dna barcoding per la tracciabilità genetico

Corso ECM
accreditato per le professioni di:
Biologo, Chimico, Farmacista, Tecnico della prevenzione nell'ambiente e nei luoghi di lavoro, Tecnico
sanitario di laboratorio biomedico, Veterinario
DNA BARCODING PER LA TRACCIABILITÀ
GENETICO-MOLECOLARE DI PRODOTTI AGRO-ALIMENTARI
BREVE PREMESSA
La qualità dei prodotti agro-alimentari al giorno d’oggi è regolata sempre più da normative
comunitarie volte a salvaguardare la salute umana e alla protezione della qualità stessa del prodotto.
Una efficiente tracciabilità agro-alimentare, intesa come corrispondenza fra le specie animali e
vegetali dichiarate come ingredienti del prodotto e le specie realmente utilizzate nel suo processo
produttivo, risulta essere di fondamentale importanza nella lotta alle sempre più frequenti truffe
alimentari.
Il corso si propone di fornire ai partecipanti conoscenze di base riguardo alla tecnica del DNA
barcoding per migliorare l’efficienza della tracciabilità agro-alimentare.
OBIETTIVI FORMATIVI
•
Fornire aggiornamenti sulle linee guida e i protocolli della tracciabilità alimentare;
•
Apprendere nuove tecniche molecolari che possono essere utilizzate come sistema di
identificazione dei prodotti agro-alimentari anche per un operatore “non specializzato”;
•
Sviluppare capacità di base nell’analisi di sequenze di DNA;
•
Sviluppare la capacità di ricerca in banche dati molecolari pubbliche;
METODOLOGIA DIDATTICA
Le lezioni frontali relative alle linee guida e ai protocolli della tracciabilità alimentare e quelle
relative alle metodiche del DNA barcoding saranno integrate da esercitazioni pratiche mirate
all’apprendimento delle tecniche di analisi bio-molecolare.
Il supporto di un laboratorio attrezzato per le analisi genetiche permetterà di sperimentare
direttamente quanto appreso durante le lezioni frontali.
Ad ogni partecipante sarà fornito il materiale a supporto delle lezioni e dell’attività di laboratorio,
tra cui una dispensa, corredata da bibliografia.
DESTINATARI
AZIENDA
CATEGORIA
PROFESSIONALE
Biologo, Chimico,
Farmacista, Tecnico della
prevenzione nell'ambiente e
nei luoghi di lavoro, Tecnico
sanitario di laboratorio
biomedico, Veterinario
TOTALE PARTECIPANTI
NUMERO
PARTECIPANTI
Max 25
Max 25
PROGRAMMA
Ore
Ore
Ore
ORARIO
08:30 – 08:45
08:45 – 09:00
09:00 – 10:15
Ore
Ore
Ore
Ore
Ore
Ore
10:15– 11:30
11:30 – 11:45
11:45 – 12:45
12:45 – 13:00
13:00 – 14:00
14:00 – 16:00
Ore
Ore
16:00 – 16:15
16:15 – 18:15
Ore
18:15 – 18:30
GIORNO 10 MARZO 2012
CONTENUTI
Registrazione dei partecipanti
Presentazione del corso
Introduzione alla tracciabilità
agro-alimentare
Il DNA-barcoding
Coffee break
Applicazioni DNA-barcoding
Confronto dibattito
Pausa pranzo
Esercitazione di laboratorio
genetico
Coffee break
Esercitazione di laboratorio
genetico
Prova finale
DOCENTI/RELATORI
Dott.ssa Enrica Capelli
Dott. Augusto Gentilli
Dott. Maurizio Casiraghi
Dott. Maurizio Casiraghi
Dott.ssa Adriana Bellati
Dott.ssa Adriana Bellati
ABSTRACT DELLE RELAZIONI
INTRODUZIONE ALLA TRACCIABILITÀ AGRO-ALIMENTARE
Augusto Gentilli
Questi ultimi anni hanno visto un fortissimo aumento dell’attenzione dei consumatori nei confronti
della qualità dei prodotti enogastronomici. Questa nuova tendenza ha avuto come conseguenza, più
che positiva, il proliferare di marchi di qualità talvolta riconosciuti in ambito internazionale (DOP,
IGP, DOCG, DOC, IGT, STG) altri a livello nazionale o locale (Presidi Slow Food, De.Co.,
prodotti dei Parchi, ecc); a questi si aggiungono i prodotti biologici o biodinamici certificati da Enti
privati autorizzati.
Un tale aumento di marchi e conseguenti disciplinari di produzione ha, purtroppo, portato talvolta
con sé l’impossibilità di verificare il rispetto delle norme produttive previste dai disciplinari stessi
nonché l’impossibilità da parte del consumatore di essere garantito, non solo sulla salubrità del
prodotto, ma anche sul corretto costo in relazione alle caratteristiche organolettiche e produttive
dello stesso.
