Sessione IV: Olivo - Agraria - Università degli Studi di Bari

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Progetto POM A32 “Norme fitosanitarie e commercializzazione delle produzioni vivaistiche”
Locorotondo (BA), 4 – 7 dicembre 2001
Sessione III
OLIVO
COORDINATORE
G. MAGNANO DI SAN LIO,
Dipartimento di Agrochimica e Agrobiologia,
Università degli Studi di Reggio Calabria
Organismi patogeni di qualità dell’olivo
1
Cariddi C., A. Ippolito1, F. Nigro1, G. Romanazzi1, M. Saponari1, V. Savino1,
N. Vovlas2
1
Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata, Università degli Studi di Bari
2
Istituto di Nematologia Agraria, CNR-Bari
PREMESSA
1. Batteri
1.1. Rogna dell’olivo
2. Funghi
2.1. Verticilliosi dell’olivo
3. Virus ed agenti virus-simili
3.1. Virus del mosaico dell’Arabis (ArMV)
3.2. Virus della maculatura latente della fragola (SLRV)
3.3. Virus dell’accartocciamento fogliare del ciliegio (CLRV)
3.4. Virus associato all’ingiallimento fogliare dell’olivo (OLYaV)
Organismi patogeni di qualità dell’olivo
Premessa
L’olivo, principale coltura arborea dell’Italia Meridionale e della Puglia in particolare, è
affetto da diverse malattie di origine fungina, batterica, virale e fitoplasmica di più o meno rilevante
importanza economica. Gli agenti causali che persistono nel materiale di propagazione assumono
particolare rilevanza ai fini della diffusione delle malattie e, pertanto, meritano una attenta
considerazione nella filiera di produzione vivaistica. Il D.M. del 14/4/1997, relativo alle norme
tecniche sulla commercializzazione dei materiali di moltiplicazione delle piante da frutto destinate
alla produzione di frutto, introducendo la categoria C.A.C. (Conformità Agricola Comunitaria),
stabilisce i requisiti fitosanitari che tali materiali di moltiplicazione devono possedere e costituisce
un importante strumento normativo per la produzione di materiale di propagazione di qualità.
La produzione di piantine sane richiede l’adozione di appropriate tecniche di allevamento
lungo tutto il ciclo di produzione vivaistica. Al riguardo, nell’ambito dell’attività svolta per il
progetto POM A32, sono stati individuati i punti critici, ossia quelle fasi od operazioni del
processo produttivo in cui possono verificarsi infezioni, per la produzione di materiale olivicolo
conforme ai requisiti minimi previsti dal decreto. Inoltre, si è ritenuto utile indicare gli obblighi che
vivaisti e Servizio fitosanitario devono rispettare e, infine, alcuni consigli pratici
rivolti agli
agricoltori.
Relativamente alla definizione di “requisiti fitosanitari” di cui all’art. 5 e all’elenco dei
patogeni di “qualità” riportato nell’allegato II del D.M. del 14/4/1997, per l’olivo si è ritenuto
opportuno, sulla base della rilevanza economica dei patogeni trasmessi attraverso il materiale di
propagazione, dell’esperienza maturata nell’ambito del Progetto POM A32 e dei dati disponibili in
letteratura, precisare gli agenti virali responsabili delle malattie nonché di integrare l’elenco delle
specie di nematodi riportate nel suddetto DM (Tabella 1). In particolare, per i virus e gli agenti
virus-simili, si è ritenuta poco proponibile, sotto il profilo economico per il vivaista e tecnico per il
laboratorio accreditato, la necessità di garantirne l’assenza da tutti. Tenendo conto di questo e dei
protocolli di importazione dei Paesi extraeuropei, con lo scopo di rendere più efficaci ed operative
le proposte del progetto, si propone di considerare tra gli agenti virali finora segnalati su olivo quelli
che per la loro epidemiologia (trasmissione per polline, seme), per la loro ubiquitarietà (ArMV,
SLRV, CLRV) potrebbero rappresentare una sorgente di inoculo per la stessa specie o per altre
specie ospiti sulle quali causano gravi danni, per la loro associazione a sintomatologie di campo ben
evidenti (OLYaV).
Per una più facile e rapida consultazione, le informazioni più importanti per ciascun
patogeno dell’olivo (l’inquadramento sistematico, le piante ospiti, la distribuzione geografica, le
modalità di diffusione, la sintomatologia, la modalità di diagnosi, i principi di lotta), nonchè i
protocolli diagnostici per i diversi agenti patogeni, sono state raccolte in apposite schede.
Tabella 1. Malattie ed organismi patogeni pregiudizievoli la qualità previsti dall’allegato II del
D.M. 14/4/1997 e proposta dal Progetto POM A32
ALLEGATO II
D.M. 14/04/1997
Malattia
PROPOSTA
PROGETTO POM A32
Agente
Malattia
Agente
Batteri
Rogna dell’olivo
Pseudomonas savastanoi Rogna dell’olivo
pv savastanoi
Tracheoverticilliosi
Verticillium dahliae
Funghi
Tutti
Tutti
Tracheoverticilliosi
Virus E Agenti Virus Simili
Mosaico dell’Arabis
ArMV,
Maculatura anulare
latente della fragola
SLRV
Accartocciamento
fogliare del ciliegio
Giallume fogliare
dell’olivo
CLRV
OLYaV
Nematodi
Galle alle radici
Meloidogyne spp.
Galle alle radici
Lesioni alle radici
Lesioni alle radici
Meloidogyne javanica,
e M. incognita
Pratylencus vulnus,
Xiphinema
diversicaudatum
1. BATTERI
1.1. Rogna dell’olivo
Inquadramento tassonomico
Famiglia
Genere
Specie
Pseudomonadacae
Pseudomonas
Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi (sin. Pseudomonas
syringae subsp. savastanoi)
Distribuzione geografica: ubiquitario
Modalità di diffusione
Il batterio sopravvive all’interno dei tubercoli e come epifita sul filloplano da dove, in
seguito a lesioni recenti causate da gelate, grandine, tagli di potatura, operazioni di raccolta e caduta
delle foglie può colonizzare i tessuti della pianta, dando luogo alle escrescenze (tubercoli). Nelle
aree meridionali le popolazioni epifitiche del batterio raggiungono la massima densità in autunno
(mese di novembre in particolare) e in primavera (mese di aprile in particolare). Tale disponibilità
d’inoculo diviene particolarmente importante nel periodo autunno-invernale quando la filloptosi è
più intensa e quindi più elevata la possibilità di infezione attraverso le cicatrici fogliari. La
diffusione negli ambienti di coltivazione avviene ad opera della pioggia, del vento, degli insetti (es.
Dacus oleae). Piogge abbondanti seguite da elevata umidità ambientale e temperature comprese tra
21 e 24 °C rappresentano le condizioni ottimali per lo sviluppo della malattia.
Piante ospiti: Olivo
Sintomatologia
La malattia può manifestarsi su tutti gli organi epigei della pianta ma soprattutto sui giovani
rami. Su questi ultimi si formano tipiche escrescenze (tubercoli) isolate o, nel caso di forti attacchi,
confluenti, di forma sferoidale, di diametro variabile da pochi millimetri fino a qualche centimetro,
dapprima di colore verdastro e a superficie liscia, poi di colore grigiastro ed infine di colore
brunastro con superficie screpolata e di consistenza legnosa. Tali escrescenze possono essere
presenti anche su foglie e piccioli e più raramente sui frutti (Tavola I).
Diagnosi
Isolamento su Agar-Nutritivo-Saccarosio (colonie bianco-crema leggermente convesse dopo
3-4 giorni di incubazione a 25 °C) o su Agar-King B (colonie debolmente fluorescenti dopo 2-3
giorni di incubazione a 25 °C); saggio LOPAT ed altri saggi biochimici, nutrizionali e fisiologici
consigliati per la identificazione delle patovar di Pseudomonas syringae, saggi sierologici (ELISA o
immunofluorescenza indiretta). Saggi di conferma: analisi degli acidi grassi cellulari o PCR.
Lotta
Attento controllo sanitario delle piante madri e in vivaio, eliminazione dei rami
particolarmente infetti, trattamenti con composti rameici, in particolare, dopo gelate, grandinate,
potatura e raccolta meccanica. È consigliabile anche effettuare almeno un trattamento nel periodo
autunnale-invernale durante il quale si ha una maggiore caduta delle foglie e uno durante il periodo
di fine inverno inizio primavera quando maggiore è il pericolo di gelate.
Punti critici
Per i vivaisti: utilizzare materiale di moltiplicazione prelevato da piante madri sane controllate
mediante controlli visivi.
Consigli pratici
Per i vivaisti: poiché il batterio è spesso presente come epifita anche sulle piante di olivo
asintomatiche, prima di effettuare il taglio per il prelievo delle marze, è consigliabile
effettuare un trattamento con composti rameici allo scopo di “ripulire” le piante da eventuali
cellule del patogeno presenti sulla superficie.
TAVOLA I
Fig. 1 - Tubercoli di “rogna” su rametto di olivo
Fig. 2 - Gravi infezioni di “rogna” su giovane pianta di olivo
2. FUNGHI
2.1. Verticilliosi dell’olivo
Regno
Divisione
Sottodivisione
Classe
Ordine
Famiglia
Genere
Specie
Mycetae
Eumycota
Deuteromycotina
Hyphomycetes
Hyphales
Mucedinacee
Verticillium
V. dahliae Kleb.
Malattia
La verticilliosi, causata da Verticillium dahliae, è una malattia tracheomicotica di molte
specie vegetali erbacee ed arboree.
Distribuzione geografica
La presenza di V. dahliae è riportata in tutte le maggiori aree olivicole del bacino del
Mediterraneo (Italia, Spagna, Francia, Grecia, Turchia, Siria, Marocco) e della California.
V. dahliae è un patogeno che vive nel terreno, dove può permanere a lungo grazie alla forma
di resistenza rappresentata dai microsclerozi. Anche le foglie di piante affette possono contribuire
alla formazione dei microsclerozi ed incrementare l'inoculo nel suolo. Le radici infette che
rimangono nel terreno dopo l’asportazione delle piante morte costituiscono un’altra fonte di
conservazione e di moltiplicazione dell’inoculo. La consociazione con specie ortive suscettibili al
patogeno (soprattutto solanacee, carciofo) può determinare un aumento del livello di popolazione di
V. dahliae nel terreno, livello che contribuisce, anche in relazione alle più frequenti lavorazioni, alle
concimazioni ed irrigazioni più abbondanti, ad una maggiore diffusione della malattia. Tra le
tecniche colturali, alcuni metodi di irrigazione (ad es. infiltrazione laterale da solchi e allagamento),
così come lo spostamento di macchine e di attrezzi di lavorazione da un terreno contaminato ad un
terreno sano, diffondono velocemente i propaguli del patogeno. L’impiego di materiale di
propagazione infetto, infine, rappresenta il più efficace metodo di diffusione del patogeno e della
malattia anche a grandi distanze.
Piante ospiti
Verticillium dahliae è agente di tracheomicosi di molte piante erbacee (solanacee, carciofo,
cotone) ed arboree, sia da frutto sia forestali. Infetta anche numerose specie di erbe infestanti che
possono comportarsi da ospiti muti.
Sintomatologia
I sintomi compaiono nel tardo inverno ed in primavera-estate a seconda del decorso della
malattia (acuto o cronico). Tipicamente la malattia si presenta con seccumi di rametti o di una o più
branche. Nelle piante giovani i seccumi possono interessare l’intera chioma, se il decorso della
malattia è acuto (Tavola II); in piante adulte ed in coltura asciutta, invece, la malattia si manifesta
solitamente come deperimento cronico, con seccumi e defogliazioni limitati a pochi rametti o a
qualche branca (Tavola VII, Fig. 2). La corteccia dei rami o dei tronchi delle giovani piante si può
presentare di aspetto normale, ma spesso sono evidenti striature necrotiche di colore bruno-rossatro,
leggermente depresse (Tavola VII, Fig. 3) Un sintomo caratteristico è costituito da imbrunimenti
che possono interessare settorialmente o interamente il cilindro legnoso (Tavola VII, Fig. 4) . Le
piante infette, inoltre, presentano solitamente ciuffi di polloni alla base del tronco o, meno
frequentemente, succhioni all’inserzione delle branche deperite. Recentemente, accanto alle forme
classiche della malattia (acuta e cronica) ne è stata aggiunta una terza, in cui piante del tutto
asintomatiche risultano infette da patotipi di V. dahliae a debole virulenza.
Diagnosi
La diagnosi viene effettuata mediante l’isolamento del patogeno da porzioni di tessuto
xilematico, utilizzando comuni substrati di coltura artificiale (Agar-Acqua, Agar Patata Saccarosio).
La presenza del patogeno nei tessuti è discontinua nel corso dell’anno in funzione dell’andamento
climatico e delle reazioni dell’ospite. Solitamente, il patogeno si isola con facilità in primaverainizio estate. La diagnosi nei tessuti legnosi può essere effettuata anche mediante alcuni Kit
commerciali ELISA e tecniche molecolari (PCR, sonde nucleiche). Nel terreno, la presenza del
patogeno viene accertata mediante isolamento in coltura su substrati semiselettivi.
Lotta
Attualmente non esistono prodotti chimici pienamente efficaci contro la verticilliosi e la
lotta si basa su interventi agronomici e su misure preventive:
- quando la malattia è in atto è necessario mantenere le piante indurite, riducendo l’irrigazione
e le concimazioni azotate e lasciando inalterati gli apporti di fosforo e potassio;
- limitare gli interventi di potatura all’asportazione dei rami con sintomi;
- evitare la consociazione con specie suscettibili (solanacee, carciofo, cotone);
- non utilizzare tecniche irrigue che diffondono più facilmente i propaguli del patogeno (ad es.
scorrimento, infiltrazione laterale e similari);
- evitare lavorazioni profonde che possono provocare ferite all’apparato radicale;
- mantenere il terreno libero da erbe infestanti mediante diserbo o lavorazioni superficiali;
- ove disponibili, utilizzare portinnesti e varietà resistenti.
Punti critici
in vivaio, utilizzare materiale di moltiplicazione (marze e talee) provenienti da piante madri
sottoposte a periodici saggi di laboratorio per accertare l’assenza di infezioni da V. dahliae;
in campo utilizzare per l’impianto piantine certificate sane;
accertare l’assenza di propaguli del patogeno nei substrati d’allevamento in vivaio e nel
terreno prima dell’impianto.
Consigli pratici
in vivaio, utilizzare contenitori nuovi o accuratamente disinfestati mediante trattamento con
soluzioni sterilizzanti (ad es. immersione per 10 minuti in soluzioni al 4% di ipoclorito
commerciale);
in pieno campo, l’asportazione delle parti infette mediante pesanti potature o capitozzatura dei
soggetti malati è sconsigliabile sulle piante giovani, le quali, stimolate a produrre nuova
vegetazione, si esauriscono e deperiscono più rapidamente;
evitare la diffusione dell’inoculo con macchine o attrezzi di lavorazione che hanno operato in
terreni infestati.
TAVOLA II
1
2
3
4
Fig. 1 - Giovane pianta di olivo con disseccamento dell’intera chioma causato
da verticilliosi a decorso acuto. È evidente l’emissione di polloni e di
succhioni alla base del tronco.
Fig. 2 - Seccume limitato ad una sola branca su pianta di olivo affetta da
verticilliosi a decorso cronico.
Fig. 3 - Striature necrotiche sulla corteccia di rametto di olivo affetto da
verticilliosi.
Fig. 4 – Imbrunimento del cilindro legnoso causato da Verticillium dahliae.
3. NEMATODI
3.1. Meloidogyne incognita (Kofoid & White, 1919) Chitwood, 1949
Premessa
Questa specie è cosmopolita e riveste notevole importanza economica per numerose colture
in climi tropicali e/o subtropicali. Numerosi sono gli ospiti erbacei e molto evidenti sono le
deformazioni dell’apparato radicale sulle piante ospiti.
Famiglia
Genere
Specie
Meloidogyne
Meloidogyne incognita
Come tutti i nematodi, la diffusione avviene attraverso attrezzi da taglio, acqua e materiale di
propagazione.
Distribuzione geografica: il nematode è strettamente legato alla presenza della specie ospite.
Piante ospiti
Tra le piante da frutto, olivo e drupacee sono gli ospiti che risentono maggiormente degli
attacchi di questa specie, anche la vite, sebbene in misura minore, risulta essere colpita da questa
specie.
