La Metabolomica applicata alla classificazione di mutazioni

La Metabolomica applicata alla classificazione
di mutazioni geniche
nella patologia emicranica
Pierangela Giustetto
L.M. Tecnologie Avanzate
Dipartimento di Fisica Generale Università di Torino
LA METABOLOMICA IN CLINICA: PRINCIPI ED APPLICAZIONI
WORKSHOP SULLA METABOLOMICA - Torino, 12 marzo 2010
Scopo dello studio e metodologia applicata
SCOPO DELLO STUDIO
•
verificare la relazione tra :
- dati ricavati da analisi ematochimiche
- valori delle velocità del flusso ematico a livello
delle arterie cerebrali medie (importanza TCD)
•
verificare l’esistenza di variazioni genetiche a carico di alcuni fattori
che determinano la regolazione ematica.
•
sviluppare un classificatore capace di differenziare le mutazioni
geniche 677-MTHFR sulla base di parametri ematochimici e strumentali
COME
FARE?
WORKSHOP SULLA METABOLOMICA - Torino, 12 marzo 2010
Scopo dello studio e metodologia applicata
DEVO CREARE UN
DATABASE…..
Ma con quali dati ?
METODOLOGIA
linee di guida che regolamentano gli studi di metabolomica
analisi statistica multivariata dei dati
Patologia : emicrania
Emicrania con e senza aura
Disordine neurologico
aumento del rischio di insorgenza
di lesioni cerebrali vascolari subcliniche
Patologia associata ad alterazioni dei parametri ematochimici
collegati all’aggregazione piastrinica
WORKSHOP SULLA METABOLOMICA - Torino, 12 marzo 2010
Mutazioni geniche 677-MTHFR
677-MTHFR : metilentetraidrofolatoreduttasi
Le mutazioni a carico del gene MTHFR sono legate
•
•
alla patologia emicranica
all’incremento del rischio di patologie a carico dei vasi arteriosi
alterazione di parametri ematochimici
alterazione della reattività cerebrovascolare
Emicrania con e senza aura
WORKSHOP SULLA METABOLOMICA - Torino, 12 marzo 2010
Parametri costituienti il database: TCD
Alterazione della reattività cerebrovascolare
Cerebral blood flow velocities (CBFV)
Velocità di flusso ematico cerebrale clinicamente
descrivono lo stato vascolare di emicranici
Breath - holding (BH) è un potente stimolo che induce la vasodilatazione
delle arterie cerebrali , conseguentemente è relativo
allo stato cerebrale vascolare
procedura di apnea
le variazioni di velocità a livello delle arterie cerebrali (CBFV) sono
significativamente evidenti durante la procedura di apnea
(il paziente blocca volontariamente la respirazione)
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Parametri costituienti il database : TCD
Transcranial Doppler sonography (TCD)
Esame utilizzato per la diagnosi e valutazione delle variazioni di velocità
a livello delle arterie cerebrali
BHI : the breath – holding index
BHI =
VBH - VBASE
* 100
VBASE
Instr. Variable
Age
Left CBFV
Right CBFV
Left BHI
Right BHI
Left HITS
Right HITS
Unit
year
cm/s
cm/s
%
%
a.u.
a.u.
VBH
= CBFV measured at the end of the BH and averaged on a 60-seconds time window
VBASE
= CBFV measured at the beginning of the BH and averaged on a 60-second time window
Parametri costituienti il database : ematochimici e genetici
Hematochemical Variable
(%)
Antithrombin
Activated partial thromboplastin
time (APTT)
Hematocrit
Hemoglobin
Erythrocytes
Fibrinogen
Leucocytes
Platelets
C Protein
S Protein
(s)
(%)
(g/dl)
(x1000000/µ)
(mg/dl)
(x1000/µl)
(x1000/µl)
(%)
(%)
(%)
Prothrombin
Prothrombin time in International
(a.u.)
