanen.
• Stænkbakker med stativer til prøveplader.
• Fugtigt kammer (f.eks. en tildækket Petri-plade, der indeholder en fugtet papirserviet).
• Dækstrimler, 24 X 40 mm, #1.
• Pasteur-pipetter.
• Centrifuge eller mikrofuge.
Fo
• 15 ml centrifugerør eller 1,5 ml mikrofugerør.
rR
• 37±1°C inkubator.
• Biologisk sikret kabinet (anbefales).
efe
• Immersionsolie i fluorescenskvalitet, efter behov.
ce
ren
• Fluorescensmikroskop med 200-250X og 400-630X
forstørrelse, udstyret med et filtersystem til fluorescein
isothiocyanat (FITC). De forskellige producenter udbyder
en bred vifte af filtersæt til aflæsning af FITC. Det tilrådes
at benytte spændingsbølgelængder for brede bånd (420490 nm) eller smalle bånd (470-490 nm) med et 515 nm
dichromatisk spejl og et 515 nm spærrefilter. Spændingsbølgelængden for det smalle bånd mindsker baggrundsfluorescensen. Variationer i spændingen, intensiteten og
justeringen af pæren og forskelle i belysningstypen og filtrene kan påvirke testens ydeevnen.
nly
eO
Us
• Kontrolplader, der indeholder Pneumocystis carinii-organismer (se afsnittet Forberedelse af kontrolplader).
• Papirservietter eller opsugningssystem.
Til inducerede spytprøver
• Dithiothreitol (DTT): En væskeforberedelse af 0,1%.
• (6,5x10-3 pletter/l). F.eks. Stat-Pak™ Sputolysin, der fås
fra Caldon Biotech. Benyttes som anvist.
• Fosfatbufret saltvand (PBS).
88
FORHOLDSREGLER
Til in vitro-diagnosticering.
Kun til professionel brug.
1. Denne test må kun udføres af personale, der er korrekt
uddannet i håndtering af kliniske prøver, som indeholder
HIV-1. Pladerne skal undersøges af personale, der har erfaring i aflæsning af immunfluorescens-analyser.
2. Håndter alle kliniske prøver som potentielt smittefarligt materiale.
Fo
3. Procedurer, der frembringer aerosoler, skal udføres i en biologisk sikret kammer. Alle materialer skal desinficeres efter
brug eller før bortskaffelse.
ren
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rR
4. Benyt god laboratoriepraksis ved håndtering af prøver eller
reagenserne i MONOFLUO™ Pneumocystis carinii Immunofluorescence Test Kit. Undgå at spise, drikke eller ryge i laboratoriet. Undgå at pipettere med munden. Undgå at
kontaminere reagenserne med mikrober eller andre stoffer.
ce
5. Farvningsreagensen indeholder Evan's Blue, der fremkalder
irritation. Undgå at spilde eller stænke farvningsreagensen
på huden og tøjet. Skyl alle områder, der kan have været i
kontakt med farvningsreagensen, grundigt med vand.
nly
eO
Us
6. Monteringsmediet har 2% formalin, der indeholder 0,8%
formaldehyd, som med en vis sandsynlighed kan forventes
at være carcinogent ifølge det amerikanske NTP-program
(United States National Toxicity Program. Eksisterende data
giver dog ingen endelige beviser for formaldehydens carcigonicitet ved de koncentrationer, der anvendes i dette sæt
(<1,00%). Undgå at spilde eller stænke monteringsmediet på
huden og tøjet. Skyl alle områder, der kan have været i kontakt med monteringsmediet, grundigt med vand.
R: 40-43: Kan fremkalde irritation ved indånding og hudkontakt. Mulig risiko for uoprettelige skader.
S: 24/25-28-36/37/39: Undgå kontakt med huden og
øjnene. Efter hudkontakt afvaskes stoffet straks med rigeligt
vand. Benyt egnet beskyttelsestøj, handsker og briller/
maske.
89
7. Farvningsreagensen indeholder natriumazid. Natriumazid
kan reagere med bly- og kobberrør og dermed danne højeksplosive metalazider. Hvis farvningsreagensen hældes i afløbet, skal du skylle det efter med store mængder vand for at
forhindre dannelse af azider.
rR
Fo
Xn: Sundhedsskadelig
0.1% NaN3
R: 21/22
Farlig ved hudkontakt og ved indtagelse.
S: 24/25-28-36/37/39
Undgå kontakt med huden og øjnene. Kommer stof
på huden vaskes straks med store mængder vand.
Brug særligt arbejdstøj, egnede beskyttelseshandsker og -briller/ansigtsskærm.
8. Rengør alle elementer, som kan genbruges, fra gang til gang.
9. Bland farvningsreagensen forsigtigt før hver test.
ren
efe
10.Brug en særskilt plade til hver patientprøve for at forhindre
enhver krydskontamination af Pneumocystis carinii-organismerne. Det anbefales også, at hver plade vaskes særskilt.
ce
11.Pladerne skal forberede ved hjælp af acetonefiksering. Formalinfikserede plader eller ethanolfikserede plader anbefales
ikke til denne test.
eO
Us
REAGENSERS HOLDBARHED OG OPBEVARING
Undgå at bruge sættet eller nogen komponenter efter udløbsdatoen. Opbevar farvningsreagensen på et mørkt sted ved
2-8°C.
nly
Opbevar reagenser ved 2-8°C. Pladerne skal gemmes ved
2-28°C. Hvis de åbne eller ikke-åbne reagenser opbevares ved
de angivne temperaturer, er de holdbare inden for den påtrykte
periode.
PROCEDURE FOR PNEUMOCYSTIS CARINII-TEST
Prøvetagning
Kliniske prøver skal være friske og tages ved hjælp af standardmetoder til indsamling af induceret spyt eller udførelse af bronchial vask eller bronchoalveolær udskylning.16,17 Prøven skal
behandles straks. Gem en del af prøven til dyrkning af kultur,
hvis der er behov for det.