Sintomatologia
Il sintomo più evidente e facilmente verificabile si manifesta a carico dell’apparato radicale della
pianta ospite che si mostra nel complesso molto ridotto e deformato dai caratteristici
rigonfiamenti (“galle”) indotti dall’azione trofica del nematode. Cellule nutrici ipertrofiche, in
prossimità dell’estremità anteriore del nematode, caratterizzano i siti di alimentazione. (Tav. III)
Danni
Le piante attaccate manifestano crescita stentata della parte aerea, ingiallimenti diffusi e fioritura
ridotta.
Diagnosi
Identificazione, a livello specifico, basata sulla morfo-anatomia (illustrata in questa scheda), che
utilizza una serie di parametri specifici rilevati su larve e adulti.
Lotta
Disinfestazione del terreno con mezzi fisici, chimici ed agronomici.
Norme fitosanitarie
Analisi nematologiche in pre-impianto, mantenimento in sanità delle piante in vivaio e uso di
materiale sano per la propagazione.
TAVOLA III
Meloidogyne incognita
A • Stadi vitali;
larve infettive
maschio
femmina
maschio
In muta
F
B
B,C) Porzione
anteriore e
posteriore del
corpo del
maschio;
D) Estremità
anteriore della
femmina;
E) Impronta
perineale della
femmina
(principale
carattere
diagnostico);
F) Radici di
mandorlo
mostranti
vistose galle;
G) Femmina
perlacea
sacciforme
conficcata in
C
G
D
E
H
3.2. Meloidogyne javanica (Treub, 1885) Chitwood, 1949
Premessa
Questa specie cosmopolita, risulta essere distribuita largamente in climi tropicali e/o subtropicali.
Numerosi sono gli ospiti erbacei ed arborei e molto evidenti sono le deformazioni dell’apparato
radicale delle piante ospiti.
Famiglia
Genere
Specie
Meloidogyne
Meloidogyne javanica
propagazione.
Piante ospiti
Tra le piante da frutto, olivo e drupacee sono ospiti che risentono maggiormente degli attacchi di
questa specie, anche la vite, sebbene in misura minore, risulta essere colpita da questa specie.
Sintomatologia
Il sintomo più evidente e facilmente verificabile si manifesta a carico dell’apparato radicale della
pianta ospite che si mostra nel complesso molto ridotto e deformato dai caratteristici
rigonfiamenti (“galle”) indotti dall’azione trofica del nematode. Cellule nutrici ipertrofiche, in
prossimità dell’estremità anteriore del nematode, caratterizzano i siti di alimentazione (Tav. IV).
Danni
Le piante attaccate manifestano crescita stentata della parte aerea, ingiallimenti diffusi e fioritura
ridotta.
Diagnosi
L’identificazione a livello specifico basata sulla morfo-anatomia illustrata in questa scheda, si
basa su una serie di parametri specifici di larve e adulti.
Lotta
Norme fitosanitarie
Analisi nematologiche in pre-impianto, mantenimento in sanità delle piante in vivaio e uso di
materiale sano per la propagazione.
TAVOLA IV
Meloidogyne javanica
A
• Radice di olivo
mostrante
vistose
deformazioni.
• Femmina del
nematode (N)
conficcata nei
tessuti radicali.
• Femmina
intera.
• Regione
B
C
campi
laterali
cellule
nutrici
nematode
D
E
3.3. Xiphinema diversicaudatum (Micoletzky, 1927) Thorne, 1939
Premessa
Simile ad altre specie del genere Xiphinema, X. diversicaudatum è una specie ectoparassita
radicale.
Famiglia
Genere
Specie
Xiphinema
Xiphinema diversicaudatum
propagazione.
Piante ospiti
In generale, sono ospiti preferenziali di questa specie diverse piante arboree, sebbene le
popolazioni più numerose si riscontrano su ospiti erbacei.
Sintomatologia
Spesso gli apici radicali delle piante ospiti attaccate da questa specie risultano ispessite, e
nelle radici capillari lo stiletto molto lungo può causare necrosi locali al punto di penetrazione (Tav.
V).
Danni
Questa specie è in grado di trasmettere principalmente le seguenti malattie virali:
- Arabis mosaic virus (ArMV).
- Strawberry latent ringspot virus (SRLV).
Diagnosi
Identificazione a livello di specie, che si basa sulla misurazione di una serie di parametri
morfo-anatomici specifici (illustrati in questa scheda) di esemplari adulti.
Lotta
Norme fitosanitarie
Analisi nematologiche degli appezzamenti destinati a campi di piante madri di olivo.
TAVOLA V
Xiphinema diversicaudatum
Caratteri
morfometrici
di Xiphinema
diversicaudatu
m
lunghezza
totale :
4.0-5.5 (4.9)
mm
odontostilo :
130-157(153)
µm
odontoforo :
70-97 (85) µm
posiz.% della
vulva:
39-46 (43)
mucrone :
12 µm
•
•
•
•
Estremità anteriore del corpo della femmina;
Estremità cefalica della femmina;
Corpo della femmina intero mostrante la ‘postura’;
Apparato riproduttore posteriore della femmina;
E-G) Coda della femmina;
H-I) Coda del maschio;
J)
‘Organo-Z’ con corpi globulari al suo interno.
3.4. Pratylenchus vulnus Allen & Jensen, 1951
Premessa
I nematodi delle lesioni seguono in ordine di importanza economica quelli galligeni e
cisticoli e sono causa di forti perdite di produzione a livello mondiale, fino al 15-18% della
produzione annua. La loro vasta diffusione e gamma di ospiti (piante erbacee e arboree) rende
indispensabile il loro riconoscimento a livello di specie, per predisporre un preciso programma di
norme fitosanitarie, in particolar modo nei vivai di fruttiferi.
Famiglia
Genere
Specie
Pratylenchus
Pratylenchus vulnus
propagazione.
Piante ospiti
Pratylenchus vulnus è essenzialmente parassita di piante arboree, ma invade anche le radici
di numerose piante erbacee. Olivo, vite e drupacee sono buoni ospiti di questa specie (endoparassita
migratore).
Sintomatologia
Parassita obbligato, migra all’interno delle radici e si nutre a spese dei tessuti corticali, ove
si riproduce, inducendo all’interno della radice stessa lesioni e necrosi nei siti di alimentazione,
interessando diversi strati cellulari (Tav. VI).
Danni
I danni provocati dalle infezioni di questa specie consistono in estese necrosi radicali con
perdita della funzionalità della radice stessa, che porta a sintomi evidenti di crescita stentata a carico
della parte epigea della pianta e ad ingiallimenti diffusi.
Diagnosi
Identificazione a livello specifico basata sulla morfologia, che esamina una serie di
parametri biometrici rilevati su esemplari di adulti (femmine e maschi).
Lotta
Sono indispensabili la disinfestazione del terreno (con mezzi chimici e fisici) e
l’eliminazione delle erbe infestanti in vivaio, per mantenere bassi livelli di popolazione del
parassita.
Norme fitosanitarie
Analisi nematologiche di pre-impianto (su terreno e radici) e l’uso di materiale esente da
nematodi sono le norme base per una buona riuscita di nuovi impianti colturali.
TAVOLA VI
Pratylenchus vulnus
A
B
C
E
Caratteri morfometrici di
Pratylenchus vulnus:
numero di annuli labiali:
3
lunghezza totale :
460-910 µm
lunghezza stiletto : 16-18 µm
posiz. % della vulva : 78-84
lungh.branca post-uterina: 2,5-
D
Esemplari del
nematode (N) nei
t
ti
ti li di
A: Femmina intera; B: Regione esofagea della femmina; C: Regione
cefalica della femmina; D: coda della femmina;
•
A. Necrosi e lesioni su radici di pesco ; B. Particolare del sito di
alimentazione
4. VIRUS
4.1. Virus del mosaico dell’Arabis (ArMV)
Famiglia
Genere
Specie
Acronimo:
Comoviridae
Nepovirus
Arabic mosaic virus
ArMV
Malattia/Avversità: latente su Olea europea.
Distribuzione geografica: segnalato in tutti i continenti sulle diverse specie ospiti.
Oltre che con il materiale di propagazione, ArMV è trasmesso da nematodi della famiglia
Dorylaimidae (principalmente Xiphinema diversicaudatum). E’ trasmissibile anche per seme, con
percentuali che in alcune specie possono raggiungere anche il 100%.
Piante ospiti
Oltre l’olivo infetta naturalmente numerose specie di Prunus, Rubus, la vite e diverse piante
erbacee quali: Arabis hirsuta, Arabis sp, Asparagus officinalis, Beta vulgaris, Cucumis sativus,
Cucurbita pepo, Daucus carota, Lactuca sativa.
Sintomatologia: non ci sono segnalazioni di sintomi su olivo.
Diagnosi
Trasmissione meccanica ad indicatori erbacei (Chenopodium amaranticolor, C. quinoa,
Cucumis sativus, Nicotiana tabacum cv. White Burley e Petunia hybrida) da mignole di olivo in
fase di fioritura. Amplificazione genica (PCR) su estratti di acido nucleico totale. Ibridazione
molecolare non radioattiva su estratti di acido nucleico totale o di acidi nucleici a doppia elica.
Lotta: impiego di materiale di propagazione sano.
Punti critici
In vivaio, utilizzare materiale di moltiplicazione (marze e talee) proveniente da piante madri
sottoposte a periodici saggi di laboratorio per accertare l’assenza da infezioni virali;
Terreno dei campi delle fonti di approvvigionamento e substrati utilizzati nel ciclo produttivo
esenti dal nematode X. diversicaudatum;
commerciale);
Consigli pratici
Agricoltori: utilizzare astoni certificati ed evitare l’utilizzo di materiali di propagazione di
dubbia origine.
4.2. Virus della maculatura latente della fragola (SLRV)
Famiglia
Genere
Specie
Acronimo:
Comoviridae
Nepovirus
Strawberry latent ringspot virus
SLRSV
Malattia/Avversità: butteratura delle olive (rara) (Tav. VII); più frequenti sono le infezioni latenti.
Distribuzione geografica
Soprattutto Europa continentale, ma presente anche in altri continenti sulle diverse specie
ospiti.
Oltre che, come tutti i virus, attraverso il materiale di propagazione, SLRSV è trasmesso dal
nematode Xiphinema diversicaudatum. In diverse specie di piante erbacee è stata dimostrata la
trasmissibilità per seme (fino al 70%).
Piante ospiti
Oltre l’olivo infetta naturalmente numerose altre specie quali la fragola, la vite, il pesco, il
susino, l’asparago, Rubus idaeus, Apium graveolens.
Sintomatologia
Su olivo sono state ritrovati occasionalmente sintomi di butteratura e malformazione delle
drupe.
Diagnosi
Trasmissione meccanica ad ospiti erbacei indicatori (Chenopodium amaranticolor, C.
murale, C. quinoa, Cucumis sativus) da mignole di olivo in fase di fioritura. Amplificazione genica
(PCR) su estratti di acido nucleico totale. Ibridazione molecolare su estratti di acido nucleico totale
o di acidi nucleici a doppia elica.
Punti critici
Punti critici:
Terreno dei campi delle fonti di approvvigionamento e substrati utilizzati nel ciclo produttivo
esenti dal nematode X. diversicaudatum;
commerciale);
Consigli pratici:
dubbia origine.
4.3. Virus dell’accartocciamento fogliare del ciliegio (CLRV)
Famiglia
Genere
Specie
Acronimo
Comoviridae
Nepovirus
Cherry leaf roll virus
CLRV
Malattia/Avversità: latente.
Distribuzione geografica: segnalato in tutti i continenti sulle diverse specie ospiti
Modalità di diffusione (epidemiologia)
Oltre che col materiale di propagazione agamica, CLRV si trasmette anche per seme e su
qualche ospite (noce) per polline.
Piante ospiti
oltre l’olivo, CLRV può infettare naturalmente il ciliegio, il noce, l’olmo, Rheum
rhaponticum, Berteroa incana, Delphinium elatum e Rumex obtusifolius.
Sintomatologia sugli ospiti naturali: sull’olivo, come già detto, è latente.
Diagnosi
Trasmissione meccanica ad ospiti erbacei suscettibili (Chenopodium amaranticolor, C.
quinoa, Cucumis sativus, Nicotiana rustica, N. tabacum cv White Burley e Xanthi) da mignole di
olivo in fase di fioritura. Amplificazione genica (PCR) su estratti di acido nucleico totale.
Ibridazione molecolare su estratti di acido nucleico totale o di acidi nucleici a doppia elica.
Punti critici:
Consigli pratici:
dubbia origine.
4.4. Virus associato all’ingiallimento fogliare dell’olivo (OLYaV)
Famiglia
Genere
Specie
Acronimo
Closteroviridae
Closterovirus
Olive leaf yellowing associated virus
OLYaV
Malattia/Avversità: giallume fogliare (raro); più frequenti sono le infezioni latenti.
Distribuzione geografica: segnalato in Italia, Grecia, Spagna, Egitto, Tunisia, Libano, Marocco,
USA, Australia.
Come tutti i virus, OLYaV si trasmette attraverso il materiale di propagazione. E’ stato
segnalato in Euphillura olivina, la cui capacità di trasmetterlo non è però stata dimostrata. Non si
trasmette per seme.
Piante ospiti: finora non è stato segnalato su altre specie.
Sintomatologia sugli ospiti naturali
Quando l’infezione è sintomatica si sviluppano ingiallimenti diffusi su parte della chioma, di
solito costituita da un’intera branca. Le foglie mostrano alterazioni di color giallo brillante che,
dalla zona apicale della lamina, si diffondono con andamento basipeto verso il picciolo,
interessando dapprima i margini e poi l’intera superficie fogliare (Tav. VII).
Diagnosi
Amplificazione genica (PCR) su estratti di acido nucleico totale; ibridazione molecolare non
radioattiva su estratti di acido nucleico totale o di acidi nucleici a doppia elica. Non sono disponibili
reagenti sierologici; inoltre OLYaV non è trasmissibile meccanicamente ad indicatori erbacei.
Punti critici:
Consigli pratici:
dubbia origine.
TAVOLA VII
B
A
C
E
D
Alterazioni
di
probabile
eziologia virale su olivo:
A) e B):
Alterazioni di
carattere morfologico sulla
vegetazione e sui frutti;
C), D), E): Giallumi fogliari
Presentazione dei poster riguardanti la messa a punto e validazione di
protocolli di monitoraggio, di campionamento, di diagnosi,
produzione e standardizzazione di reagenti per corredi diagnostici.
U. Prota
Dipartimento di Protezione delle Piante, Sezione di Patologia Vegetale
Università degli Studi di Sassari
Impiego dell’ELISA nella diagnosi di Verticillium dahliae, agente della tracheomicosi
dell’olivo
Romanazzi G., F. Nigro, I. Pentimone, P. Gallone, A.Ippolito
Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata
Università degli Studi di Bari
Riassunto
La verticilliosi causata da Verticillium dahliae Kleb., è la più preoccupante malattia
crittogamica dell’olivo, in grado di uccidere le piante attaccate nella fase giovanile e di
compromettere fortemente la vigoria di quelle adulte. La lotta contro la malattia si basa
principalmente sull’uso di materiale di propagazione sano e le recenti normative sulla
commercializzazione del materiale vivaistico forniscono gli strumenti operativi per la produzione di
materiale olivicolo di qualità, esente da V. dahliae. Per la diagnosi della malattia è fondamentale la
disponibilità di metodiche affidabili, rapide e di facile applicazione. Oggetto delle presenti indagini
è stata la valutazione di kit commerciali ELISA per Verticillium spp. nella diagnosi della
verticilliosi dell’olivo. Sono stati utilizzati i kit Agdia, Loewe e Bioreba. Tutti i kit impiegati hanno
consentito la diagnosi del patogeno su porzioni di legno sia artificialmente sia naturalmente infetto;
i migliori risultati sono stati ottenuti utilizzando il kit Agdia, che ha fornito risultati concordi con
quelli ottenuti dall’isolamento in coltura. Gli stessi kit, quando impiegati su campioni di terreno,
hanno dato risposta positiva in campioni con una elevata carica di microsclerozi, mostrando,
tuttavia, una sensibilità inferiore a quella ottenuta con il metodo classico, basato sull’uso di substrati
selettivi.
