dossier - Parmigiano Reggiano

Transcript

dossier - Parmigiano Reggiano
Istituto Nazionale di Ricerca
per gli Alimenti e la Nutrizione
Via Ardeatina 546 – 00178 Roma
DOSSIER
Il Parmigiano Reggiano: un prodotto
naturalmente funzionale
INRAN 2008
1
a cura dell’Istituto Nazionale di Ricerca per gli Alimenti e la Nutrizione – INRAN
via Ardeatina 546- 00178 Roma
Presidente Prof. Carlo Cannella
Laboratorio Latte e prodotti lattiero.caseari
Resp. Dott. Laura Pizzoferrato
2
Sintesi del documento
Il Parmigiano Reggiano DOP è un formaggio a latte crudo e parzialmente scremato,
a pasta cotta e a maturazione lenta per minimo 12 mesi e raramente per meno di 15-18 mesi al
consumo. Il latte proviene da vacche la cui alimentazione è prevalentemente costituita da
foraggi freschi e fieno della zona d’origine (province di Parma, Modena, Reggio-Emilia e
alcuni territori di Bologna e Mantova).
La trasformazione del latte in Parmigiano Reggiano è ancora basata su una metodica
artigianale legata all’esperienza dei casari e al rispetto di usi e consuetudini secolari. L’attività
enzimatica della flora lattica del latte e del sieroinnesto naturale, grazie alla tecnologia di
produzione che non prevede l’uso di additivi e alla lunga fase di stagionatura, trasforma il
latte in un prodotto di grande complessità e ricchezza dal punto di vista organolettico e
nutritivo.
Il ridotto contenuto di acqua di questo formaggio (30% circa) comporta l’elevato
valore energetico pari a 388 Kcal per 100 grammi di formaggio. Le proteine (in media 33%)
sono la componente quantitativamente più importante del Parmigiano Reggiano mentre il
contenuto di grasso (in media 28%), legato all’uso di latte parzialmente scremato, risulta in
linea con la definizione merceologica di formaggio semigrasso.
La composizione in acidi grassi riflette quella del grasso del latte, il contenuto di
colesterolo è relativamente modesto, pari mediamente a 83-91 mg per 100 grammi di
formaggio. Se si tiene presente che una porzione di Parmigiano Reggiano è 50g e che un uovo
contiene circa 200 mg di colesterolo ci si rende conto che il contributo del formaggio
all’assunzione giornaliera di colesterolo è limitato. Il Parmigiano Reggiano contiene inoltre
minerali (calcio, di cui è una fonte ricchissima, fosforo, sodio, cloro), microelementi (in
particolare zinco e selenio) e vitamine lipo e idrosolubili. Da sottolineare anche il contenuto
medio in sale, circa l’1,4%, nettamente inferiore rispetto al passato, per consentire l’uso di
questo formaggio a un più ampio numero di consumatori. Da considerare infine che il
Parmigiano Reggiano, come tutti i formaggi stagionati è privo di lattosio.
Studiando questo prodotto e tutto il comparto lattiero-caseario, come da oltre dieci
anni sta facendo l’INRAN, non solo dal punto di vista tecnologico, alimentare e nutritivo, ma
3
anche sotto l’aspetto funzionale, è possibile mettere in luce come, per la presenza di molecole
funzionali (antiossidanti, antinfiammatori, anticancerogeni, ipotensivi ecc) il latte in generale
e il Parmigiano Reggiano in particolare – grazie al tipo di allevamento selezionato e al
peculiare processo produttivo - possano essere a tutti gli effetti considerati prodotti
“naturalmente” funzionali.
In conclusione, per il contenuto in nutrienti e composti funzionali e per l’elevata
digeribilità, il Parmigiano Reggiano è un alimento consigliabile nell’alimentazione in tutte le
fasce d’età.
4
CARATTERISTICHE COMPOSITIVE E VALORE NUTRITIVO DEL
PARMIGIANO-REGGIANO DOP
Nella Tabella 1 è riportata la composizione in acqua, proteine, grassi, ceneri e cloruro
di sodio del Parmigiano Reggiano, secondo quanto indicato dal Consorzio e quanto presente
nella banca dati INRAN sui prodotti lattiero caseari. Nella stessa Tabella è riportato il valore
dell’energia calcolato secondo il D.Lgs. 16 febbraio 1993 in attuazione della direttiva
90/496/CEE del Consiglio del 24 settembre 1990, usando i seguenti coefficienti di
conversione:
Carboidrati
4 kcal/g - 17 kJ/g
Proteine
4 kcal/g - 17 kJ/g
Grassi
9 kcal/g - 37 kJ/g
Energia (kcal) = 4 x (g proteine +g carboidrati) + 9 x (g lipidi)
Energia (kJ) = 17 x (g proteine +g carboidrati) + 37 x (g lipidi)
Tabella 1: Composizione centesimale (g/100 g di formaggio) e apporto energetico (Kcal e
kJ da 100 g di formaggio)
Composizione
Dati INRAN
media
Dati Consorzio
minimo
media
umidità (%)
30,4
30,8
28,6
32,8
proteine (%)
33,5
33,0
30,8
34,8
grasso (%)
28,1
28,4
25,5
31,4
acidi grassi saturi
17,1
20,9
trans
1,0
1,1
colesterolo (mg)
91
83
ceneri (%)
4,6
4,6
4,0
5,2
sale (%)
1,5
1,4
1,0
1,9
energia kcal/100g
387
388
kJ/100g
1609
1612
massimo
Le proteine, presenti nel Parmigiano Reggiano, in elevata quantità (33%) sono anche di
ottima qualità biologica, sia per la composizione amminoacidica particolarmente favorevole, sia
per la facile digeribilità dovuta all’azione, durante la stagionatura, degli enzimi proteolitici
5
derivati dal latte di partenza e dai batteri lattici. Il contenuto totale in amminoacidi liberi
rappresenta mediamente il 23,2% delle proteine con un minimo di circa 19% e un massimo di
oltre 27%.
Il contenuto totale in amminoacidi liberi è direttamente proporzionale alla durata della
stagionatura fino a 15 mesi, poi si stabilizza e, con il procedere dell'invecchiamento, i fenomeni di
metabolismo a carico degli amminoacidi stessi aumentano fino a superare l'eventuale loro
liberazione.