90
Forberedelse af Kliniske Prøver før FluorescenSfarvning
Prøver med induceret spyt
1a.Placer 2 – 3 ml spyt i et 15 ml centrifugerør. Tilsæt en tilsvarende mængde dithiothreitolreagens. Bland prøven i røret
med en Vortex-mixer, og inkuber den i 5 – 10 minutter ved
37°C eller 15 minutter ved stuetemperatur (ST = 15 – 30°C).
– ELLER –
efe
rR
Fo
1b.Hvis prøven er for tyktflydende til at kunne overføres til et
centrifugerør uden besvær, skal du estimere og tilsætte en
tilsvarende mængde dithiothreitolreagens direkte til indsamlingskarret, ryste kraftigt for at blande og inkubere i 5-10
minutter ved 37°C eller 15 minutter ved stuetemperatur (ST =
15 – 30°C). Overfør til et centrifugerør så hurtigt som muligt
under inkubationen, og bland i en Vortex-mixer, før du
fortsætter.
ren
2. Tilsæt en mængde på ca. 5 – 6 ml PBS med en pH på 7,2,
svarende til surhedsgraden for spyt og DTT tilsammen, til
røret. Bland prøven grundigt i Vortex-mixeren.
ce
3. Centrifuger ved 1500 x G i 5 minutter.
eO
Us
4. Dekanter eller luft supernatanten omhyggeligt, indtil der er
maksimalt 0,5 ml koncentrat og supernatant i røret. Trin 2, 3
og 4 skal om nødvendigt gentages for at fjerne alle spor af
slim.
nly
5. Genopslæm koncentratet grundigt. Brug en pipette til at
tilsætte en dråbe (ca. 25 – 50 µl) på en af de mikroskopplader, der følger med sættet. Spred dråben jævnt ud over
brønden med siden af pipettespidsen uden at at ridse
pladen. Lad pladen lufttørre. En pladeopvarmer ved 37°C
kan bruges til at fremskynde tørringen af prøven.
6. Fikser i ca. 10 minutter i acetone. Pladerne kan behandles
straks eller fryses ned ved -20°C i op til en måned, før
farvningen udføres.
91
Prøver fra bronchial vask og bronchoalveolære
udskylninger
Ikke-mucoide prøver som f.eks. bronchiale vaske eller bronchoalveolære udskylninger kræver sandsynligvis ikke den mucolytiske procedure. Til disse prøver kan protokollen begynde
med centrifugering, trin 3 ovenfor, i et 15 ml centrifugerør eller
1,5 ml mikrofugerør.
rR
Fo
BEMÆRK! Der kan også anvendes en cytospincentrifuge kan
bruges til at forberede plader fra induceret spyt, bronchial vask
eller BAL-prøver.12 Ved brug af cytospinproceduren skal kontrolprøverne behandles på samme måde. De plader, der er forberedt med en cytospincentrifuge, skal fikseres i ti minutter i
acetone og farves som beskrevet nedenfor i afsnittet Procedure
for fluorescensfarvning.
ce
ren
efe
FORBEREDELSE AF KONTROLPLADER
Hver gang testen udføres, skal der indgå en positiv kontrolplade. Prøver fra bronchial vask og bronchoalveolær udskylning
er de mest egnede som positive kontrolprøver. Udvælg de
prøver, som tidligere er blevet konstateret positive for Pneumocystis carinii ved histologisk farvning. Følg de procedurer,
der er skitseret i afsnittet Forberedelse af kliniske prøver før fluorescensfarvníng. Efter acetonefikseringen kan du nedfryse
pladerne ved -20°C i op til en måned. Du kan også bruge en
konstateret positiv prøve som positiv kontrolprøve. Testen kan
kun betragtes som gyldig, hvis kontrolplader opnår den rette
farvning og kan fortolkes som beskrevet i afsnittet Evaluering af
testresultater.
eO
Us
PROCEDURE FOR FLUORESCENSFARVNING
nly
1. Hvis pladerne har været nedfrosset, skal du lade dem få stuetemperatur, før farvningsproceduren fortsættes.
2. Placer pladen i et fugtigt kammer.
3. Tilsæt en tilstrækkelig mængde farvningsreagens for Pneumocystis carinii til hver brønd med prøvemateriale (2-3
dråber), så reagensen dækker prøven, men forbliver inden
for kanten af brønden.
4. Inkuber i 30 – 35 minutter ved 37±1°C. Undgå, at farvningsreagensen for Pneumocystis carinii tørrer på pladen under
proceduren.
92
5. Fjern overskydende farvningsreagens for Pneumocystis carinii ved at tømme pladen over på en ren papirserviet eller ved
opsugning.
6. Vask pladen ved at placere den i et stativ og nedsænke den i
deioniseret vand eller almindeligt vand fra hanen i et minut
under forsigtig omrystning med jævne mellemrum. Fjern
overskydende vand ved at tømme pladen på en ren
papirserviet eller ved opsugning.
7. Tør pladen grundigt ved lufttørring eller med en pladeopvarmer ved 37±1°C.
Fo
8. Tilsæt 1 – 2 dråber monteringsmedium til pladen. Anbring en
dækstrimmel over pladen, idet du sørger for, at der ikke
dannes luftbobler.
ren
efe
rR
9. Undersøg pladerne inden for 2 – 3 timers farvning. Efter
aflæsningen kan pladerne opbevares mørkt ved 2 – 8°C eller
i op til seks måneder i mørke ved -20°C eller lavere temperaturer. Plader, der nedfryses, skal nå stuetemperatur, før
aflæsningen udføres. Denne procedure skal forhindre, at
kondensdannelse forvrænger prøvens aflæsning.
ce
10.Et negativt resultat betragtes som gyldigt, hvis du kan
bekræfte prøvematerialets forekomst på pladen ved hjælp af
lysmikroskopi.
nly
eO
Us
UNDERSØGELSE AF FARVEDE PLADER
Scan hver brønd ved en forstørrelse på 200X eller mere. Hvis
der observeres fluorescens, skal du bruge en forstørrelse på
400X eller 630X (med immersionsolie) til at bekræfte de karakteristiske farvningsmønstre, der er beskrevet i afsnittet Evaluering af testresultater. Kontroller, at der findes prøvemateriale på
hver enkelt plade, når analysen er fuldført.