Abstract
Verticillium wilt, caused by Verticillium dahliae Kleb., is the most important fungal disease
of olive trees; it induces the apoplectic death of young plants, whereas older ones go through a slow
decline. The use of pathogen-free propagative material is of basic importance to prevent the spread
of the disease and the introduction of the pathogen into disease-free soil. The recent Italian (DM
14/04/97) and European regulations on the commercialization of plant propagative material provide
the operative tools to produce V. dahliae free olive plants. Therefore, the availability of reliable,
rapid, and ready to use diagnostic methods is important for early in planta detection of the pathogen
and for avoiding infested soils. The purpose of the current study was the evaluation of commercial
ELISA kits in detecting V. dahliae in olive plants and soils. Agdia, Loewe and Bioreba kits were
included in the trials. All the kits allowed the diagnosis of the pathogen on wood artificially and
naturally infected by the pathogen; Agdia kit performed the best, with results in agreement with
those obtained by using isolation on agar medium. In the investigations performed on soils naturally
infested by V. dahliae, ELISA kit allowed the detection of the pathogen in soils containing a high
amount of microsclerotia, although sensitivity was lower than that observed by using selective
media.
Introduzione
La verticilliosi, causata da Verticillium dahliae Kleb., è la più preoccupante malattia
crittogamica dell’olivo, e la sua diffusione nei nostri ambienti è in aumento (Saponari et al., 2001).
Le piante giovani infettate dal patogeno possono subire un avvizzimento apoplettico, mentre le
piante adulte manifestano un deperimento cronico, con defogliazione e arresto di sviluppo limitato a
pochi rametti. La lotta contro questa malattia molto si giova dell’uso di materiale di propagazione
sano, e le recenti normative sulla commercializzazione del materiale vivaistico (DM del 14/4/1997)
forniscono gli strumenti operativi per la produzione di materiale olivicolo di qualità esente da
infezioni di V. dahliae. Per la diagnosi della malattia, pertanto, è di fondamentale importanza la
disponibilità di metodiche affidabili, rapide e di facile applicazione. La presenza di V. dahliae nella
pianta è attualmente diagnosticata mediante isolamento su terreno di coltura da frammenti di legno,
mentre la presenza di microsclerozi nel terreno viene valutata mediante la diluizione in piastra su
substrato semiselettivo, tecniche che richiedono tempo e personale esperto. L’ELISA è da tempo
applicata in patologia vegetale nella diagnosi di malattie virali (Voeller et al., 1976; Clark e Adams,
1977), mentre il suo uso nella diagnosi di malattie fungine è relativamente recente, probabilmente a
causa della maggiore complessità antigenica degli agenti causali e della disponibilità d’altri mezzi
di diagnosi (Magnano di San Lio et al., 1995; Lorito et al., 2001). Oggetto delle nostre indagini è
stata la valutazione di kit commerciali ELISA specifici per Verticillium nella diagnosi della
verticilliosi dell’olivo.
Materiali e Metodi
Sono stati utilizzati kit delle ditte Agdia, Loewe e Bioreba, che impiegano normali piastre
ELISA da 96 pozzetti (Tab. 1). Tali kit, in grado di diagnosticare la presenza del patogeno nell’arco
di 24 ore, sono stati utilizzati su Piastre “Nunc MaxiSorp” e “Falcon”. Frammenti di legno (0,5 g) di
giovani piante, ricavati mediante un temperamatite, sono stati frantumati in azoto liquido; la polvere
ottenuta è stata sospesa nel tampone di estrazione (5 ml) e filtrata con garza. Allo stesso modo, 1 g
di terreno, previamente setacciato con vaglio da 2 mm, è stato sminuzzato in azoto liquido, sospeso
in 10 ml di tampone di estrazione e la sospensione filtrata con garza. Duecento µl della sospensione
sono stati posti in piastre ELISA previamente sensibilizzate con l’anticorpo, con 3 ripetizioni per
ogni campione. Le incubazioni sono state condotte seguendo le istruzioni riportate per ciascun kit.
La risposta è stata valutata leggendo l’assorbanza a 405 nm mediante un fotometro (Multiskan EX).
Contemporaneamente, frammenti di legno prossimi alla zona utilizzata per la diagnosi sierologica
sono stati posti su substrato agarizzato per valutare il livello di colonizzazione dei tessuti da parte
del patogeno; per i terreni, invece, la diagnosi comparativa è stata effettuata su substrato
semiselettivo secondo la tecnica di Harris et al. (1993).
Dal confronto fra i risultati ottenuti con i saggi immunoenzimatici e quelli ricavati dai
metodi classici, si è ritenuto di considerare infetti i campioni che presentavano un valore di
assorbanza pari almeno alla somma tra la media delle letture fotometriche relative ai testimoni non
infetti e il triplo della loro deviazione standard (Sutula et al., 1986).
Risultati e discussione
Nel complesso sono stati analizzati 182 campioni di legno, 97 dei quali da piante
artificialmente inoculate e 75 campioni di terreno, di cui 14 infestati artificialmente. Tutti i kit
impiegati hanno consentito la diagnosi del patogeno su porzioni di legno infetto; i migliori risultati
sono stati ottenuti utilizzando il kit Agdia su piastre Falcon, che ha fornito risultati concordi con
quelli ottenuti dall’isolamento in coltura (Tab. 2). Tale kit ha permesso di diagnosticare la presenza
del patogeno sia in piante sintomatiche naturalmente infette, sia in piante di olivo artificialmente
inoculate che non mostravano evidenti sintomi di disseccamento sulla chioma. Nelle prove svolte
sui terreni, invece, i kit hanno fornito una risposta positiva solo con campioni contenenti più di 20
microsclerozi per grammo (dati non mostrati). Un metodo per concentrare i microsclerozi nel
campione di terreno potrebbe consistere nell’uso delle sole frazioni con dimensioni comprese tra 20
e 250 µm; pertanto, sono in corso ulteriori indagini per migliorare la sensibilità dei kit. Al momento
non sembra che l’ELISA sia stata applicata alla diagnosi della verticilliosi di piante arboree, poiché
la concentrazione del patogeno nei tessuti legnosi è piuttosto bassa, come anche indicato da Tosi e
Zazzerini (2000). Al contrario, la verticilliosi è stata diagnosticata mediante ELISA in tessuti di
crisantemo e patata (Van de Koppel e Schots, 1995; Plasencia e Banttari, 1997).
Conclusione
Il test ELISA è impiegabile nella diagnosi di V. dahliae in porzioni di legno di olivo,
diversamente da quanto riportato da Tosi e Zazzerini (2000), i quali hanno utilizzato una differente
procedura per l’estrazione degli antigeni dal materiale infetto. Infatti, i 3 kit commerciali ELISA
impiegati hanno consentito la diagnosi del patogeno nel legno di piante artificialmente e
naturalmente infette. I migliori risultati sono stati forniti dal kit Agdia, che ha mostrato una
sensibilità paragonabile a quella ottenuta con l’isolamento su substrato agarizzato. Data la notevole
diffusione della verticilliosi dell’olivo sul territorio regionale pugliese (Saponari et al., 2001),
riteniamo che i kit possano essere utili per confermare la diagnosi visiva sia in campo sia in vivaio.
Pertanto, il saggio ELISA può rappresentare una valida alternativa all’isolamento su substrato
agarizzato nella diagnosi su larga scala della verticilliosi dell’olivo con il vantaggio di essere di
facile esecuzione e di non richiedere l’uso di attrezzature costose. Per la diagnosi del patogeno nel
terreno bisogna attendere i risultati di ulteriori indagini tendenti a migliorarne la sensibilità.
Ringraziamenti
Si ringrazia il p.a. Sig. Vincenzo Maurantonio per la validissima collaborazione tecnica.
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Tab. 1. Caratteristiche dei kit ELISA utilizzati nelle prove.
Patogeno
individuato
Verticillium
dahliae
Verticillium
dahliae
Verticillium spp.
Nome e caratteristiche
Anticorpi
07081S/K
Policlonali
VDAH
Policlonale/
monoclonale
Monoclonali
Verticillium
Ditta
produttrice
Loewe
Agdia
Bioreba
Tab. 2. Risultati del saggio ELISA con il kit Agdia per la diagnosi di V. dahliae su legno di giovani
piante di olivo artificialmente inoculate e naturalmente infette.
Campione
Frammenti infetti (%)
Abs 405 nm
P1 pianta artificialmente inoculata
96
0,408*
70
0,372
95
0,536
P4 pianta naturalmente infetta
25
0,341
36
0,353
45
0,360
5
0,320
P9 testimone sano 1
-
0,263
P10 testimone sano 2
-
0,288
P11 testimone sano 3
-
0,280
Tampone
0,227
Verticillium dahliae FV 330
1,435
* i valori in grassetto indicano un’assorbanza superiore alla somma tra la media delle letture
fotometriche relative ai testimoni non infetti (M) e il triplo della loro deviazione standard (DS),
utilizzata come soglia di discriminazione (S) fra campioni infetti e campioni non infetti. S=M+3DS;
M=0,277; DS=0,013; S=0,315
Diagnosi nel terreno di Verticillium dahliae, agente di tracheomicosi nell’olivo, con l’uso della
PCR in tempo reale
Nigro F., L. Schena, P. Gallone, G. Romanazzi e A. Ippolito
Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata
Università degli Studi di Bari
RIASSUNTO
È stata sviluppata una tecnica molecolare per l’accertamento in tempo reale della presenza di
Verticilliun dahliae in terreno olivetato, basata sulla reazione a catena della polimerasi mediante
primer Scorpion. Dalla comparazione delle sequenze dello spaziatore intergenico del DNA
ribosomiale (rDNA) 18S-28S di V. dahliae ed altre specie correlate, sono state individuate due
coppie di primer (Ver2-Ver3 e Vd7b-Vd10) specifiche per il patogeno. Tali primer sono stati
utilizzati in un protocollo di PCR a doppio stadio, impiegando la coppia Ver2-Ver3 nel primo e la
coppia Vd7b-Vd10, amplificante un frammento interno al precedente, nel secondo stadio. Il primer
Vd7b è stato poi modificato per l’ottenimento di uno Scorpione molecolare che, utilizzato in coppia
con Vd10, ha consentito la diagnosi di V. dahliae in campioni di terreno prelevati da vivaio e da
pieno campo, sia naturalmente che artificialmente infestati. La tecnica sviluppata nel presente
lavoro potrebbe essere utile per ridurre i tempi di identificazione e diagnosi di V. dahliae nel terreno
e nei tessuti vegetali, migliorando le procedure di certificazione fitosanitaria.
SUMMARY
A technique based on the real-time Scorpion polymerase chain reaction (Scorpion-PCR) for
the specific detection of Verticillium dahliae in soil from olive orchard was developed. For this
purpose, two specific primer pairs (Ver2 -Ver3 and Vd7b-Vd10) were designed by comparison of
sequences from the 18S-28S ribosomal DNA (rDNA) intergenic spacer sequences (IGS) of isolates
of V. dahliae and related species. A nested-PCR protocol was developed to detect the pathogen by
using Ver2-Ver3 in the first step and Vd7B-Vd10 in the second step. Specific Scorpion-PCR
amplification using modified Vd7b primer was successful in detecting V. dahliae from nursery and
olive orchard soil both naturally and artificially infested with the pathogen. The procedures
developed in this work could have application to detect V. dahliae in soil and plants for
implementing phytosanitary certification schemes.
INTRODUZIONE
La verticilliosi, causata da Verticillium dahliae Kleb., è una grave tracheomicosi di molte
piante arboree ed erbacee. Recenti indagini hanno dimostrato che la malattia sull’olivo è in
preoccupante espansione in
Puglia (Saponari et al., 2001) e in diversi paesi del bacino del
Mediterraneo (Jiménez-Díaz et al., 1998). La diffusione è particolarmente elevata nei giovani
impianti, con ogni probabilità a causa dell’impiego di materiale di propagazione infetto,
dell’utilizzazione di tecniche intensive di coltivazione (irrigazione e concimazioni abbondanti, sesti
d’impianto ridotti), nonché per la consociazione o coltivazione in rotazione con specie ortive molto
suscettibili.
Considerata la difficoltà della lotta contro la malattia in atto, l’impiego di materiale di
propagazione sano e la realizzazione dei nuovi impianti in terreni non infestati dal patogeno
assumono una fondamentale importanza ai fini della prevenzione della malattia. Inoltre, le recenti
normative sulla commercializzazione del materiale di propagazione dei fruttiferi (D.M. del
14/4/1997), introducendo la categoria di materiale C.A.C. (Conformitas Agricola Comunitatis),
impongono al vivaista la produzione di piantine di olivo esenti da infezioni di V. dahliae. Per tale
produzione è richiesta l’adozione di idonee tecniche di allevamento e di appropriati controlli
fitosanitari lungo tutto il ciclo produttivo. V. dahliae è un patogeno che vive nel terreno, dove può
permanere a lungo grazie alla forma di resistenza rappresentata dai microsclerozi; pertanto, test
diagnostici miranti ad accertare la presenza del patogeno nelle miscele utilizzate dai vivaisti e nel
terreno prima dell’impianto sono indispensabili per contrastare la malattia.
L’esecuzione di controlli fitosanitari su un elevato numero di campioni di piante e di terreno
richiede la disponibilità di tecniche diagnostiche che siano nel contempo semplici, rapide, sensibili
e riproducibili. Classicamente, la diagnosi viene effettuata mediante l’isolamento del patogeno da
porzioni di tessuto xilematico, utilizzando comuni substrati di coltura, o dal terreno, mediante
substrati semi-selettivi (Huisman e Ashworth, 1974). Tali tecniche sono laboriose e richiedono
tempo e personale specializzato. Infatti, l’isolamento e l’identificazione del patogeno da tessuto
xilematico richiede almeno 7 giorni, mentre nel caso di isolamenti da terreno sono necessarie 8-12
settimane, a seconda del protocollo utilizzato (Harris, 1993; Wheeler e Rowe, 1995).
Nel corso dell’ultimo decennio sono state sviluppate diverse tecniche molecolari per la
diagnosi di Verticillium spp. nel terreno e nell’ospite, tra le quali quelle basate sulla reazione a
catena della polimerasi (PCR) sono risultate sensibili ed affidabili (Nazar et al., 1991; Li et al.,
1994). Nel caso specifico della verticilliosi dell’olivo è stato recentemente messo a punto un
protocollo di PCR a doppio stadio (nested-PCR) che ha consentito la diagnosi precoce della malattia
in tessuti legnosi mediante l’impiego di primer specifici per patotipi non defoglianti di V. dahliae
(Mercado Blanco et al., 2001). Tuttavia, la diffusione su larga scala di queste tecniche può essere
limitata dalla elevata manualità (con conseguenti pericoli di contaminazione) e da operazioni di
post-amplificazione, come elettroforesi e colorazione degli acidi nucleici con bromuro di etidio,
necessarie per l’individuazione dell’amplicone specifico. Tali operazioni, oltre ad allungare i tempi
di diagnosi, costituiscono un potenziale pericolo per l’operatore e per l’ambiente, considerate le
caratteristiche cancerogene del bromuro di etidio. Alcune recenti tecniche di PCR (Taq-Man,
Molecular Beacons e Scorpion-PCR) consentono di superare tali inconvenienti poiché l’amplificato
viene identificato in tempo reale attraverso uno specifico segnale fluorescente emesso nel corso
dell’amplificazione. Tra queste ultime tecniche, la Scorpion-PCR (Whitcombe 1999) sembra essere
la più efficiente ed è stata utilizzata con successo nella diagnosi di virus (Finetti Sialer et al., 2000),
funghi fitopatogeni (Ippolito et al., 2000; Schena et al., 2001a) e di agenti di lotta biologica (Schena
et al., 2001).
Obiettivo del presente lavoro è stato quello di sviluppare una tecnica per la diagnosi in
tempo reale di Verticillium dahliae nel terreno mediante Scorpion-PCR.
MATERIALI E METODI
1. Isolati fungini
Tutti gli isolati fungini utilizzati nel presente lavoro sono stati conservati a 4°C in tubi
contenenti Agar Patata Saccarosio (APS). Le colture di routine sono state allevate a 21°C su piastre
contenenti Agar Patata Glucosio (APG).
2. Determinazione del numero di microsclerozi di V.dahliae nel terreno
La densità di inoculo di microsclerozi di V. dahliae nei campioni di terreno è stata determinata
mediante il protocollo di Harris (1993), utilizzando un substrato semiselettivo (Huisman e
Ashworth, 1974). Gli stessi campioni di terreno sono stati poi utilizzati per l’estrazione del DNA da
sottoporre al saggio mediante Scorpion-PCR a doppio stadio.