Si rende quindi evidente che la messa a punto di tecniche veloci, sicure e standardizzate per
verificare almeno alcuni di tali aspetti sarebbe di grande aiuto e sostegno sia per i consumatori sia
per i produttori che si preoccupano realmente di fornire prodotti di alta qualità. In tal senso
l’approccio più adatto attualmente disponibile sembra essere quello biomolecolare e, in particolare,
la tecnica del DNA – barcoding. Tale tecnica rende possibile, ad esempio, non solo la
determinazione esatta della specie a cui appartengono determinate carni (vacca, zebù, capra, pecora,
tonno, nasello, ecc.) ma anche l’identificazione della razza (ad esempio fassona, chianina,
limousine). È evidente l’importanza di poter riconoscere, ad esempio, una bresaola IGP prodotta
legalmente con carne di zebù da una artigianale derivante da carni di razze bovine autoctone e di
qualità. Inoltre, recenti ricerche stanno mettendo a punto nuove tecniche anche per prodotti lavorati
in cui siano potenzialmente presenti una o più varietà di una determinata materia prima (ad esempio
formaggi di latte misto vaccino e caprino come il bitto DOP oppure vini monovitigno quali il
Brunello di Montalcino DOCG che dovrebbe essere prodotto con il solo Sangiovese grosso ma che
è noto essere talvolta ingentilito mediante l’aggiunta di merlot o di altri vitigni internazionali.).
Considerato l’elevato costo di alcuni di questi prodotti è fondamentale tutelare i diritti sia dei
consumatori sia dei produttori seri che, con sacrifici e fatica, portano avanti onestamente politiche
di qualità.
DNA-BARCODING E APPLICAZIONI
Maurizio Casiraghi
Il DNA barcoding è una tecnica molecolare che ambisce al difficile scopo di identificare le specie
biologiche. Sebbene esistessero già tecniche molecolari per l’identificazione degli organismi
viventi, il canadese Paul H.Hebert propose l’approccio DNA barcoding nel 2003, puntando
sull’analogia tra il codice a barre di un prodotto del supermercato e il DNA contenuto nelle cellule
di un organismo vivente. Ovviamente non esiste un codice a barre nel DNA, ma la serie di basi
azotate che ne costituiscono la catena possono essere lette e interpretate in maniera tale da
discriminare due specie.
Questa tematica è particolarmente attuale nel mondo della biologia, perché i ricercatori cercano
metodi per identificare le specie da almeno 250 anni. Non sorprende quindi che una tecnica che si
propone come la modalità per identificare le specie attiri su di se molto interesse. A partire dal 2003
si sono spese molte parole sul DNA barcoding. La comunità scientifica si è divisa non solo tra
sostenitori e detrattori del metodo, ma una “terza fascia” si è rapidamente diffusa. Si tratta di coloro
che non lavorano direttamente con il DNA barcoding e che hanno un’idea vaga di cosa si tratti.
Questa terza fascia è estremamente eterogenea. È composta da chi, per esempio, si è occupato di
filogenesi e filogeografia e ritiene che il DNA barcoding sia un sottoprodotto di queste discipline.
Oppure vi ritroviamo un buon numero di genetisti che ancora si interrogano stupefatti sul perché sia
necessario cercare uno o pochi marcatori universali per identificare le specie. O ancora
annoveriamo quelli che sono convinti che il DNA barcoding sia magicamente in grado di
identificare nuove specie (che è poi uno dei grandi proclami dei promulgatori della tecnica).
La cosa paradossale è che tutte queste posizioni sono in qualche modo giustificabili, perché esiste
una certa confusione anche tra chi la tecnica la utilizza.
Quale posizione prendere in questo mare magnum?
Il DNA barcoding è una tecnica con dei vantaggi e dei limiti. La grande innovazione non è la
capacità discriminatoria e quindi il potere di identificazione delle specie. Il DNA barcoding non è
perfetto, perché un sistema perfetto non esiste. Abbiamo tecniche molecolari che sono più sensibili
del DNA barcoding. La vera forza del DNA barcoding è che si tratta del più grande e generale
sistema discriminatorio che ha introdotto dei rilevanti automatismi e schematizzazioni nella
tassonomia. Il tentativo di fornire delle metodiche universali di catalogazione dei reperti biologici,
di analisi del dato, di fruizione dei risultati è la vera forza del sistema.