EVALUERING AF TESTRESULTATER
1. Prøver, der er inficeret med Pneumocystis carinii, indeholder
store runde eller elliptiske cyster, der kan være placeret både
i klynger eller enkeltvis og har en æblegrøn farve. Der skal
kunne observeres to eller flere veldefinerede, fluorescerende cyster, for at prøven kan betragtes som positiv.
2. Sporozoider trophozoider kan også være farvede. De vises
som små halvmåneformede eller pleomorfiske strukturer. Der
93
kan også forekomme en klar farvning af den amorfe, ekstracellulære matrix. Prøver, der kun indeholder klart farvet,
amorft materiale eller typiske sporozoide og trophozoide
former, kræver en aktiv søgning efter cyster, før der kan
stilles en definitiv diagnose. Hvis der ingen cyster kan
påvises, mistænkes prøven som værende positiv for Pneumocystis carinii, og der skal tages endnu en prøve til test ved
hjælp af farvning.
3. Andre organismer og andet cellemateriale fra prøver fra åndedrætsorganerne skal antage baggrundsfarverne rød, orangerød eller guld.
Fo
4. En prøve betragtes som negativ, hvis der ikke kan påvises
den karakteristiske fluorescens, der er beskrevet ovenfor.
efe
rR
5. Et negativt resultat på en induceret spytprøve, skal
bekræftes på en efterfølgende prøve, der er indsamlet ved
hjælp af bronchial vask eller bronchoalveolær udskylning.
ce
ren
BEGRÆNSNINGER FOR PROCEDUREN
Et negativt resultat udelukker ikke muligheden af en Pneumocystis carinii-infektion hos patienten. Prøvetagningen og
forberedelsen er afgørende dele af testproceduren. Hvis prøven
indsamles på et uegnet tidspunkt i sygdomsforløbet, ved hjælp
af en uegnet metode eller med en forkert håndtering af prøven,
eller hvis anvendelsen af reagenserne er ukorrekt, kan der opstå
fejl i konstateringen af Pneumocystis carinii. Diagnosen skal
stilles i sammenhæng med de kliniske symptomer.
eO
Us
nly
Der må kun køres en enkelt prøve på hver plade.Vær s Vær
omhyggelig med at behandle, fiksere, farve og vaske prøverne
hver for sig for at forhindre eventuel overførsel af Pneumocystis
carinii-organismer fra en plade til en anden.
Overskydende slim i prøver kan forhindre en tilstrækkelig farvning. Et tykt lag spyt kan forhindre en korrekt farvning. Vær
omhyggelig med at påføre en lag, der er så tyndt som muligt.
Uspecifik indkapsling af Pneumocystis carinii-farvningsreagensen kan forekomme, hvis prøven ikke er blevet vasket
korrekt.
Negative resultater må kun betragtes som gyldige, når du har
bekræftet prøven på pladen ved hjælp af lysmikroskopi.
94
Hvis prøven fra den bronchiale vask eller bronchoalveolære
udskylning er negativ, men patienten fortsat viser symptomer
på en luftvejslidelse, skal du tage andre etiologiske stoffer i
betragtning og benytte de tilsvarende diagnostiske procedurer
(herunder kulturer).
rR
Fo
FUNKTIONSEGENSKABER
Tre forskere har deltaget i en klinisk undersøgelse for at evaluere MONOFLUO™ Pneumocystis carinii-immunofluorescenstesten. Der blev indsamlet kliniske prøver fra patienter, der var
mistænkt for at have Pneumocystis carinii-lungebetændelse.
Der blev indsamlet en induceret spytprøve fra hver patient, som
blev testet parallelt med MONOFLUO™ (MF)-testen og ved histologsik farvning (referencemetode). To der blev anvendt to histologiske farvninger: en Wright-Giemsa-farvning [Diff-Quik™
(DQ)] og toluidinblåt O (TBO).
ce
ren
efe
Hvis den inducerede spytprøve viste sig positiv med referencemetoden, blev resultatet betragtet som indikativt for infektion med P. carinii. Hvis resultatet med referencemetoden var
negativt for den inducerede spytprøve, blev der taget en prøve
ved bronchoalveolær udskyldning (BAL), og denne blev testet.
Hvis BAL-testen gav en positivt resultat, var patienten positiv
for P. carinii. Hvis BAL-testen var negativ, blev patienten
betragtet som negativ for P. carinii. Der indgik 100 patienter i alt
i analysen. De opnåede resultater er vist i Tabel 2.
eO
Us
Tabel 2: Resultater af patientprøver
Sted 1&2
DQ
Prøvemateriale
nly
Patienter, der er positive for P.carinii
• ved induceret spyt
• ved BA
62
53
9
Sted 3
MF
TBO
MF
63
53
10
14
8
6
14
14
6**
**Disse seks var positive for en induceret spytprøve med MONOFLUO™-testen og
positive for BAL-prøven. Der blev indsamlet BAL-prøver fra seks patienter, eftersom TBOresultaterne for spytprøver viste sig negative.
I tabel 3 præsenteres antallet af patienter, der blev klassificeret
som positive og negative med MONOFLUO™ Pneumocystis
carinii Immunofluorescence Test Kit til sammenligning med referencetesten.