Il grasso trovato è compreso tra un valore minimo di 25,5% e un massimo di 31,4% con
un valore medio di 28,4% e risulta compatibile con la definizione merceologica di formaggio
semi-grasso per il Parmigiano Reggiano. L'analisi gas-cromatografica ha confermato che la
composizione in acidi grassi del Parmigiano-Reggiano riflette esattamente quella del grasso del
latte.
Le ceneri rappresentano in media il 4,6% del Parmigiano-Reggiano con oscillazioni da un
minimo di 4% a un massimo di 5,2%. Queste oscillazioni sono, in gran parte, attribuibili al
contenuto in sodio che, nella forma di cloruro di sodio, ha una variabilità relativa del 15,7%. Da
sottolineare il fatto che il contenuto medio in cloruro di sodio del Parmigiano-Reggiano (1,6%)
riscontrato attualmente è nettamente più basso rispetto a quello trovato circa 30 anni or sono (2,42,5%).
Tabella 2: Composizione in macro e microelementi del Parmigiano-Reggiano.
Composizione
Dati INRAN
media
media
Dati Consorzio
minimo
massimo
calcio mg/100g
1159
1158
914
1361
fosforo mg/100g
678
678
610
720
sodio mg/100g
600
646
453
906
potassio mg/100g
102
102
57
129
magnesio mg/100g
43
43
37
51
zinco mg/100g
4
4
2
7
ferro ug/100g
200
184
124
291
rame ug/100g
829
829
360
1294
manganese ug/100g
21
21
14
32
selenio ug/100g
12
12
2
38
cobalto ug/100g
1
1
<1
3
6
La componente minerale del Parmigiano-Reggiano, mostra che, riguardo al calcio e al
fosforo, i valori medi trovati di 1,16% e di 0,68% rispettivamente garantiscono un rapporto
maggiore di 1 tra calcio e fosforo.
I livelli di vitamine nel formaggio Parmigiano-Reggiano sono riportati in Tabella 3.
Tabella 3: Contenuto vitaminico (ug/100g) del Parmigiano-Reggiano.
Composizione
Vitamina A (RE)
Dati INRAN
media
Dati Consorzio
minimo
massimo
media
358
270
93
445
trans retinolo
304
13cis retinolo
58
beta carotene
66
107
20
263
460
440
44-
838
Vitamina E (TE)
alfa tocoferolo
460
beta tocoferolo
tr
Vitamina B1
32
34
17
52
Vitamina B2
370
370
280
474
Vitamina B6
106
110
50
185
Vitamina B12
4
4
2
9
Vitamina PP
51
55
20
121
Ac. pantotenico
303
320
227
407
Biotina
23
23
6
74
RE, TE: retinolo e tocoferolo equivalenti
La variabilità esistente tra i contenuti vitaminici dei campioni analizzati non dipende dalla
zona di provenienza (montagna, collina, pianura) né dalla stagione (estate, inverno). Solo il
contenuto di beta-carotene e, in parte, di tocoferolo presentano significative differenze legate alla
stagione: sono più bassi nei campioni invernali rispetto a quelli estivi quando l’animale mangia
foraggi freschi, particolarmente ricchi di queste sostanze.
Infine calcolando, dai dati medi INRAN, le coperture dei fabbisogni nutrizionali garantite
dal consumo di una porzione (50 g) di Parmigiano Reggiano si ottiene quanto indicato nella
7
Tabella 4. Il calcolo è effettuato secondo le GDA (Guideline Daily Amounts) per tutti i nutrienti,
considerando diete da 2000 kcal per le donne e 2500 kcal per gli uomini. Per il riferimento
massimo dell’assunzione di acidi grassi trans (5g/die) sono stati invece utilizzati i LARN (ed.
1996).
Tabella 4: Copertura dei fabbisogni di una donna, di un uomo o di un adulto garantita da
una porzione (50 g) di Parmigiano Reggiano DOP.
Parametro
Copertura giornaliera dei fabbisogni (%)
donna
uomo
Energia
9,7
7,7
Proteine
33,5
27,9
Grassi
20,1
17,6
AG saturi
42,8
28,5
*AG trans
9,4
9,4
12,5
12,5
Sale (NaCl)
adulto
Calcio
72,4
Fosforo
42,4
Ferro
0,7
Magnesio
7,2
Zinco
13,3
Sodio
12,5
Vitamina A
22,4
Vitamina E
2,3
Vitamina B1
1,1
Vitamina B2
11,6
Niacina
0,1
Vitamina B6
2,7
Vitamina B12
200,0
Biotina
7,7
Acido Pantotenico
2,5
*Dati LARN, 1996
Dati GDA, 2007
8
COMPOSIZIONE NUTRIZIONALE E CARATTERISTICHE FUNZIONALI DEL
PARMIGIANO REGGIANO DOP
L'importanza dei prodotti lattiero-caseari nell'alimentazione umana è nota e
riconosciuta da molto tempo. Le proteine di elevato valore biologico e il calcio, presente in
forma particolarmente biodisponibile, di facile assorbimento da parte dell’intestino umano,
costituiscono probabilmente le tematiche più approfondite nello studio di questi prodotti e più
note al grande pubblico. Gli aspetti meno favorevoli legati alla presenza di acidi grassi saturi e
di colesterolo sono ugualmente noti ma, nel passaggio dalla valutazione scientifica alla
percezione del consumatore, sono stati negli anni amplificati e a volte esasperati, senza validi
motivi, dai mass media.
Per molti anni la stampa di informazione e anche alcune riviste scientifiche hanno
imputato al consumo del latte e dei formaggi tutta una serie di “sciagure” come l’obesità,
l’ipercolesterolemia, l’insorgenza di malattie cardiovascolari. Attualmente si ritiene invece
che sia un troppo elevato indice di massa corporea (BMI), causato da una dieta nel complesso
squilibrata e da un’attività fisica insufficiente, la vera causa di questi problemi.
A partire dai primi anni ’90, la ricerca svolta presso l’INRAN si è inserita in questa
problematica utilizzando un approccio diverso da quello classico. E’ stata rivalutata
criticamente e sulla base delle nuove conoscenze scientifiche la presenza dei componenti
considerati “negativi” (colesterolo, acidi grassi ecc.) e nel contempo sono stati messi in risalto
i componenti “positivi” non solo dal punto di vista esclusivamente nutritivo (proteine, calcio)
ma anche "funzionale". Ovvero nel latte e nei formaggi sono state messe in evidenza sostanze
in grado di svolgere una "funzione" fisiologica benefica che si può definire “protettiva” e che
va oltre quella prettamente nutritiva.
