Diapositiva 1

II° Congresso Lattiero-Caseario
Torino, 21 settembre 2010
METODOLOGIE ANALITICHE PER LA
TUTELA DEI FORMAGGI A LATTE
CRUDO OVINO.
C. Piga, M. F. Scintu,
G. Sanna, P. Piu, G. Piredda
REGIONE
AUTONOMA
DELLA SARDEGNA
Agenzia regionale
per la ricerca in agricoltura
Università degli Studi di Sassari
Dipartimento di Chimica
1
La Caseificazione del Latte Crudo
Rappresenta una forma di produzione molto antica, tipica
soprattutto di quelle nazioni ove la tradizione lattiero-casearia
ha raggiunto elevati vertici di esperienza ed affidabilità.
Garantisce il mantenimento
della flora casearia autoctona
e di gran parte del corredo
enzimatico nativo del latte
Contribuisce allo sviluppo dei sapori e dei profumi
tipici che assicurano ai prodotti un legame unico con il
territorio che lo ha espresso
2
Il Latte Ovino in Sardegna
Produzione annua di circa 340 mila tonnellate rappresenta*
• Il 57% della produzione Nazionale (560 mila tonn.)*
• Il 3,7% della produzione Mondiale (9.000 mila tonn.)*
Viene interamente trasformato in prodotti lattiero-caseari. Il 70% di questa
produzione è costituita da tre prodotti a Denominazione d’Origine Protetta D.O.P.
Pecorino Sardo
Pecorino Romano
Fiore Sardo
* fonte dati Istat3 2007
Trattamento Termico
Prodotto
Tipo di Latte
Fiore Sardo
Crudo
Pecorino
Romano
Termizzato
Pecorino
Sardo
Crudo, Termizzato,
Pastorizzato
Pecorino Sardo
Pecorino Romano
Fiore Sardo
D.P.R. 54/97 in materia di trattamenti termici
Nasce con lo scopo di
garantire la sicurezza
alimentare attraverso il
trattamento di bonifica
termica
individua degli indici che
attestino l’avvenuto
trattamento di bonifica
termica (pastorizzazione).
NON individua
indici per verificare che il
trattamento termico non
sia stato eseguito
4
Indici Analitici
ENZIMI ENDOGENI
α-L-fucosidasi
[inattivazione 52-62°C]
γ-glutamiltransferasi
Prodotto
Tipo di Latte
Fiore Sardo
Crudo
Pecorino
Romano
Termizzato
Pecorino
Sardo
Crudo, Termizzato,
Pastorizzato
ESIGENZA ANALITICA
indici per verificare che il
trattamento termico non
sia stato eseguito
[inattivazione 65-75°C ]
Zehetner [1996], Blel [2002]
5
Indici Analitici
 Accertarne la presenza di entrambi gli enzimi nel latte ovino
 Mettere a punto delle metodiche analitiche per la loro determinazione nel latte
e nel formaggio di origine ovina
 Validare le metodiche analitiche
 Verificarne il campo di inattivazione termica
 Studiarne la variabilità di attività enzimatica in rapporto ai parametri zootecnici
ENZIMI ENDOGENI
α-L-fucosidasi
[inattivazione 52-62°C]
γ-glutamiltransferasi
[inattivazione 65-75°C ]
6
Determinazione Analitica
α-L-fucosidasi
[inattivazione 52-62°C]
γ-glutamiltransferasi
[inattivazione 65-75°C ]
Andrews, A.T., Anderson, M., Goodenough, P.W., (1987). A study of the heat stabilities of a number of indigenous milk enzymes. Journal of Dairy Research, 54, 237-246.
7
Baumrucker, R.C., (1979). γ-Glutamyl Transpeptidase of Bovine Milk Membranes: Distribution and Characterization. Journal of Dairy Science, 62, 253-258.
Metodica Spettrofotometrica
Il metodo spettrofotometrico utilizzato per la determinazione della γglutamiltransferasi nel latte vaccino1) non è risultato applicabile al latte
ovino
Il processo di chiarificazione del latte, indispensabile per una corretta
lettura spettrofotometrica, risultava essere incompleto
Clarifying Reagent®
A (U.A.)