95
Tabel 3: Sammenligning af resultater, der er opnået ved hjælp af
histologisk farvning, og resultater ved hjælp af MONOFLUO™immunfluorescenstesten (inkluderer både spyt- og BAL-prøver)
Histologisk farvning
Monofluo™
+
–
+
76
1
–
0
23
efe
rR
Fo
Ud af de 100 testede patienter, viste 76 sig positive for P. carinii
og 24 negative for P. carinii ifølge den histologiske farvningsmetode. MONOFLUO™-testen identificerede alle 76 positive
patienter korrekt og gav negative resultater for P.carinii for 23
patienter. En enkelt induceret spytprøve viste sig negativ med
både MONOFLUO™-testen og referencetesten, men BALprøven fra denne patient var negativ ifølge referencetesten og
positiv ifølge MONOFLUO™-testen.
ce
ren
Med udgangspunkt i de kliniske data var ydeevnen for MONOFLUO™ Pneumocystis carinii Immunofluorescence Test Kit følgende:
Sensitivitet = 100 %
Specificitet = 95,8 %
Us
Bakterier
Bacteroides spp.
Eggerthella lenta
Escherichia coli
nly
eO
KRYDSREAKTIVITET
Følgende bakterielle og fungale kulturer fra kulturisolater og fra
prøver blev testet for krydsreaktivitet ved hjælp af MONOFLUO™ Pneumocystis carinii Immunofluorescence Test Kit og
blev ikke fundet krydsreaktive:
Neisseria spp.
Nocardia asteroides
Pepto streptococcus
Proteus mirabilis
Pseudomonas spp.
Rothia dentocariosa
96
Staphylococcus spp.
Streptococcus spp.
Streptococcus, Gruppe A,B,C,F,G
Treponema denticola
Veillonella parvula
Svamp
Aspergillus niger
Aspergillus flavus
Aspergillus terreus
Candida albicans
Candida krusei
Candida tropicalis
Torulopsis glabrata
Trichosporon spp.
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efe
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Fo
Bakterier
Haemophilus spp.
Micrococcus luteus
Moraxella lacunata
nly
eO
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97
MONOFLUO™
Pneumocystis carinii IFA testkit 32515
Immunofluorescerande antikroppstestkit för detektion
och identifiering av Pneumocystis carinii i
luftvägsprover.
efe
rR
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ANVÄNDNINGSOMRÅDE
MONOFLUO™ Pneumocystis carinii IFA testkit ska användas
för detektion av Pneumocystis carinii-cystor och -trofozoiter i
prover från luftvägarna.
ce
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ÖVERSIKT
Pneumocystis carinii är en encellig, eukaryot organism som
finns i lungorna hos många däggdjur, inklusive människan.
Organismen sprids genom luften och orsakar vanligtvis asymptomatisk infektion. Exponering under barndomen kan ge milda
eller subkliniska fall där organismen ligger latent ända upp i
vuxen ålder. Hos personer med nedsatt immunförsvar blir
organismen opportunistisk och orsakar diffus, interstitiell pneumoni.1,2
eO
Us
nly
Individer som riskerar att få Pneumocystis carinii inkluderar prematura barn, personer med immundefekter (som AIDS), och de
som får immunsuppressiv medicin, t.ex. kortikosteroider. Pneumocystis carinii är det vanligaste opportunistiska smittämnet
hos AIDS-patienter, av vilka nästan 80 % har infektionen.3,4,5,6
Morfologiska studier av organismen har påvisat tre former i livscykeln för Pneumocystis carinii: cystor, sporozoiter och trofozoiter. De tjockväggiga cystorna (4-7 µm i diameter) innehåller
vanligtvis åtta komma-formade sporozoiter, som sedan mognar
till större,pleomorfa trofozoiter (2-8 µm i diameter) innan de
kapslas in och upprepar cykeln.1,6 Cystorna, med sina distinkt
morfologiska egenskaper, associeras vanligtvis med förekomsten av Pneumocystis carinii.
98
Snabb klinisk diagnos av Pneumocystis carinii är livsviktig eftersom organismerna snabbt infiltrerar lungvävnaden och orsakar
dyspné, feber och hosta.7 Tidig upptäckt kan påskynda relevant
behandling och öka chansen för patientens överlevnad.8,9
Fo
Diagnos görs numera med radiologisk teknik och identifiering
av Pneumocystis carinii-cystor och trofozoiter utföres med histologisk färgning av luftvägsprover. Vanliga färgningsmetoder
(toluidinblått O, Gomori’s metenamin silvernitrat eller Giemsa)
avslöjar cystväggar och/eller trofozoiter/sporozoiter.6,10 Då
dessa färgningar är ospecifika, kan det vara svårt att göra en
riktig identifiering av organismen. En mer invasiv teknik för
provinsamling, såsom bronkoalveolär lavage krävs ofta för att
säkra förekomsten av Pneumocystis carinii.11
ce
ren
efe
rR
Användning av ett direkt, fluorescens-antikroppsförfarande
med inducerat sputumprov, bronksköljvätska eller bronkoalveolära lavageprover erbjuder en enkel, mycket specifik metod för
detektion av Pneumocystis carinii.12,13,14,15 De monoklonala antikropparna i MONOFLUO™ Pneumocystis carinii immunofluorescens-testkit är kemiskt kopplade till fluorescein-isotiocyanat
(FITC). Detta ger ett mycket specifikt, direkt, immunofluorescerande reagens med en låg nivå av bakgrundsfluorescens.