Esaminati con questo approccio, i prodotti lattiero-caseari riservano a volte delle
sorprese: prodotti simili per composizione in macronutrienti (proteine e grassi) possono
invece contenere i costituenti cosiddetti "minori" (es. sali, vitamine e isomeri coniugati
dell’acido linoleico ovvero CLA) in quantità molto diversificate. Tra i fattori che determinano
questa variabilità sicuramente la stagione e la razza, ma anche e soprattutto la tecnica di
allevamento del bestiame ovvero lo stile di vita e il benessere dell’animale.
La ricerca condotta presso l'INRAN ha dimostrato come sia riduttivo considerare latte
e prodotti derivati solo ed esclusivamente fonti di nutrienti essenziali (proteine, calcio e
vitamine). Come è stato riportato (Guimont et al., 1997), il latte contiene circa 2000 molecole
9
alcune delle quali presentano una attività biologica particolare ovvero sono, in base alla
definizione data dalla UE, a buona ragione “funzionali” cioè “alimenti che rientrano in una
dieta normale e che contengono composti biologicamente attivi in grado di migliorare la
salute o ridurre il rischio di malattia (EUFIC, 2006)”.
Proteine e componenti funzionali di origine proteica
Le proteine del latte contengono tutti gli amminoacidi “essenziali” che il nostro
organismo non è in grado di sintetizzare e di cui la dieta costituisce l’unica fonte. Gli
amminoacidi isoleucina, leucina, lisina, treonina, triptofano, valina, metionina, fenilalaninatirosina e l’istidina, amminoacido essenziale solo nella prima infanzia, presenti in quantità
ottimale e in forma particolarmente biodisponibile, sono alla base dell’elevato valore
biologico delle proteine del latte e dei prodotti derivati.
Amminoacidi bioattivi del latte sono la metionina, la taurina, la glicina, l'istidina e il
triptofano metabolizzato nell’uomo a serotonina e melatonina (Cestaro, 1994).
Tra le proteine del latte in particolare la lattoferrina si è dimostrata in grado di inibire
direttamente i fenomeni ossidativi (Shinmoto et al., 1992), ma anche i peptidi del siero, di
peso molecolare compreso tra 500 e 5000, sono risultati attivi in vivo prevenendo fenomeni
di lipoperossidazione delle membrane biologiche (Colbert & Decker , 1991).
Le proteine del latte vaccino e dei prodotti lattiero-caseari derivati, oltre ad essere una
fonte di energia e di amminoacidi, possiedono proprietà biologiche, attribuibili a sequenze
peptidiche (costituite da 2-30 residui amminoacidici) potenzialmente bioattive. Alcuni peptidi
ottenibili sia in vitro che in vivo dalla digestione enzimatica soprattutto delle caseine
presentano attività biologiche di particolare interesse. Peptidi caseinici sono in grado di
chelare il ferro impedendo così tutte le reazioni ossidative catalizzate da questo metallo, sono
dotati di attività immuno-stimolante e antinfiammatoria, sono caratterizzati da attività
antipertensive, antitrombotiche e oppioido-simile e possono quindi aumentare il rilascio delle
beta endorfine e in tal modo contrastare lo stato di stress (Schlimme & Meisel, 1997). Alcuni
peptidi caseinici possono anche agire in modo indiretto, facilitando e aumentando
l'assorbimento fisiologico di minerali come il calcio (antipertensivo) e lo zinco
(antiossidante).
Questi peptidi si originano da sequenze amminoacidiche naturalmente presenti nelle
proteine del latte e possono essere liberati e attivati da processi proteolitici (digestivi) durante
10
la maturazione del formaggio (stagionatura) o durante la digestione all’interno del nostro
apparato gastrointestinale.
Tabella 1 – Biopeptidi del latte, provenienza e attività
biopeptidi
Proteina precursore
Bioattività
casomorfine
α-,β-caseina
Agonista oppioide
α-lattorfina
α-lattoalbumina
Agonista oppioide e ACEinibitoria
β-lattorfina
β-lattoalbumina
Agonista oppioide e ACEinibitoria
lattoferroxine
lattoferrina
Antagonista oppioide
casoxina C
κ-caseina
Antagonista oppioide
casoxina D
αs1-caseina
Antagonista oppioide
casochinine
αs1-,β-caseina
ACE-inibitoria e
immunoregolatoria
lattochinine
α-lattoalbumina,
ACE-inibitoria
β-lattoglobulina
sieroalbumina
immunopeptidi
α-,β-caseina
Immunoregolatoria
α-lattoalbumina,
β-lattoglobulina
lattoferricina B
lattoferrina
Immunoregolatoria e
antimicrobica
casocidina
αs2-caseina
Antimicrobica
isracidina
αs1-caseina
Antimicrobica
casoplateline
κ-caseina
Antitrombotica
inibitore
della κ-caseina
Antitrombotica
inibitore
della lattoferrina
Antitrombotica
peptide
trombina
peptide
trombina
caseinofosfopeptidi
αs1-, αs2, β-caseina
Legame e trasporto di minerali
11
Nella produzione dei formaggi vengono utilizzate colture starter di batteri, dotati di un
efficiente sistema proteolitico, che si aggiungono alla flora lattica e che portano alla
produzione di oligopeptidi. Nel tratto gastrointestinale umano gli enzimi digestivi (proteasi
gastriche e intestinali, peptidasi dell’orletto a spazzola) idrolizzano ulteriormente gli
oligopeptidi, concorrendo alla formazione di peptidi bioattivi.
I peptidi bioattivi agiscono nell’organismo dei mammiferi con meccanismi similormonali. I peptidi introdotti preformati oppure prodotti dall’idrolisi intestinale possono
raggiungere i siti target nel lato luminale del tratto gastrointestinale o, dopo essere stati
assorbiti nel circolo sistemico attraverso trasporto carrier-mediato o per via paracellulare,
negli organi periferici.
