B Kitt Cod. GD 630 Istruzioni d`Uso Istruzioni d`Uso

REAL QUANT B Kit
Cod. GD 630
HBV-Dna - Analisi Quantitativadel virus dell’epatite B umano 40 TESTS
SOLO PER USO RICERCA
Istruzioni d’Uso
INTRODUZIONE: II virus dell’epatite B (HBV) è causa di un gran numero di patologie che vanno dalle infezioni clinicamente in apparenti alle forme più severe correlate
ad epatite fulminante, cirrosi, carcinoma epatocellulare. Sebbene un gran numero di tests sia già impiegato per seguire il corso di queste malattie e per prevedere
l’evoluzione della patologia correlata all’infezione, uno dei marker che appare sempre più efficace per il monitoraggio dei pazienti cronicamente infetti, è rappresentato dal
dosaggio quantitativo del HBV-Dna. Tale dosaggio è fondamentale per controllare la replicazione virale e la progressione della malattia, oltre che per stabilire l’efficacia di
un trattamento antivirale in pazienti con epatite B cronica. Il Viral Load materno, inoltre, durante il periodo prenatale è considerato uno dei fattori determinanti l’infezione
in infanti ed è stato identificato come marcatore predittivo di tali infezioni ancor più della presenza di HbeAg nella madre.La ricerca di HBV Dna è utile anche per chiarire
casi di sierologia incerti dovuti a variabilità genetica del virus.
Uno dei parametri più importanti da considerare nella pratica di tale dosaggio è la variabilità della viremia circolante, che spazia in un range compreso tra 102 e 108 copie di
HBV Dna/ml di siero; pertanto il metodo da utilizzare deve possedere un range dinamico sufficientemente ampio. Il sistema proposto, che si avvale della rivelazione in
tempo reale, è in grado di fornire una corretta analisi quantitativa del Dna virale fino a 10X106 copie/ml (vedi grafico riportato in calce) senza dover ricorrere ad alcuna
diluizione del campione. Grazie alla Real Time PCR, infatti, è possibile osservare ed utilizzare la cinetica dei cicli iniziali della reazione di amplificazione del Dna per
poter, in maniera molto efficace, quantizzare prodotti di PCR senza dover ricorrere a laboriose analisi post PCR e costruendo la curva di calibrazione al ciclo ottimale (CT)
di risposta della fluorescenza.
Il kit REAL QUANT B è stato studiato per consentire la determinazione della viremia dell’HBV-Dna, nella regione pre-Core, in campioni di plasma di soggetti infetti,
mediante l’uso di un protocollo in Real Time PCR. Un attento studio della sequenza dei Primers e del protocollo di amplificazione consente l’utilizzo del Sybr Green come
fluoroforo. La curva di calibrazione (da un minimo di 3 fino a 5 punti) viene generata grazie all’ausilio di uno standard a titolo noto, calibrato in Unità Internazionali,
rispetto allo standard di riferimento della WHO n° 96/790.
PRINCIPIO DEL METODO
1. Il DNA del Virus dell’epatite B viene estratto da con il kit GD215, ottimizzato per l’estrazione contemporanea di Rna e Dna da plasma o siero umano.
2. L’estratto viene amplificato con due Primer specifici diretti verso la regione pre-core del virus HBV, producendo un frammento di circa 104 bp.
La reazione viene condotta in presenza di tre diluizioni di uno standard di riferimento a titolo noto, calibrato in Unità Internazionali, rispetto allo standard di riferimento della WHO n°
97/746. Viene costruita la curva di calibrazione su tre punti, sulla quale viene interpolato il risultato relativo al campione sconosciuto, per ottenerne la quantizzazione.
Applicabilità:
Volume del campione:
Numero di test:
Tempi di esecuzione:
Conservazione:
Stabilità:
Reagenti richiesti:
non compresi nel kit
Caratteristiche dei reagenti:
Materiali richiesti:
Strumenti richiesti
su Dna estratto e purificato (2-20 microlitri) con GD215 DNA/RNA Extra Kit.
da 2 a 20 ml
40
circa 4/5 ore in funzione del termociclatore in uso
a –20°C
Superiore a 12 mesi se correttamente conservato
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Portaprovette refrigerato
Puntali sterili con barriera antiaereosol
Tubi 0,2 ml per PCR (Rnasi/Dnasi free) provvisti di tappi ottici.
TERMOCICLATORE provvisto di Lettore in FLUORESCENZA con filtro SYBR GREEN I.