3. Estrazione del DNA
Il DNA da colture fungine pure e dal terreno è stato estratto secondo le metodiche riportate da
Schena et al., 2001.
4. Identificazione di primer specifici per V. dahliae
Coppie di primer potenzialmente specifici per V. dahliae
sono state identificate sulla base
delle sequenze delle regioni IGS (InterGenic Spacer regions) dei geni codificanti l’RNA
ribosomiale di V. dahliae, V. alboatrum e V. longisporum (Pramateftaki et al., 2000). Le sequenze
(GenBank Accession Number: AF144007; AF144006; AF144005) sono state allineate con l'ausilio
del programma "CLUSTALW" (EMBL, European Bioinformatics Institute) e le regioni geniche
uniche di V. dahliae
utilizzate per disegnare primer specifici. Complessivamente sono state
saggiate oltre 30 possibili coppie di primer la cui specificità è stata saggiata su DNA estratto da
funghi ad habitat terricolo, appartenenti a circa 80 specie, e da numerosi isolati di V. dahliae e
V. alboatrum.
5. Scorpion-PCR a doppio stadio
Tra tutte le coppie di primer saggiate in prove preliminari di PCR classica ne sono state scelte
due per sviluppare un protocollo di Scorpion-PCR a doppio stadio. La coppia di primer Ver2-Ver3,
risultata specifica per Verticillium spp., amplifica un frammento di 339 paia di basi ed è stata
utilizzata nel primo stadio; una coppia di primer interni al frammento precedente, Vd7B-Vd10, che
amplifica una porzione di 139 bp è stata utilizzata nel secondo stadio. Il primer Vd7b è stato
modificato dalla Oswel Research Products Ltd. (Southampton, UK) per sviluppare un primer
Scorpion, marcato con il fluoroforo FAM. L’amplificazione è stata realizzata in un termociclatore
provvisto di fluorimetro (BIO-RAD iCycler Thermal Cycler) e di uno specifico software che
consente la registrazione grafica in tempo reale della fluorescenza emessa.
RISULTATI E DISCUSSIONE
Tra tutti i primer saggiati, diversi sono risultati in grado di amplificare specificatamente
frammenti della regione IGS di V. dahliae. Tali frammenti, risolti su gel di agarosio dopo
colorazione con bromuro di etidio, hanno mostrato le dimensioni attese (dati non riportati). Anche
la coppia Vd10-Vd7bFAM, utilizzata in successione a Ver2-Ver3 nel protocollo di Scorpion-PCR a
doppio stadio, è risultata specifica, fornendo evidenti incrementi di fluorescenza solo in presenza di
DNA estratto da colture di V. dahliae (Fig.1). L’elettroforesi su gel di agarosio del prodotto
dell’amplificazione ottenuto con la coppia Vd10-Vd7bFAM ha confermato la presenza del
frammento atteso
di139 bp (dati non mostrati). Utilizzando tali primer V. dahliae è stato
diagnosticato in terreni artificialmente e naturalmente infestati (Fig. 2). Gli incrementi di
fluorescenza sono risultati tanto più evidenti quanto più elevata era la densità di microsclerozi per
grammo di terreno, determinata mediante l’impiego del substrato semiselettivo (Fig. 2). La
setacciatura del terreno mediante due vagli a 150 e 20 µm, solitamente effettuata prima della
diagnosi su substrato semiselettivo, ha determinato ulteriori incrementi della fluorescenza. Tale
risultato può essere attribuito all’effetto “concentrazione” determinato dalla setacciatura,
considerato che per l’estrazione del DNA è stata utilizzata la stessa quantità di terreno tal quale o
setacciato.
CONCLUSIONE
La tecnica sviluppata nel presente lavoro consente di accertare la presenza di V. dahliae nel
terreno in 1-2 giorni lavorativi, periodo che risulta notevolmente ridotto rispetto alle 8-12 settimane
solitamente necessarie con il metodo classico dell’isolamento in piastra su substrato semiselettivo.
Inoltre, risultati di prove preliminari effettuate su tessuto xilematico
prelevato da piante
naturalmente o artificialmente infette indicano che tale tecnica può essere utilizzata anche per la
diagnosi della malattia nella pianta. La disponibilità di un metodo diagnostico rapido e specifico
può avere una notevole ricaduta pratica, considerato che l’impiego in vivaio di terreni e substrati
privi del patogeno e di marze sane, nonché l’impianto in terreni non infestati, costituiscono validi
strumenti di lotta contro la verticilliosi dell’olivo.
BIBLIOGRAFIA
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Figura 1. Specificità dei primer Vd10-Vd7bFAM che ha consentito l’identificazione in tempo
reale di isolati di V. dahliae. È riportata la fluorescenza relativa normalizzata (∆Rn) ottenuta
amplificando DNA del patogeno a confronto con quello estratto da numerosi altre specie fungine.
Figura 2. Diagnosi in tempo reale di V. dahliae in terreni artificialmente inoculati con il patogeno.
Nella reazione di Scorpion-PCR a doppio stadio sono stati rilevati incrementi di
fluorescenza (∆Rn) solo per i terreni in cui era presente il patogeno; l’intensità della
fluorescenza e il ciclo soglia sono risultati correlati al numero di microsclerozi determinata
nel terreno mediante il substrato semiselettivo.
Diagnosi di virus dell’olivo mediante l’impiego degli RNA a doppia elica
Saponari M1., El Beaino T1., Grieco F2., Savino V1., Martelli G.P2
1
2
Centro di Studio sui Virus e le Virosi delle Colture Mediterranee, CNR, Bari
Introduzione
La diagnosi dei virus dell’olivo presenta numerose difficoltà dovute alla scarsa reattività
sintomatica, latenza delle infezioni e similarità di alcuni quadri sintomatologici. Tali problemi
creano grossi ostacoli alla selezione sanitaria, rendendo di poca utilità le osservazioni di campo e
alquanto indispensabili le indagini di laboratorio. Per l’olivo non è stato possibile mettere a punto
l’indexaggio, che rappresenta un valido strumento di identificazione delle principali virosi per altre
specie frutticole.
Pertanto l’accertamento della presenza dei virus dell’olivo si è basato sinora esclusivamente
sul loro isolamento mediante trasmissione meccanica su ospiti erbacei, tecnica poco affidabile per la
bassa sensibilità intrinseca e per la non trasmissibilità di alcuni degli agenti virali segnalati su
questa specie.
Considerata anche la limitata affidabilità delle tecniche immunologiche, si è passati alla
valutazione di tecniche molecolari. Il primo approccio in questo settore è stata l’applicazione
dell’analisi degli RNA bicatenari (dsRNA) che risultano dalla moltiplicazione virale i quali
accumulandosi nei tessuti ne rappresentano un sicuro indice di infezione.
L’applicazione di questo tipo di saggio su pochi campioni, qualche anno addietro, aveva
sorprendentemente rivelato che le infezioni virali erano tutt’altro che sporadiche.
Queste informazioni all’avvio del progetto fecero indirizzare le attività verso la messa a
punto di un protocollo di estrazione ed analisi dei dsRNA da olivo, con l’obiettivo di mettere a
punto un protocollo meno laborioso di quelli riportati in bibliografia. Nel presente lavoro si
riportano i risultati della comparazione di diversi protocolli pubblicati su altre specie, di diverse
epoche di saggio e di piante di diversa età.
MATERIALI E METODI
Le diverse comparazioni hanno riguardato :
•
•
•
•
Età della pianta saggiata
Quantità di tessuto corticale utilizzato: 5 o 10 grammi
Conservazione del floema prelevato dai rami a –20°C : da 1 mese fino a 6 mesi
Estrazione con l’uso di solventi organici e non organici
Età delle piante saggiate
Semenzali all’età della 5a-6 a foglia e semenzali di 2 anni, pronti per l’innesto, sono stati
raccolti, rispettivamente, a gruppi di 10 o singolarmente e sottoposti ad estrazione.
Piante innestate di un anno e piante individuate in impianti commerciali di diversa età (5-10-2530-60 anni) sono state utilizzate per prelevare campioni da analizzare.
Quantità di tessuto corticale utilizzato e tempo di conservazione a –20°C
Le estrazioni sono state effettuate su tessuto polverizzato in presenza di azoto liquido, da 10
grammi e 5 grammi di tessuto floematico ricavato da rami ben lignificati e/o germogli erbacei. Il
tessuto è stato poi direttamente sottoposto alle diverse tipologie di estrazione oppure conservato a
–20°C per tempi di 1-6 mesi.
Estrazione con l’uso di solventi organici e non organici
I dsRNA sono stati estratti sia con trattamento fenolico seguito da cromatografia su colonna
di CF11 (Dodds, 1993) o su MN 301 (Choi, 1997), che senza l’utilizzo di soluzioni di fenolocloroformio (De Paulo, and Powell, 1995) per la purificazione degli acidi nucleici totali (TNA).
Nel primo caso 5 e 10 grammi di tessuto corticale sono stati polverizzati in presenza di azoto
liquido ed omogeneizzati in tampone di estrazione (2 volumi di STE 2X, 0.5 volumi di SDS,
1 1.5 volumi di fenolo, 1.5 volumi di cloroformio e 0.4 volumi di 2-Mercaptoetanolo) per 45
minuti. Il supernatante recuperato dopo una centrifugazione è stato nuovamente estratto con 1.5
volumi di fenolo e 1.5 volumi di cloroformio, recuperato dopo 10 minuti di centrifugazione, e
portato ad una concentrazione etanolica del 17% dopo addizione di 0.7 – 1.2 g di cellulosa CF 11
(rispettivamente per le estrazioni da 5 e da 10 grammi). Dopo 40 min di agitazione e successiva
centrifugazione il pellet di cellulosa ricavato è stato sottoposto a 5 cicli di lavaggio con tampone
apposito (STE 1X contenente 17% di etanolo), lasciato asciugare all’aria ed eluito con 4 volumi di
STE 1X. Gli acidi nucleici totali eluiti sono stati precipitati e sottoposti a digestione enzimatica
(Saldarelli, 1994) . Al termine delle digestioni i campioni sono stati caricati su gel di poliacrillamide
al 5% e sottoposti a 5 ore di corsa elettroforetica. Le bande sono state successivamente visualizzate
con una colorazione in argento nitrato.
Nel caso della cromatografia su cellulosa MN 301, la fase acquosa recuperata dopo la fase di
estrazione è stata precipitata sia in presenza di alcol isopropilico che di alcol etilico. Il pellet
ottenuto è stato risospeso in un volume minimo di STE 1X con 17% di concentrazione etanolica,
addizionato di 50 mg di cellulosa MN301 e lasciato per 30 minuti in agitazione. Il pellet di cellulosa
ottenuto dopo centrifugazione è stato sottoposto a 4 lavaggi con lo stesso tampone riportato per la
CF 11, ed eluito con 200 microlitri/100 milligrammi di STE 1X. La successiva digestione e analisi
elettroforetica sono state condotte come riportato per il protocollo precedente.
L’estrazione senza l’ausilio di fenolo cloroformio è stata effettuata in 5 volumi di tampone di
estrazione (100mM Tris, 50mM EDTA, 0.5M NaCl, 10mM 2-Mercaptoetanolo) con l’aggiunta di
0.01 volumi di SDS 10% incubando per 30 minuti a 65°C. La purificazione è stata ottenuta
aggiungendo 0.25 ml di KOAc 5M ed incubando per 20 min in ghiaccio. Con la successiva
centrifugazione sono stati ottenuti gli acidi nucleici totali in seguito processati secondo i due
protocolli già riportati.
RISULTATI
Il protocollo di estrazione dei dsRNA è stato adattato con successo ai tessuti di olivo. Con
tutte le tipologie di estrazione è stato possibile ottenere risultati positivi, sia pure naturalmente con
una efficienza diversa.
I risultati più attendibili e ripetibili sono stati ottenuti con il primo protocollo descritto, ovvero
utilizzando per la cromatografia la cellulosa CF11, con cui 5 grammi di tessuto corticale sono stati
sufficienti per visualizzare chiaramente su gel le bande di dsRNA. Con tale quantità di tessuto
corticale è stato possibile effettuare tutte le fasi di estrazione in tubi da 50ml (Nalgene Sigma) più
maneggevoli dei tubi da 250ml necessari qualora si parta da un quantitativo maggiore di tessuto.
Inoltre il maggior numero di alloggiamenti delle centrifughe per questo tipo di tubi permette di
poter processare un maggior numero di campioni contemporaneamente, con conseguente riduzione
dei tempi necessari per le analisi ed un risparmio di reagenti chimici.
Molecole di dsRNA sono state visualizzate durante tutto il corso dell’anno, con variazione di
intensità legata al periodo di massima replicazione dei rispettivi virus presenti nelle piante. Picchi
nell’intensità delle bande visualizzate sono stati riscontrati nei mesi primaverili ed autunnali.
Nessuna differenza apprezzabile è stata osservata tra le estrazioni da materiale fresco e quelle da
tessuto conservato per periodi diversi a –20°C.
CONCLUSIONI
Il successo dell’applicazione di questi protocolli su olivo ha permesso di evidenziare che
l’olivo è tutt’altro che indenne da infezioni virali (dal 25 al 100% delle piante sono infette) . Le
infezioni sono per lo più latenti, ciò nonostante stando alle normative comunitarie e nazionali, i
materiali di moltiplicazione di olivo devono essere privi di virus. La messa a punto del protocollo
descritto è un strumento diagnostico di sicura utilità nella produzione di materiale di propagazione
di qualità, economicamente compatibile con l’esigenza del mercato attuale, che renderebbe ancor
più competitive le produzioni vivaistiche nazionali.
Analisi del dsRNA
( Dodds, 1993)
Corteccia di rami di olivo
Doppia Estrazione fenolocloroformio
Lavaggio CF11-dsRNA
Eluizione del dsRNA
17% Etanolo-STE
STE 1x
Fluito
recuperato
Scartato
TNA
1. Preparazione del tessuto
2. Estrazione degli acidi
nucleici totali
DNase
RNase
3. Prurificazione del dsRNA:
A) Cromatografia su cellulosa CF11
M
II III IV (+) (-)
Pellet raccolto
Concentrazione del dsRNA
B) Digestione enzimatica
4. Analisi del dsRNA in 6% gel di poliacrilammide
Analisi elettroforetica di un estratto di 5 gr di tessuto corticale
Produzione di reagenti molecolari per la diagnosi dei virus dell’olivo
Saponari M., Grieco F., Pantaleo A., Savino V., Martelli G.P.
INTRODUZIONE
A tutt’oggi 13 specie virali (Tab. 1) appartenenti a 7 diversi generi sono state isolate da olivo
(Martelli, 2000). Di queste, il virus del mosaico dell’Arabis (ArMV), il virus dell’accartocciamento
fogliare del ciliegio (CLRV), il virus della maculatura anulare latente della fragola (SLRV), il virus
del mosaico del tabacco (TMV), il virus della necrosi del tabacco (TNV), il virus del mosaico del
cetriolo (CMV) sono polifagi, ubiquitari e di grande importanza per le altre colture. I quattro
nepovirus (ArMV, CLRV, SLRV, OLRSV) ed il closterovirus associato all’ingiallimento fogliare
dell’olivo (OLYaV) sono inoltre passibili di quarantena in alcuni Paesi extracomunitari in cui
l’olivicoltura è in espansione.
La messa a punto di protocolli di laboratorio per la loro corretta identificazione è stata resa
indispensabile dalla necessità di ottemperare alle norme di qualità comunitarie relative ai materiali
di moltiplicazione e dai provvedimenti legislativi che regolano la procedura di certificazione
volontaria. Infatti, in entrambi i casi è previsto l’obbligo dei controlli sanitari che attestino l’esenza
del materiale da tutti i virus.
Le tecniche diagnostiche adoperate sinora erano basate su saggi biologici (inoculazioni su
ospiti erbacei) e si sono dimostrate assai poco selettive ed affidabili. Difatti, da un largo numero di
campioni negativi al saggio biologico sono state isolate molecole di RNA a doppia elica (dsRNA),
che sono indicatrici della presenza di un’infezione virale. Questa necessità ha motivato gli studi
condotti nell’ambito del progetto POM A32 indirizzati alla messa a punto di tecniche di diagnosi
molecolare, ed in particolare di analisi di dsRNA, ibridazione molecolare ed amplificazione genica
(RT-PCR). Per l’impiego delle ultime due tecniche è stato necessario oltre che l’individuazione dei
relativi protocolli, mettere a punto, preliminarmente i reagenti molecolari necessari, ossia set di
primers da utilizzare nelle reazioni di PCR e la produzione di sonde clonate per le reazioni di
ibridazione molecolare.