Dagli anni ’60 numerosi studi hanno portato all’identificazione di diversi peptidi
derivati dalle proteine del latte (α-lattoalbumina, β-lattoglobulina, caseine, immunoglobuline,
lattoferrina, fosfoglicoproteine, transferrina e sieroalbumina) che sono stati caratterizzati dal
punto di vista strutturale e fisiologico (Clare & Swaisgood, 2000; Schlimme & Meisel, 1995;
Shah, 2000). Inoltre, molti di questi peptidi sono dotati di attività multifunzionale, potendo
svolgere due o più attività biologiche (Meisel, 2004). Alcune regioni della struttura primaria
delle proteine contengono sequenze peptidiche sovrapposte che esercitano diversi effetti
biologici. Queste regioni sono state considerate come “zone strategiche” e come tali protette
dalla proteolisi che avviene sulle proteine del latte in modo tale che i biopeptidi possano
esplicare la loro azione funzionale in vivo. (Meisel & Bockelmann, 1999).
Lipidi e componenti funzionali di origine lipidica
Una caratteristica tipica dei lipidi del latte è la presenza di elevate quantità di acidi
grassi a catena corta e media (dal C4 al C10) assorbibili direttamente, senza passare
attraverso le lipoproteine e ciascuno con una attività funzionale specifica.
L’acido butirrico (C4) del latte, affiancandosi al butirrato endogeno prodotto nel colon
dalla flora batterica per fermentazione della fibra alimentare, è in grado di aumentare la
sintesi della melatonina e della metallotioneina, una delle principali proteine antiossidanti del
plasma (Liu et al., 1992) e delle apolipoproteine favorendo l’omeostasi fisiologica del
colesterolo e dei trigliceridi plasmatici (Kaptein et al., 1992).
Gli acidi grassi a catena media sono invece in grado di indurre un fenomeno di
vasodilatazione (White et al., 1991) e di agire sinergicamente con gli acidi grassi a catena
12
corta, contribuendo in modo indiretto ad aumentare le difese antiossidanti dell’organismo
(Cestaro, 1994).
In questi ultimi anni è stato molto approfondito lo studio di un particolare gruppo di
acidi grassi, i CLA o isomeri coniugati dell’acido linoleico. Negli acidi grassi insaturi
naturali, i doppi legami sono normalmente interrotti da un ponte metilenico (non coniugati) e
in forma cis, ovvero con due sostituenti dalla stessa parte rispetto al doppio legame. Durante i
processi di idrogenazione (industriale nella produzione di oli idrogenati o naturale ad opera
degli enzimi del rumine), la sequenza originale dei doppi legami dell’acido grasso polinsaturo
viene modificata e si ha migrazione dei doppi legami in posizione coniugata, isomerizzazione
da cis a trans e, ovviamente, diminuzione del numero totale di doppi legami.
Il CLA è generalmente presente nei grassi alimentari, ma il grasso degli animali
ruminanti e quindi il latte e i formaggi derivati, ne contengono le più elevate concentrazioni.
In particolare nel latte è soprattutto presente il 9cis, 11trans isomero dell’acido linoleico.
(Gurr, 1995). Le proprietà anticancerogeniche di queste sostanze in colture cellulari in vitro
sono ormai generalmente accettate nel mondo scientifico (Parodi, 1997), ma non ancora
confermate sulle cellule umane, ancora dibattute sono invece le proprietà antiossidanti.
Proprietà antiossidanti sono state anche attribuite ai fosfolipidi contenuti nel latte:
fosfatidilserina (Yoshida et al., 1991), sfingomielina e il suo catabolita sfingosina (Franson et
al., 1992).
Importante è anche il contenuto nel latte di derivati della colina (glicerofosfocolina e
fosfocolina) che per l’attività chelante sul ferro (Gordon et al., 1991) possono essere definiti
degli antiossidanti indiretti.
Carboidrati e componenti funzionali di origine glucidica
Il lattosio, il carboidrato più presente nel latte, scompare nelle primissime ore dopo la
caseificazione, infatti la trasformazione del lattosio in acido lattico e la conseguente
acidificazione dell’ambiente, è uno dei cardini del processo produttivo del Parmigiano
Reggiano DOP. La rapida scomparsa del lattosio può anzi costituire un parametro per
controllare sperimentalmente la corretta lavorazione del prodotto.
L’assenza del lattosio nel formaggio stagionato pronto per il consumo è un dato molto
importante per i soggetti intolleranti ovvero per gli individui che, per insufficiente presenza
dell’enzima lattasi, non sono in grado di digerire il lattosio.
13
L’intolleranza al lattosio causa, oltre a una riduzione della varietà della dieta dovuta
alla necessità di eliminare latte e formaggi freschi, anche un apporto di calcio inferiore al
fabbisogno. Al contrario, evidenze sempre più numerose mostrano che soggetti con deficit di
lattasi possono ottenere adeguati apporti di calcio con prodotti lattiero-caseari stagionati,
yogurt con fermenti lattici vivi contenenti lattasi, latte privo o a ridotto contenuto di lattosio.
Sulla base delle norme proposte della Commissione Europea relativa ai latti artificiali
per il neonato e il lattante. (http:// europa.eu.int /comm /food /fs /sc /scf /index_en.html) e dei
risultati di numerose analisi, il Parmigiano Reggiano DOP può essere definito “lactose free”
(senza lattosio) ed è questa una delle caratteristiche che lo rendono “naturalmente funzionale”.
Altri carboidrati: gli oligosaccaridi.
In tutti i campioni esaminati presso il Consorzio sono stati individuati numerosi picchi
riferibili a oligosaccaridi. Il pattern di tali picchi ha dimostrato una sequenza abbastanza
costante nei diversi campioni esaminati. Viceversa tali picchi non sono rilevabili nel latte
bovino. La loro presenza nel Parmigiano Reggiano potrebbe essere ricondotta all’azione dei
processi fermentativo-digestivi che si verificano durante la produzione del formaggio
attraverso la sintesi di nuovi oligosaccaridi o la liberazione di catene oligosaccaridiche da
molecole più complesse quali caseina e altre glicoproteine (Coppa, 2007)
Gli oligosaccaridi presenti nel latte, sono formati da un numero di monosaccaridi non
superiore a 10. Nel latte umano se ne possono trovare quantità variabili tra 5 e 8 grammi per
litro (Gnoth e al., 2002), tra i campioni di latte fino a oggi analizzati, solo il latte di elefante
risulta contenerne quantità confrontabili. Per quanto a livelli molto più bassi che nel latte
umano, gli oligosaccaridi sono presenti anche nel latte ovino e caprino (Beccati et al., 1999).
Alcuni studi hanno inoltre dimostrato che nel latte di capra la frazione oligosaccaridica è
presente in maggiore quantità che nel latte vaccino commerciale.