Förutom att binda till Pneumocystis carinii-cystor, binds de
monoklonala antikropparna också specifikt till Pneumocystis
carinii trofozoiter, sporozoiter och extracellulära matrix. Testkitet
används för snabb identifiering av Pneumocystis carinii-cystor
och -trofozoiter direkt i patientprover.
eO
Us
nly
TESTPRINCIP
MONOFLUO™ Pneumocystis carinii färgningsreagens innehåller murin monoklonal antikropp märkt med fluorescein-isotiocyanat (FITC). Antikroppen reagerar med alla former av
Pneumocystis carinii (cystor, sporozoiter och trofozoiter) och
även med extracellulär matrix som finns i infekterade prover.
Objektglas bereds för mikroskopi från kliniska prover enligt
beskrivningen i avsnittet: Beredning av kliniska prover före fluorescensfärgning. Efter fixering färgas objektglasen med färgningsreagens för MONOFLUO™ Pneumocystis carinii.
Färgningsreagensen binds till varje Pneumocystis carinii-organism som finns i provet. Efterföljande sköljning tar bort obundet
reagens. Objektglasen monteras sedan med MONOFLUO™99
monteringsmedium som bifogas i kitet. Monteringsmediet innehåller en ”anti quencher” - som förlänger den tid under vilken
objektglasen kan undersökas innan fluorescensen mattas av.
Vid betraktande i fluorescensmikroskop lyser infekterade prover
ljust äppelgröna. Färgade cystor ses som stora, runda till ovala
strukturer som förekommer både enskilt och i kluster. Sporozoiter och trofozoiter kan också färgas, och syns som relativt små,
halvmåneformade eller pleomorfa strukturer. Dessutom bör
också den amorfa, extracellulära matrixen lysa starkt. Andra
organismer och cellulärt material från luftvägsprover är motfärgade i rött till orange-rött eller guldgult utan den karaktäristiska
fluorescensen hos Pneumocystis carinii-cystor.
Fo
PRODUKTBESKRIVNING
Innehåll
Beredning
Blanda försiktigt före
bruk
• FITC-märkta
monoklonala
antikroppar (murina)
• Motfärgning (Evans
Blue)
• Natriumazid**
• Proteinstabiliserad
buffert
R2 •
• Buffrad glycerol
Monteringsmedium
• Formaldehyd***
1 droppflaska (3,5 mL) • Anti-quencher
R3 • Objektglas för
• Objektglas för
fluorescens24 (två brunnar vardera) mikroskopi
ce
ren
R1 • Pneumocystis
carinii
färgningsreagens*
1 droppflaska
(2,2 mL)
efe
Komponent
rR
Tabell 1: Ingående material
Förvara reagens vid 2-8 °C. Objektglas bör förvaras vid 2-28 °C.
eO
Us
Klar att användas
nly
Torka med luddfri
servett före
användning.
*Tillräcklig volym för färgning av 24 individuella testbrunnar. **0,001 % natriumazid.
***< 0,04 % formaldehyd.
NÖDVÄNDIG MEN EJ BIFOGAD MATERIAL.
• Aceton, reagenskvalitet, (förvara i en tättförsluten behållare för att undvika vattenabsorbtion).
• Avjoniserat vatten eller kranvatten
• Färgningsskålar med ställ för objektglas .
• Fuktkammare (t.ex. en täckt petriskål som innehåller en
fuktad pappershandduk).
100
• Täckglas, 24 x 40 mm, nr 1.
• Pasteur-pipetter.
• Centrifug eller mikrofug.
• 15 mL centrifugrör eller 1,5 ml mikrofugrör.
• 37±1 °C inkubator.
• Biologiskt säkerhetsskåp (rekommenderas).
• Immersionsolja av fluorescens-kvalitet, vid behov.
ren
efe
rR
Fo
• Fluorescensmikroskop med 200-250X och 400-630X förstoring, utrustad med filtersystem för fluorescein-isotiocyanat (FITC). En stor uppsättning filter för avläsning av
FITC kan köpas från olika tillverkare. Excitationsvåglängder för bredband (420-490 nm) eller smalband
(470-490 nm) med en 515 nm dikromatisk spegel och ett
515 nm barriärfilter rekommenderas. Den smalbandiga
excitationsvåglängden minskar bakgrundsfluorescens.
Variationer i wattstyrka, intensitet och vinkling av glödlampan samt skillnader i belysningstyp och filter kan påverka
testets tillförlitlighet.
ce
• Kontrollobjektglas som innehåller Pneumocystis cariniiorganismer (se avsnittet Beredning av kontrollobjektglas).
• Pappershanddukar eller aspirationssystem.
Us
eO
För inducerade sputumprover
• Ditiotreitol (DTT): Vätskeberedning 0,1 %
• Fosfatbuffrad saltlösning (PBS)
101
nly
• (6,5x10-3 mol/L). Exempelvis Stat-Pak™ Sputolysin från
Caldon Biotech; använd enligt bruksanvisning.
FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER
Endast för in vitro-diagnostisk användning.
Endast för professionellt bruk.
1. Detta test ska bara utföras av personal som har adekvat
utbildning i hantering av prover som kan innehålla HIV-1.
Objektglasen bör undersökas av personal som har erfarenhet
av att avläsa immunofluorescensanalyser.
2. Hantera alla kliniska prover som potentiellt smittsamt material.
Fo
3. Handhavande som genererar aerosoler bör utföras i ett biologiskt säkerhetsskåp. Allt material bör desinficeras efter
användning eller innan det kastas.
efe
rR
4. Använd god laboratorieteknik vid hantering av prover eller
reagens för MONOFLUO™ Pneumocystis carinii immunofluorescenstestkit. Det är ej tillåtet att äta, dricka eller röka i laboratoriet! Munpipettera ej! Undvik kontamination av reagens.
ce
ren
5. Färgningsreagensen innehåller Evans Blue, som kan ge irritationer. Undvik att spilla eller stänka färgningsreagens på
hud eller kläder. Spola rikligt med vatten på alla områden
som kan ha kommit i kontakt med färgningsreagens.
nly
eO
Us
6. Monteringsmediet omfattar 2 % formalin som innehåller
0,8 % formaldehyd, som kan förväntas vara cancerframkallande. Men befintliga data visar inte helt säkert att formaldehyd orsakar cancer vid de koncentrationer som används i
detta kit (<1,00 %). Undvik att spilla eller stänka monteringsmedium på hud eller kläder. Spola rikligt med vatten på alla
områden som kan ha kommit i kontakt med monteringsmedium.