MATERIALI E METODI
Per la selezione delle coppie di primers, da utilizzare come sequenze innesco in reazioni di
PCR, è stato necessario conoscere le sequenze virali dei rispettivi virus. Tali sequenze sono state
derivate dalle banche dati (EMBL database) e la regione da amplificare è stata scelta in base al
grado di conservazione (Fig. 1) (Grieco, 2000). Primers sono stati identificati per otto virus (ArMV,
CLRV, SLRV, OLRSV, CMV, OLYaV, OLV-1, OLV-2) in considerazione della disponibilità di
sequenze in banca dati e della relativa importanza degli stessi (Tab. 2).
Per alcuni di essi (ArMV, CLRV, SLRV, e CMV) non essendoci sequenze di isolati da olivo
sono state utilizzate sequenze identificate su altre specie, allineate con l’ausilio di un apposito
programma per l’individuazione di regioni conservate entro cui selezionare i primer.
Prima di procedere alla sintesi dei primers ne è stata valutata l’efficienza e la specificità mediante
una reazione di PCR virtuale usando il programma Amplify (Genetic Dept., University of
Wisconsin, USA) (Fig. 2). Per i virus trasmissibili meccanicamente un’ulteriore verifica è stata fatta
sugli estratti di acidi nucleici totali (TNA) da piante erbacee ognuna infetta da un singolo virus.
Verificata la funzionalità sugli ospiti erbacei si è passati all’applicazione su estratti di floematico di
olivo adattando un protocollo di PCR (Fig. 3) riportato per altre specie arboree (Minafra e Hadidi,
1994).
Contestualmente alla identificazione dei primers sono stati prodotti con RT-PCR frammenti
di dsDNA che sono stati inseriti in un vettore di trascrizione (pSPT64) e i plasmidi ricombinanti
utilizzati per trasformare cellule di Escherichia coli (ceppo DH5α) competenti. Il DNA purificato
da colonie positive è stato
sottoposto a digestione enzimatica con un opportuno enzima di
restrizione (EcoRI o HindIII) per permettere la linearizzazione del vettore a valle della sequenza
virale di dsDNA e quindi la sintesi da parte della T7 RNA polimerasi della ribosonda marcata con
digossigenina a partire dal proprio promotore a monte dell’inserto. In tabella 3 sono riportati i cloni
ottenuti con le relative dimensioni dei ribosonde da essi ottenute. La reazione di trascrizione è stata
effettuata utilizzando il kit Dig RNA Labeling kit (Roche) seguendo il protocollo fornito. Il prodotto
ottenuto è stato analizzato in gel di agarosio 1.2%, per verificarne l’integrità e per quantificarlo. La
ribosonda così ottenuta è stata conservata a –70°C ed utilizzata ad una concentrazione di 100ng per
ml nella reazione di ibridazione. Reazioni di ibridazione sono state condotte sia su estratti di dsRNA
che su estratti di acidi nucleici totali (TNA) (Fig. 4)
Si è anche cercato di migliorare la sensibilità della PCR ed eliminare l’erraticità di alcuni risultati
ottenuti, probabilmente dovuti all’irregolare distribuzione dei virus nella pianta. A tale scopo per
ArMV, CLRV, SLRV, OLRSV, OLV-1, OLV-2 è stata disegnata una coppia di primer interna a
quella selezionata in precedenza in modo da effettuare una reazione di PCR a doppio stadio (twosteps o nested-RT-PCR) (Pantaleo, 2001). Anche in questo caso i nested-primer sono stati disegnati
sulla base delle sequenze pubblicate, con l’ausilio del programma di amplificazione virtuale
Amplify.
L’efficacia è stata valutata sia su TNA che su estratto grezzo da olivo (Grieco, 1999).
RISULTATI
I soddisfacenti risultati ottenuti dall’applicazione dell’amplificazione genica (classica e
nested) e dell’ibridazioni molecolare hanno rappresentato un grosso progresso nella diagnosi dei
virus dell’olivo (Fig. 5). Questi due approcci sono l’unico strumento dotato di riproducibilità e
sensibilità tali da assicurare l’identificazione di agenti virali in olivo. L’analisi del dsRNA altra
tecnica applicata con successo sull’olivo già da alcuni anni, rappresenta un sicuro marker di
infezione ma raramente permette l’identificazione univoca dell’agente infettante. La messa a punto
di tali reagenti molecolari ha inoltre confermato i dati preliminari ottenuti proprio con il dsRNA, su
un’elevata incidenza di infezioni virali in questa specie, il 90% delle piante in cui sono stati trovati
dei dsRNA sono risultate infette da almeno uno degli otto agenti virali per i quali si dispone di un
set di primer e di una ribosonda. La PCR a doppio stadio ha permesso di ottenere un aumento della
sensibilità del saggio PCR.
Comunque ulteriori studi sono in atto per ottimizzare questi protocolli allo scopo di evitare
contaminazioni e quindi false reazioni positive, che tendono a limitare l’applicazione diagnostica
di questa tecnica su larga scala.
Bibliografia
Pantaleo A., Saponari M., Gallitelli D., 2001. Development of a nested PCR protocol for detection
of olive-infecting viruses in crude extracts. Journal of Plant Pathology, 83 (2), 143-146.
Grieco F., Gallitelli D., 1999. Multiplex reverse transcriptase-polymerase chain reaction applied to
virus detection in globe artichoke. Journal of Phytophatology, 147, 183-185.
F. Grieco, Saponari M., Alkowni R., Savino V., Garau R., Martelli GP., 2000. Progressi nella
diagnosi dell’olivo. Inf. Fitopatologico, 11, 49-52.
Dodds J., 1993. DsRNA in diagnosis. In Mattews R.E.F (ed). Diagnosis of plant virus diseases,
pp274-294. CRC Press, Boca Raton, USA.
Choi Y.G., Randles J.W., 1997. Microgranules cellulose improves dsRNA recovery from plant
nucleic acid extracts. Biotechniques, 23, 610-611.
De Paulo J.J. and Powell C.A., 1995. Extraction of double-stranded RNA from plant tissues without
the use of organic solvents. Plants disease, 79, 246-248.
Tabella 1: Virus isolati da olivo
VIRUS
GENERE
SIGLA
NOME IN ITALIANO
SLRV
Maculatura anulare latente della
fragola
Mosaico dell'Arabis
Accartocciamento fogliare del
ciliegio
ArMV
CLRV
CMV
OLRSV
OLV-1
OLV-2
OVYaV
OYMDaV
TNV
TMV
OSLV
OLYaV
Mosaico del cetriolo
Maculatura anulare latente dell'olivo
Latente 1 dell'olivo
Latente 2 dell'olivo
Virus associato all'ingiallimento
nervale dell'olivo
Virus dell'ingiallimento maculato e
del deperimento dell'olivo
Necrosi del Tabacco
Mosaico del tabacco
Virus semilatente dell'olivo
Virus associato all'ingiallimento
fogliare dell'olivo
Nepovirus
Nepovirus
Nepovirus
Cucumovirus
Nepovirus
Necrovirus
Oleavirus
Potexvirus
Capillovirus ?
Necrovirus
Tobamovirus
(indeterminato)
Closterovirus
Figura 1: Allineamento di sequenze disponibili in banca dati
R i c e rc a d e l l e s e q u e n z e d e l l a p ro t e i n a c a p s id i c a p e r i l v i r u s d e l m o s a i c o d e l l’A r a b i s
A L L IN E A M E N T O D E L L E S E Q U E N Z E D IS P O N I B IL I
(C L U S T A L V P ro g ra m )
A rM V 1 -C P
AGTTGTTAGTGAATGGAACGGGGTCACTAACATCTGGAACCGATTGTTTA
A rM V 2 -C P
AGTTGTTAGTGAATGGAACGGGGTCACTAACAACTCGAATCAACTGTTTA
A rM V 3 -C P
AGTTGTTAGTGAATGGAACGGGGTCACTAGCAACTGGACTCAACTGTATA
A rM V 4 -C P
AGTTGTTAGTGAATGGAACGGGGTCACTAACAACTGGAATCAACTGTTTA
P rim e r
R E A Z IO N E d i R T -P C R v i rt u a le
( P r o g r a m m a A M P L IF Y )
1
2406
A rM V R N A 2
488
Tabella 2: Coppie di primer identificate per ciascun virus
Virus
OLV-1
Regione
Limite di
Lunghezza
amplificata sensibilità
della
regione
amplificata
747 nt
3’-terminale
c. 10 fg
Sequenza dei primer utilizzati per la RTPCR (Grieco, 2000)
(5’ to 3’)
Sequenza dei primer utilizzati per la
Nested- RT-PCR (Pantaleo, 2001)
(5’ to 3’)
CTCACCCATCGTTGTGTGG
TTTCACCCCACCAAATGGC
AATGTTACCCTGGCCACC
TGTGGTTACAAATTGAC
SLRSV
525 nt
Proteina
capsidica
c. 100 fg
TCAAGGAGAATATCCCTGGCCC
CTAAGTGCCAGAACTAAACC
CTAAGTGCCAGAACTAAACC
CATTGTCCATGTGTTGAGGCT
CMV
513 nt
Replicasi
c. 10 fg
TAACCTCCCAGTTCTCACCGT
CCATCACCTTAGCTTCCATGT
/
ArMV
504 nt
Proteina
capsidica
c. 100 fg
TTGGTTAGTGAATGGAACGG
TCAACTCACCCTCCAAATCCC
TCAACTCACCCTCCAAATCCC
CCCCAATGATTATTTCCTATGG
OLRSV
492 nt
3’-terminale
c. 100 fg
CTGCAAAACTAGTGCCAGAGG
TGCATAAGGCTCACAGGAG
GTGGTGACGTGCTCTATCC
GGAGTCTAGGAATTGAAAACA
CLRV
431 nt
Proteina
capsidica
c. 100 fg
TTGGCGACCGTGTAACGGCA
GTCGGAAAGATTACGTAAAAGG
CCCAAGAATTTAGGGGG
AAACTCTAAAAGTAAA
OLV-2
390 nt
Replicasi
c. 10 fg
ACGTGTTAGTCGCTGTGGTACC
TATGTTTGACGCACCGGAGCG
CGTCGGAGATTATCTCTGA
TGACTCTGTTCAGAAGTAG
OLYaV
383 nt
Proteina
hsp70
c. 10 fg
CGAAGAGAGCGGCTGAAGGCTC
GGGACGGTTACGGTCGAGAGG
/
Figura 2: Schema di reazione di amplificazione genica utilizzato
°C
94
D enaturazione
35 cicli
Appaiam ento
dei prim er
72
Estensione ad opera di
una DNA polim erasi
55
30 sec
30 sec
30 sec
Figura 3: Sintesi di una ribosonda marcata e reazione di ibridazione
1 Clonaggio di un dsDNA virale
in un vettore di trascrizione
2. Linearizzazione con un
appropriato enzima di
restrizione
3. Trascrizione in vitro con Dig RNA Labeling kit (ROCHE)
ATP, CTP, GTP, UTP
Inserto
+ DIG-UTP
Ribosonda
marcata
Promotore
+ T7 RNA polimerasi
pSPT 64
Promotore T7
II. Applicazione dell’estratto di
dsRNA o TNA su membrana di
nylon
Acidi nucleici denaturati
Membrana di nylon
III. Ibridazione a macchia
Ibridazione
Reazione di
ibridazione con la
ribosonda marcata
2. Rilevamento del segnale
Riconoscimento della
digossigenina da parte di un
Anti-DIG-AP
Substrato chemiluminescente
CDP-Star
Autoradiografia del
filtro
Tabella 3: Cloni disponibili per la trascrizione delle ribosonde
Virus
Clone
Enzima di
Promotore
restrizione
Lunghezza della
Regione trascritta
ribosonda
ArMV
pSPArMV
HindIII
T7
490nt
Proteina capsidica
CLRV
pSPCLRV
HindIII
T7
420nt
3’terminale
SLRSV
pSPSLRSV
HindIII
T7
520nt
Proteina capsidica
OLYaV
pSPOLYV
HindIII
T7
530nt
Proteina hsp70
CMV
pCMVS3
BamHI
T7
1500nt
Proteina capsidica
OLV1
pSPTOLV
EcoRI
T7
1050nt
Proteina capsidica
OLV2
pSPOLV2
HindIII
T7
1280nt
Proteina di movimento
OLRSV
pSPOLRSV
HindIII
T7
1100nt
3’terminale
A
386 bp
Elettroforesi del prodotto
amplificato con l’uso di
primers virus-specifici
B
Reazioni di ibridazione tra la
sonda e l’acido nucleico virale
presente nell’estratto applicato
sulla mambrana
Figura 4: Esempi di risultati della reazione di RT-PCR (A) e di Ibridazione molecolare
(B)
Figura 5: Amplificazione geniche ottenute con l’uso dei nested-primers
marker
OLRSV
OLV-2 OLV-1
1
2
3
a b c
a b c
a b c
1000
500
400
300
200
100
marker
SLRV
CLRV
4
ArMV
5
6
1000
500
400
300
200
100
a b c
a
b c
a
b c
Validazione di protocolli di diagnosi massale per i virus dell'olivo
1
Cardone A., 1 N.Trisciuzzi, 2 M. Saponari
1
Centro di Ricerca e Sperimentazione in Agricoltura “Basile Caramia”, Locorotondo (Ba)
2
INTRODUZIONE
L'elevato standard sanitario richiesto con l'emanazione delle Direttive della Commissione n.
93/48/CEE del 23 giugno 1993, n. 93/64/CEE del 5 luglio 1993 e n. 93/79/CEE del 21 settembre
1993, per la commercializzazione delle produzioni vivaistiche di olivo, ha stimolato ricerche per
l'accertamento della virus-esenza nel materiale di propagazione di olivo (Grieco, 2000; Pantaleo,
2000). In seguito a questi studi è stata evidenziata un'elevata incidenza delle infezioni virali allo
stato latente (Saponari, 2001), che ha rivelato i limiti in termini di sensibilità ed affidabilità delle
diverse tecniche diagnostiche virologiche impiegate sino a qualche anno addietro, come la diagnosi
biologica mediante inoculazione meccanica su ospiti erbacei e la diagnosi sierologica.
Il recepimento di queste direttive a livello nazionale con il il DM 14/04/1997 ha reso
necessaria la messa a punto ed il trasferimento ai laboratori accreditati di tecniche diagnostiche
rapide, attendibili e di facile applicazione.
Nella presente nota viene riportata l'esperienza effettuata negli ultimi due anni dal
laboratorio accreditato di diagnosi fitopatologica del Centro di Ricerca e Sperimentazione in
Agricoltura "B. Caramia" (CRSA) di Locorotondo (Ba).
Nell’ambito di questo progetto diverse unità di ricerca (Dipartimento di Protezione delle
Piante e Microb. Applicata (DPPMA) dell'Università di Bari e il Centro Virus e Virosi delle Colture
Mediterranee (CeViCoM) del CNR di Bari) si sono occupate della problematica, avendo come
obiettivi l’individuazione di coppie primers per reazioni di amplificazioni geniche (PCR) e di sonde
per le ibridazioni molecolari, nonché di protocolli per il loro corretto impiego.
Per la validazione di questi protocolli, presso il CRSA sono state condotte delle prove di
diagnosi su larga scala, con lo scopo di individuare il periodo, la tecnica di campionamento ottimali
e l’affidabilità delle stesse.
MATERIALI E METODI
Considerata la proposta formulata nell’ambito del progetto POM A32 relativamente ai virus
da cui il materiale di propagazione deve risultare esente per essere commercializzato (Saponari et
al., 2001), nonché considerando i virus inclusi nel protocollo della categoria virus-controllato
nell’ambito della certificazione dell’olivo, nelle prove di validazione sono stati considerati i
seguenti virus: mosaico dell’Arabis (ArMV) accartocciamento fogliare del ciliegio (CLRV),
maculatura anulare latente della fragola (SLRV) e il virus associato all’ingiallimento fogliare
dell’olivo (OLYaV).