Gli oligosaccaridi vengono sintetizzati in vivo per glicosilazione del lattosio a opera di
glicosil transferasi specifiche.
I residui monosaccaridici presenti nella molecola degli
oligosaccaridi sono essenzialmente galattosio, glucosio, N-acetil glucosamina, fucosio e acido
sialico. Un esempio delle principali molecole di oligosaccaridi presenti nel latte vaccino sono
riportate in Tabella 3.
Nel latte umano sono principalmente presenti glicosidi N acetilati, noti come fattori di
crescita del Lactobacillus bifidus e caratterizzati da una positiva influenza sulla flora
intestinale dei bambini allattati al seno (Saksena et al, 1999).
14
Prerequisito indispensabile perché ciò avvenga è che gli oligosaccaridi siano assorbiti
come tali nell’intestino tenue e infatti oligosaccaridi intatti sono stati ritrovati nelle urine di
neonati allattati al seno (Gnoth et al., 2002). Saggi microbiologici in vitro effettuati
utilizzando diverse frazioni di oligosaccaridi isolati da latte umano, hanno anche dimostrato
una inibizione della adesività di germi patogeni a cellule epiteliali in coltura (Coppa et al.,
1999).
Tabella 3. Oligosaccaridi neutri e acidi nel latte e nel colostro vaccino
Oligosaccaridi neutri
Oligosaccaridi acidi
3 -Galattosil-lattosio
6- Galattosil - lattosio
3-Sialil- lattosio
6-Sialil- lattosio
3-Fucosil N-acetil-lactosamine
6-Glucolilneuraminil- lattosio
N-Acetil-lattosamina
6-Sialil-lattosamina
N-Acetilgalattosaminil glucosio
6-Glucolilneuraminil-lattosamina
N-Acetilgalattosil- lattosio
3-Sialil galactosyl- lattosio
Latto-N-novopentaose
Disialil lattosio
3 - Galattosil lattosio
Sialil-lattosamina-1-fosfato
Sialil-lattosamina-6-fosfato
3-Glucolilneuraminil- lattosio
Gli oligosaccaridi sono inoltre coinvolti in molti processi di riconoscimento cellulare e
posseggono numerose attività biologiche quali quella immunostimolante, anti infiammatoria,
anti virale e immunologica (Saksena et al., 1999).
Nel latte, sia nella frazione grassa che in quella acquosa, è stata evidenziata la
presenza, in quantità non ben definita, di glicosaminoglicani: con questa denominazione si
identifica una classe di molecole naturali regolatrici di primarie attività biologiche quali tra
l’altro l’interazione con i fattori di crescita e la regolazione delle funzioni di coagulazione del
sangue, antitrombotiche, anti virali e anti infiammatorie (Casu & Lindahl, 2001).
Il concetto di prebiotico inteso come ingrediente non digeribile che agisce
positivamente sulla salute dell’ospite stimolando la crescita di batteri probiotici si addice
perfettamente agli oligosaccaridi naturali del latte che, anche nell’organismo adulto, non
vengono digeriti e assorbiti nella parte alta dell’intestino e giungono nel colon dove possono
agire da substrato di crescita e di selezione per la microflora.
Ben altra importanza sembrano avere alcuni oligosaccaridi presenti nel latte e
contenenti un composto anionico, l’acido n-acetil-neuramminico o acido sialico, dotato di
spiccata attività antiossidante per la capacità di chelare stabilmente il ferro (Cestaro, 1994).
15
Nel complesso gli oligosaccaridi del latte presentano attività antinfiammatoria, antibatterica,
antivirale e immunostimolante (Pilatte et al., 1993).
Vitamine e componenti funzionali vitaminici
Nel latte le vitamine presenti in maggiore quantità sono la vitamina A, E e K tra le
vitamine liposolubili, e la vitamina C, acido folico e riboflavina tra le vitamine idrosolubili.
Le più importanti vitamine con attività antiossidante sono la vitamina C e la vitamina
E. La vitamina C, la cui forma principale è l’acido ascorbico idrosolubile, è in grado di
bloccare i radicali liberi e numerose specie reattive dell’ossigeno in fase acquosa
(Giammarioli et al, 1998).
beta carotene
Meccanismo antiossidante:
1
O2 + 1carotene
3
carotene
3
1
O2 + 3carotene
carotene + calore
R1
5
OH
6
4'
R2
7
8
O
8'
2
R3
Tocolo
R1
5,7,8 trimetil tocolo (alfa tocoferolo) CH3
7,8 dimetiltocolo (beta tocoferolo) H
5,8 dimetiltocolo (gamma tocoferolo)CH3
8 metiltocotrienolo (delta tocoferolo) H
Meccanismo antiossidante:
ROO. + tocoferolo
RO. + tocoferolo
ROO. + tocoferolo.
RO. + tocoferolo.
R2
R3
CH3
CH 3
H
H
CH3
CH3
CH 3
CH 3
ROOH + tocoferolo.
ROH + tocoferolo.
ROO-tocoferolo
RO-tocoferolo
16
La vitamina E è costituita da un gruppo di sostanze liposolubili (4 tocoferoli e 4
tocotrienoli) che agiscono donando un atomo di idrogeno e interrompendo in questo modo la
catena di reazioni di ossidazione. Sia la vitamina C che la vitamina E sono presenti nel latte,
sia pure in quantità non elevatissima.
Presente solo nel latte vaccino è invece il beta carotene, precursore della vitamina A e
antiossidante in fase lipidica. La sua efficacia risiede soprattutto nella capacità di dissipare,
grazie alla sua struttura molecolare, il surplus di energia del radicale libero. L’energia in
eccesso viene dispersa sotto forma di calore senza danneggiare la molecola del carotenoide
che è quindi riutilizzabile per una nuova efficace azione antiossidante (Stahl, 1996).
La vitamina D è presente nel latte in piccole quantità
variabili tra 0,01 e 0,2
ug/100ml, nei formaggi grassi fino a 50 ug/100g. Di questa vitamina si stanno ipotizzando
effetti protettivi che vanno ben al di là di quelli relativi alla salute delle ossa. Sembrerebbe
che una carenza di vitamina D aumenti anche il rischio di alcune patologie quali tumori,
diabete tipo 1 e malattie cardio vascolari (Marshall, 2008).
Oligoelementi antiossidanti
Importante
tra gli oligoelementi la presenza nel latte di selenio, attivatore della
glutatione perossidasi e il calcio per le sue proprietà ipotensive e antistress (Hamet, 1997).