Matrice
340 nm
400 nm
Latte vaccino2)
0,1400
0,0900
Latte ovino
0,4139
0,2529
Il bianco reagenti del latte ovino presentava un’opalescenza residua
nettamente superiore al latte vaccino, generando un errore sistematico
nel metodo
1) Blel, M., Guingamp, M.F., Gaillard, J.L., Humbert, G. (2002). Studies on the thermal sensitivy of γ-glutamyltranspeptidase measured with a modified test
procedure and compared with that of alkaline phosphatase and lactoperoxidase in milk. Lait, 82, 555-566.
8 of
2) Humbert, G., Guingamp, M.F., Linden, G., Gaillard, J.L., (2006). The Claifying Reagent, or how to make the analysis of milk and dairy products easier. Journal
Dairy Research, 73, 464-471.
Metodica Spettrofotometrica
Il metodo spettrofotometrico utilizzato per la determinazione della γglutamiltransferasi nel latte vaccino1) non è risultato applicabile al latte
ovino
Il processo di chiarificazione del latte, indispensabile per una corretta
lettura spettrofotometrica, risultava essere incompleto
Clarifying Reagent®
Specie
Solidi totali %
Grasso %
Proteine %
Lattosio %
Ceneri %
Vacca
12,7
3,7
3,4
4,8
0,7
Pecora
19,3
7,4
4,5
4,8
1,0
Opalescenza del latte
1) Blel, M., Guingamp, M.F., Gaillard, J.L., Humbert, G. (2002). Studies on the thermal sensitivy of γ-glutamyltranspeptidase measured with a modified test
procedure and compared with that of alkaline phosphatase and lactoperoxidase in milk. Lait, 82, 555-566.
9 of
2) Humbert, G., Guingamp, M.F., Linden, G., Gaillard, J.L., (2006). The Claifying Reagent, or how to make the analysis of milk and dairy products easier. Journal
Dairy Research, 73, 464-471.
Chiarificazione del latte Ovino
La scrematura del latte non ha avuto alcun effetto positivo
sull’opalescenza residua
Aggiunta di un agente chelante (100 µL EDTANa4 [0,2 M] ) capace di
coordinare il Ca2+ e destabilizzare le sub-micelle caseiniche
Clarifying Reagent®
Matrice
A (U.A.)
340 nm
400 nm
Latte vaccino1)
0,1400
0,0900
Latte ovino
0,4139
0,2529
Latte ovino con EDTA
0,0015
0,0130
Evidente riduzione dell’assorbanza, indice di una perfetta chiarificazione
Pone la tecnica da noi messa a punto su livelli di sensibilità ben superiori a
quella messa a punto per il latte vaccino
10
1) Humbert, G., Guingamp, M.F., Linden, G., Gaillard, J.L., (2006). The Claifying Reagent, or how to make the analysis of milk and dairy products easier. Journal of Dairy
Research, 73, 464-471.
Chiarificazione del latte Ovino
Tale accorgimento permette di ottenere delle
rette di taratura perfettamente sovrapponibili
Ovino
Vaccino
α-L-fucosidasi 1)
0,16
vaccino
γ-glutamiltransferasi 2)
0,45
0,4
0,14
0,35
0,12
Abs a 410 nm
Abs a 410 nm
ovino
0,1
0,08
0,06
0,04
0,3
0,25
0,2
0,15
0,02
0,1
0
0,05
0
0,025
0,05
0,075
0,1
0,125
0,15
0,175
0
0
[p-nitrofenolo] mM
0,025
0,05
0,075
0,1
0,125
0,15
0,175
[p-nitroanilina] mM
Latte
Equazione della retta
r2
Latte
Equazione della retta
r2
Vaccino
y = (0,971 ± 0,027)x – 0,004 ± 0,002
0,997
Vaccino
y = (2,713 ± 0,033)x – 0,003 ± 0,002
0,999
Ovino
y = (0,953 ± 0,007)x – 0,003 ± 0,001
0,999
Ovino
y = (2,724 ± 0,024)x – 0,003 ± 0,002
0,999
Test del t di
Student
