Sottopopolazioni leucocitarie in concentrati

Sottopopolazioni leucocitarie
in concentrati piastrinici da aferesi
e da plasma ricco di piastrine
Saverio Misso(1), Bianca Feola(1), Claudio Marotta(1), Daniela Graziano(2),
Pietro Concilio(2), Annagrazia Fratellanza(2), Valentina Minerva(1),
Antonio Minerva(1)
(1)
(2)
Immunoematologia e Servizio Trasfusionale Azienda Ospedaliera, Caserta
(Responsabile della Ricerca: Dr. Antonio Minerva)
Immunoematologia e Medicina Trasfusionale AUP Federico II, Napoli
Leucocytes in platelet concentrates could be
responsible of serious side effects: alloimmunization
versus HLA antigens, infections and others, each one
depending on a different leucocyte population. In the
last years it has been proposed to infuse platelet
concentrates containing less than 5 x 105 leucocytes
per unit in order to prevent these reactions. Two
methods are commonly used: filtration and apheresis.
The Authors evaluated phenotypic differences of
leucocytes in not filtrated platelet concentrates
produced by apheresis and in filtrated platelet
concentrates derived from platelet rich plasma.
Parole chiave: concentrati piastrinici, citometria a flusso,
leucodeplezione
Key words: platelet concentrates, flow cytometry,
leucodepletion
Introduzione e scopo
La trasfusione dei concentrati piastrinici (CP) è usata
nella terapia trasfusionale di pazienti affetti da gravi
piastrinopenie e/o piastrinopatie; è noto che tale trasfusione
può determinare effetti collaterali causati dai leucociti che
residuano in tali preparati: alloimmunizzazione HLA,
refrattarietà alla trasfusione piastrinica, reazioni febbrili non
emolitiche (FNHTR), infezioni o altre complicanze
trasfusionali1,2. Per la prevenzione di tali complicanze è stato
proposto, da alcuni anni, di trasfondere concentrati
piastrinici aventi un numero di leucociti < 5x105 per unità3,4,18.
Attualmente sono utilizzati due metodi che permettono una
Ricevuto: 22 Marzo 2001 - Accettato: 27 settembre 2001
Corrispondenza:
Dott. Saverio Misso
Via San Francesco d'Assisi, 5
81100 Caserta
258
riduzione dei leucociti negli emocomponenti: la filtrazione
e le tecniche aferetiche5. Tali tecniche ci permettono un
decremento dell'incidenza dell'alloimmunizzazione HLA23,
della refrattarietà alla stessa trasfusione24, una riduzione
dell'infezione da Cytomegalovirus (CMV) equivalente alla
trasfusione di emocomponenti CMV negativi6-8,26-28 ed una
riduzione delle infezioni post-operatorie6,9. Mentre fino a
pochi anni fa l'attenzione di numerosi gruppi di studi era
tutta verso il numero assoluto dei leucociti residui nei CP10-15,
dal 1991 tale attenzione è stata spostata verso le
caratteristiche biologiche delle cellule presenti negli
emocomponenti usati nella pratica trasfusionale16. La
popolazione leucocitaria residua di un emocomponente
leucodepleto comprende una varietà di cellule
funzionalmente differenti e fenotipicamente identificabili
che
sono
responsabili
dello
sviluppo
dell'alloimmunizzazione e/o di altri tipi di reazioni
trasfusionali, ognuna delle quali associata ad una
particolare sottopopolazione leucocitaria17,19,20; infatti, la
FNHTR è associata alla presenza dei granulociti e dei
monociti21, l'alloimmunizzazione ai monociti-macrofagi23,24,
l'infezione da HTLV-1 ai linfociti T22, l'infezione da CMV ai
granulociti, ai monociti ed ai linfociti 26-29, la GvHD ai linfociti
T CD4+ e T CD8+25. Scopo del nostro studio è stato quello
di analizzare il numero dei leucociti residui, la distribuzione
della sottopopolazione leucocitaria ed eventuali differenze
fenotipiche nei concentrati piastrinici prodotti sia con
tecnica aferetica non filtrati che da plasma ricco di piastrine
post-filtrazione.