Nei prodotti lattiero-caseari, dove il calcio si trova in forma organica ed inorganica, ricorrono
le premesse più confacenti per un buon assorbimento, pari al 43-45%, di questo minerale.
Particolarmente importante l’azione dello zinco, presente in concentrazioni
significative nel latte. Questo elemento è in grado di attivare la superossido dismutasi,
inibire l’attività pro-ossidante del ferro, indurre la sintesi della metallotioneina ed attivare
l’ornitina decarbossilasi per la sintesi delle poliammine (Cestaro, 1994).
17
Bibliografia
Bardocz S., 1993. Eur. J. Clin. Nutr., 47(10), 683-690.
Beccati D, Casu B, Naggi A, Sturiale L, Torri G, Coppa G, Bruni S. 1999; In profilo
composizionale degli oligosaccaridi potrebbe differenziare il latte delle diverse specie
animali. Caseus, 4:20-2.
Casu B, Lindahl U. 2001; Structure and biological interactions of heparin and heparan sulfate.
Adv carbohydr chem biochem, 57:159-206.
Cestaro B., Per una vita inossidabile. Apporti nutrizionali del latte e derivati.
1994,
ETASLIBRI RCS Medicina, Milano.
Clare DA, Swaisgood HE. 2000; Bioactive milk peptides: a prospectus. JDairy Sci 83:11871195
Colbert L.B., Decker E.A., 1991. J. Food Sci. 56(5), 1248-1250.
Coppa GV, Bruni S, Zampini L, Pierani P, Facinelli B, Gabrielli O. 1999; Bacterial adhesivity
inhibtion by human milk oligosacharides. Pediatric res. 45:744.
Coppa GV, 2007.Caratterizzazione biochimica dei carboidrati dei carboidrati contenuti nel
formaggio Parmigiano Reggiano a diversi tempi di stagionatura. Quaderni del Parmigiano
Reggiano pp.62-81.
FAO/WHO Expert Consultation. Protein quality evaluation. Food and Nutrition Paper No. 51,
FAO, Roma, 1991.
Franson R.C., Harris L.K., Ghosh S.S., Rosenthal M.D., 1992. Biochim. Biophys. Acta,
1136(2), 169-174.
Giammarioli S., Filesi C., Sanzini E., 1998. La Rivista di Scienza dell'Alimentazione, 1, 6376.
Gnoth MJ, Rudloff S, Kunz C, Kinne RKH, 2002; Studies on the intestinal transport of
humanmilk oligosaccharides (HMO) using Caco-2 cells. Food Research International
35:145-9.
Gordon L.I., Weiss D., Prachand S., Weitzman S.A., 1991. Free Rad. Res. Commun. 15(1),
65-71.
Guimont C., Marchall E., Girardet J.M., Linden G., 1997. CRC in Food Science and
Nutrition, 37(4), 393-410.
Gurr M., 1995. Lipid Tech., 11, 133-135.
Hamet P., 1997 in Latte e Derivati. Tra tecnologia e nutrizione. INN, Roma, pp.349-351.
International Dairy Federation (IDF). 1991. B-Document 198.
18
Kaptein A., Roodenburg L., Princen H.M. 1992. Clin. Biochem., 25(5), 317-319.
Liu J., McKim J.M., Liu Y.P., Klaassen C.D. 1992. In vitro Cell. Dev. Biol., 28A(5), 320326.
Marshall T.G. 2008 Vitamin D discovery outpaces FDA decision making. Bioassays, 30(2),
173-182.
Meisel H, Bockelmann W. 1999 Bioactive peptides encrypted in milk proteins: proteolytic
activation and thropho-functional properties. Antonie van Leeuwenhoek;76:207-215).
Meisel H. 2004 Multifunctional peptides encrypted in milk proteins. Biofactors;21:55-61
Meisel H. 2005 Biochemical properties of peptides encrypted in bovine milk proteins.
CurrMed Chem;12:1905-1919
Parodi P.W., 1997. J.Nutrition, 127(6), 1055-1060.
Pilatte Y., Bignon J., Lambre C.R., 1993. Glycobiology, 3(3), 201-218.
Saksena R, Deepak D, Khare A, Sahai R, Tripathi LM, Srivastava VML. 1999. Biochimica et
Biophysica Acta;1428:433-45,
Schlimme E, Meisel H. 1995 Bioactive peptides derived from milk proteins.Structural,
physiological and analytical aspects. Nahrung;39(1):1-20
Schlimme E., Meisel H., 1997 in Latte e Derivati. Tra tecnologia e nutrizione. INN, Roma,
pp.39-42.
Shah NP. 2000 Effects of milk-derived bioactives: an overview. Br J Nutr; 84 Suppl 1:S3S10)
Shinmoto H., Dosako S., Nakajima I., 1992. Biosci. Biotech. Biochem., 56(12), 2079-2080.
Stahl W., Sies H., 1996. Arch. Bioc. Bioph, 1, 1-9.
White R.P., el-Bauomy A.M., Wood W.B., 1991. Gen. Pharmacol., 22(4), 741-748.
Yates M.T., Lambert L.E., Whitten J.P., Mc Donald I., Mano M., Ku G., Mao S.J., 1992.
FEBS Lett., 309(2), 135-138.
Yoshida K., Terao J., Suzuki T., Takama K., 1991. Biochem. Biophys. Res. Commun.,
179(2), 1077-1081.
19
IL PARMIGIANO REGGIANO È UN PRODOTTO FUNZIONALE?
NATURALMENTE!
Nel Parmigiano-Reggiano sono presenti alcuni composti “funzionali”, in grado di
produrre effetti benefici sulla salute e sul benessere del consumatore.
In particolare:
peptidi “nascosti” nelle proteine, che possono essere liberati da processi proteolitici
durante la produzione o durante la digestione ed esercitare una modulazione di processi
metabolici. Tali peptidi, detti bioattivi, sono caratterizzati da attività di tipo anti-ipertensivo
(ACE-inibitore), immunomodulante (stimolazione dei macrofagi, protezione nei confronti di
infezioni batteriche), di trasporto di minerali (specialmente del calcio), antiaggregante
piastrinica, battericida, oppioide.
oligosaccaridi con funzione prebiotica, cioè carboidrati a catena corta non digeribili
che hanno la capacità di stimolare la crescita e/o l’attività di uno o più batteri nel colon
esercitando effetti benefici sulla salute. A partire dagli anni’80 è stata ipotizzata la presenza
nel Parmigiano-Reggiano di un “fattore bifidogeno” dotato di specifica attività prebiotica.
isomeri coniugati dell’acido linoleico (CLA) per i quali sono state ipotizzate attività
anticancerogena, antiaterogena, antiobesità, antidiabetogena, antiaggregante, di stimolazione
della mineralizzazione ossea, della risposta immunitaria, di regolazione della risposta
allergenica.