Oltre alla verifica intrinseca della sensibilità e dell’affidabilità dei protocolli diagnostici,
scopi della validazione sono stati, inoltre, l’individuazione del periodo migliore di campionamento e
la valutazione della soglia di rilevabilità dei virus in relazione all’età delle piante. Pertanto, sono
stati raccolti circa 900 campioni, in diverse aree della regione in primavera, estate ed autunno, da
semenzali di un anno, da piante innestate pronte per la commercializzazione e da piante adulte di
impianti commerciali utilizzate come fonti di approvvigionamento. In tutti i casi i campioni sono
stati costituiti raccogliendo talee lignificate con i relativi germogli apicali dai quattro punti cardinali
della pianta.
I campioni raccolti sono stati conservati, in sacchetti di polietilene a 4°C fino a due mesi
dalla raccolta. Dalle talee è stato prelevato del tessuto floematico sia dai rami ben lignificati che dai
germogli erbacei.
Per l’estrazione degli acidi nucleici
totali è stato adattato un protocollo basato sulla
separazione cromatografica degli acidi nucleici (Foissac, 2000).
Per ogni campione un’unica estrazione di acidi nucleici totali (TNA) è stata sufficiente per
poter poi procedere sia alla reazione di ibridazione molecolare che a quella di amplificazione genica
(PCR) utilizzando le coppie di primer e le sonde identificate e prodotte sempre nell’ambito delle
attività del progetto (Grieco, 2000).
RISULTATI E DISCUSSIONE
I campioni sono stati analizzati da 2 unità di personale specializzato (tecnici laureati)
nell’arco di 3 mesi. Con tali metodiche è stato infatti possibile processare 40 campioni a settimana
per unità operativa per l'identificazione dei 4 virus su indicati.
I risultati hanno dimostrato l’elevata incidenza di infezioni virali, già rilevabili sia nei
semenzali all’età dell’innesto che nelle piante pronte per la commercializzazione. Questo è stato un
dato importante ai fini di una diagnosi precoce per esempio nelle piante utilizzate per la costituzione
di campi di piante madri, o nei controlli effettuabili sul materiale commercializzato ai fini di
eventuali verifiche sanitarie.
Differenze di risposta sono state riscontrate sui campioni costituiti da floema di rami o di
germoglio, risultati più costanti sono stati ottenuti con il primo tipo di materiale, raccolto nei mesi
di marzo-giugno.
In merito invece alla praticità ed alla affidabilità delle due tecniche molecolari impiegate,
l'analisi di un così elevato numero di campioni ha evidenziato i limiti della tecnica di amplificazione
genica, basata su reazioni enzimatiche molto suscettibili a parametri ambientali e soprattutto a
contaminazioni e degradazioni che ne compromettono i risultati. Tali inconvenienti sono stati
ovviati eseguendo le operazioni sotto una cappa a flusso laminare, e seguendo un protocollo di PCR
in singolo tubo che limitando la manipolazione del campione ne limita i contatti con l'ambiente
esterno fonte di contaminazioni. L'ibridazione molecolare si è invece dimostrata una tecnica più
affidabile e ben adattabile per l'analisi di un numero elevato di campioni, non ancora comparabile
con la praticità dei saggi sierologici come l'ELISA ma di certo un valido supporto nella diagnosi
massale dei virus dell'olivo per il miglioramento sanitario delle produzioni vivaistiche.
In conclusione il lavoro ha evidenziato la possibilità di una diagnosi precoce dei virus
dell’olivo. Inoltre il protocollo di estrazione, messo a punto dalle Unità di Ricerca coinvolte rende
compatibile ed ammortizzabile il costo dei saggi (di circa 30.000 lire/campione comprensivo di
manodopera per il campionamento e per l'esecuzione dei saggi, del costo dei reagenti, dei costi di
manutenzione e ammortamento delle apparecchiature) rispetto all’uso di kit commerciali (50.000
lire/campione), pertanto applicabili sulle fonti di approvvigionamento utilizzate dai vivaisti per la
produzione di materiale di categoria CAC, considerando peraltro la cadenza triennale con cui tali
saggi devono essere ripetuto (Saponari, 2001) al fine di assicurare la conservazione in sanità delle
stesse.
Bibliografia
Pantaleo A., Saponari M., Gallitelli D., 2001. Development of a nested PCR protocol for detection
of olive-infecting viruses in crude extracts. Journal of Plant Pathology, 83 (2), 143-146.
Grieco F., Saponari M., Alkowni R., Savino V., Garau R., Martelli GP., 2000. Progressi nella
diagnosi dell’olivo. Inf. Fitopatologico, 11, 49-52.
Saponari M., F. Nigro, , Vovlas N., Cariddi C., Grieco F.,Trisciuzzi N., Savino V., Martelli G. P.,
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13p.(http://www.agr.uniba.it/poma32/Termoli/AttiTermoli.htm).
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from viruliferous mealybugs and infected tissue by cDNA amplification. Journal of
Virological Methods, 47, 175-188.
Foissac X., Svanella –Dumas L., Gentit P., Duluq M.J., Candresse T., 2000. Polyvalent detection of
fruit tree tricho, capillo and foveavirus by nested RT-PCR using degenerated and inosine
containing primers (PDO RT-PCR). ISHS Canterbury
Agente
virale
Tecnica
diagnostica
Tipo di tessuto
OLYaV
Amplificazione
genica (PCR)
CLRV
Ibridazione
molecolare
multipla
Floema
ricavato da
talee
significate ed
erbacee
ArMV
Epoca di
campionamen
to
MarzoGiugno
Conservazione
Tempi
necessari per il
saggio
40 campioni a
settimana
In sacchetti di
polietilene a
4°C fino a 2
mesi
SLRV
Raccolta dei campioni da piante di età diversa
Estrazione da 0.2 g
di floema in
presenza di azoto
liquido
2 ore
Purificazione
degli acidi nucleici totali (TNA)
Costo per
campione
30.000
Acidi nucleici totali (TNA)
Preparazione del
campione per lo spot
su membrana di nylon
4 ore
1 ora
Preparazione del campione per la
reazione di amplificazione genica
12 ore
3 ore
Reazione di Ibridazione molecolare
Reazione di amplificazione genica
Lavaggio e sviluppo della membrana
6 ore
1 ora
Separazione mediante corsa elettroforetica in
gel di poliacrilammide prodotto PCR
2ore
Rilevamento del segnale su lastra
autoradiografica
1 ora
Visualizzazione delle bande mediante
colorazione con argento nitrato
Protocolli per gli accertamenti sanitari degli organismi patogeni di “qualità”
dell’olivo
C. Cariddi1, P. Gallone1, F. Grieco2, G. Loconsole1, F. Nigro1, G. Romanazzi1, M. Saponari1,
N. Trisciuzzi3, N. Vovlas4
1
2
Centro Studio sui Virus e le Virosi delle Colture Mediterranee, CNR-Bari
3
Centro di Ricerca e Sperimentazione in Agricoltura “B. Caramia” Locorotondo (Ba)
4
Istituto di Nematologia Agraria, CNR-Bari
Introduzione
La corretta identificazione dei patogeni pregiudizievoli la qualità del materiale di propagazione
rappresenta uno dei requisiti fondamentali per l’applicazione delle norme contenute nel DM
14/04/1997. Di seguito si riportano i rilievi e/o gli accertamenti di laboratorio standardizzati per
ognuno dei patogeni considerati nell’elenco definito all’interno del progetto (Saponari, 2001). Gli
accertamenti di laboratorio sono stati riservati a quei patogeni sistemici, che potendo infettare le
fonti e il relativo materiale di propagazione anche in forma asintomatica, possono sfuggire alle sole
osservazioni visive, nonché ai patogeni terricoli la cui presenza può essere accertata esclusivamente
mediante tecniche di laboratorio.
I rilievi visivi, da effettuarsi sia sulle fonti di approvvigionamento che sul materiale prodotto
in vivaio, avranno periodicità annuale e saranno effettuati in concomitanza con il periodo di
massima espressione sintomatologica della malattia. Gli accertamenti di laboratorio sono stati
previsti sulle fonti di approvvigionamento (sia sul terreno che sulle piante) a cadenza tale da
garantirne la sanità e su tutti i substrati colturali utilizzati in vivaio.
I. BATTERI
La specie Pseudomonas savastanoi pv savastanoi è l’unica specie batterica considerata tra i
patogeni pregiudizievoli la qualità dei materiali di propagazione dell’ olivo. L’allegato II del
decreto, così come per gli altri casi, parla di assenza del patogeno; tuttavia, considerato che tale
batterio può essere molto spesso presente sull’olivo allo stato epifitico, indipendentemente dalla
presenza di sintomi, si è proposto di sostituire “l’assenza del patogeno” con l’assenza dei sintomi
della malattia.
I controlli sanitari, pertanto, saranno mirati alla osservazione visiva dei sintomi, in quanto
chiari e inequivocabili, escludendo sia sulle fonti di approvvigionamento che su materiale di
propagazione qualsiasi verifica di laboratorio, con l’obbligo però di eseguire un trattamento con
composti rameici dopo ogni rilevante evento biotico o abiotico causante ferite, e prima di ogni
prelievo di materiale di propagazione.
Naturalmente i controlli visivi, annuali, andranno fatti nel periodo primaverile e autunnale in
concomitanza con la massima espressione sintomatologica della malattia.
II. FUNGHI
Verticillium dahliae, responsabile della tracheomicosi dell’olivo nota come verticilliosi, è
un fungo ad habitat tellurico, dove può sopravvivere a lungo grazie alla differenziazione di
microsclerozi. Ai fini di una diagnosi precoce del patogeno (prima della comparsa dei sintomi
esterni) e per escludere infezioni asintomatiche, oltre ai rilievi visivi, sono necessari accertamenti di
laboratorio. Per il campo di piante madri gli accertamenti diagnostici dovranno essere eseguiti sul
terreno e sulle piante. In particolare, per il terreno la diagnosi dovrà essere effettuata al momento
dell’impianto, determinando la densità di inoculo dei microsclerozi in almeno 5 campioni/Ha; per
le piante, invece, il saggio diagnostico sul tessuto legnoso è previsto a cadenza triennale sul 10%
delle piante. Inoltre, è necessario che i terreni o le miscele utilizzate in vivaio durante il ciclo
colturale siano esenti dal fungo. Pertanto, l’accertamento sanitario deve essere effettuato ogni
qualvolta si prepari una nuova miscela a partire da componenti non sterili, analizzando almeno un
campione ogni 5 m3 di terriccio.
Per la diagnosi di V. dahliae sono disponibili substrati semiselettivi e kit ELISA. I substrati
semiselettivi possono essere impiegati per l’accertamento della presenza del patogeno nel terreno,
mediante la tecnica della diluizione in piastra, e nei tessuti legnosi; i kit ELISA, invece, possono
essere utilizzati per gli accertamenti sui tessuti legnosi.
ACCERTAMENTI DI LABORATORIO PER Verticillium dahliae
Tipo di saggio
Isolamenti su substrati semiselettivi (Allegati 11A; 2-2A);
kit ELISA (Allegato 3)
Isolamenti su substrati semiselettivi
Affidabilità del saggio
Matrice utilizzata
Modalità di conservazione
Epoca di saggio
Temperatura di saggio
Tempo di diagnosi
Note
ottima;
terreno (Allegato 1); porzioni di tessuto
xilematico prelevate da rami, tronco colletto
(Allegato 2);
terra fina secca a 20°C fino a 3 mesi; materiale
vegetale a 4°C fino ad una settimana,
conservarti in sacchetti di plastica chiusi;
fine inverno-inizio primavera e fine estate-inizio
autunno;
20-25°C;
2 mesi per l’isolamento da terreno e 7-8 gg per
l’isolamento da tessuti legnosi;
tempi lunghi, costi bassi.
Kit ELISA
Affidabilità del saggio
Matrice utilizzata
Modalità di conservazione
Epoca di saggio
Temperatura di saggio
Tempo di diagnosi
Note
Buona
tessuto xilematico prelevato da rami, tronco,
colletto, radici; (Allegato 3)
a 4°C fino ad una settimana, campioni conservati
in sacchetti di plastica chiusi;
fine inverno-inizio primavera;
20-37°C;
24 ore;
tempi brevi, costi modesti.
III. NEMATODI
Tra i patogeni terricoli considerati pregiudizievoli alla qualità vi sono i nematodi, il decreto
considera tali soltanto le specie del genere Meloidogyne, senza peraltro definirle. L’epidemiologia
di alcuni virus (trasmessi da nematodi) e i danni causati da un altro gruppo di nematodi
endoparassiti hanno portato ad una integrazione di questo gruppo di patogeni estendendolo a
Xiphinema diversicaudatum e Pratylencus vulnus nonché definendo nel genere Meloidogyne, come
specie da considerare M. javanica e M. incognita. Per l’accertamento della presenza di nematodi
fitoparassiti in un ambiente agrario e la successiva determinazione della specie, fondamentale
importanza rivestono la raccolta e l’esame diagnostico di laboratorio dei campioni di terreno e delle
parti della pianta infestati. La conoscenza, quindi del comportamento biologico dei nematodi e del
loro rapporto con le diverse parti della pianta ospite è basilare per una corretta estrazione
quantitativa e qualitativa. In allegato 7 si riporta il protocollo per le analisi nematologiche.
IV. VIRUS
I virus considerati per l'approntamento dei protocolli sono stati, così come definito nei punti
critici, i seguenti: mosaico dell'Arabis (ArMV), accartocciamento fogliare del ciliegio (CLRV),
maculatura anulare latente della fragola (SLRV), virus associato all'ingiallimento fogliare dell'olivo
(OLYaV). I saggi di laboratorio andranno fatti a cadenza triennale sul 10% delle piante, in
considerazione delle modalità di trasmissione (seme e polline) note per i primi tre virus e
sconosciute per l'OLYaV.
Per la diagnosi di questi virus sono disponibili esclusivamente reagenti molecolari per le
reazioni di amplificazione genica (PCR) e di ibridazione molecolare, dato che sia i saggi sierologici
che quelli biologici mediante trasmissione su ospiti erbacei differenziali sono risultati molto erratici.
La diagnosi simultanea dei primi tre è stata ottenuta con successo con una reazione di
ibridazione molecolare (Allegato 4) utilizzando le ribosonde prodotte e messe a punto durante la
produzione di kit diagnostici (Grieco, 2000). Mentre per l'OLYaV i primer identificati (Grieco,
2000) sono stati utilizzati con successo su estratti di acido nucleico totale (TNA), mediante una
reazione di amplificazione genica, sia classica (Allegato 5) che in singolo tubo (Allegato 6).
ACCERTAMENTI DI LABORATORIO
AGENTE
ArMV (Virus del mosaico dell’Arabis)
Disponibili kit ELISA commerciali non efficaci su
Disponibilità di reagenti sierologici
estratti di olivo
Primers e sonda clonata
Disponibilità di reagenti molecolari
Buona
Attendibilità del saggio mediante di
amplificazione genica PCR (All. 5-6)
Buona
Attendibilità del saggio mediante
ibridazione molecolare(All. 4)
Scarsa
trasmissioni meccaniche
Primavera
Periodo ottimale per il saggio
AGENTE
CLRV (Virus dell’accartocciamento fogliare del ciliegio)
estratti di olivo
Buona
amplificazione genica PCR
Buona
ibridazione molecolare
Scarsa
Primavera
AGENTE
SLRV (Virus del mosaico dell’Arabis)
estratti di olivo
Buona
Buona
Scarsa
Primavera
AGENTE
OLYaV (Virus associato all’ingiallimento fogliare dell’olivo)
NO
Buona
Scarsa
Non trasmissibile meccanicamente
Autunno
CONCLUSIONI
La reazione a catena della polimerasi (PCR) e l'ibridazione molecolare sono senz'altro le
tecniche che hanno profondamente modificato negli ultimi anni la diagnosi di virus a bassa
concentrazione come quelli dell'olivo, portando progressi notevoli in campo diagnostico. Di
particolare utilità per questa specie, in cui l'identificazione degli agenti virali presenta non poche
difficoltà a causa della sua scarsa reattività, dell'assenza di indicatori arborei per la trasmissione per
innesto, della scarsa attendibilità delle trasmissioni meccaniche su ospiti erbacei e della scarsa
attendibilità dei saggi sierologici.
Come spesso riportato, ai vantaggi in termini di sensibilità, soprattutto per la PCR, si
accompagnano alcuni inconvenienti quali la laboriosità della tecnica, la necessità di personale e
strutture specialistiche, nonché i rischi maggiori di risultati falsificati a causa di contaminazioni
delle reazioni.