VORTEX
Set di pipette pre PCR
1) da 0.5-10 µl
2) da 5-50 µl
3) da 50-200 µl
4) da 200-1000 µl
ATTENZIONE: Tutti i materiali necessari all'esecuzione del test devono essere sterili e monouso. Occorre poter disporre di un set di micropipette dedicato. Si suggerisce di
eseguire tutte le operazioni in cappa biologica ed in ghiaccio. E' tassativo l'uso di guanti durante la manipolazione di campioni e reagenti.
CONTENUTO DEL
KIT E SUO UTILIZZO:
1) SOLUZIONE REALT – BUFFER* :
Conservazione:
2) SOLUZIONE PRIMER REALT/HBV-A:
Conservazione:
3) SOLUZIONE PRIMER REALT/HBV-S**:
Conservazione:
4) SOLUZIONE DI MgCl2 (25mM)
Conservazione:
5) SOLUZIONE URACIL DNA GLICOSYLASE :
Conservazione:
6) SOLUZIONE DNA TAQ GOLD (170 U.I.)***:
Conservazione:
7) CONTROLLO POSITIVO A TITOLO NOTO**** :
Conservazione:
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codice colore VIOLA
-20° C (scongelare immediatamente prima dell’uso).
codice colore VERDE
-20° C
codice colore VERDE
-20° C (scongelare immediatamente prima dell’uso).
codice colore GIALLO
-20° C
codice colore MARRONE
-20°
codice colore ROSSO
-20° C
codice colore TRASPARENTE
-20° C
NOTE:
*
La mix contiene il tampone e gli additivi necessari per l’esecuzione della reazione di amplificazione incluso il Sybr Green I ed i dNTPs - (dUTP) a concentrazione
ottimizzata. Agitare accuratamente. Prelevare l’aliquota desiderata evitando di prolungare l’esposizione della soluzione per lungo tempo.
**
Agitare accuratamente.
*** Attenzione non usare Enzimi diversi da quello contenuto nel Kit. Gli Enzimi vanno conservati a –20°C. Essi sono sospesi in una soluzione ad alta viscosità, per
impedirne il congelamento e scongelamento e, pertanto la perdita di attività biologica. E’ indispensabile, seguire le seguenti precauzioni:
• Agitare accuratamente il tubo manualmente.
• Centrifugare brevemente.
• Aspirare lentamente la quantità di enzima necessaria per l’esecuzione del test
Distribuire nella MASTER-MIX avendo cura che la diffusione sia omogenea.
**** Controllo positivo di HBV-DNA inattivato. Il titolo è indicato sull’etichetta. Il controllo, già addizionato di lisante, va precipitato come il campione e
successivamente diluito per costruire la curva di calibrazione. Conservazione –20°C.
ESECUZIONE DELLA REAZIONE
DI AMPLIFICAZIONE
PREPARAZIONE DELLA MASTER MIX:
• Scongelare i reagenti e portarli a Temperatura Ambiente.
• Agitare accuratamente tutte le soluzioni per ottenere una omogenea distribuzione dei reagenti in esse contenuti.
• Predisporre i tubi per l’esecuzione della reazione di Amplificazione nel portatubi refrigerato, includendo tre tubi per i controlli di
calibrazione ed almeno un controllo negativo (anche H2O estratta con i campioni).
• Preparare gli enzimi nel portatubi refrigerato.
SOLUZIONE STOCK (volume per test in µl) x (n. test)
q.b.
40 µl finali
H2O-STERILE
REALT – BUFFER
10 µl
PRIMER REALT/HBV-A
1 µl
PRIMER REALT/HBV-S
1 µl
MgCl2 (25mM)
6 µl
SOLUZIONE URACIL DNA GLICOSYLASE (1 U.I./ µL)
0,5 µl (0,5 U.I.)
TAQ POLIMERASI (5 U.I/ µL)
0,5 µl(2,5U.I.)
VOLUME TOTALE
40 µl x (n. test)
Moltiplicare i valori riportati per singolo test per il numero di test che si vuole eseguire per singola seduta per ottenere la MIX finale.
PREPARAZIONE DEI CAMPIONI:
• DISTRIBUIRE 40 microlitri di MASTER-MIX nei tubi predisposti per l’amplificazione.
• Aggiungere 10 microlitri di campione per tubo e porre in TERMOCICLATORE Real Time.
AMPLIFICAZIONE:
• Eseguire il seguente ciclo di Temperature :
1 ciclo
2 ciclo
40 cicli
1 ciclo
STORAGE
50° C
95° C
94° C
72° C
72° C
2 min.
1 min.
30 sec.
10 min.
94° C
55° C
55° C
6 min.
1 min.
30 sec
72° C
72° C
1 min.