tc p-nitroanilina
tc p-nitrofenolo
Coefficienti angolari
0,584
1,333
Intercette
0,515
1,685
tt 0,05/2,4
2,776
1
Piga C., Urgeghe P.P, Piredda G., Scintu M.F., Sanna G., Analytical methods for the evaluation of α-L-fucosidase activity in sheep milk. Food Analytical Methods, 2010, 3, 17-21
2
11
Piga C., Urgeghe P.P, Piredda G., Scintu M.F. Sanna G, Assessment and validation of methods for the determination of γ-glutamyltransferase activity in sheep milk,
Food Chemistry, 2009, 115, 1519-1523
Metodica Cromatografica
Determinazione dell’ α–L-fucosidasi nel latte vaccino mediante tecnica RP-HPLC1)
 maggiore sensibilità
analitica
 maggiore stabilità della
soluzione chiarificata
(15 giorni a 4°C)
 maggiore semplicità
operativa al protocollo
12
1) De Noni, I., (2006). Study on the variabilità of fucosidase activity in bovine milk by means of HPLC. International Dairy Journal, 16, 9-17
Metodica Cromatografica
ON+
O
O
CH3
O
OH
OH
OH
OHO
N+
α-L-fucosidasi 1)
O
Applicata con successo alla
determinazione
nel latte ovino
O
N+
OHO
O
N
H
O
NH2
N+
O
O-
H2N
γ-glutamiltransferasi 2)
1
Piga C., Urgeghe P.P, Piredda G., Scintu M.F., Sanna G., Analytical methods for the evaluation of α-L-fucosidase activity in sheep milk. Food Analytical Methods, 2010, 3, 17-21
2
13
Piga C., Urgeghe P.P, Piredda G., Scintu M.F. Sanna G, Assessment and validation of methods for the determination of γ-glutamyltransferase activity in sheep milk,
Food Chemistry, 2009, 115, 1519-1523
Validazione
α-L-fucosidasi
γ-glutamiltransferasi
ConfrontoRP-HPLC
oggettivo delle
performance
UV-Vis
RP-HPLC
analitiche di entrambe le metodiche
Guida EURACHEM
UV-Vis
Limite di rivelabilità
2,37
1,24
2,84
1,52
OVINO
mU mL-1
3,23 1)
1,5 2)
7,1 3)
n.d.
VACCINO
Limite di quantificazione
7,11
3,72
8,52
4,56
mU mL-1
9,69 1)
4,5 2)
21,3 3).
n.d.
10– 150 µM
5– 150 µM
10– 150 µM
1– 150 µM
80-500 µM1)
0,1 – 150 µM
10– 150 µM
n.d.
Precisione ripetibilità (r)
4,3
4,5
3,5
2,9
C.V.% (n=10)
6,0 1)
6,0 2)
3,0 3)
n.d.
Range dinamico lineare
Accuratezza (bias)
1) McKellar, R.C., Piyasena, P., (2000). International Dairy Journal 10, 1-6.
2) De Noni, I., (2006). International Dairy Journal, 16, 9-17
3) Blel, M., Guingamp, M.F., Gaillard, J.L., Humbert, G. (2002). Lait, 82, 555-566.
14
Validazione
Confrontoconfronto
oggettivo
delle
performance
RP-HPLC
UV-Vis
RP-HPLC
tra le metodiche
analitiche
α-Fuc
analitiche di entrambe le metodiche
Guida EURACHEM
mU
mL-1
Limite di quantificazione
mU
mL-1
Range dinamico lineare
2,37
45
U/mL (spettrofotometro)
Limite di rivelabilità
UV-Vis
1,24
2,84
1,5
7,1
1,52
40
35
3,23
30
2
R
25
20
7,11
3,72
15
q) tsp = 1,3
4,56
tc(0,05/2,9) = 2,262
10
5
9,69
0
0
5
10– 150 µM
10
4,5.
15
20
25
21,3.
30
35
U/mL (HPLC)
5– 150 µM
10– 150 µM
40
50
1– 150 µM
confronto tra le metodiche analitiche
γ-GTP
?????
n.d.
45
0,1 – 150 µM
10– 150 µM
n.d.
4,5
3,5
2,9
6,0
3,0
y=(0,9281±0,052)x-(0,0031±0,0030)
Precisione ripetibilità (r)
C.V.% (n=10)
Accuratezza (bias)
U/mL (spettrofotometro)
0,09
4,3
0,08
0,07
y=mx+q m=1 q=0
m) tsp = 1,43
0,06
6,0
0,05
0,04
y=mx+q m=1 q=0
m) tsp = 0,7
n.d.
= 0,9877
8,52
y=(0,9531±0,065)x-(2,640±1,927)
n.d.