Nell'ottica di un'applicazione massale di queste tecniche quale può essere la necessità dei
laboratori accreditati, si è cercato di limitare l'influenza di tali inconvenienti, mettendo a punto
protocolli di estrazione del campione efficaci ma nel contempo semplici. La messa a punto di un
protocollo di ibridazione molecolare mediante dot-blot, utilizzando un estratto di TNA come
stampo invece di un estratto di dsRNA, ha rappresentato una non indifferente riduzione di costi e di
tempi per la preparazione del campione. Così come la messa a punto di un protocollo di “singletube” PCR ha velocizzato di non poco i tempi di reazione nonché ridotto i rischi
di
contaminazione.
Riguardo al V. dahliae, i protocolli proposti si basano essenzialmente su tecniche
diagnostiche tradizionali che, al momento, sono le uniche in grado di fornire risultati certi per la
diagnosi del patogeno in un ambiente così complesso come il terreno. Rilevante ai fini della
diagnosi massale sembra, invece, l’impiego dei kit ELISA per accertare la presenza del patogeno
nei tessuti legnosi. Tali kit hanno permesso di diagnosticare la presenza del patogeno sia in piante
sintomatiche naturalmente infette, sia in piante di olivo che non mostravano evidenti sintomi di
disseccamento sulla chioma. Data la notevole diffusione della verticilliosi dell’olivo (Saponari et
al., 2001), i kit ELISA rappresentano una valida alternativa all’isolamento su substrato agarizzato
nella diagnosi su larga scala, con il vantaggio di essere di facile esecuzione e di non richiedere
l’impiego di attrezzature costose.
Allegato 1
Diagnosi di V. dahliae nel terreno mediante isolamento su substrato semiselettivo
a) Prelievo dei campioni di terreno in campo o in vivaio
1) Individuare la forma e la superficie dell’appezzamento da sottoporre ad accertamento;
2) definire lo schema di prelievo dei campioni secondo percorsi preordinati dipendenti dalla
forma dell’appezzamento (ad es. a W, a Z, a X, etc.), in modo tale da non escludere settori
dal prelievo e da effettuare un campionamento sistematico-randomizzato, ossia prelievo del
campione ad intervalli regolari di n metri;
3) dopo aver allontanato gli strati superficiali (1-2 cm), prelevare il campione di terreno (del
peso di circa 1 Kg) fino ad una profondità massima di 20-25 cm;
4) per ogni ettaro di terreno da sottoporre ad accertamento sanitario prelevare almeno 10
campioni;
5) porre i campioni in apposite buste di carta per il trasporto in laboratorio;
6) nel caso delle miscele preparate in vivaio, subito dopo le operazioni di preparazione,
prelevare 10 campioni di circa 1 Kg di peso ogni 5 m3 di miscela. I campioni devono essere
prelevati da diversi punti della massa e prima della formazione del cumulo, in modo che
non ci siano zone non raggiungibili dal prelievo;
7) porre i campioni in apposite buste di carta per il trasporto in laboratorio;
Note - I campioni devono essere prelevati con terreno in tempera. Qualora fosse noto che un settore
dell’appezzamento sia stato precedentemente coltivato con una specie ortiva suscettibile al
patogeno, è opportuno che i campioni di terreno prelevati da tale settore siano tenuti separati da
quelli prelevati dal resto dell’appezzamento.
b) Lavorazione dei campioni in laboratorio
8) Disporre i singoli campioni su fogli di carta assorbente, in modo da formare uno strato di 1-2
cm;
9) far essiccare i campioni di terreno o di miscela all’aria per circa 25-30 giorni, in un ambiente
fresco e ventilato, smuovendo periodicamente lo strato e sbriciolando le zolle più grosse;
10) una volta essiccati, mescolare accuratamente i 10 campioni raccolti per ogni ettaro di terreno
o per ogni 5 m3 di miscela e prelevare, rispettivamente, 5 e 1 campione del peso di circa
300 g;
11) setacciare i campioni così ottenuti con setaccio a maglie di 2 mm;
12) pesare 25 g di terra fina e porli in una beuta frangiflusso da 250 ml;
13) portare ad un volume di 100 ml con acqua distillata sterile;
14) porre in agitazione per 1 h a 270 rpm su agitatore rotativo;
15) filtrare il terreno attraverso due setacci impilati aventi rispettivamente maglie da 150 e 20
µm;
16) raccogliere il materiale presente sul setaccio inferiore in una beuta e risospenderlo in 100 ml
di acqua distillata sterile;
17) seminare uniformemente la sospensione su substrato semiselettivo di Harris (Allegato 1A)
nella misura di 2 ml per piastra (∅ 100 mm), per un totale di 10 piastre;
18) lasciare asciugare le piastre per circa 30 min sotto cappa e incubarle a 24 °C al buio per 15
giorni;
19) lavare le piastre sotto acqua corrente, in modo da allontanare i residui di terreno presenti;
20) incubare nuovamente le piastre a 24°C, al buio, per 15 giorni;
21) rilevare il numero di colonie da microsclerozi servendosi di uno stereomicroscopio (almeno
20 ingrandimenti);
NOTE: Il numero di microsclerozi per grammo di terra fina può essere calcolato come segue:
Nx2, dove N= numero medio di microsclerozi per piastra; 2 = fattore di diluizione; 25 = g iniziali di
terra fina da cui è stato ottenuto il setacciato.
Difficoltosa risulta la distinzione dei microsclerozi di V. dahliae da quelli di V. tricorpus. In
quest’ultima specie i microsclerozi sono più grandi e più tondeggianti, caratteristiche difficilmente
apprezzabili con un esame allo stereomicroscopio; osservate attentamente in coltura, invece, le due
specie possono essere distinte per la presenza di clamidospore e di ife scure che caratterizza V.
tricorpus.
Allegato 1A
Preparazione del substrato semiselettivo per V. dahliae (Harris et al., 1993)
Preparazione dell’estratto di suolo:
porre 1 kg di terreno in 1 l di acqua, sterilizzare a 1 atm per 20 min, far decantare la
sospensione, filtrare sottovuoto su carta Whatman e conservare a 5°C.
Preparazione del substrato agarizzato
In un cilindro da litro porre:
• 24 ml di estratto di suolo;
• 1.5 g di KH2PO4;
• 4 g di K2HPO4;
• 1 ml di tergitolo;
• 2 g di sodio polipectato;
• 15 g di agar;
• 2 ml di soluzione salina contenente 10 g di KH2PO4, 5 g di KCl, 5 g di MgSO4, 0.1g di
FeSO4, 20 g di NaNO3 per 100 ml;
• portare ad volume di 900 ml con acqua distillata;
• versare il contenuto del cilindro in una bottiglia da litro e sterilizzare in autoclave a 1 atm per
20 min.
• Dopo aver raffreddato a 55°C, aggiungere 100 ml di una soluzione antibiotica contenente 60
mg di cloramfenicolo, 60 mg di clortetraciclina, 50 mg di streptomicina e 6 mg di biotina.
• Versare il substrato così preparato in piastre Petri, in ragione di 12-13 ml/piastra
Allegato 2
Diagnosi di V. dahliae nei tessuti legnosi mediante isolamento in piastra
su substrato semiselettivo
a) Prelievo dei campioni legnosi in campo o in vivaio
1) Ispezionare tutte le piante fonti di approvvigionamento presenti nel campo per accertare la
presenza di eventuali sintomi: ingiallimento aspecifico delle foglie, defogliazione,
disseccamento dei germogli, dei rami o delle branche, imbrunimenti del legno, etc;
2) individuare il 10% delle piante da sottoporre ad accertamento diagnostico, includendovi
quelle mostranti eventuali sintomi; fatte salve queste ultime, le rimanenti dovranno essere
individuate secondo percorsi preordinati dipendenti dalla forma dell’appezzamento (ad es. a
W, a Z, a X, etc.), in modo tale da non escludere settori dal prelievo e da saggiare tutte le
piante nell’arco di 10 anni;
3) da ciascuna branca delle piante individuate prelevare 10-15 porzioni di rametti (di 15-20 cm
di lunghezza), distribuiti omogeneamente sulla branca; in presenza di sintomi prelevare rami
ancora vitali e non completamente disseccati;
4) sistemare i campioni raccolti per ciascuna pianta in buste di plastica numerate, dopo aver
coperto i rametti con carta assorbente imbibita di acqua per evitare una eccessiva
disidratazione; trasportare il materiale in laboratorio in un contenitore refrigerato.
Note. Considerata la possibile influenza che lo stato vegetativo della pianta e la temperatura
ambientale possono avere sulla frequenza di isolamento di V. dahliae, il prelievo dei campioni
dovrà essere effettuato da marzo a giugno.
5) Disinfestare superficialmente i rametti mediante immersione in una soluzione di ipoclorito di
sodio all’1% per 30 s;
6) risciacquare abbondantemente i rametti e lasciarli ad asciugare sucarta bibula sterile;
7) sempre operando in condizioni di asepsi (ad es. alla fiamma di un becco Bunsen o sotto
cappa a flusso laminare), allontanare la corteccia e gli strati più superficiali del tessuto
legnoso mediante un bisturi o un coltello la cui lama sia stata opportunamente sterilizzata alla
fiamma;
8) prelevare porzioni del tessuto xilematico e seminarle in piastre contenenti agar-patataglucosio+antibiotici (Allegato 2A); nel caso di rami con sintomi, prelevare le porzioni di
xilema dalla zona di confine tra la parte sana e quella disseccata;
9) incubare le piastre in termostato a 21°C e verificare periodicamente la crescita di eventuali
colonie fungine a partire dalla porzione di legno seminata; solitamente per V. dahliae sono
sufficienti 6-8 gg. di incubazione, al termine dei quali può essere anche possibile identificare
il patogeno sulla base delle sue caratteristiche morfologiche (struttura dei conidiofori, forma
e dimensione dei conidi, presenza, dimensione e forma dei microclerozi, etc.)
10) nei casi dubbi, trasferire le colonie sospette su nuove piastre, incubare per 5-6 gg, a 21°C,
quindi procedere all’identificazione come descritto in precedenza.
Allegato 2A
Preparazione del substrato semiselettivo per l’isolamento di V. dahliae da tessuto legnoso
(agar-patata-glucosio + antibiotici)
Materiale occorrente
200 g di patate;
20 g di glucosio;
20 g di agar;
250 mg di streptomicina solfato
250 mg di ampicillina
Acqua distillata fino ad 1 litro.
Procedura
1)
Pelare e tagliare a cubetti le patate;
2)
cuocere le patate in 600-700 ml di acqua distillata, in autoclave a 0,5 atm (110°C) per
10 min;
3)
filtrare il brodo ottenuto su un doppio strato di garza;
4)
aggiungere il glucosio e l’agar;
5)
portare a volume di 900 ml;
6)
sterilizzare ad 1 atm (120°C) per 20 min;
7)
stabilizzare il substrato in bagno termostatato a 55-60°C;
8)
aggiungere 100 ml di una soluzione antibiotica contenente 250 mg di streptomicina
solfato e 250 mg di ampicillina;
9)
versare in piastre Petri con diametro 100 mm (12-13 ml/piastra).
Allegato 3
Diagnosi di V. dahliae in tessuti legnosi di olivo mediante kit ELISA
I kit attualmente disponibili in commercio sono prodotti dalle Ditte: Adgen, Agdia e Loewe.
a) Prelievo dei campioni legnosi in campo
Adottare le stesse procedure riportate nell’Allegato 2 ai punti 1-4
1) Scortecciare la porzione di legno interessata, preferibilmente costituita da giovani rametti;
come controllo, includere nel saggio 1-2 campioni sicuramente sani e 1-2 campioni
sicuramente infetti;
2) prelevare sottili scaglie di legno mediante un temperamatite o un coltello;
3) frantumare 1 g di materiale in azoto liquido;
4) sospendere la polvere ottenuta in 10 ml del tampone di estrazione fornito con il kit;
5) filtrare la sospensione con garza;
6) sensibilizzare una piastra ELISA con 200 ml di una sospensione di IgGs specifiche per V.
dahliae in tampone di sensibilizzazione e incubare 4 h a 37°C;
7) eseguire cinque lavaggi con tampone di lavaggio;
8) aggiungere 200 ml del campione preparato nel tampone di estrazione;
9) eseguire cinque lavaggi con tampone di lavaggio fornito dal kit;
10) incubare una notte a 4°C;
12) dispensare 200 ml della sospensione di IgGs specifiche per V. dahliae coniugate con fosfatasi
alcalina in tampone di coniugazione;
14) aggiungere 200 ml di P-nitrofenilfosfato (1 mg/ml) in tampone di dietanolammina;
15) lasciar sviluppare la reazione colorimetrica (viraggio a color giallo);
16) leggere l’assorbanza a 405 nm mediante un misuratore fotometrico dopo 0,5 - 1 e 2 ore ed,
eventualmente, dopo una notte a 4°C. Si considerano infetti i campioni con una assorbanza
uguale o superiore alla somma tra la media delle letture fotometriche relative ai testimoni non
infetti e il triplo della loro deviazione standard (Sutula et al., 1986).
Allegato 4
Protocollo di ibridazione molecolare per la diagnosi ArMV, CLRV e SLRV.
Campionamento
I campioni devono essere costituiti prelevando 10-15 rametti ben lignificati lungo tutta la
chioma della pianta. I campioni raccolti devono essere conservati in frigorifero a 4–6°C per un
periodo massimo di 2 mesi.
a) Protocollo per l’estrazione degli acidi nucleici totali (tna)
1. Preparazione del campione: prelevare 0.5g di tessuto corticale da diverse porzioni di
talee lignificate;
2. Omogeneizzare il tessuto in un mortaio in presenza di azoto liquido e raccoglierne
200mg in un tubo eppendorf;
3. Aggiungere1ml di tampone di estrazione e 200 µl di Sarcosyl 10%, agitare ed incubare a
70°C per 10 min. agitando ogni 2-3 min.;
4. Incubare per 5 min. in ghiaccio;
5. Centrifugare per 10 min. a 12000 rpm;
6. Recuperare 300 µl di supernatante in un nuovo tubo ed aggiungervi 300µl di soluzione
NaI, 150 µl di etanolo assoluto, 35 µl di sospensione di silica;
7. Lasciare per 10, in lenta agitazione a temperatura ambiente;
8. Centrifugare a 6000 rpm per 1 min., recuperare il pellet e risospenderlo in 500µl di
tampone di lavaggio (wb)
9. Ripetere la fase 7
10. Lasciare i tubi ad asciugare capovolgendoli su unoo strato di carta;
11. Risospendere il pellet in 150 µl di H2O sterile ed incubare a 70°C per 4 min..
12. Centrifugare a 12000 rpm per 3 min.;
13. Recuperare il supernatante (TNA) e trasferirlo in un nuovo tubo;
14. Effettuare una lettura spettrofotometrica dell’estratto, per valutare il rapporto
dell’assorbanza A260/A280.
b) Concentrazione e applicazione degli acidi nucleici estratti su membrana
15. Precipitare il TNA aggiungendo 2,5 volumi di etanolo assoluto e o,1 volumi di sodio
acetato 3M ph 5,5.