Materiali e metodi
Preparazione concentrati piastrinici
Abbiamo analizzato 24 concentrati piastrinici (CP) da
aferesi non filtrati prodotti con un separatore cellulare a
LA TRASFUSIONE DEL SANGUE vol. 46 - num. 4 luglio-agosto 2001 (258-262)
Sottopopolazioni leucocitarie in concentrati piastrinici
flusso continuo Cobe Spectra LRS turbo versione 7 (Cobe
BCT corp., Lakewood, CO,USA). Le piastrine sono state
ottenute da donatori periodici di età compresa tra 28-44
anni, 14 di sesso maschile e 10 di sesso femminile aventi
una conta piastrinica e leucocitaria pre-donazione
rispettivamente di 220 - 310 x 103/µL e di 4.1 - 5.2x103/µL.
Sono stati analizzati, inoltre, 11 pools piastrinici prodotti
da plasma ricco di piastrine (PRP), ottenuti sempre da
donatori periodici di sangue afferenti al nostro centro di
Immunoematologia. Tutti i pool, ognuno dei quali era
costituito da sei unità di piastrine, sono stati filtrati in
laboratorio con filtri Biofil P10 plus (Biofil-Fresenius AG,
Homburg, Germany) seguendo le istruzioni d'uso fornite
dal produttore.
Conteggio dei leucociti
Il conteggio leucocitario pre-filtrazione è stato
effettuato mediante un apparecchio automatico (Sysmex
SF 3000 Europe GMBH, Bornbarch, 1 Norderstedt,
Germania) in possesso del nostro Centro. Per il conteggio
post-filtrazione, a causa della sensibilità minima dei contatori
automatici (100 leucociti/µL contro una sensibilità di 1-5
leucociti\µL indispensabile per una corretta valutazione dei
leucociti residui 12 , è stato utilizzato il metodo
fluorocromatico11,14: la sospensione cellulare è stata
dispensata in 20 pozzetti (2 µL in ognuno) in una piastra
di Terasaki da tipizzazione tessutale, ad essa sono stati
aggiunti 5 µL di fluorocromo (Fluoroquence - One Lambda,
Inc., Conaga Park, CA, USA) ed incubato per 10-15 minuti
a temperatura ambiente. Successivamente, dopo una
centrifugazione di 2 minuti a 300 g, la lettura delle piastre è
stata eseguita mediante un microscopio a fluorescenza
invertito. La concentrazione delle cellule è stata ottenuta
sommando i leucociti presenti in ogni pozzetto e dividendoli
per il volume totale di sospensione cellulare dispensato
(40µL).
Analisi del fenotipo leucocitario
Per l'analisi del fenotipo leucocitario5, 40 mL del pool
dei CP sono stati trasferiti in una provetta da 50 mL e
centrifugati a 800 g per 5 minuti a 22 ± 2 °C per concentrare
i leucociti. La maggior parte del plasma surnatante è stata
rimossa lasciando 15 mL di plasma con il quale il pellet
leucocitario è stato risospeso, inoltre è stato aggiunto PBS/
albumina in modo tale da portare il volume a 30 mL. Allo
stesso modo è stato preparato il concentrato leucocitario
residuo nei prodotti da aferesi. Successivamente, 5 mL della
sospensione leucocitaria sono stati aggiunti a 6 mL di un
gradiente di densità, il tutto è stato centrifugato a 800 g per
15 minuti a 22 °C in modo da ottenere nella parte superiore
della provetta piastrine, nella parte intermedia il gradiente e
nella parte inferiore i leucociti adesi al fondo. Il plasma, le
piastrine ed il gradiente di densità sono stati aspirati mentre
i leucociti sono stati risospesi nel restante surnatante.
Il volume è stato, poi, portato a 12 mL con PBS/albumina
ed il tutto è stato centrifugato a 800 g x 5 minuti a 22 °C.