In conclusione:
il Parmigiano Reggiano, per l’assenza di lattosio, è consigliabile ai diabetici, ai
soggetti intolleranti al lattosio per deficit di lattasi ed in alcune patologie gastrointestinali.
il Parmigiano-Reggiano è una fonte molto efficiente di calcio per le grandi quantità
che apporta (1159 mg/100g) e per la particolare biodisponibilità.
20
ALLEGATO 1 - PEPTIDI BIOATTIVI
Negli ultimi anni sempre maggiore attenzione è stata dedicata allo studio dei cosiddetti
“peptidi bioattivi”. Questi residui della digestione o della fermentazione delle proteine di un
alimento (latte soprattutto, ma anche glutine) presentano specifiche funzioni biologiche che si
affiancano al più noto ruolo nutrizionale. Fonte specifica di queste sostanze è la caseina, ma
anche le proteine del siero di latte possono contribuire alla formazione dei bio-peptidi. La
presenza di questi peptidi è stata ricercata in proteine diverse provenienti da latte vaccino e in
proteine derivanti da specie animali diverse: l’alfa s1 caseina bovina e la beta caseina sono
sicuramente le proteine-fonte più promettenti, ma anche le lattoalbumine beta (proteine del
siero) di provenienza bovina, ovina e caprina possono rappresentare un substrato adatto alla
formazione di peptidi bioattivi.
Diverse le attività fisiologiche di queste sostanze: all’attività oppiacea si affianca
l’attività immunostimolante e quella antitrombotica ed antipertensiva. In particolare alcuni
fosfopeptidi sono in grado di formare complessi chelati con ioni metallici, calcio e magnesio
in particolare, favorendone l’assorbimento intestinale.
Ciò provoca un miglioramento
generale nelle condizioni di salute del consumatore e quindi una maggiore resistenza allo
stress ossidativo. Inoltre, per caratteristiche più spiccatamente chimiche (meccanismi ossidoriduttivi e potere chelante) questi composti sono in grado di esercitare un’azione antiossidante
diretta. I siti di fosforilazione, fortemente conservati nel corso dell’evoluzione, prevedono una
sequenza costituita da serina e treonina associate come indicato nella Tabella seguente .
Peptidi chelanti - Siti di fosforilazione
Nome
Sequenza
Proteina-fonte
Residuo serina
Ser - X - AA acido
α - β caseina
Residuo treonina
Thr - X - AA acido
α - β caseina
AA Acido: asparagina - acido aspartico; glutammina - acido glutammico
21
Peptidi bioattivi
Nome
Sequenza
Proteina-fonte
beta
casomorfina
(oppioide
agonista)
esorfina (alfa casomorfine)
esorfina (alfa casomorfine)
lattorfine (oppioide agonista)
lattorfine (oppioide agonista)
lattotensine
(stimolante
muscol.liscia)
casoxina (oppioide antagonista)
casoxina (oppioide antagonista)
casoxina (oppioide antagonista)
peptidi immunostimolanti
peptidi immunostimolanti
peptidi immunostimolanti
casochinine (antipertensivo)
casochinine (antipertensivo)
casochinine (antipertensivo)
casochinine (antipertensivo)
peptidi
antitrombotici
(casoplateline)
peptidi
antitrombotici
(casoplateline)
peptidi
antitrombotici
(casoplateline)
peptidi
antitrombotici
(casoplateline)
fosfopeptidi (legante di minerali)
fosfopeptidi (legante di minerali)
fosfopeptidi (legante di minerali)
fosfopeptidi (legante di minerali)
YPFPGPI
beta caseina
RYLGYLE
RYLGYL
YGLF
YLLF
HIRL
alfa caseina
alfa caseina
alfa l.albumina
beta l.globulina
beta l.globulina
SRYPSY
RYPSY
YPSY
TTMPLW
PGPIPN
LYE
FFVAP
FFVAPFPEVFGK
YEEPVLGPVR
AVPYPQR
LSFMAIPPK
cappa caseina
cappa caseina
cappa caseina
alfa caseina
beta caseina
beta caseina
alfa caseina
alfa caseina
beta caseina
beta caseina
cappa caseina
MAIPPKK
cappa caseina
MAIPPKKNQDK
cappa caseina
NQDK
cappa caseina
SSSEEIVPN
DIGSESTEDQAMEDIK
QMEAESISSSEEIVPNSVQEK
RELEELNVPGEIVESLSSSEESIT
R
alfa caseina
alfa caseina
alfa caseina
beta caseina
22
INDIVIDUAZIONE DEI PEPTIDI BIO-ATTIVI
POTENZIALMENTE PRESENTI NELLA SEQUENZA AMMINOACIDICA
DELLE PRINCIPALI PROTEINE DEL LATTE
N.B. Le sequenze di amminoacidi di cui è nota la bio-attività sono riportate in grassetto.