R: 40-43: Kan ge känslighetsreaktion vid inandning och hudkontakt. Kan ge irreversibla effekter.
S: 24/25-28-36/37/39: Undvik kontakt med huden och
ögonen. Vid kontakt med huden, tvätta genast med mycket
vatten. Använd skyddskläder, handskar och ögon-/
ansiktsskydd.
7. Färgningsreagens innehåller natriumazid. Natriumazid kan
reagera med bly- och kopparrör och bilda högexplosiva met-
102
allazider. För att undvika att azid lagrar sig bör rören spolas
länge med vatten om reagenser hälls ut i avloppet.
Xn: Hälsovådligt
0,1 % NaN3
R: 21/22
Farligt vid hudkontakt och förtäring.
S: 24/25-28-36/37/39
Undvik kontakt med huden och ögonen. Vid kontakt
med huden tvätta genast med mycket vatten. Använd
lämpliga skyddskläder, skyddshandskar samt skyddsglasögon eller ansiktsskydd.
8. Rengör alla återanvändbara saker noggrant.
Fo
9. Blanda färgningsreagens försiktigt före varje test.
rR
10.Använd ett separat objektglas för varje patientprov för att
förhindra eventuell korskontamination av Pneumocystis carinii-organismer. Varje objektglas bör också tvättas separat.
ren
efe
11.Objektglas bör beredas med hjälp av acetonfixering. Formalin- eller etanolfixerade objektglas rekommenderas inte för
detta test.
ce
REAGENSSTABILITET OCH FÖRVARING
Använd inte testet eller någon av dess komponenter efter sista
förbrukningsdatum. Förvara färgningsreagens mörkt vid 2-8 °C.
eO
Us
Förvara reagens vid 2-8 °C. Objektglas bör förvaras vid
2-28 °C. Om de förvaras vid angivna temperaturer är både öppnade och oöppnade reagenser stabila till angiven förbrukningstid.
TESTFÖRFARANDE FÖR PNEUMOCYSTIS CARINII
nly
Provtagning
Kliniska prover bör insamlas färska med hjälp av standardmetoder för inducerat sputum, bronksköljvätska eller bronkoalveolärt lavage.16,17 Provet bör bearbetas omedelbart. Spara en del
av provet för eventuell odling.
103
Beredning av Kliniska Prover före Fluorescensfärgning
Inducerade sputumprover
1a.Sätt 2-3 ml sputum i ett 15 ml centrifugrör. Tillsätt lika stor
volym ditiotreitolreagens. Vortexblanda röret och inkubera i
5-10 minuter vid 37 °C eller 15 minuter i rumstemperatur
(15-30°C).
-ELLER-
efe
rR
Fo
1b.Om provet är för trögflytande för att enkelt kunna överföras
till ett centrifugrör, tillsätt en lika stor volym ditiotreitolreagens direkt i insamlingskärlet, rör ordentligt så att det
blandas och inkubera i 5-10 minuter vid 37 °C eller 15
minuter i rumstemperatur (15-30 °C). Överför till ett centrifugrör så snart som möjligt under inkubation och vortexblanda innan du fortsätter.
ren
2. Tillsätt cirka 5-6 mL PBS pH 7,2, samma som för sputum
plus DTT tillsammans, till röret och vortexblanda.
3. Centrifugera vid 1500 x G i fem minuter.
ce
4. Dekantera eller aspirera supernatanten och lämna 0,5 mL
eller mindre av pellet och supernatant i röret. Steg 2, 3 och 4
kan vid behov upprepas för att avlägsna alla spår av slem.
Us
nly
eO
5. Resuspendera pelleten ordentligt. Tillsätt en droppe med
pipett (cirka 25-50 µL) på ett mikroskopobjektglas som medföljer testet. Fördela droppen jämnt över brunnen med sidan
av pipettspetsen. Se till att inte repa objektglaset. Lufttorka.
En objektglasvärmare med en temperatur på 37 °C kan
hjälpa till att torka provet.
6. Fixera i cirka 10 minuter i aceton. Objektglas kan bearbetas
direkt eller frysas vid –20 °C i upp till en månad före färgning.
Bronksköljvätska och bronkoalveolära lavage-prover
Ej mukösa prover såsom bronksköljvätska eller bronkoalveolära
lavager kräver sannolikt inte mukolytiskt förfarande. För dessa
prover kan protokollet starta med centrifugering, steg 3 ovan, i
ett 15 ml centrifugrör eller 1,5 ml mikrofugrör.
104
OBS: Alternativt kan cytospincentrifugering användas för
beredning av objektglas med prover från inducerat sputum,
bronksköljvätska eller BAL.12 När cytospinförfarande följs bör
kontroller utföras på samma sätt. Objektglas beredda med
cytospincentrifug fixeras i 10 minuter i aceton och färgas enligt
beskrivning nedan i avsnittet Fluorescensfärgningsförfarande.
efe
rR
Fo
BEREDNING AV KONTROLLOBJEKTGLAS
Ett positivt kontrollobjektglas bör ingå vid varje testtillfälle.