R2 = 0,9787
q) tsp = 1,03
0,03
0,02
0,01
tc(0,05/2,9) = 2,262
0
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
0,1
U/mL (HPLC)
15

Accertata la presenza di entrambi gli enzimi nel
latte ovino
Messe a punto delle metodiche analitiche per la

loro determinazione nel latte
Validate le metodiche analitiche

Verificarne il campo di inattivazione termica
Studiarne la variabilità di attività enzimatica in
rapporto ai parametri zootecnici
Determinarne l’attività enzimatica nel formaggio
16
Inattivazione Termica
°C
80
75
70
Pastorizzato
68
Termizzato
60
57
Crudo
40
15 30 45 60 300 600 900 1200 sec
Lunghezza = 50 mm; Diametro interno = 5 mm; Volume = 1 mL
Tipo di trattamento
I trattamenti termici sono stati eseguiti a 7
temperature comprese tra 40 e 80°C per nove
intervalli di tempo compresi tra 0 e 1200 secondi, su
campioni di latte intero proveniente da pecore di
razza Sarda.
Pastorizzazione
Termizzazione
Crudo
Temperatura/tempo
71,7°C/15 s
57-68°C/15 s
< 40°C
D.P.R. 54/97
17
Inattivazione Termica
α-L-fucosidasi
• range termico d’inattivazione dell’enzima è compreso tra i 57 ed i 70°C.
• a 57°C trattamenti di circa 300 secondi azzerano quasi l’attività residua.
• Oltre i 68°C sono sufficienti solo tempi di qualche decina di secondi per
inattivare completamente l’enzima.
γ-glutamiltransferasi
• rimanga pressoché stabile fino a 60°C per decrescere vistosamente
passando a 75 e 80°C.
• a 70°C la sua attività viene dimezzata per trattamenti di 300 secondi
• a 75°C lo stesso grado di inattivazione è provocata da un trattamento di
35 secondi
18
PARAMETRI
Variabilità dell’attività enzimatica
Stagionali
Alimentari
Campionamento condotto durante le 14 settimane di lattazione tra
febbraio - maggio nelle 2 mungiture giornaliere
Pecore di
dell’azienda
Sardegna
razza Sarda
zootecnica di
(n=36)
AGRIS
Gregge
Carico di pascolamento
Alimentazione
AB
Alto
Biologico
BB
Basso
Biologico
AC
Alto
Convenzionale
BC
Basso
Convenzionale
19
Variabilità dell’attività enzimatica
Risultati ottenuti in seguito all’indagine hanno
permesso di affermare che l’attività enzimatica
per entrambi gli enzimi:

Non è influenzata:
 dal carico
 dal tipo di alimentazione

Nel corso della lattazione è risultata:
 crescente per l’α-L-fucosidasi
 sostanzialmente costante per la γ-glutamiltransferasi
α-L-fucosidasi
γ-glutamiltransferasi
Media (U/ml)
158.99
3.83
Min (U/ml)
207.70
4.89
Max (U/ml)
81.04
3.12
20
Attività enzimatica nel formaggio
La maggiore sensibilità dimostrata dalla metodica RPHPLC ha permesso di determinare l’attività enzimatica
dell’ α-L-fucosidasi e della γ-glutamiltransferasi nel
formaggio ovino
α-L-fucosidasi
γ-glutamiltransferasi
Media (U/gss)
17.44
1.71
Min (U/gss)
10.08
1.23
Max (U/gss)
28.03
2.10
21
Conclusioni
 E’ stata accertata e caratterizzata l’attività enzimatica dell’α-Lfucosidasi e della γ-glutamiltransferasi nel latte ovino
 Sono state messe a punto e validate due metodiche analitiche
indipendenti per la determinazione spettrofotometrica e RPHPLC di entrambi gli enzimi nel latte ovino
 E’ stato verificato che il range di inattivazione termica dell’ αL-fucosidasi
e
della
γ-glutamiltransferasi
coincide
rispettivamente con il trattamento di termizzazione e
pastorizzazione
22
Conclusioni
 L’attività enzimatica non è risultata essere influenzata
dall’alimentazione e dal carico di pascolamento
 L’α-L-fucosidasi presenta un’attività enzimatica fortemente
crescente durante la lattazione
 E’ stata determinata l’attività enzimatica di entrambi gli
enzimi nel formaggio ovino
23
GRAZIE PER L’ATTENZIONE
24