alfa s1 caseina bovina (B 8P)
RPKHPIKHQGLPQEVLNENL
SKDIGSESTEDQAMEDIKQM
IQKEDVPSERYLGYLEQLLR
HSMKEGIHAQQKEPMIGVNQ
SGAWYYVPLGTQYTDAPSFS
LRFFVAPFPEVFGKEKVNEL
EAESISSSEEIVPNSVQEKH
LKKYKVPQLEIVPNSAEERL
ELAYFYPELFRQFYQLDAYP
DIPNPIGSENSEKTTMPLW
40
80
120
160
199
KQEKNMAINPSKENLCSTFC
SAEVATEEVKITVDDKHYQK
QGPIVLNPWDQVKRNAVPIT
MESTEVFTKKTKLTEEEKNR
KTVYQHQKAMKPWIQPKTKV
40
80
120
160
200
207
ESITRINKKIEKFQSEEQQQ
PFPGPIPNSLPQNIPPLTQT
AMAPKHKEMPFPKYPVQPFT
QSWMHQPHQPLPPTVMFPPQ
PQRDMPIQAFLLYEEPVLGP
40
80
120
160
200
209
KIAKYIPIQYVLSRYPSYGL
YAKPAAVRSPAQILQWQVLS
PHLSFMAIPPKKNQDKTEIP
STVATLEASPEVIESPPEIN
40
80
120
160
169
alfa s2 caseina bovina (A 11P)
KNTMEHVSSSEESIISQETY
KEVVRNANEEEYSIGSSSEE
ALNEINEFYQKFPQYLQYLY
PTLNREQLSTSEENSKKTVD
LNFLKKISQRYQKFALPQYL
IPYVRYL
beta caseina (A1 5P)
RELEELNVPGEIVESLSSSE
TEDELQDKIHPFAQTQSLVY
PVVVPPFLQPEVMGVSKVKE
ESQSLTLTDVENLHLPPLLL
SVLSLSQSKVLPVPEKAVPY
VRGPFPIIV
kappa caseina (B1 P)
EEQNQEQPIRCEKDERFFSD
NYYQQKPVALINNQFLPYPY
DTVPAKSCQAQPTTMARHPH
TINTIASGEPTSTPTIEAVE
TVQVTSTAV
23
beta lattoglobulina bovina
LIVTQTMKGLDIQKVAGTWY
VYVEELKPTPEGDLEILLQK
VFKIDALNENKVLVLDTDYK
CLVRTPEVDDEALEKFDKAL
HI
SLAMAASDISLLDAQSAPLR
WENDECAQKKIIAEKTKIPA
KYLLFCMENSAEPEQSLVCQ
KALPMHIRLSFNPTQLEEQC
40
80
120
160
162
VSLPEWVCTTFHTSGYDTEA
CKNDQDPHSSNICNISCDKF
INYWLAHKALCSEKLDQWLC
40
80
120
123
alfa lattoalbumina
EQLTKCEVFRELKDLKGYGG
IVENNQSTDYGLFQINNKIW
LNNDLTNNIMCVKKILDKVG
EKL
24
INDIVIDUAZIONE DELLE SEQUENZE CHELANTI
POTENZIALMENTE PRESENTI NELLA SEQUENZA AMMINOACIDICA
DELLE PRINCIPALI PROTEINE DEL LATTE
N.B. Le sequenze di amminoacidi di cui è noto il potere chelante sono sottolineate.
alfa s1 caseina bovina (B 8P)
RPKHPIKHQGLPQEVLNENL
SKDIGSESTEDQAMEDIKQM
IQKEDVPSERYLGYLEQLLR
HSMKEGIHAQQKEPMIGVNQ
SGAWYYVPLGTQYTDAPSFS
LRFFVAPFPEVFGKEKVNEL
EAESISSSEEIVPNSVQEKH
LKKYKVPQLEIVPNSAEERL
ELAYFYPELFRQFYQLDAYP
DIPNPIGSENSEKTTMPLW
40
80
120
160
199
KQEKNMAINPSKENLCSTFC
SAEVATEEVKITVDDKHYQK
QGPIVLNPWDQVKRNAVPIT
MESTEVFTKKTKLTEEEKNR
KTVYQHQKAMKPWIQPKTKV
40
80
120
160
200
207
ESITRINKKIEKFQSEEQQQ
PFPGPIPNSLPQNIPPLTQT
AMAPKHKEMPFPKYPVQPFT
QSWMHQPHQPLPPTVMFPPQ
PQRDMPIQAFLLYEEPVLGP
40
80
120
160
200
209
KIAKYIPIQYVLSRYPSYGL
YAKPAAVRSPAQILQWQVLS
PHLSFMAIPPKKNQDKTEIP
STVATLEASPEVIESPPEIN
40
80
120
160
169
alfa s2 caseina bovina (A 11P)
KNTMEHVSSSEESIISQETY
KEVVRNANEEEYSIGSSSEE
ALNEINEFYQKFPQYLQYLY
PTLNREQLSTSEENSKKTVD
LNFLKKISQRYQKFALPQYL
IPYVRYL
beta caseina (A1 5P)
RELEELNVPGEIVESLSSSE
TEDELQDKIHPFAQTQSLVY
PVVVPPFLQPEVMGVSKVKE
ESQSLTLTDVENLHLPPLLL
SVLSLSQSKVLPVPEKAVPY
VRGPFPIIV
kappa caseina (B1 P)
EEQNQEQPIRCEKDERFFSD
NYYQQKPVALINNQFLPYPY
DTVPAKSCQAQPTTMARHPH
TINTIASGEPTSTPTIEAVE
TVQVTSTAV
25
beta lattoglobulina bovina
LIVTQTMKGLDIQKVAGTWY
VYVEELKPTPEGDLEILLQK
VFKIDALNENKVLVLDTDYK
CLVRTPEVDDEALEKFDKAL
HI
SLAMAASDISLLDAQSAPLR
WENDECAQKKIIAEKTKIPA
KYLLFCMENSAEPEQSLVCQ
KALPMHIRLSFNPTQLEEQC
40
80
120
160
162
VSLPEWVCTTFHTSGYDTEA
CKNDQDPHSSNICNISCDKF
INYWLAHKALCSEKLDQWLC
40
80
120
123
alfa lattoalbumina
EQLTKCEVFRELKDLKGYGG
IVENNQSTDYGLFQINNKIW
LNNDLTNNIMCVKKILDKVG
EKL
26
Codici per gli Amminoacidi
Nome
Acido aspartico
Asparagina
Treonina
Serina
Acido glutammico
Glutammina
Prolina
Glicina
Alanina
Valina
Isoleucina
Leucina
Tirosina
Fenilalanina
Lisina
Istidina
Arginina
Cisteina
Metionina
Triptofano
1 lettera
3 lettere
D
N
T
S
E
Q
P
G
A
V
I
L
Y
F
K
H
R
C
M
W
Asp
Asn
Thr
Ser
Glu
Gln
Pro
Gly
Ala
Val
Ile
Leu
Tyr
Phe
Lys
His
Arg
Cys
Met
Trp
Bibliografia
Le sequenze amminoacidiche sono state tratte dai seguenti lavori:
Schlimme E., Meisel H., 1995. Die Nahrung, 1, 1-20.
Wong D.W.S., Camirand W.M., Pavlath A.E., 1996. CRC Science and Nutrition, 36(8), 807-844.
Pihlanto-Leppala A., Paakkari I., Rinta-Koski M., Antila P., 1997. J. Dairy Res., 64, 149-155
27