Bronkialsköljvätska eller bronkoalveolära lavageprover är bäst
lämpade som positiv kontroll. Valda prover bör först konfirmeras som positiva för Pneumocystis carinii genom histologisk
färgning. Följ förfarandet som anges i avsnittet Beredning av
kliniska prover före fluorescensfärgning. Efter acetonfixering
kan objektglasen frysas vid –20 °C i upp till en månad. Alternativt kan ett känt positivt prov användas som positiv kontroll. För
att testet ska ha validitet måste kontrollobjektglaset färgas korrekt och tolkas enligt beskrivning i avsnittet; Utvärdering av
testresultat.
ren
FLUORESCENSFÄRGNINGSFÖRFARANDE
ce
1. Om objektglasen varit frysta ska de anta rumstemperatur
innan färgningsförfarandet fortsätts.
Us
2. Placera objektglaset i en fuktkammare.
eO
3. Tillsätt tillräckligt med Pneumocystis carinii färgningsreagens
i varje brunn innehållande prov (2-3 droppar) så att det täcker
provet men ligger innanför kanten på brunnen.
nly
4. Inkubera i 30-35 minuter vid 37±1°C. Låt inte färgningsreagensen torka på objektglaset under förfarandet.
5. Ta bort överflödigt Pneumocystis carinii färgningsreagens
genom att tömma objektglaset mot en ren pappershandduk
eller genom aspiration.
6. Tvätta objektglaset genom att sätta det i ett ställ och skölja
det med avjoniserat vatten eller kranvatten i en minut samtidigt som du rör det försiktigt. Ta bort överflödigt vatten
genom att tömma objektglaset mot en ren pappershandduk
eller genom aspiration.
7. Torka objektglaset noga genom lufttorkning eller med en
objektglasvärmare vid 37±1 °C.
105
8. Tillsätt en eller två droppar monteringsmedium på objektglaset och sätt på ett täckglas. Var försiktig så att inte luftbubblor bildas.
9. Undersök objektglasen inom 2-3 timmar efter färgning. Efter
avläsning kan objektglasen förvaras mörkt över natten vid 28 °C eller mörkt i upp till sex månader vid –20 °C eller lägre.
Objektglas som förvarats i kyla måste anta rumstemperatur
före avläsning för att förhindra att kondensation skymmer
provet.
10.För att negativa resultat ska ha validitet, kontrollera i ljusmikroskop att provceller finns på objektglaset.
efe
rR
Fo
UNDERSÖKNING AV FÄRGADE OBJEKTGLAS
Skanna varje brunn med 200X eller större förstoring. Om fluorescens noteras, använd 400X eller 630X (med immersionsolja)
för att bekräfta färgmönstrens utseende enligt beskrivning i avsnittet; Utvärdering av testresultat. Konfirmera att provceller
finns på varje objektglas efter fluorescensanalysen.
ren
UTVÄRDERING AV TESTRESULTAT
ce
1. Prover som är infekterade med Pneumocystis carinii innehåller stora runda till ovala cystor, som finns både enskilt och
i kluster, som färgas ljust äppelgröna. Två eller flera väldefinierade fluorescerande cystor måste observeras för
att provet ska anses positivt.
Us
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2. Sporozoiter och trofozoiter kan också vara färgade. De uppträder som små halvmåneformade eller pleomorfa strukturer.
Ljust färgad, amorf extracellulär matrix kan även finnas.
Prover som endast innehåller ljust färgat amorft material eller
typiska sporozoit- eller trofozoitformer bör leda till att man
direkt letar efter cystor innan en definitiv diagnos kan fastställas. Vid frånvaro av cystor bör provet anses misstänkt
positivt för Pneumocystis carinii och ännu ett prov bör tas för
färgning.
3. Andra organismer och cellulärt material från luftvägsprover
bör vara motfärgat i rött till orange-rött eller guldgult.
4. Ett prov anses negativt om fluorescensegenskaperna enligt
beskrivningen ovan ej observeras.
106
5. Ett negativt resultat på inducerat sputum bör verifieras med
ett uppföljningsprov från bronksköljvätska eller bronkoalveolärt lavage.
TESTETS BEGRÄNSNINGAR
Ett negativt resultat utesluter inte möjligheten för en Pneumocystis carinii-infektion hos patienten. Provinsamling och beredning är
viktiga steg i testförfarandet. Insamling av prov vid en olämplig
tidpunkt under sjukdomens förlopp, med en olämplig metod eller
med olämplig hantering av provet, eller fel användning av
reagenser kan göra att detektion Pneumocystis carinii uteblir.
Diagnos bör fastställas tillsammans med kliniska symptom.
rR
Fo
Kör endast ett prov per objektglas. Var noga med att behandla,
fixera, färga och tvätta varje prov separat för att förhindra att
organismer från Pneumocystis carinii sköljs över till andra
objektglas.
ren
efe
För mycket slem i prover kan hindra adekvat färgning. Vissa
tjocka sputumutstryk kanske inte färgas ordentligt. Var noga
med att göra utstryk så tunna som möjligt. Icke-specifik ansamling av Pneumocystis carinii färgningsreagens kan ske om inte
provet tvättas ordentligt.
ce
För att negativa resultat ska ha validitet, kontrollera i ljusmikroskop att provmaterial finns på objektglaset.
eO
Us
Om bronksköljvätska eller bronkoalveolärt lavageprov är negativt, men patienten fortsatt uppvisar symptom associerade med
luftvägssjukdom, bör andra etiologiska agens misstänkas och
lämpliga diagnosförfaranden (inklusive odling) genomföras.
nly
PRODUKTEGENSKAPER
Tre laboratorier deltog i en klinisk studie för att utvärdera
MONOFLUO™ Pneumocystis carinii immunofluorescens test.
Kliniska prover insamlades från patienter som misstänktes ha
en Pneumocystis carinii-pneumoni. Ett inducerat sputumprov
togs från varje patient och testades parallellt med MONOFLUO™ (MF) och histologisk färgning (referensmetod). Två histologiska färgningar användes; Wright-Giemsa-färgning [DiffQuik™ (DQ)] och toluidinblå O (TBO).