Dopo la centrifugazione, il surnatante è stato rimosso
ed il pellet dei leucociti è stato lavato con 10 mL di PBS/
albumina, centrifugato ed infine risospeso fino ad un
volume pari a 400 µL.
Lo studio delle sottopopolazioni leucocitarie è stato
effettuato in citofluorimetria a flusso15 (Ortho Diagnostic
Systems-Cytoron Absolute ARS, Raritan, USA) utilizzando
anticorpi monoclonali (Serotec Ltd 22 Bankside, Station
Approach, Kidlington,Oxford, England) anti-leucociti (CD
45 FITC), anti-linfociti T CD4+ (CD 3 FITC\CD 4 PE), antilinfociti T CD8+ (CD 3 FITC\CD 8 PE), anti-linfociti B (CD 3
FITC\CD19 PE), anti-monociti-mielomonociti (CD 14 PE) e
anti-granulociti (CD 15 FITC). 20 µL di tali anticorpi
monoclonali sono stati aggiunti a 50 µL della sospensione
leucocitaria nelle rispettive provette precedentemente
contrassegnate e i campioni sono stati incubati per 15 minuti
a temperatura ambiente.
Al termine dell'incubazione, ad ogni provetta sono stati
aggiunti 300 µL di soluzione lisante e quindi è stata effettuata
la lettura al citofluorimetro. Il gate per i granulociti, i monociti
ed i linfociti è stato selezionato sulla base della fluorescenza
del CD45, infatti, tutte le normali cellule del sangue
esprimono l'antigene CD45 sulla loro superficie a differente
densità.
Abbiamo utilizzato tale anticorpo monoclonale sia per
identificare i leucociti sui campioni in esame che per facilitare
l'identificazione delle tre maggiori sottoclassi.
Inoltre, la differenzazione dei linfociti B, T CD4+ e T
CD8+ è stata ottenuta dalla analisi di due fluorescenze
associate al gate della popolazione linfocitaria. Un totale di
circa 40000 eventi per aliquota è stato esaminato.
La determinazione del numero assoluto dei leucociti e
della sottopopolazione leucocitaria è stata effettuata due
giorni dopo la produzione dei concentrati piastrinici. Per
l'analisi statistica abbiamo utilizzato il t-Student
test,considerando significativa la p inferiore a 0,05.
Risultati
I risultati, espressi come media e deviazione standard,
sono i seguenti: i leucociti residui per unità di CP prodotti
da aferesi sono stati 3,9 + 2 x 105 mentre quelli residui nei
CP da PRP post-filtrazione sono stati 4,1 + 3 x 105.
Lo studio delle sottopopolazioni leucocitarie è riportato
nella tabella I e nella figura 1.
259
S. Misso et al.
Figura 1- Confronto fra i subsets leucocitari nei CP da Aferesi e da PRP. La p è stata considerata significativa se
inferiore a 0,05
Tabella I: valori medie e derivate standard dei subsets leucocitari studiati
CP-Aferesi
CP-PRP
CD19
CD4
CD8
CD14
CD15
10,3 ± 3
11,5 ± 4
46,4 ± 6.6
56,2 ± 7.6
33,9 ± 4.2
27,5 ± 4.7
7,8 ± 3.1
2,2 ± 0.7
1,3 ± 0.7
1,3 ± 0.6
Discussione e conclusioni
Reazioni febbrili ed allergiche sono complicanze
frequenti delle trasfusioni di piastrine sia da singolo
donatore (aferesi) che da donatori multipli (random). Tali
reazioni sono in rapporto con la sensibilizzazione verso
antigeni HLA e non HLA presenti sui linfociti, granulociti
o piastrine che vengono trasfusi e verso proteine
plasmatiche; numerosissime sono le reazioni avverse
associate all'infusione di tali elementi cellulari tra cui vanno
ricordate la refrattarietà alla trasfusione delle piastrine,
reazioni trasfusionali febbrili non emolitiche, GvHD,
infezioni virali ecc. La responsabilità dei leucociti nelle
principali reazioni trasfusionali è ormai universalmente
260
riconosciuta e la pratica della leucodeplezione è sempre
più impiegata di routine nella terapia trasfusionale onde
evitare reazioni indesiderate, così come l'utilizzo di separatori
cellulari in grado di produrre dei concentrati piastrinici con
un numero di leucociti talmente limitato da non richiedere
l'uso dei filtri per la leucodeplezione.