30 sec
Istruzioni d’Uso
REAL QUANT B Kit
RIVELAZIONE DELL’AMPLIFICATO
La rivelazione avviene in tempo reale durante la reazione di amplificazione se viene utilizzato un termociclatore provvisto di
lettore a fluorescenza per tubi da PCR.
Come ben noto, durante la reazione di PCR il Dna target in presenza di due primer specifici, di nucleotidi liberi, della TaqPolimerasi e di MgCl2, produce repliche di se stesso che ne aumenta esponenzialmente il N° di copie. Ciò avviene grazie ai cicli di
temperatura impostati sul termociclatore; infatti con il riscaldamento il DNA si denatura, durante la fase di annealing avviene il
riconoscimento del Dna da parte dei Primers, che vengono poi estesi ad opera della Taq Polimerasi. Con la ripetizione del processo
si verifica una crescita esponenziale ed un accumulo del prodotto di PCR. Se la PCR viene condotta in presenza di un colorante in
grado di legare il DNA a doppia elica, come il Sybr Green I, è possibile monitorare l’accumulo del prodotto di PCR in tempo reale.
Il Sybr Green I, infatti, è altamente specifico per il DNA a doppia elica e mostra un grande incremento di fluorescenza quando si
lega ad esso.
I sistemi di lettura in Real Time sono costruiti per poter registrare la fluorescenza emessa dal fluoroforo, piuttosto che dai probes,
durante la reazione stessa.
La luce della lampada alogena passa attraverso un filtro ottico che la taglia a 485 nm. A questa lunghezza d’onda è possibile
eccitare sia il Sybr Green che vari fluorofori legati a probes (FAM, TET, VIC e JOE). La luce viene poi riflessa su un deviatore ed
attraverso uno specchio viene convogliata su una lente di Fresnel e quindi sui campioni. La luce emessa dal campione viene
raccolta da una CCD camera che acquisisce il segnale e lo memorizza. Durante ogni ciclo di PCR, vengono acquisite immagini
multiple dei campioni, che alla fine della reazione vengono analizzate da un software in grado di costruire una curva di
calibrazione degli standards, consentendo all’operatore di modificare il CT in funzione della linearità di risposta alle varie
concentrazioni. La fluorescenza emessa dal campione a concentrazione sconosciuta, al CT selezionato, viene interpolato nella
curva standard e se ne ricava la concentrazione.
La costruzione della curva di calibrazione degli standard quantitativi, ottenuta in questo modo, presenta i seguenti vantaggi:
1) Non viene penalizzata la sensibilità del sistema, perché non è necessario ridurre il N° di cicli per evitare la saturazione del segnale;
2) Non è richiesta alcuna manipolazione del prodotto di PCR, poiché non è necessaria una fase di rivelazione post-PCR, con
conseguente risparmio di tempo e riduzione della possibilità di contaminazione da Carry-Over;
3) Il prodotto della reazione può essere sottoposto, in caso di necessità, a successiva analisi su gel o mediante elettroforesi capillare.
SOLO PER USO RICERCA
Rev. 1 Giug 2001
PRODOTTO E DISTRIBUITO DA:
G ENE D IA
TEL/FAX 0583962672 - EMAIL: [email protected]
TEL/FAX 0815465026 – EMAIL : [email protected]
PRODUZIONE: Email: [email protected]
10
fluorescenza
40 TESTS
RIC. E SVIL.: Trav. M. Pietravalle, IIa 80100 NAPOLI
12
WEB: www.genedia.it
8
6
4
BLANK
STD 3
SAMPLE
STD 4
STD 1
BLANK
cycle 40
cycle 39
cycle 38
cycle 37
cycle 36
cycle 35
cycle 34
cycle 33
cycle 32
cycle 31
cycle 30
cycle 29
cycle 28
cycle 27
cycle 26
cycle 25
cycle 24
cycle 23
cycle 22
cycle 21
cycle 20
cycle 19
cycle 18
cycle 17
cycle 16
2
0
HBV-Dna - Analisi Quantitativa
del virus dell’epatite B umano
S. R . L .
AMM. E PROD.: Via Lombarda,169 55013 LAMMARI LU
Cinetica di Reazione
14
Cod. GD 630
STD 2
Grafico 1: Logaritmo della Fluorescenza/cicli
Curva di CALIBRAZIONE HBV-Dna
30
y = -4,107x + 45,206
28
26
C/T
24
22
20
18
16
3,000
3,500
4,000
4,500
5,000
5,500
Log.CONCENTRAZIONE
Serie1
6,000
6,500
7,000
Curva Teorica
Grafico 2: Curva di Calibrazione CT