Om sputumprovet var positivt med referensmetoden, betraktades resultatet indikera en infektion med P. carinii. Om resultatet
med referensmetoden var negativt på sputumprov, insamlades
107
och testades ett bronkoalveolärt lavage-prov (BAL). Om BAL
var positivt, var patienten positiv för P. carinii. Om BAL var negativt, ansågs patienten negativ för P. carinii. Totalt 100 patienter
ingick i analysen. De erhållna resultaten sammanfattas i tabell 2.
Tabell 2: Patientresultat
Plats 1&2
Plats 3
Prov
DQ
MF
TBO
MF
Patienter positiva för P.carinii
med inducerat sputumprov
med BAL
62
53
9
63
53
10
14
8
6
14
14
6**
Fo
**Dessa sex var positiva med MONOFLUO™-test på både sputumprov och BAL. BAL
insamlades på sex patienter då TBO-resultatet på sputum var negativt.
efe
rR
Antalet patienter klassade som positiva resp. negativa med
MONOFLUO™ Pneumocystis carinii immunofluorescens test i
jämförelse med referenstest visas i Tabell 3.
ren
Tabell 3: Jämförelse av resultat från histologisk färgning respektive
MONOFLUO™ immunofluorescens test (inkluderar både inducerat
sputum och BAL)
Histologisk färgning
76
–
0
-
1
Us
+
ce
+
Monofluo™
23
eO
nly
Av 100 testade patienter, var 76 positiva för P. carinii och 24 var
negativa för P. carinii enligt bestämning med histologisk färgning.
MONOFLUO™-testet identifierade alla 76 positiva patienter korrekt och var negativt på 23 patienter som var negativa för
P. carinii. Ett inducerat sputumprov var negativt med både
MONOFLUO™-test och referenstestet. BAL från denna patient
var negativ med referenstestet och positiv med MONOFLUO™testet.
Baserat på dessa kliniska data var produktegenskaperna för
MONOFLUO™ Pneumocystis carinii immunofluorescens test:
Känslighet = 100 %
Specificitet = 95,8 %
108
KORSREAKTIVITET
Följande bakterie- och svamp-species från odlingsisolat och
från prover testades för korsreaktivitet med MONOFLUO™
Pneumocystis carinii immunofluorescens test och befanns vara
icke-reaktiva:
ce
Candida tropicalis
Torulopsis glabrata
Trichosporon spp.
nly
eO
Us
Svamp
Aspergillus niger
Aspergillus flavus
Aspergillus terreus
Candida albicans
Candida krusei
Neisseria spp.
Nocardia asteroides
Pepto streptococcus
Proteus mirabilis
Pseudomonas spp.
Rothia dentocariosa
Staphylococcus spp.
Staphylococcus spp.
Streptococcus, Grupp A,B,C,F,G
Treponema denticola
Veillonella parvula
ren
efe
rR
Fo
Bakterier
Bacteroides spp.
Eggerthella lenta
Escherichia coli
Haemophilus spp.
Klebsiella pneumonia
Micrococcus luteus
Moraxella lacunata
109
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Bio-Rad
Laboratories
ce
ren
efe
rR
Fo
Website: www.bio-rad.com
Bio-Rad Laboratories Main Office:
4000 Alfred Nobel Drive, Hercules, California 94547
Ph. (510) 724-7000, Fx. (510) 741-5824
Also in:
Australia - Regents Park, Ph. 61-2-9914-2800,
Fx. 61-2-9914-2888
Austria - Vienna, Ph. 43-1-877-8901, Fx. 43-1-876-5629
Belgium - Nazareth, Ph. 32-9-385-5511, Fx. 32-9-385-6554
Canada - Montreal, Ph.1-514-334-4372,Fx. 1-514-334-4415
China - Beijing, Ph. 86-10-6205-1850, Fx. 86-10-6205-1876
Denmark - Copenhagen, Ph. 45-39-17-99-47,
Fx. 45-39-27-16-98
Finland - Espoo, Ph. 358-9-804-22-00, Fx. 358-9-804-11-10
France - Marnes-la-Coquette , Ph. 33-1-4795-6000
Fx. 33-1-4741-9133
Germany - Munich, Ph. 49-89-318840, Fx. 49-89-318-84100
Hong Kong - Kowloon, Ph. 852-2789-3300,
Fx. 852-2789-1257
India - New Delhi, Ph. 91-11-460-3676, Fx. 91-11-461-0765
Israel - Rishon Le Zion, Ph. 972-3-9514127,
Fx. 972-3-9514129
Italy - Milan, Ph. 39-02-216091, Fx. 39-02-21609-399
Japan - Tokyo, Ph.81-3-5811-6290, Fx. 81-3-5811-6282
Korea - Seoul, Ph. 82-2-3473-4460, Fx. 82-2-3472-7003
Florida - Miami, Ph. 305-894-5950, Fx. 305-894-5960
Mexico - Mexico D.F., Ph. 525-514-2210, Fx. 525-514-2209
The Netherlands - Veenendaal, Ph. 31-318-540666,
Fx. 31-318-542216
New Zealand - Auckland, Ph. 64-9-415-2280,
Fx. 64-9-415-2284
Russia - Moscow, Ph. 7-501-721-14-00, Fx. 7-095-979-98-56
Singapore, Ph. 65-272-9877, Fx. 65-273-4835
Spain - Madrid, Ph. 34-91-590-5200, Fx. 34-91-590-5211
Sweden - Sundbyberg, Ph. 46-8-627-50-00,
Fx. 46-8-627-54-00
Switzerland - Glattbrugg, Ph. 41-61-717-95-55,
Fx. 41-61-717-95-50
United Kingdom - Hemel Hempstead,Ph. 44-181-328-2000,
Fx. 44-181-328-2550
nly
eO
Us
Revised September 2003
504131

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