Parametri costituienti il database : ematochimici e genetici
Agents for platelet
(Born test)
Arachidonic Acid
Adenosine diphosphate (ADP)
(1 micromolar) – ADP1
Adenosine diphosphate (ADP)
(3 micromolar) – ADP3
Collagen (2 micromolar)
Ristocetin
Genetic data : 677-MTHFR genotype
Mutation
N° Subjects
Aura
T/T 677- MTHFR
14
7
C/T 677- MTHFR
18
8
NO MUTATION
18
6
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
MUTAZIONI DEL GENETIPO
MTHFR C677T
·C/T eterozigosi
·T/T omozigosi
·assente
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Materiale e metodi
Numero pazienti : 50 donne sofferenti di emicrania
( diagnosi eseguita secondo criteri dell’ International Headache Society
presso Women’s Headache Center of the University of Torino )
Età media : 38.5 ± 1.6 anni (range: 18 – 64 anni)
DATABASE: matrice dei dati con 50 righe (pazienti)
e 24 colonne contenenti le variabili ematochimiche,
strumentali ed I risultati degli esami genetici.
Sono stati identificati alcuni outliers a livello delle variabili
ematochimiche, ma si è ritenuto opportuno non eliminarli in quanto
potenzialmente rappresentativi della variabilità del livello patologico.
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Elimino correlazioni lineari
CORRELAZIONI LINEARI
Variabili con r ³ 0,6
Variabili
Coefficiente di
correlazione r
Antitrombina Piastrine
0,6
Aptt - Pt inr
0,6
Ematocrito Emoglobina
0,6
Ematocrito Eritrociti
0,7
Ematocrito Ristocetina
0,7
Emoglobina Eritrociti
0,6
P - value
0,00001
0,00001
0,00001
0,00001
0,00001
0,00001
Variabile
eliminata
Antitrombina
Pt inr
Ematocrito
Ematocrito
Ematocrito
Eritrociti
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Elimino correlazioni lineari
Variabili con r ³ 0,5
Variabili
Coefficiente di
correlazione r
P - value
Variabili eliminate
Antitrombina Piastrine
0,6
Aptt - Pt inr
0,6
Ematocrito Emoglobina
0,6
Ematocrito - Eritrociti
0,7
Ematocrito Ristocetina
0,7
Emoglobina Eritrociti
0,6
Aptt - Proteina C
0,5
0,0005
Proteina C
Fibrinogeno - Proteina
C
0,5
0,0003
Proteina C
Proteina C - Pt inr
0,5
0,0002
Proteina C
0,00001
0,00001
0,00001
0,00001
0,00001
0,00001
Antitrombina
Pt inr
Ematocrito
Ematocrito
Ematocrito
Eritrociti
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Anova a più vie
Analisi della varianza a più vie per la Vel MCA Sn e DX
Somma dei
quadrati
G.l
.
Media dei
quadrati
Rapporto F
P-value
Acido Arachidonico
0,00351771
1
0,00351771
0,29
0,5935
Adp (1 microm )
0,00907521
1
0,00907521
0,75
0,3929
Adp (3 microm)
0,142102
1
0,142102
11,74
0,0017
Aptt
0,000335301
1
0,000335301
0,03
0,8688
Collagene (2 microm)
0,0992056
1
0,0992056
8,20
0,0073
0,0000320133
1
0,0000320133
0,00
0,9593
Età
0,0160808
1
0,0160808
1,33
0,2575
Fibrinogeno
0,0336244
1
0,0336244
2,78
0,1053
Leucociti
0,00515275
1
0,00515275
0,43
0,5187
Piastrine
0,000636147
1
0,000636147
0,05
0,8201
Proteina C
0,00389097
1
0,00389097
0,32
0,5746
Proteina S
0,0136767
1
0,0136767
1,13
0,2957
Protrombina
0,044936
1
0,044936
3,71
0,0629
0,0612871
1
0,0612871
5,07
0,0314
A:MUTAZIONE
0,0932812
2
0,0466406
3,85
0,0316
B:AURA
0,0144231
1
0,0144231
1,19
0,2831
RESIDUO
0,387185
32
0,0120995
Sorgente
COVARIABILI
Emoglobina
Ristocetina
EFFETTI PRINCIPALI
Analisi delle Componenti Principali
PCA was performed on a data set consisting of the 50
subjects (rows) and the following 7 observations: ADP3,
collagen, ristocetin, right CBFV, left CBFV, right BHI
and left BHI.
We extracted 3 PCs; their combination explained 79.9% of
the total variance of the data.