Tuttavia, il numero dei leucociti non dà informazioni
circa le varie sottopopolazioni leucocitarie presenti nei
concentrati piastrinici, mentre le varie sottopopolazioni e
la loro funzione hanno un ruolo fondamentale in relazione
ai rischi ed ai benefici della trasfusione di un
emocomponente in generale e dei concentrati piastrinici in
particolare, specialmente se si considera che tali
emocomponenti vengono trasfusi per la maggior parte a
Sottopopolazioni leucocitarie in concentrati piastrinici
pazienti con un sistema immunitario già abbastanza
compromesso.
Dai nostri risultati, conformi a quelli di altri autori17, si
deduce che vi è una differenza nell'ambito delle
sottopopolazioni leucocitarie presenti nei CP random filtrati
ed in quelli da aferesi. I CP da aferesi contengono un numero
più elevato (statisticamente significativo) di cellule CD14+
rispetto ai CP random filtrati (p < 0,05), viceversa hanno un
minor numero di linfociti T CD4+ (p < 0,05) ed un aumento
dei T CD8+ (p < 0,05).
Nessuna differenza statisticamente significativa, invece,
è stata riscontrata tra le cellule CD15+ e CD19+ dei due
emocomponenti considerati (p > 0,05).
Tali dati, a nostro avviso, possono avere una importanza
clinica notevole, poiché mettono in evidenza che il CP è un
emocomponente che presenta delle diverse caratteristiche
a secondo della tecnica con la quale è prodotto.
Considerando che la linea monocitico-macrofagica
gioca un ruolo importante nella alloimmunizzazione e nella
refrattarietà, è questa la linea cellulare, a nostro avviso, che
deve essere ridotta nei concentrati piastrinici.
Valutando solo questo aspetto del problema, dovremmo
concludere che i concentrati piastrinici prodotti da PRP
comportano un minor rischio di alloimmunizzazione rispetto
a quelli prodotti da aferesi.
Se però valutiamo il problema nella sua interezza
(trasmissione di CMV, ipotetica trasmissione di prioni,
difficoltà tecnica a produrre un concentrato piastrinico da
PRP sempre con caratteristiche riproducibili, GvHD) il
preparato aferetico è l'emocomponente che presenta tali
vantaggi.
Inoltre, considerando il basso numero degli elementi
leucocitari e le basse percentuali delle sottopopolazioni
presenti in ambedue concentrati, è difficile valutare il loro
reale ruolo nel meccanismo fisiopatologico dell'evento
alloimmunizzante.
Alla luce di queste valutazioni, quindi, sono auspicabili
studi clinici che ci permettono di valutare la reale efficacia
terapeutica ed i rischi di tali emocomponenti nel paziente
politrasfuso.
Riassunto
I leucociti nei concentrati piastrinici possono essere
responsabili di seri effetti collaterali: alloimmunizzazione
nei confronti di antigeni del sistema HLA, infezioni ed
altro, ciascuno dei quali dipendente da differenti
sottopopolazioni leucocitarie.
Negli ultimi anni è stato proposto di trasfondere
concentrati piastrinici contenenti meno di 5 x 105 leucociti
per unità, allo scopo di prevenire queste reazioni.
Due sono i metodi comunemente usati, filtrazione e
aferesi. Sono state valutate le differenze fenotipiche dei
leucociti presenti in concentrati piastrinici prodotti
mediante aferesi e non filtrati e in concentrati piastrinici
derivati da plasma ricco di piastrine e sottoposti a
filtrazione.
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