16. Lasciare in precipitazione overnight a –20°C oppure 2 h a –70°C;
17. Centrifugare per 25 min. a 12000 rpm;
18. Svuotare il supernatante ed aggiungere 500 µl di etanolo al 70%;
19. Centrifugare per 5’, dopodiché svuotare il supernatante;
20. Asciugare il pellet in una pompa da vuoto;
21. Risospenderlo in 10 µl di H2O;
22. Aggiungere 10 µl di soluzione denaturante e lasciare per 5 min. a temperatura ambiente;
23. Applicare 10 µl del campione su ciascuno dei due filtri opportunamente preparati (
quadrettati, e prettrattati nella soluzione denaturante, questa preparazione può essere
effettuata anche mesi prima);
24. Lasciar asciugare la membrana ed esporla per 10 min. ai raggi UV su un
transilluminatore;
25. La membrana così preparata può essere subito sottoposta ad ibridazione oppure
conservata per un tempo illimitato a temperatura ambiente in una busta di polietilene.
c) Reazione di ibridazione
1. Incubare la membrana con 1ml/10cm2 di soluzione di granuli per 30 min. a 55°C;
2. Cambiare la soluzione di granuli con un uguale volume della stessa soluzione ed
aggiungervi 50ng/ml della sonda per ArMV, CLRV, SLRV;
3. Incubare tutta la notte a 58°C;
4. Effettuare 3 lavaggi da 30min. ciascuno a 65°C con una soluzione SSC 1X – SDS
1%;
5. Incubare per 2’ in una soluzione SSC 2X a temperatura ambiente;
6. Incubare per 30’ in una soluzione SSC 2X contenente RNasi A 1mg/ml;
7. Lavare il filtro in Whashing Buffer per 5 min.;
8. Incubare per 30 min. in Buffer 2;
9. Incubare per 30 min. in Buffer 2 contenente antiAP Fab 1:5000;
10. Effettuare 2 lavaggi da 20 min. in Whashing Buffer;
11. Equilibrare per 2 min. in Buffer 3;
12. Drenare il filtro su della carta assorbente 3MM;
13. Incubare per 5 min. con 1ml/100cm2 di una soluzione di buffer 3 contenente il
substrato CDP-Star 1:100;
14. Drenare il filtro su della carta assorbente 3MM;
15. Disporre i filtri su uno strato di pellicola trasparente e sistemarli in camera oscura
nella apposita cassetta per esposizione;
16. Lasciare in esposizione per almeno un ora, prima di procedere allo sviluppo nelle
apposite soluzioni di sviluppo e fissaggio.
17. Riesporre il filtro qualora l’intensità del segnale non sia quella ottimale.
Reagenti e soluzioni necessari per l’estrazione del campione:
Tampone
di
4 M guanidina tiocianato, 0.2 M sodio acetato, 1M potassio
estrazione
acetato, 0.025 M EDTA bisodico, 2.5% polivinil pirrolidone40K, preparare in acqua distillata sterile e conservarlo a 4°C;
prima dell’utilizzo aggiungere 1% di B-mercaptoetanolo
Sarcosyl 10%
10g di N-Laurilsarcosine/100ml di acqua distillata sterile
Soluzione di NaI
sciogliere dapprima 0,75 g di sodio solfito anidro in 40 ml di
acqua distillata sterile, poi sciogliervi 36 g di NaI
Risospendere 60g di silica in 500 ml di acqua distillata,
mescolare e lasciar decantare per 24 ore. Elimin.are 470 ml di
supernatante e riportare il volume con H2O distillata a 500 ml,
mescolare e lasciar decantare per 5 h. elimin.are 440 ml di H2O e
portare ad un volume finale di 60 ml di sospensione a pH 2 con
HCl. Autoclavare e conservare al buio a 4°C
Sospensione
silica
di
WB soluzione di
lavaggio per RNA
Etanolo assoluto
Etanolo al 70%
Soluzione
denaturante
0,01M Tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA bisodico; 0,05 M cloruro
di sodio; 50% alcol etilico
100 mM sodio idrossido, 0,05 mM EDTA bisodico
Reagenti e soluzioni necessarie per la reazione di ibridazione:
DNA plasmidico
Contenente la sequenza della sonda
Kit commerciale (Roche)
per la trascrizione e marcatura della sonda
Soluzione Dig easy hyb Roche
granules (Roche)
Blocking solution 10%
10 g di blocking in 100 ml di buffer 1
Buffer 1 1x pH 7.5
0.1M acido maleico, 0.15M sodio cloruro
Buffer 2
Buffer 1 con 1% di blocking solution
Buffer 3 1x pH 9.5
0.1M Tris-HCl, 0.1M sodio cloruro, 0.05M magnesio cloruro
Whashing buffer
Buffer 1 con 0. 3% di Tween 20
3M sodio cloruro, 0.3M sodio citrato bi-idrato
SSC 20X
SDS 10%
10 g di Sodio dodecil solfato in 100 ml di H2O
Anti Ap
Roche
CDP-Star
Roche
Tween 20
Sigma
Allegato 5
Protocollo di amplificazione genica per ArMV, CLRV, SLRV, OLYaV
A) Protocollo per l’estrazione degli acidi nucleici totali (tna)
Seguire quanto riportato dalla fase1 alla fase 14 dell’allegato 1.
B) Sintesi del cDNA :
1) Aggiungere a 0.5µg di RNA estratto, 0.5 µg di random primer ed incubare a 95°C per 5 min.;
2) Incubare in ghiaccio per 2 min.;
3) Aggiungere la seguente mix di reazione:
1µl di dNTPs 10mM
1.2 µl di DTT
4 µl di Buffer 5x
0.8 µl di M-MLV
Portare a volume finale di 20µl
4) Incubare per 1.5 ore a 42°C;
5) Conservare –20°C.
C) Reazione di amplificazione genica:
1) Mettere 2.5 µl della reazione di cDNA in un tubi da 0.2ml;
2) Aggiungere la seguente mix di reazione: 1µl di Primer senso*
1µl di Primer antisenso*
0.5µl di dNTPs 10mM
0.5µl di MgCl2
2.5µl di Buffer 10x
0.2µl di Taq DNA polimerasi
16.3µl di H2O
3) Incubare la reazione in un termociclatore secondo il seguente ciclo:
94°C x 5 min.
94°C x 30sec
72°C x 30 sec
72°C x 7min.
55°C x 30 sec
16°C x ∞
X 35 CICLI
4) Il prodotto PCR può essere subito analizzato in gel di poliacrilammide oppure conservato a –
20°C.
*La coppia di primer senso ed antisenso è virus-specifica, pertanto per l’identificazione di
ciascuno dei 4 virus sarà aggiunta la rispettiva coppia di primer.
D) Analisi del prodotto di amplificazione:
Corsa elettroforetica in gel di poliacrilammide 6%
Preparazione di 5ml di gel:
3.86 ml di H2O distillata sterile
0.65 ml di acrilammide
0.5 ml di TBE 10x
60µl di Ammonio persolfato in soluzione del 10%
6µl di Temed
1)
2)
3)
4)
Lasciar polimerizzare per circa 20-30 min.;
Caricare in ogni pozzetto del gel 10 µl del campione miscelato a 3 µl di gel loading buffer;
Elettroforesi per circa 1 ora applicando un voltaggio costante di 100-110 V;
Quando il blu di bromofenolo giunge ad 1 cm dal termine del gel sospendere la corsa e
procedere alla colorazione del gel in con argento nitrato:
• Immergere il gel in una vaschetta (in plastica o vetro) contenente una soluzione di acido
acetico al 10% per 20 min.;
• Effettuare 3 lavaggi del gel in H2O distillata per 1 min.. ciascuno;
•
•
•
•
•
•
•
incubare per 3 min. in una soluzione all’1% di acido nitrico
Effettuare 3 lavaggi del gel in H2O distillata per 1 min. ciascuno;
Incubare il gel nella soluzione di AgNO3 per 30 min.;
Effettuare un lavaggio del gel in H2O distillata per qualche secondo;
Sviluppare il gel nella soluzione di Na2CO3;
Quando l’intensità delle bande del marker e dei testimoni positivi è ottimale fermare la
colorazione eliminando la soluzione Na2CO3, ed aggiungere una soluzione di acido
acetico al 10%.
Il gel così colorato può essere fotografato e/o scansionato e può essere conservato
sigillandolo tra due strati di telo di plastica.
Allegato 6: Single-Tube PCR
A) Protocollo per l’estrazione degli acidi nucleici totali (tna)
Seguire quanto riportato dalla fase 1 alla fase 14 dell’allegato 1.
B)
1)
2)
3)
4)
Sintesi del cDNA ed amplificazione genica:
Aggiungere a 3µl di TNA 14µl di H2O RNase-free in tubi eppendorf da 0.2 ml
Denaturare i TNA a 95°C per 5 min.
Incubare in ghiaccio per 2 min.
Aggiungere la seguente mix di reazione:
1µl di dNTPs 2.5 mM
0.2 µl di M-MLV
1µl di Primer senso*
1µl di Primer antisenso*
2µl di MgCl2
2.5µl di Buffer 10x
0.3µl di Taq DNA polimerasi
5) Incubare la reazione in un termociclatore secondo il seguente ciclo:
94°C x 5 min.
42°C x 1.5h
94°C x 30sec
55°C x 30 sec
72°C x 30 sec
72°C x 7min.
16°C x ∞
X 35 CICLI
4) Il prodotto PCR può essere subito analizzato (fase D dell’allegato 2) in gel di poliacrilammide
oppure conservato a –20°C.
Reagenti e soluzioni necessarie per la reazione di PCR e per la successiva elettroforesi:
Soluzione di deossinucleotidi
10mM ciascuno (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
Trascrittasi inversa
M-MLV, buffer 5x, DDT 0.1M
Dna polimerasi
Taq polimerasi, buffer 10x, MgCl2 25mM
Primer *
Soluzione 6µM di ciascuno
Poliacrilammide
Soluzione di acrilammide/bisacrilammide al 40% (29:1)
Temed
soluzione commerciale
APS
Soluzione al 10% in H2O, preparato fresco
TBE 10x pH 8,3
90 mM acido borico, 90 mM Tris-HCl, 2,5 mM EDTA
bisodico
Gel loading buffer
15% Ficoll (type 400, Amersham), 0,25% blu di bromofenolo,
in H2O distillata.
Marker di peso molecolare per
DNA
DNA fago λ/Hind III
Soluzione di AgNO3
100 mg AgNO3 , 150 µl di formaldeide al 37%
Soluzione di Na2CO3
3g di Na2CO3 anidro, 150µl formaldeide al 37%, 4 µl di una
soluzione di sodio tiosolfato.(200mg/ml)
Soluzione Ac. acetico
10%
Soluzione di Ac. nitrico
1%
Allegato 7
Isolamento dei nematodi
Campionamento e metodi di estrazione.
I campioni di vegetali e/o di terreno da analizzare, costituiti da sub-campioni prelevati a caso
(almeno 10 campioni finali per una superficie di 1 Ha), devono essere posti in sacchetti di
polietilene e conservati, in attesa di essere esaminati, in cella frigorifera a 4–6°C per evitare
alterazioni (schiusa delle uova, morte delle larve, ecc.).
Prelievo e composizione del campione
Per il campionamento dei nematodi delle piante arboree (endoparassiti migratori e sedentari,
semi-endoparassiti e vettori di virus vegetali), ogni momento richiesto per un controllo fitosanitario
risulta adatto. Il campione (1-2 kg circa), prelevato dalla rizosfera della pianta ospite ad una
profondità di 5-40 cm, deve essere preferibilmente composto da radici capillari e terreno
circostante.
Metodi di estrazione dei nematodi dalle radici.
I nematodi fitoparassiti, in genere, possono invadere varie parti della pianta ospite. Nelle radici
di piante da frutto vari stadi di sviluppo di nematodi di endoparassiti e semi-endoparassiti possono
essere presenti in varie fasi del loro sviluppo e possono essere estratti con il metodo della
omogeinizzazione. Questo metodo è generalmente usato per estrarre i vari stadi di sviluppo di
nematodi siaendo e semi-endo parassiti sedentari (Meloidogyne spp. e Tylenchulus semipenetrans)
sia endo-parassiti migratori (Pratylenchus spp.).
Le varie fasi si possono così riassumere:
1. Riduzione delle radici in pezzi da 1-1,5 mm;
2. frantumazione delle radici (10 g. circa in 100 ml di acqua) con il frullatore;
3. filtrazione della sospensione ottenuta attraverso i due setacci, posti l’uno sull’altro, con
maglie da 710 e 40 µm e successiva raccolta dei i nematodi e residui vegetali in
sospensione acquosa.
4. osservazione microscopica della sospensione ed identificazione dei nematodi.
La sospensione di nematodi, ottenuta con il metodo sinora descritto può essere resa più limpida con
una opportuna centrifugazione.
Metodi di estrazione dei nematodi dal terreno
I nematodi fitoparassiti possono essere presenti nel terreno sotto forma di uova, di larve
infestanti, di stadi larvali intermedi e di adulto. I nematodi liberi nella rizosfera possono essere
recuperati con il metodo del travaso e con il metodo della centrifugazione.
A)
Travaso o setacciamento
Sono richiesti alcuni secchi da 5-6 litri e una serie di setacci con maglie di varia apertura per
raccogliere gli esemplari di tutte le dimensioni.
Le varie fasi dell’estrazione possono essere così riassunte:
1)
Sospensione in acqua di circa 1 kg di terreno;
2)
uno o due travasi della sospensione in secchi successivi, osservando brevi pause per
favorire la decantazione dei residui terrosi più grossi;
3)
4)
filtrazione della sospensione attraverso 2 setacci da 710 e 40 µm per raccogliere i
nematodi e particelle terrose ;
osservazione microscopica del campione.
B) Centrifugazione
Questo metodo è molto indicato per la raccolta di nematodi liberi attivi e passivi presenti nel
terreno.
Le varie fasi dell’estrazione possono essere così riassunte:
1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
8)
risospendere il campione di terreno da esaminare in 4-5 litri di acqua;
concentrare attraverso un setaccio detriti organici e nematodi in modo da ottenere un
campione di 400 –500 ml, aggiungendo 10-20 g di caolino ;
centrifugare per 3-5 minuti a 2500 giri;
eliminare il supernatante;
risospendere il residuo (detriti e nematodi ) in una soluzione di solfato di magnesio
avente una densità di 1,2 (465g di prodotto commerciale per litro di acqua), mediante un
agitatore;
centrifugare nuovamente per 2-3 minuti a 2000 giri/m;
recuperare i nematodi filtrando il supernatante attraverso un setaccio di 5 µm;
osservazione microscopica della sospensione.
Strumentazione e materiale essenziale per l’esecuzione dei suddetti accertamenti sanitari:
Virus
Strumento
e/o
materiale
Agitatore
con
termostatica
Agente e
saggio
Ibridazione
molecolare
RT-PCR
Isolamento
su substrato
semiselettivo
Agitatore orbitale
X
X
Agitatore vortex
X
X
Agitatori
X
X
Centrifuga con contenitori
da almeno 500 ml
Contenitore per azoto
liquido
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
Freezer
a
bassa
temperatura (-80°C)
X
X
Frigorifero
X
X
X
X
X
X
Lettore ELISA
Membrana di Nylon
X
Microcentrifuga da banco
X
X
X
Micropipette multicanale
X
X
X
X
X
Microscopio
Mortai in porcellana
dal
terreno
X
X
Fornetto per ibridazione
Micropipette tarate
ELISA
dalle
radici
X
Cappa a flusso laminare
Cassetta per esposizione
delle lastre
Kit
X
cupola
Apparato per elettroforesi
verticale
Autoclave
Nematodi
V. dhaliae
X
X
X
X
Piastre in polistirene
X
Piastre Petri
Plasticheria monouso
X
Pompa da vuoto
X
X
X
X
X
X
X
Provette da 0.2 ml
Provette da 1.5 ml
X
X
Provette da 15 e 50 ml
X
X
Rimescolatore (Agitatore)
a vibrazione
Setaccio con maglie da
40µm
Setaccio con maglie da
710µm
Stufa
X
Vetreria (bottiglie, beute,
matracci, etc)
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
Termociclatore
Comune frullare
Vaschette in plastica
X
X
Puntali aerosol-free per
micropipette
Puntali per micropipette
X
X
X
X
X
X
X
X
X
BIBLIOGRAFIA
Harris D.C., J.R. Yang and M.S. Ridout, 1993. The detection and estimation of Verticillium dahliae
in naturally infested soil. Plant Pathology, 42: 238-250.
Saponari M., F. Nigro, G. Loconsole, G. Romanazzi, N. Vovlas, C. Cariddi, 2001. Distribuzione dei
patogeni dell’olivo in Puglia. In: Savino V. (Coordinatore), Atti del convegno Progetto POM
A32 - I risultati di due anni di attività. Termoli, 1-2 marzo 2001, 13 pp.
(http://www.agr.uniba.it/poma32/Termoli/AttiTermoli.htm).
Sutula C.L., Gillet J.M., Morrissey S.M., Ramsdell D.C., 1986. Interpreting ELISA data and
establishing the positive-negative threshold. Plant Disease 70: 722-726.
F. Grieco, Saponari M., Alkowni R., Savino V., Garau R., Martelli GP., 2000. Progressi nella
diagnosi dell’olivo. Inf. Fitopatologico, 11: 49-52.
Martelli G.P., 2000. Infectious diseases and certification of olive: an overview. Bullettin
OEPP/EPPO Bulletin, 29, 127-133.

Sessione IV: Olivo - Agraria - Università degli Studi di Bari

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