Il DNA barcoding è la tecnica ideale per un “non addetto ai lavori”. L’esperto deve mettere a punto
il sistema, ma poi è un profano l’ideale utilizzatore. Pensiamo a una persona che conosce
abbastanza bene le piante, sa identificare molte specie della flora locale, ma un giorno trova qualche
cosa che assomiglia a un insetto su una foglia. Che cos’è? Nel passato si doveva rivolgere a un
esperto, ma oggi, perfino lui può utilizzare la tecnica generalista del DNA barcoding. Riuscirà a
identificare l’insetto? Potrebbe, ma potrebbe anche solo “andarci vicino”. L’immagine è quella delle
matrioske (la serie di bambole contenuta una nell’altra): con la nostra tecnica ci aspettiamo di
identificare la bambolina più piccola (la specie?), ma a volte con il DNA barcoding ci fermiamo al
livello più alto. Come giudichiamo questo: un successo o un insuccesso? Nella logica DNA
barcoding qualunque cosa riduca la nostra incertezza sul piano identificativo rappresenta un
risultato apprezzabile.
TECNICHE DI CAMPIONAMENTO E ANALISI DNA BARCODING
Adriana Bellati
L’analisi DNA barcoding si basa sulla tecnica di PCR (Reazione di Polimerizzazione a Catena del
DNA) che richiede solo piccolissime quantità di DNA di partenza, rendendo possibile l’impiego di
qualsiasi tipo di campione biologico: sangue, tessuto, liquidi biologici, bulbo pilifero, ecc.
Tuttavia, il principale rischio consiste nella possibilità di contaminare il campione, e quindi il DNA
da analizzare, già durante la fase di raccolta, o di frammentarlo eccessivamente in seguito a errata
manipolazione. Ogni campione biologico è infatti soggetto a degradazione se non adeguatamente
conservato. Sebbene il DNA sia molto più stabile di enzimi e proteine in generale, esso è comunque
soggetto a degradazione, sia a causa dell’azione digestiva delle endonucleasi, enzimi litici
normalmente presenti nelle cellule che sono attivi in fase di morte cellulare, sia a causa di agenti
esterni biologici (come muffe, funghi, batteri) e fisici (come luce solare, ultravioletta, temperatura e
umidità). La quantità di DNA che può essere recuperata da un campione dipende strettamente dalle
modalità di conservazione dello stesso. La rigorosa applicazione delle corrette modalità di prelievo,
trasporto, trattamento e conservazione del campione è perciò condizione preliminare ed essenziale
per garantire l’attendibilità dei risultati ottenuti con le tecniche di biologia molecolare.
La prima parte dell’esercitazione verterà sulle modalità di prelievo e conservazione dei campioni
biologici per poter eseguire con successo l’analisi DNA barcoding. Utilizzo di guanti,
sterilizzazione della strumentazione, modalità di conservazione (congelamento, ETOH assoluto,
Silica gel). Verranno quindi presentate le più tradizionali tecniche di estrazione del DNA,
amplificazione e sequenziamento del gene Citocromo c ossidasi I (cox I), con il supporto di
strumentazione da laboratorio e proiezione di presentazioni in power point che ripercorrono le
diverse fasi dei suddetti procedimenti di analisi molecolare.
Infine, l’ultima parte dell’esercitazione sarà dedicata a un aspetto critico dell’analisi DNA
barcoding, ossia l’interpretazione dei risultati ottenuti in laboratorio e l’assegnazione del campione
di interesse alla corretta specie su base molecolare. A tal proposito, verranno forniti ai partecipanti i
fondamentali rudimenti per l’utilizzo dei software bioinformatici dedicati e per la consultazione
delle banche dati molecolari primarie disponibili on-line (GenBank, EMBL, DDBJ) e del Barcode
of Life Data System (BOLD). In particolare, verranno presentati i principali formati
per la
visualizzazione delle sequenze nucleotidiche ottenute mediante sequenziamento e per la submission
del dato (es. FASTA), i più importanti descrittori per procedere alla ricerca delle sequenze
depositate in banca dati e i tradizionali tools per operare correttamente la ricerca di similarità tra
sequenze (es. BLAST).
RESPONSABILE SCIENTIFICO
Enrica Capelli: Ricercatrice presso il Dipartimento di Scienze della Terra e dell’Ambiente,
Università degli Studi di Pavia
DOCENTI
Casiraghi Maurizio: Dipartimento di Biotecnologie e Bioscienze, Università degli Studi di Milano
Bicocca
Gentilli Augusto: Professore a contratto presso la Facoltà di Scienze MM. FF. NN. dell'Università
degli Studi di Pavia - Membro della Federazione Italiana Sommelier Albergatori Ristoratori
(FISAR)
Bellati Adriana: dottoranda in Ecologia Sperimentale e Geobotanica presso Dipartimento di
Scienze della Terra e dell’Ambiente, Università degli Studi di Pavia
TUTOR
Ghitti Michele: Dipartimento di Scienze della Terra e dell’Ambiente, Università degli Studi di
Pavia Cocca Walter: Dipartimento di Scienze della Terra e dell’Ambiente, Università degli Studi di
Pavia
Provider:
Ufficio ECM - Dipartimento di Scienze del Farmaco
Università degli Studi di Pavia
V.le Taramelli 12 - 27100 Pavia
Responsabile Prof. Tiziana Modena
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