Percentuale
Percentuale
di varianza
cumulata
2,10881
30,126
30,126
2
1,91171
27,310
57,436
3
1,57248
22,464
79,900
4
0,754341
10,776
90,676
5
0,387245
5,532
96,208
6
0,156472
2,235
98,444
7
0,108945
1,556
100,000
Componente
Autovalore
1
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Analisi delle Componenti Principali
Component
e1
Component
e2
Component
e3
Adp (3 microm)
-0,276244
0,397792
-0,452594
Collagene (2
microm)
0,133355
0,178354
-0,574217
Ristocetina
-0,0409594
0,371782
-0,406511
Vel. Mca Sn
0,60293
-0,181082
-0,212281
Vel. Mca Dx
0,589729
-0,212849
-0,223389
Apnea Dx
0,342949
0,540346
0,287138
Apnea Sn
0,274424
0,549236
0,350384
The PCs are mainly correlated to the
CBFVs (first component),
BHI (second and third component)
collagen, ADP3, and ristocetin (third component).
We found that cerebral blood flow velocities and response to breath – holding are
important variables in characterizing mutations in migraine.
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Analisi delle Componenti Principali
MUTAZIONI DEL GENETIPO 677-MTHFR
·C/T eterozigosi
·T/T omozigosi
·assente
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Analisi delle Componenti Principali
MUTAZIONI DEL GENETIPO 677-MTHFR
·C/T eterozigosi
·T/T omozigosi
·assente
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Partial Least Squares
PLS tratta le stesse variabili indipendenti della PCA , e con variabili dipendenti:
mutazioni geniche ed aura
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Variazione BHI in funzione delle mutazioni
45
40
LEFT BHI
RIGHT BHI
Values (%)
35
30
25
20
15
10
5
0
NO MUTATION
Mut. C677T C/T Mut. C677T T/T
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Variazione variabili ematochimiche in funzione delle mutazioni
100
90
ADP3
Collagen
Ristocetin
80
Values (%)
70
60
50
40
30
20
10
0
NO MUTATION
Mut. C677T C/T Mut. C677T T/T
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Analisi Discriminante - classificatore
Metodo supervisionato per la predizione
di mutazioni geniche
We randomly selected 40 patients to build the classifier and we used
the remaining 10 subjects for validation.
We tested 100 different possible combinations
We tested 100 combinations leading to corpus and validation sets containing at
least 2 subjects for each group.
We classified 1000 subjects:
363 of which belonged to the T/T677 group,
364 to the C/T677 group,
and 273 to the no mutation group
Our classifier showed overall satisfactory performance:
95.9% sensitivity and 89% specificity.
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Analisi Discriminante - classificatore
Tabella di classificazione del corpo classificatore
Percentuale di casi correttamente classificati: 100,00%
Tabella di classificazione dei 10 casi utilizzati per verifica
Analisi Discriminante - classificatore
Mutation
Sensitivity
T/T 677- MTHFR 100% -- (95.6% - 100%)
C/T 677- MTHFR 91.8% -- (87.5% - 95.5%)
NO MUTATION 89.0% -- (84.7% - 92.4%)
Specificity
97.6% -- (94.1% - 98.3%)
97.6% -- (92.3% - 99.0%)
95.9% -- (90.2% - 98.8%)
Conclusioni
Recenti studi hanno riconosciuto una stretta correlazione tra
•
la presenza dell’ aumento del livello di omocisteina
•
la mutazione omozigote T/T677
•
patologie a carico delle arterie periferiche con rischi
cardiovascolari in particolar modo se in presenza
di stati ipertensivi.
coinvolgimento delle patologie a carico delle arterie carotidee e
delle coronarie con alterazione dello spessore di parete, come
l’incremento dello spessore intima media (IMT), spesso anche in
associazione ad alterazioni della funzionalità cognitive e
possibili insorgenze di danni vascolari
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Giustetto P., Molinari F., Liboni W., Manetti C., Valerio M.C., Culeddu N., Chessa M., Metabolomics applied to the
classification of migraine with different 677-MTHFR mutation – Advances in metabolic profiling,
Barcellona 5-6 novembre 2009
Grazie per la
vostra cortese
attenzione
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